專利名稱：：編碼線蟲毒素的基因的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
：本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域。本發(fā)明提供新的編碼殺線蟲蛋白質(zhì)的基因。這些蛋白質(zhì)以及編碼它們的核酸序列可用于制備殺線蟲制劑以及生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因的抗害蟲植物。
背景技術(shù)：
：線蟲類(衍生自希臘詞的線)是活躍的、靈活的、細(xì)長(zhǎng)形的生物體，它們生活在濕潤(rùn)的表面或者是液體環(huán)境中，包括土壤內(nèi)部的水膜以及其他生物體內(nèi)部的濕潤(rùn)組織。雖然只有20，000種線蟲類被鑒定，實(shí)際上卻估計(jì)有40，000到千萬(wàn)種線蟲真實(shí)存在。一些種類的線蟲已經(jīng)進(jìn)化成了非常成功的植物和動(dòng)物的寄生蟲，并且已經(jīng)造成農(nóng)業(yè)和畜牧業(yè)巨大的經(jīng)濟(jì)損失和在人類中的發(fā)病和死亡。(Whitehead(1998)PlantNematodeControl.CABInternational,NewYork)。據(jù)估計(jì)在全世界范圍內(nèi)，每年寄生線蟲造成園藝與農(nóng)業(yè)超過(guò)780億美元的損失，依據(jù)在整個(gè)主要作物預(yù)計(jì)平均12%年損來(lái)計(jì)算。例如，預(yù)計(jì)全世界范圍線蟲造成大豆大約每年32億美元的損失(Barker等(1994)PlantandSoilNematodes=SocietalImpactandFocusfortheFuture。TheCommitteeonNationalNeedsandPrioritiesinNematology0CooperativeStateResearchService,USDepartmentofAgricultureandSocietyofNematologists)。只有非常少量的化學(xué)物質(zhì)能夠控制線蟲(Becker(1999)AgriculturalResearchMagazine47(3):22-24；U.S.Pat.No.6,048,714)然而，化學(xué)殺線蟲劑的方式依然是主要的線蟲控制方法。通常，殺線蟲的化學(xué)制品是高毒的化合物，為引發(fā)真實(shí)的環(huán)境影響而為人所知，而且在使用的劑量和位置上越來(lái)越被限制。大環(huán)內(nèi)酯(例如，阿凡曼菌素與密比霉素)是原則上提供優(yōu)秀的專一性與效力的化學(xué)制品，允許環(huán)境上安全地管理植物寄生的線蟲。遺憾的是，在實(shí)踐中，這兩種殺線蟲的試劑在農(nóng)業(yè)應(yīng)用中被證明對(duì)根源病原體效果不明顯。雖然某些阿凡曼菌素顯示精確的對(duì)植物寄生線蟲的活性，但是這些化學(xué)制品受困于不良生物利用率，因?yàn)樗鼈兊墓饷舾行?，土壤微生物?duì)其降解，以及與土粒的強(qiáng)結(jié)合(Lasota&Dybas(1990)ActaLeiden59(1-2)217-225；Wright&Perry(1998)MusculatureandNeurobiology.In:ThePhysiologyandBiochemistryofFree-LivingandPlant-parasiticNematodes(R.N.Perry&D.J.feight編著)，CABInternational1998)。因此盡管對(duì)動(dòng)物寄生線蟲，螨與昆蟲(植物與動(dòng)物應(yīng)用)多年的研究與廣泛應(yīng)用，大環(huán)內(nèi)酯(例如，阿凡曼菌素與密比霉素))從來(lái)沒(méi)有被商業(yè)開發(fā)用于控制土壤中的植物寄生線蟲。發(fā)明概述本申請(qǐng)?zhí)峁┝私o予植物、植物細(xì)胞、組織與種子線蟲耐受活性的組合物和方法。組合物包括編碼殺線蟲多肽序列的核酸分子，包含這些核酸分子的載體，以及包含所述載體的宿主細(xì)胞。組合物也包括殺線蟲的多肽序列與所述多肽的抗體。核苷酸序列可被用于DNA構(gòu)建體或者表達(dá)盒，所述DNA構(gòu)建體或者表達(dá)盒用來(lái)在生物體中轉(zhuǎn)化和表達(dá)，生物體包括微生物與植物。核苷酸或者氨基酸序列可以是化學(xué)合成的序列，其已經(jīng)被設(shè)計(jì)用于在生物體中表達(dá)，生物體包括但不限于微生物或者植物。組合物也包含轉(zhuǎn)化了的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、組織與種子。具體地，提供了分離的編碼殺線蟲蛋白質(zhì)的核苷酸分子。另外，與殺線蟲蛋白質(zhì)對(duì)應(yīng)的氨基酸序列也被包括在內(nèi)。具體地，本文提供了一種分離的核酸分子，包括編碼SEQIDNO:4，5，8，9，13，14，47，48或者49所示的氨基酸序列的核苷酸序列，所述核苷酸序列如SEQIDNO=1,2,3,6,7,10，11，12，15,45或者46所示，以及它們的變體和片段。和本發(fā)明的核苷酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列，或者和本發(fā)明序列雜交的核苷酸序列也被包括在內(nèi)。提供了生產(chǎn)本發(fā)明多肽的方法，以及用所述多肽控制或者殺死線蟲寄生蟲的方法。也提供了在樣品中檢測(cè)本發(fā)明的核酸和多肽的方法和試劑盒。本發(fā)明的組合物和方法可用于生產(chǎn)具有提高的線蟲抗性或者耐受性的生物體。所述生物體和包含組合物的生物體符合農(nóng)業(yè)目的。本發(fā)明的組合物用于鑒定和生產(chǎn)具有改善的線蟲抗性的植物群體，以及用于鑒定數(shù)量性狀基因座(QuantitativeTraitLoci)(QTLs)，所述數(shù)量性狀基因座用于具有線蟲抗性或耐受性的植物的標(biāo)識(shí)物輔助育種。附圖描述圖1顯示多酚氧化酶的酶促作用。圖2顯示AXN-I前體蛋白(SEQIDNO13)，其質(zhì)譜峰被標(biāo)出。圖3A和;3B顯示了AXN-I(SEQIDNO4)和多酚氧化酶的比對(duì)，所述多酚氧化酶來(lái)自粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)(SEQIDNO:31)，小麥黃斑葉枯病菌(Pyrenophoratritici-repentis)(SEQIDNO32),Podosporaanserina(SEQIDNO33),Myifl#M(Lentinulaedodes)(SEQIDNO:34)，血紅密孑L菌(Pycnoporussanguineus)(SEQIDNO:35)，滑菇(Pholionameko)(SEQIDNO:36)，黑孢塊菌(Tubermelanosporum)(SEQIDNO37)，以及煙曲霉(Aspergillusfumigatus)(SEQIDNO:38)。圖4顯示了AXN_8(SEQIDNO:13)和多酚氧化酶的比對(duì)，所述多酚氧化酶來(lái)自雙孢菇(Agaricusbisporus)(SEQIDNO:39)，粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)(SEQIDNO31)，以及Streptomycescastaneglobisporus(SEQIDNO:40)。推定結(jié)合銅的組氨酸處于氨基酸SEQID而13的47，81，90，208，212以及2；35位點(diǎn)。蛋白酶活性位點(diǎn)處于SEQIDNO39的377位點(diǎn)，SEQIDNO31的403位點(diǎn)。結(jié)合銅的組氨酸處于SEQIDNO39的58位點(diǎn)，SEQIDNO31的67位點(diǎn)，以及SEQIDNO40的38，54，63，190，194以及216位點(diǎn)。圖5顯示了AXN-9(SEQIDNO48)和AXN-8(SEQIDNO13)的比對(duì)。圖6顯示了用抗-AXN-I抗體孵育的大豆發(fā)根組織的Western印跡。A泳道是從包含AXN-I基因的轉(zhuǎn)基因根組織獲得的根組織，B泳道是來(lái)自于缺乏AXN-I基因的對(duì)照系。發(fā)明詳述纖線蟲導(dǎo)致包括食物和經(jīng)濟(jì)作物的農(nóng)產(chǎn)品的實(shí)質(zhì)損失，并且基本上和具有殺線蟲活性的化合物對(duì)抗。線蟲類是微小的蠕蟲樣動(dòng)物，以超過(guò)2，000種蔬菜、果實(shí)、與觀賞植物的根、葉與莖為食。一種普通的線蟲是根結(jié)線蟲，其進(jìn)食導(dǎo)致根具有特征性蟲癭。其他的以根部為食的線蟲類是胞囊型和損害型，其為更加寄主專一性。大豆胞囊線蟲(SCN)可以減少根部固氮根瘤的數(shù)量，以及會(huì)使根部對(duì)其他土壤中帶有的植物病原菌的攻擊更加敏感。由于現(xiàn)存的線蟲防治方法的毒性(與在很多情形里，弱的效力)，人們想要發(fā)展出安全與有效5的控制線蟲的替代方式。本發(fā)明涉及在生物體，特別是植物或者植物細(xì)胞中調(diào)節(jié)線蟲抗性或者耐受性的組合物以及方法。所謂“抗性”，意指線蟲在攝取本發(fā)明的多肽或者與本發(fā)明的多肽其他接觸時(shí)被殺死。所謂“耐受”，意指線蟲運(yùn)動(dòng)、進(jìn)食、繁殖或者其他功能損傷或減少。方法包括用編碼本發(fā)明殺線蟲蛋白的核苷酸序列轉(zhuǎn)化生物體。特別地，本發(fā)明的核苷酸序列用于制備具有殺線蟲活性的植物與微生物。因此，提供了轉(zhuǎn)化了的細(xì)菌、植物、植物細(xì)胞、植物組織和種子。組合物包括細(xì)菌的、真菌的、或者植物來(lái)源的殺線蟲核酸和蛋白質(zhì)。此處所述殺線蟲核酸序列編碼多酚氧化酶。多酚氧化酶據(jù)信在預(yù)防昆蟲與微生物攻擊植物中起了關(guān)鍵性的生理學(xué)作用，并且作為植物與植物產(chǎn)物對(duì)昆蟲、微生物、與壓傷的傷反應(yīng)的一(Marshall^Λ^,(2000)"EnzymaticBrowninginFruits,VegetablesandSeafoods，，F(xiàn)oodandAgriculturalOrganizationoftheUnitedNationsatwww,fao.org)。隨著水果與蔬菜成熟，因?yàn)樗鼈兊姆雍康慕档?，使得它們?duì)疾病與害蟲侵襲的易感性增加。水果與蔬菜內(nèi)源的酚氧化酶催化從它們酚的組分生產(chǎn)醌。一旦形成了，這些醌經(jīng)歷了聚合反應(yīng)，導(dǎo)致了黑色素的產(chǎn)生，所述黑色素顯示出抗菌與抗真菌的活性，以及幫助保持水果和/或植物生理學(xué)健康。然而，通過(guò)利用多酚氧化酶活性控制線蟲在以前還沒(méi)被發(fā)現(xiàn)過(guò)。在這里涉及的多酚氧化酶包括新的序列以及本領(lǐng)域已知的多酚氧化酶序列。發(fā)現(xiàn)所述序列用于構(gòu)建隨后用來(lái)轉(zhuǎn)化到目的生物體的表達(dá)載體，作為分離其他同源(或者部分同源)基因的探針，以及用于通過(guò)本領(lǐng)域公知的方法(例如結(jié)構(gòu)域交換，或者DNA改組)生產(chǎn)改變的殺線蟲蛋白質(zhì)。發(fā)現(xiàn)所述蛋白質(zhì)用于控制或者殺死線蟲害蟲群體以及用于生產(chǎn)具有殺線蟲活性的組合物。所謂“殺線蟲毒素”或者“殺線蟲蛋白質(zhì)"，意指具有抗一種或多種線蟲害蟲毒力活性的毒素，包括但不限于，如SEQIDNO:4，5，8，9，13，14，18，20，22，47，48或者49所示線蟲毒素，或者和這樣一種蛋白質(zhì)具有同源性的蛋白質(zhì)。殺線蟲蛋白質(zhì)包括從此處披露的全長(zhǎng)核酸序列推導(dǎo)出來(lái)的氨基酸序列，比全長(zhǎng)序列短的氨基酸序列，因?yàn)槭褂酶淖兊南掠螁⑹嘉稽c(diǎn)，或者由于加工(例如，蛋白水解(proteolytic)裂解，可變剪接，等等)，生產(chǎn)出具有殺線蟲活性的縮短的蛋白質(zhì)。所述加工可以在表達(dá)所述蛋白質(zhì)的生物體內(nèi)發(fā)生，或者在吞食所述蛋白質(zhì)后的害蟲體內(nèi)發(fā)生。線蟲害蟲本發(fā)明的組合物和方法用于生產(chǎn)對(duì)線蟲害蟲，尤其是植物-寄生線蟲耐受的轉(zhuǎn)基因植物。寄生植物的線蟲能在植物的所有部分棲居，包括根部、發(fā)育的花莖、葉以及莖部。植物寄生蟲根據(jù)它們的進(jìn)食習(xí)慣分成廣義類別移動(dòng)的外寄蟲、移動(dòng)的體內(nèi)寄生蟲、與定居內(nèi)寄生蟲。定居內(nèi)寄生蟲，包括根結(jié)線蟲(根結(jié)線蟲屬(Medoidogyne))與包囊線蟲(Globodera和胞囊線蟲屬(Heterodera))誘導(dǎo)進(jìn)食部位并且根內(nèi)部建立長(zhǎng)期的感染，對(duì)作■害。(Whitehead(1998)PlantNematodeControl。CABInternational,NewYork)。例舉的植物寄生線蟲包括但不限于，滑刃線蟲屬物種(Aphelenchoidesspp.)(滑刃線蟲(Foliarnematodes))，刺線蟲屬物種(belonolaimusspp.)(細(xì)刺線蟲(TheStingnematode))，豐公材線蟲(Bursaphelenchusxylophilus)(豐公才古妻線蟲(Pinewiltnematode)),輪線蟲禾中(Criconemoidesspecies)(環(huán)線蟲(RingNematode)),馬鈴薯莖線蟲(Ditylenchusdestructor)(馬鈴薯莖線蟲(PotatoRotNematode)),起絨草蓬線蟲(Ditylenchusdipsaci)(莖線蟲(Stemandbulbnematode)),馬鈴薯癌腫病菌(Globoderapallida)(尖板條馬鈴薯囊腫線蟲(PalePotatoCystNematode))，(Globoderarostochiensis)((GoldenNematode)),螺旋線蟲屬(Helicotylenchus)(螺旋線蟲(SpiralNematodes)),大豆異皮線蟲(Heteroderaglycines)(大豆胞囊線蟲(Soybeancystnematode),舌甘菜異皮線蟲(Heteroderaschachtii)(糖用甜菜囊月中線蟲(Sugarbeetcystnematode)),玉米異皮線蟲(Heteroderazeae)(玉蜀黍囊腫線蟲(TheCornCystNematode))，燕麥異皮線蟲(Heteroderaavenae)(谷類囊月中線蟲(cerealcystnematode))，紐帶線蟲屬(Hoplolaimus)(柳葉刀線蟲(TheLanceNematode))，根結(jié)線蟲屬物種(Meloidogynespp.)(lfl^n^^),Mesocriconemaxenoplax((Ringnematode)),(Nacobbusaberrans)(假根結(jié)線蟲(Falseroot-knotnematode)),paratrichodorus(粗而短的-根部線蟲(StiAby-RootNematodes))，短體線蟲屬物種(Pratylenchusspp)(損害線蟲(Lesionnematode))，相似穿孔線蟲(Radopholussimilis)(穿孔線蟲(Burrowingnematode)),腎形小盤旋線蟲(Rotylenchulusspp.)(腎狀線蟲(Reniformnematode))，矮化線蟲屬物種(Tylenchorhynchusspp.)(阻礙線蟲(Stuntnematodes))，半穿刺小墊刃線^(Tylenchulussemipenetrans)((ttftolfl^^(TheCitrusnematode)),^M^&M(Xiphinema)(短劍線蟲(TheDaggerNematode))。多酚氧化酶這里公開的殺線蟲組合物包含多酚氧化酶核酸與氨基酸序列，也包括它們的變體和片段。在各種實(shí)施方案中，組合物包含表達(dá)或者包含多酚氧化酶的轉(zhuǎn)基因植物或者殺蟲配方。所述組合物用于在對(duì)線蟲侵襲特別是植物寄生線蟲侵襲敏感的區(qū)域控制或者殺死植物寄生線蟲。為了本發(fā)明的目的，“多酚氧化酶”指一類包含銅的氧化酶，包括，例如，單酚單氧化酶，例如酪氨酸酶，聯(lián)苯酚氧化酶，例如兒茶酚氧化酶與漆酶，血藍(lán)蛋白等等。在各種實(shí)施方案中，這里涉及的多酚氧化酶是屬于3型銅蛋白質(zhì)家族。多酚氧化酶是帶有雙核銅中心的酶，在酶的活性位點(diǎn)中銅離子結(jié)合分子氧原子以使得催化。每個(gè)銅原子的氧化態(tài)影響氧結(jié)合，從而影響每一步驟中的氧化酶活性。單酚單氧化酶的情況下，+2氧化態(tài)銅離子指導(dǎo)在現(xiàn)存的酚環(huán)鄰位上加上羥基。接著聯(lián)苯酚氧化酶能結(jié)合這些聯(lián)苯酚產(chǎn)物并且氧化兩個(gè)羥基部分以產(chǎn)生相應(yīng)的醌。聯(lián)苯酚氧化酶活性通過(guò)將銅離子還原到+1態(tài)并且與分子氧原子結(jié)合來(lái)發(fā)揮。雖然有些生物體只擁有單一的多酚氧化酶活性(尤其是植物，其實(shí)施聯(lián)苯酚氧化酶步驟)，其他酶實(shí)施單氧化酶與聯(lián)苯酚氧化酶反應(yīng)。對(duì)于3型銅酶已經(jīng)解析出一些X射線結(jié)構(gòu)，并且酶中有保守的、明確的結(jié)構(gòu)基序。值得注意的是這些酶的活性位點(diǎn)，其中銅被六或七個(gè)組氨酸殘基結(jié)合，并且單一的半胱氨酸殘基高度保守。結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)還提示，大多數(shù)的多酚氧化酶對(duì)它們的底物有某些松弛的專一性，因此酶的活性位點(diǎn)在催化作用中是靈活的。這種酶似乎是幾乎普遍分布在動(dòng)物、植物、真菌與細(xì)菌中。利用cDNA序列技術(shù)已經(jīng)測(cè)出來(lái)自Streptomycesglaucescens(Huber等人，1985),抗生鏈霉菌(Streptomycesantibioticus)(Bernan等人，1985)，與粗糙鏈孢霉(Neurosporacrassa)(Lerch,1982)，番茄(Shahar等人，1992；Newman等人，1993)，蠶豆(Cary等人，1992)，馬鈴薯(Hunt等人，1993)，小鼠(Shibahara等人，1986)，以及人類(Kwon等人，1987；Giebel等人，1991)的多酚氧化酶的一級(jí)蛋白質(zhì)序列。密切相關(guān)植物例如番茄與馬鈴薯的多酚氧化酶顯示大約91%的序列同源性，而番茄與蠶豆的多酚氧化酶只顯示40%精確同源性(Wong，1995)。盡管由不同物種得來(lái)的多酚氧化酶之間序列同一性低，但是它們?nèi)吭谒鼈兊幕钚晕稽c(diǎn)有一個(gè)兩核的銅中心，其中3型銅結(jié)合組氨酸殘基，并且這個(gè)結(jié)構(gòu)是高度保守的。Marusek等人證明來(lái)自不同的植物和真菌的多酚氧化酶N-末端域許多重要的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)是保守的，包括酪氨酸基序，其被認(rèn)為是連接N-和C-末端結(jié)構(gòu)域的連接區(qū)域的開始標(biāo)志。序列比對(duì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)表明多酚氧化酶的C-末端結(jié)構(gòu)域可能在三級(jí)結(jié)構(gòu)上和血藍(lán)蛋白相像(Marusek等人Q006)JInorgBiochem.100(1):108_23，這里全文引作參考，特別是關(guān)于多酚氧化酶保守結(jié)構(gòu)特征的描述)。已經(jīng)公開了相當(dāng)數(shù)量的PPOs的氨基酸序列，從植物、真菌及其他生物體酶的克隆得到的，并且許多報(bào)告和綜述提供了這樣的對(duì)比信息，例如vanGelder等人(1997)Phytochemistry45:1309-1323；Wichersφ人U003)Appl.Microbiol.Biotechnol.61336-341;Cho等人U003)Proc.Nat.Acad.ki.USA100:10641-10646;Marusek等人(2006)JInorgBiochem.100(1):108-23；Halaouili等人(2006)J.Appl.Microbiol.100219-232；Hernandez-Romero^人(2006)FEBSJ.273:257-270；Nakamura^人(2000)Biochem.J.350:537-545；以及，Matoba等人(2006)J.Biol.Chem.281:8981_8990，這里引用的所有文獻(xiàn)以其整體引入作為參考。多酚氧化酶已經(jīng)從哺乳動(dòng)物、鳥、魚、昆蟲、爬行動(dòng)物、兩棲動(dòng)物、真菌以及細(xì)菌中分離出來(lái)。多酚氧化酶以酶原或者前體多酚氧化酶(propolyphenoloxidase)的形式存在于某些物種中，并且蛋白酶類也被認(rèn)為在前體多酚氧化酶形式的激活中涉及到。這些蛋白酶類被認(rèn)為由微生物活性誘導(dǎo)，并且還提示這些酶可以由宿主蛋白酶通過(guò)感染或者入侵事件而激活。生物體產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，例如葡聚糖，糖蛋白，昆布多糖，脂多糖等等，也可以通過(guò)蛋白酶類誘導(dǎo)前體多酚氧化酶的激活。這些代謝物甚至是在缺少蛋白質(zhì)分解活性時(shí)還能激活前體多酚氧化酶。在各種不同的植物品種中，多酚氧化酶基因在細(xì)胞核內(nèi)編碼，并且經(jīng)歷細(xì)胞質(zhì)內(nèi)翻譯。一旦形成，前體多酚氧化酶被運(yùn)輸?shù)饺~綠體，在那里經(jīng)歷蛋白裂解剪切，以生產(chǎn)活化的多酚氧化酶形式(Vaughn等人，1988，Physiol.Plant.,72:659-665)。單酚單加氧酶單酚單加氧酶(EC1.14.18.1；CASnumber:9002-10-2)催化單酚到ο-聯(lián)苯酚的羥基化作用。所述酶被認(rèn)為在動(dòng)物中是酪氨酸酶，因?yàn)長(zhǎng)-酪氨酸是主要的單酚化酶作用底物。另一方面，酪氨酸是一元羥基的酚，是重要的氨基酸。酪氨酸的羥基化作用導(dǎo)致二羥苯丙氨酸(DOPA)的形成。在植物中，所述酶有時(shí)被認(rèn)為是甲酚酶，由于其利用單酚底物甲酚的酶的能力。單酚單加氧酶又名單酚單氧化酶、多巴氧化酶、酚氧化酶、酚氧化酶Α、酚氧化酶B和酪氨酸酶。8從鏈霉菌屬得到的與稱之為“輔助蛋白質(zhì)(caddieprotein)”復(fù)合的酪氨酸酶晶體結(jié)構(gòu)描述在MatcAa等人Q006)J.Biol.Chem.281(13):8981_8990，這里引用的所有文獻(xiàn)以其整體引入作為參考。聯(lián)苯酚氧化酶聯(lián)苯酚氧化酶(EC1.10.3.1；CASnumber=9002-10-2)是催化酚例如兒茶酚氧化的酶。聯(lián)苯酚氧化酶又名兒茶酚氧化酶，多酚氧化酶，以及多酚氧化酶。聯(lián)苯酚氧化酶利用雙氧(0執(zhí)行例如兒茶酚的酚的氧化。在有兒茶酚的情況下，苯醌形成了。從兒茶酚脫去的氫與氧結(jié)合形成水。兒茶酚氧化酶是含銅的酶，其活性與酪氨酸酶——一類相關(guān)的銅氧化酶的相似。漆酶(ρ-聯(lián)苯酚氧化酶，E.C.1.10.3.2)(DPO)是一種含銅多酚氧化酶。它有獨(dú)特的氧化P-聯(lián)苯酚的能力，因而使得它與O-聯(lián)苯酚氧化酶例如兒茶酚氧化酶不同。幾種酚的酶作用底物，包括多酚，甲氧基取代酚，二胺和相當(dāng)大范圍的其他化合物充當(dāng)漆酶的酶作用底物(Thurston，1994，Microbiology,140:19-26)0漆酶存在于許多致植物病的真菌和某些高等植物中(Mayer禾口Harel,1991,Phenoloxidaseandtheirsignificanceinfruitandvegetables,InP.F.Fx,ed.FoodEnzymology,p.373.London,Elsevier)。分離的核酸分子及其變體和片段本發(fā)明一方面關(guān)于分離或者重組的核酸分子，包括編碼殺線蟲蛋白質(zhì)和多肽或者其生物學(xué)活性部分的核苷酸序列，也包括核酸分子，其足以用作識(shí)別編碼具有序列同源性區(qū)的蛋白質(zhì)的核酸分子的雜交探針。如在這里使用的，術(shù)語(yǔ)“核酸分子”意指包括DNA分子(例如，重組DNA，cDNA或者基因組DNA)和RNA分子(例如，mRNA)，以及使用核苷酸類似物產(chǎn)生的DNA或者RNA類似物。核酸分子可以是單鏈或者雙鏈，但優(yōu)選是雙鏈DNA。“分離”或者“純化”的核酸分子或者蛋白質(zhì)，或者其生物學(xué)活性部分，當(dāng)由重組技術(shù)生產(chǎn)出來(lái)時(shí)，是基本上不含其他的細(xì)胞材料或者培養(yǎng)基的；或者當(dāng)化學(xué)合成時(shí)，基本上沒(méi)有無(wú)前體化合物或者其他的化學(xué)品。優(yōu)選的是，“分離”核酸不含在該核酸來(lái)源的生物體基因組DNA中天然地位于核酸側(cè)翼(S卩，位于核酸5'和3'端的序列)的序列(優(yōu)選蛋白質(zhì)的編碼序列)。為了本發(fā)明的目的，當(dāng)用來(lái)指核酸分子時(shí)，“分離的”則不包括分離的染色體。例如，在各種不同的實(shí)施方案中，編碼殺線蟲蛋白質(zhì)的分離的核酸分子能包含少于大約51Λ，41Λ，3kb,2kb,lkb,0.5kb或者0.Ikb的在該核酸來(lái)源的細(xì)胞基因組DNA中天然位于核酸分子側(cè)翼的核苷酸序列?；旧蠜](méi)有細(xì)胞材料的殺線蟲蛋白質(zhì)包括有少于大約30%、20%、10%或5%(干重)非-殺線蟲蛋白質(zhì)(此處也稱為“污染蛋白質(zhì)”)的蛋白質(zhì)制劑。編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的核苷酸序列包括SEQIDNO:1，2，3，6，7，10，11，12，15，16，17，19，21，45或46所示的序列，以及它們的變體，片段以及互補(bǔ)序列。所謂“互補(bǔ)序列”意指與給定的核苷酸序列充分互補(bǔ)使得它可以和給定的核苷酸序列雜交形成一種穩(wěn)固的雙螺旋的核苷酸序列。這種核苷酸序列編碼的殺線蟲蛋白質(zhì)相應(yīng)的氨基酸序列如SEQIDN04,5,8,9,13，14，18，20，22，47，48或49所示。本發(fā)明也包括編碼殺線蟲蛋白質(zhì)的這些核苷酸序列片段的核酸分子。所謂“片段”，意指編碼殺線蟲蛋白質(zhì)的核苷酸序列的一部分。核苷酸序列的片段可以編碼殺線蟲蛋白質(zhì)的生物學(xué)活性部分，或者其可以是通過(guò)下文披露的方法能用作雜交探針或者PCR引物的片段。編碼殺線蟲蛋白質(zhì)的核苷酸序列片段的核酸分子包含大約至少50、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1350、1400個(gè)連續(xù)的核苷酸，或者根據(jù)需要高達(dá)此處披露的編碼殺線蟲蛋白質(zhì)的全長(zhǎng)核苷酸序列中存在的核苷酸數(shù)目。所謂“連續(xù)”的核苷酸，意指彼此直接相連的核苷酸殘基。本發(fā)明的核苷酸序列的片段編碼仍然保留殺線蟲蛋白質(zhì)生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)片段，因此，保留殺線蟲以及多酚氧化酶活性。所謂“保留活性”，意指片段具有至少大約30%、至少大約50%、至少大約70^^80^^90^^95%或者更高的參考蛋白質(zhì)的殺線蟲和/或多酚氧化酶活性。檢測(cè)線蟲抗性或者殺線蟲活性的方法描述在，例如，美國(guó)專利發(fā)明者B·卡爾,博格B·范迪,C·L·彼得斯,C·普特雷,J·T·多姆,K·S·桑普森,S·沃爾拉斯,T·卡恩,V·貝林松申請(qǐng)人:阿森尼克斯公司