本發(fā)明屬于微生物領(lǐng)域，特別涉及一種自然發(fā)酵豆醬中菌體宏蛋白質(zhì)組的提取方法。

背景技術(shù)：

我國的自然發(fā)酵豆醬歷史悠久，是勞動人民智慧的結(jié)晶。然而自然發(fā)酵豆醬也面臨一系列的問題：如高鹽、不適應(yīng)現(xiàn)代健康的要求，易受到雜菌、有害菌的污染等。因此，對自然發(fā)酵豆醬的深入研究迫在眉睫。

宏蛋白質(zhì)組指的是環(huán)境混合微生物群落中所有生物的蛋白質(zhì)組總和，對宏蛋白質(zhì)組進(jìn)行研究的方法稱為宏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。將此方法用于豆醬中微生物的研究，可減小對所研究的微生物群體的限制性，也不必預(yù)先篩選出特定的蛋白質(zhì)，一次性可做大量研究，便于對豆醬中的微生物有一個宏觀全面的了解。宏蛋白組學(xué)的研究過程包括蛋白質(zhì)樣品的處理、分離、分析鑒定等。樣品處理的好壞直接決定了后續(xù)實驗的結(jié)果，本發(fā)明提供一種自然發(fā)酵豆醬中菌體宏蛋白質(zhì)組的提取方法，為后續(xù)研究奠定了基礎(chǔ)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種自然發(fā)酵豆醬中菌體宏蛋白質(zhì)組的提取方法，用于豆醬中微生物的研究，能減小對所研究的微生物群體的限制性，也不必預(yù)先篩選出特定的蛋白質(zhì)，一次性可做大量研究。

本發(fā)明提供的技術(shù)方案包括以下步驟：將新鮮采集的自然發(fā)酵豆醬于離心桶中，低速離心除去雜質(zhì)，高速離心得到菌體，液氮研磨破碎菌體，TCA-丙酮沉淀蛋白質(zhì)，丙酮清洗除雜，冰上風(fēng)干得到粗蛋白質(zhì)，加入裂解液，超聲助溶，離心后得到蛋白質(zhì)清液，采用SDS-PAGE和質(zhì)譜進(jìn)行檢測。

本發(fā)明的積極效果：用于豆醬中微生物的研究，能減小對所研究的微生物群體的限制性，也不必預(yù)先篩選出特定的蛋白質(zhì)，一次性可做大量研究。

具體實施方式

A、采用自然發(fā)酵的方法制作豆醬：10公斤新收獲的東北大豆洗凈，浸泡24小時后置于鐵鍋中蒸煮4小時，將煮熟的豆粒絞碎制成200g左右的長方體形狀，放在陽光下晾干后包上紙，白天接受日曬，夜間拿到室內(nèi)，發(fā)酵兩個月制成醬醅,期間每5天取樣一次。

將醬醅表面菌毛洗凈，破碎后放入缸中，加入水和鹽，醬醅：鹽：水比例為1:0.7:1.5，混合均勻，缸上覆蓋紗布，靜置發(fā)酵三天后每天上下翻醬一次，一個月后醬成，期間每5天取樣一次。

B、取新鮮采集的豆醬或醬醅70g放于500ml離心桶中，加入200ml磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH=7.0），放入直徑1cm的玻璃珠30顆，人工震蕩離心桶10分鐘；

C、將玻璃珠取出，2000r/min，離心10分鐘，取出上清液；沉淀物中加入150ml磷酸鹽緩沖液搖勻，2000r/min，離心10分鐘，取出上清液；重復(fù)一次；

D、將所有上清液2000r/min，離心20分鐘，收集上清，棄去沉淀物；

E、將所有上清液6000r/min，離心20分鐘，棄去上清，收集沉淀物；

F、沉淀物用5ml磷酸鹽緩沖液清洗后6000r/min，離心20分鐘得到菌體沉淀物；

G、菌體沉淀物進(jìn)行液氮研磨，研磨成粉后，平均轉(zhuǎn)移至3個2ml離心管，每管加入1.5ml10%（質(zhì)量：體積）的TCA-丙酮，-20℃過夜；

H、10000r/min，離心20分鐘，棄去上清，向沉淀物中加入1.5ml丙酮清洗，放入-20℃冰箱沉淀2小時，10000r/min，離心20分鐘，棄上清，收集沉淀物；重復(fù)兩次；

I、沉淀物冰上風(fēng)干成粉后，按照0.1g/ml加入裂解液，26w超聲助溶10分鐘，工作2秒停3秒，10000r/min，離心1小時，取上清，即為蛋白質(zhì)清液；

J、采用SDS-PAGE和質(zhì)譜進(jìn)行檢測：對提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳實驗，分離膠濃度為12％（體積：體積），濃縮膠濃度為5％（體積：體積）。電泳時間設(shè)置為80v，15min；120v至跑完。利用Image Lab 軟件對所得的SDS-PAGE 電泳膠圖進(jìn)行掃描。將電泳后的蛋白條帶切下，分別放入2ml離心管中，脫色后經(jīng)胰蛋白酶消化，并利用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀（Bruker Daltonics Co.miroTOF-QΙΙ型）對肽段樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，用2.3.01版本的Mascot數(shù)據(jù)搜索軟件搜索uniprot20140225數(shù)據(jù)庫，得到匹配蛋白。

試劑配制：

1. 0.1mol/L，pH=7.0磷酸鹽緩沖液（1000ml）：

（1）0.1mol/L磷酸氫二鉀溶液（1000ml）：稱取22.8220g磷酸氫二鉀于1000ml容量瓶中，加入去離子水混勻定容。

（2）0.1mol/L磷酸二氫鉀溶液（1000ml）：稱取13.6090g磷酸二氫鉀于1000ml容量瓶中，加入去離子水混勻定容。

取610ml溶液（1）和390ml溶液（2）混勻，加入8g氯化鈉，0.2g氯化鉀混勻后，調(diào)pH至7.0，現(xiàn)用現(xiàn)配。

2.裂解液（20ml）：稱取尿素8.4081g，硫脲3.0448g，CHAPS（3-[3-（膽酰胺基丙基）二甲氨基]丙磺酸鹽）0.8g ，蛋白酶抑制劑PMSF（苯甲基黃酰氟）0.0035g，DTT（二硫蘇糖醇）0.2g于20ml容量瓶中，加入去離子水混勻后定容，現(xiàn)用現(xiàn)配。

3.10%TCA-丙酮（100ml）：取10gTCA于100ml容量瓶，加入冰丙酮混勻后定容。

4.12%分離膠（10ml）：水3.35ml，30%（質(zhì)量：體積）丙烯酰胺混合液4.0ml，1.5mol/LTris（三羥甲基氨基甲烷）(pH8.8)2.5ml，10%（質(zhì)量：體積）SDS（十二烷基硫酸鈉）0.1ml，10%（質(zhì)量：體積）AP（過硫酸銨）0.15ml，最后加入TEMED（四甲基乙二胺）0.015ml混合均勻。

5.5%濃縮膠（3ml）：水2.1ml，30%丙烯酰胺混合液0.5ml，1.5mol/LTris(pH6.8)

0.38ml，10%SDS0.03ml，10%AP0.03ml，最后加入TEMED0.003ml混合均勻。

實施例1

1）采用自然發(fā)酵的方法制作豆醬：10公斤新收獲的東北大豆洗凈，浸泡24小時后置于鐵鍋中蒸煮4小時，將煮熟的豆粒絞碎制成200g左右的長方體形狀，放在陽光下晾干后包上紙，白天接受日曬，夜間拿到室內(nèi)，發(fā)酵兩個月制成醬醅。將醬醅表面菌毛洗凈，破碎后放入缸中，加入水和鹽，醬醅：鹽：水比例為1:0.7:1.5，混合均勻，缸上覆蓋紗布，靜置發(fā)酵三天后每天上下翻醬一次，一個月后醬成。

2）取新鮮采集的豆醬70g放于500ml離心桶中，加入200ml磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH=7.0），放入直徑1cm的玻璃珠30顆，人工震蕩離心桶10分鐘；

3）將玻璃珠取出，2000r/min，離心10分鐘，取出上清液；沉淀物中加入150ml磷酸鹽緩沖液搖勻，2000r/min，離心10分鐘，取出上清液；重復(fù)一次；

4）將所有上清液2000r/min，離心20分鐘，收集上清，棄去沉淀物；

5）將所有上清液6000r/min，離心20分鐘，棄去上清，收集沉淀物；

6）沉淀物用5ml磷酸鹽緩沖液清洗后6000r/min，離心20分鐘得到菌體沉淀物；

7）菌體沉淀物進(jìn)行液氮研磨，研磨成粉后，平均轉(zhuǎn)移至3個2ml離心管，每管加入1.5ml10%（質(zhì)量：體積）的TCA（三氯乙酸）-丙酮，-20℃過夜；

8）10000r/min，離心20分鐘，棄去上清，向沉淀物中加入1.5ml丙酮清洗，放入-20℃冰箱沉淀2小時，10000r/min，離心20分鐘，棄上清，收集沉淀物；重復(fù)兩次；

9）沉淀物冰上風(fēng)干成粉后，按照0.1g/ml加入裂解液，26w超聲助溶10分鐘，工作2秒停3秒，10000r/min，離心1小時，取上清，即為蛋白質(zhì)清液；

10）采用SDS-PAGE（十二烷基硫酸鈉聚丙烯酞胺凝膠電泳）和質(zhì)譜進(jìn)行檢測：對提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳實驗，分離膠濃度為12％（體積：體積），濃縮膠濃度為5％（體積：體積）。電泳時間設(shè)置為80v，15min；120v至跑完。利用Image Lab 軟件對所得的SDS-PAGE 電泳膠圖進(jìn)行掃描。將電泳后的蛋白條帶切下，分別放入2ml離心管中，脫色后經(jīng)胰蛋白酶消化，并利用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀（Bruker Daltonics Co.miroTOF-QΙΙ型）對肽段樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，用2.3.01版本的Mascot數(shù)據(jù)搜索軟件搜索uniprot20140225數(shù)據(jù)庫，得到匹配蛋白。

實施例2

1）采用自然發(fā)酵的方法制作醬醅：10公斤新收獲的東北大豆洗凈，浸泡24小時后置于鐵鍋中蒸煮4小時，將煮熟的豆粒絞碎制成200g左右的長方體形狀，放在陽光下晾干后包上紙，白天接受日曬，夜間拿到室內(nèi)，發(fā)酵兩個月制成醬醅，期間每5天取樣一次。

2）取新鮮采集的醬醅70g，破碎后放于500ml離心桶中，加入200ml磷酸鹽緩沖液（0.1mol/L，pH=7.0），放入直徑1cm的玻璃珠30顆，人工震蕩離心桶10分鐘；

3）將玻璃珠取出，2000r/min，離心10分鐘，取出上清液；沉淀物中加入150ml磷酸鹽緩沖液搖勻，2000r/min，離心10分鐘，取出上清液；重復(fù)一次；

4）將所有上清液2000r/min，離心20分鐘，收集上清，棄去沉淀物；

5）將所有上清液6000r/min，離心20分鐘，棄去上清，收集沉淀物；

6）沉淀物用5ml磷酸鹽緩沖液清洗后6000r/min，離心20分鐘得到菌體沉淀物；

7）菌體沉淀物進(jìn)行液氮研磨，研磨成粉后，平均轉(zhuǎn)移至3個2ml離心管，每管加入1.5ml10%（質(zhì)量：體積）的TCA-丙酮，-20℃過夜；

8）10000r/min，離心20分鐘，棄去上清，向沉淀物中加入1.5ml丙酮清洗，放入-20℃冰箱沉淀2小時，10000r/min，離心20分鐘，棄上清，收集沉淀物；重復(fù)兩次；

9）沉淀物冰上風(fēng)干成粉后，按照0.1g/ml加入裂解液，26w超聲助溶10分鐘，工作2秒停3秒，10000r/min，離心1小時，取上清，即為蛋白質(zhì)清液；

10）采用SDS-PAGE和質(zhì)譜進(jìn)行檢測：對提取的蛋白質(zhì)進(jìn)行電泳實驗，分離膠濃度為12％（體積：體積），濃縮膠濃度為5％（體積：體積）。電泳時間設(shè)置為80v，15min；120v至跑完。利用Image Lab 軟件對所得的SDS-PAGE 電泳膠圖進(jìn)行掃描。將電泳后的蛋白條帶切下，分別放入2ml離心管中，脫色后經(jīng)胰蛋白酶消化，并利用液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜儀（Bruker Daltonics Co.miroTOF-QΙΙ型）對肽段樣品進(jìn)行質(zhì)譜分析，用2.3.01版本的Mascot數(shù)據(jù)搜索軟件搜索uniprot20140225數(shù)據(jù)庫，得到匹配蛋白。