本發(fā)明涉及一類新型的組蛋白去甲基化酶JMJD3抑制劑及其制備方法和用途；本發(fā)明還涉及此類化合物在制備用于治療由組蛋白去甲基化酶JMJD3介導的疾病的藥物中的應用，具體涉及在制備治療腫瘤、炎癥以及自身免疫等疾病藥物中的應用。

背景技術：

表觀遺傳學是20世紀80年代逐漸興起的一門學科，是在研究與經(jīng)典孟德爾遺傳學遺傳法則不相符的許多生命現(xiàn)象過程中逐步發(fā)展起來的。表觀遺傳學由C.H.Waddington于1942年作為一個后生論和遺傳學的合詞而提出。表觀遺傳學又稱“擬遺傳學”、“表遺傳學”、“外遺傳學”以及“后遺傳學”(英文epigenetics)。在生物學和特定的遺傳學領域，研究的是在不改變DNA序列的前提下，某些機制所引起的可遺傳的基因表達或細胞表現(xiàn)型的變化。表觀遺傳學主要研究內(nèi)容大致包括兩方面：一類為基因選擇性轉錄表達的調(diào)控，有DNA甲基化，基因印記，組蛋白共價修飾，染色質(zhì)重塑；另一類為基因轉錄后的調(diào)控，包含基因組中非編碼的RNA，微小RNA，反義RNA，內(nèi)含子及核糖開關等。

染色質(zhì)的基本單位是核小體，核小體是由DNA與組蛋白構成，組蛋白有五種類型：H1、H2A、H2B、H3、H4。染色質(zhì)結構狀態(tài)能影響基因表達，當組蛋白把DNA圍繞成壓縮狀態(tài)DNA不能轉錄，當組蛋白與DNA形成疏松狀態(tài)DNA能轉錄，組蛋白和DNA進行表觀修飾可改變?nèi)旧|(zhì)結構狀態(tài)從而導致導致基因激活或沉默。

組蛋白H3和H4的氨基末端露在外面，可以進行共價修飾，如乙?；c去乙?；?、磷酸化與去磷酸化、甲基化與去甲基化等。組蛋白甲基化調(diào)控著重要的細胞過程，比如DNA修復、細胞周期進程、細胞分化和基因表達。組蛋白甲基化是一個可逆過程，是由組蛋白甲基轉移酶(HMTs)和組蛋白去甲基化酶共同參與形成和維持不同的組蛋白甲基化狀態(tài)。組蛋白去甲基化酶主要有賴氨酸特定的去甲基化酶1(LSD1)和Jumonji C(JmjC)家族兩類。LSD1可以去除單、雙 甲基化，JmjC家族可以去除三甲基化等。賴氨酸三甲基化的去除，可以相應的影響端粒的長度，是作為表觀遺傳修飾的重要途徑，可能調(diào)控機體增殖，衰老，腫瘤發(fā)生等重要生物學過程。

JmjC家族屬于最大的賴氨酸去甲基化酶(KDM)家族，人體內(nèi)大約有20種，可分為五個亞型包括KDM2/7，KDM3，KDM4(JMJD2)，KDM5，KDM6(JMJD3和UTX)，JmjC家族是Fe²⁺和α-酮戊二酸依賴的氧化酶，依賴這些共因子去除賴氨酸上的甲基化，JmjC去甲基化酶家族在多種類型的腫瘤中過表達，如JMJD2在乳腺癌中過表達，JMJD3在肺癌、肝癌和多種血液系統(tǒng)惡性腫瘤等癌癥中過表達，JMJD3在患有ANCA相關血管炎的嗜中性粒細胞和初級霍奇金淋巴瘤中也過表達。JmjC家族的UTX和JMJD3可以催化而移去H3K27位置的賴氨酸的甲基，UTX和JMJD3通過激活HOX基因而參與細胞分化和多能細胞抑制過程。其中UTX調(diào)節(jié)了RB依賴的細胞命運控制，而JMJD3通過激活INK4b-ARF-INK4a位點而參與了癌基因誘導的衰老。這些為我們后續(xù)的抑制劑研究帶來更好的機遇。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個目的在于提供一類結構新穎的組蛋白去甲基化酶JMJD3抑制劑，即由通式(I)表示的化合物，其立體異構體、可藥用鹽、前藥、溶劑化物、水合物、酯和晶型，其可用于治療、預防和抑制由組蛋白去甲基化酶JMJD3介導的相關疾??；

本發(fā)明的另一目的在于提供一種制備通式(I)表示的化合物的方法；

本發(fā)明的還一目的在于提供一種含有由通式(I)表示的化合物、其立體異構體、可藥用鹽、前藥、溶劑化物、水合物、酯或晶型的藥物組合物；

本發(fā)明的又一目的在于提供所述的由通式(I)表示的化合物、其立體異構體、可藥用鹽、前藥、溶劑化物、水合物、酯或晶型的用途；所述的由通式(I)表示的化合物、其立體異構體、可藥用鹽、前藥、溶劑化物、水合物、酯或晶型為作用于組蛋白去甲基化酶的選擇性抑制劑，其能對組蛋白去甲基化酶的去甲基化作用進行抑制，特別是對JMJD3的去甲基化作用進行抑制從而產(chǎn)生生物活性。

本發(fā)明的再一目的在于提供了由通式(I)表示的化合物、其立體異構體、可藥用鹽、前藥、溶劑化物、水合物、酯或晶型用于制備治療腫瘤、炎癥以及自身免 疫等疾病的藥物的用途。

本發(fā)明提供一類具有如下結構通式(I)表示的化合物，及其立體異構體、可藥用鹽、前藥、溶劑化物、水合物、酯和晶型。

其中：

當Y為N，X為C時，

R³為

R¹可為

R²可以為5-6元芳香環(huán)或者雜芳香環(huán)，雜芳香環(huán)中包含一個或者多個雜原子，雜原子獨立的選自N、O或者S，且雜原子與嘧啶環(huán)(即X、Y所在的六元環(huán))相連，其中芳香環(huán)或者雜芳香環(huán)有一個或者多個取代基，取代基獨立的選自：氫、鹵素、羥基、C1-C3直鏈或支鏈烷基或C1-C3直鏈或支鏈烷氧基取代基；

或者R²為NR^aR^b，其中R^a和R^b彼此相同或不同，并各自獨立地選自：4-7元脂肪環(huán)、芳香環(huán)稠合的4-7元脂肪環(huán)、C1-C5直鏈或支鏈烷基、C1-C3直鏈或支鏈烷氧基、雜芳香環(huán)連接的C1-C3烷基；

或者，NR^aR^b形成5-8元雜脂肪環(huán)、芳香環(huán)或雜芳香環(huán)稠合或偶聯(lián)或橋連的5-8元雜脂肪環(huán)(其中雜脂肪環(huán)和雜芳香環(huán)中各自獨立的包含一個或者多個雜原子，所述雜原子選自N、O或者S)，上述雜脂肪環(huán)或芳香環(huán)或雜芳香環(huán)還可以有一個或者多個取代基，取代基獨立選自：鹵素、羥基、乙酰基、二甲氨基、C1-C3直鏈或支鏈烷基或C1-C3直鏈或支鏈烷氧基；

或者，當X為N，Y為C時，

R³可以為下面的環(huán)系：

R¹可為

R²可以為5-6元芳香環(huán)或者雜芳香環(huán)，雜芳香環(huán)中包含一個或者多個雜原子，雜原子獨立的選自N、O或者S，且雜原子與嘧啶環(huán)(即X、Y所在的六元環(huán))相連，其中芳香環(huán)或者雜芳香環(huán)有一個或者多個取代基，取代基獨立的選自：氫、鹵素、羥基、C1-C3直鏈或支鏈烷基或C1-C3直鏈或支鏈烷氧基取代基；

或者R²為NR^aR^b，其中R^a和R^b彼此相同或不同，并各自獨立地選自：4-7元脂肪環(huán)、芳香環(huán)稠合的4-7元脂肪環(huán)、C1-C5直鏈或支鏈烷基、C1-C3直鏈或支鏈烷氧基、雜芳香環(huán)連接的C1-C3烷基；

或者，NR^aR^b形成5-8元雜脂肪環(huán)、芳香環(huán)或雜芳香環(huán)稠合或偶聯(lián)或橋連的5-8元雜脂肪環(huán)(其中雜脂肪環(huán)和雜芳香環(huán)中各自獨立的包含一個或者多個雜原子，所述雜原子選自N、O或者S)，上述雜脂肪環(huán)或芳香環(huán)或雜芳香環(huán)還可以有一個或者多個取代基，取代基獨立選自：鹵素、羥基、乙酰基、二甲氨基、C1-C3直鏈或支鏈烷基或C1-C3直鏈或支鏈烷氧基；

優(yōu)選地：

當Y為N，X為C時，

R³為

R¹為

R²為

或者，當X為N，Y為C時，

R³可以為下面的環(huán)系：

R¹可以為

R²可以為

最優(yōu)選地，所述結構通式(I)表示的化合物選自下列化合物：

所述結構通式(I)表示的化合物的酯是指所述化合物的羧酸采用前藥策略所制備的酯，如甲酯、乙酯等。有文獻(Nature 488,404–408，doi:10.1038/nature11262)表明化合物成酯后可以產(chǎn)生明顯的細胞效應，如文章中的GSK-J1與GSK-J4。我們也進行了實驗測試，數(shù)據(jù)表明(見后文的表2，表3)制備成酯后可以進入細胞，發(fā)揮其生物功能。

通式(I)所示的化合物可以含有不對稱或手性中心，因此可以以不同立體異構體形式存在。本發(fā)明化合物的所有立體異構體形式，包括但不限于非對映異構體、對映異構體和阻轉異構體以及它們的混合物(如外消旋混合物)，均包括在本發(fā)明的范圍內(nèi)。

通式(I)所示的化合物還可以以不同互變異構形式存在，所有這些形式均包括 在本發(fā)明范圍內(nèi)。術語“互變異構體”或“互變異構形式”是指經(jīng)由低能壘相互轉化的不同能量的結構異構體。

通式(I)所示的化合物可以以非溶劑化形式和含有藥學上可接受的溶劑(如水、乙醇等)的溶劑化形式存在，本發(fā)明的化合物包括溶劑化和非溶劑化形式。

通式(I)所示的化合物具有堿性基團，因此可與無機酸或有機酸形成藥學上可接受的鹽(即可藥用鹽)，包括可藥用酸加成鹽，通過用無機酸或有機酸處理通式(I)所示的化合物的游離堿，可以得到藥學上可接受的鹽，所述的無機酸如鹽酸、氫溴酸、磷酸和硫酸，所述的有機酸如抗壞血酸、煙酸、檸檬酸、酒石酸、乳酸、馬來酸、丙二酸、富馬酸、草酸、蘋果酸、乙醇酸、琥珀酸、丙酸、乙酸、甲磺酸、三氟甲磺酸、苯磺酸、對甲苯磺酸等。

為了說明之用，下列所示的反應路線提供用于合成本發(fā)明的化合物以及關鍵中間產(chǎn)物的可能途徑。有關個別反應步驟的更詳細的說明，請見后述的實施例部分。本發(fā)明通式(I)所示的化合物可以通過包括化學領域眾所周知的那些方法來合成，尤其根據(jù)本發(fā)明的說明來合成。原料一般可以從商業(yè)來源如西格瑪奧德里奇公司獲得，或者使用本領域技術人員熟知的方法容易地制備。

在反應路線中的化合物包括其鹽，例如，如具有通式(I)的化合物定義的鹽類等，即用有機酸或無機酸處理化合物的游離堿的形式，得到相應化合物的鹽。

本發(fā)明提供的通式(I)表示的化合物的制備方法，可以通過下述反應路線進行制備。

反應路線一：

步驟a：化合物1A與金屬鈉、氯化銨得到中間體，中間體與丙二酸二乙酯、 金屬鈉反應得到化合物1B；

步驟b：化合物1B與三氯氧磷，五氯化磷反應得到化合物1C；

步驟c：化合物1C與3-氨基丙腈通過親核取代反應得到化合物1D；

步驟d：化合物1D與2,3,4,5-四氫-1H-苯并[D]氮雜卓通過親核取代反應得到通式化合物1E；

步驟e：化合物1E與疊氮化鈉反應得到化合物1F，即化合物1E中的氰基通過與疊氮化鈉反應變?yōu)樗牡?5-基。

反應路線二：

步驟a：化合物2A與碳酸二乙酯、氫化鈉反應得到化合物2B；

步驟b：化合物2B與硫脲、碳酸鉀反應得到化合物2C；

步驟c：化合物2C與2-氯乙酸、水、濃鹽酸反應得到化合物2D；

步驟d：化合物2D與三氯氧磷，五氯化磷反應得到化合物2E；

步驟e：化合物2E與NH₂CH₂CH₂R⁴通過親核取代反應得到化合物2F；

步驟f：化合物2F與R²–H通過親核取代反應得到化合物2G；

步驟g：化合物2G通過水解等不同的反應得到化合物2H，即分別得到化合物2-化合物22。

在步驟e中，化合物2E通過與NH₂CH₂CH₂R⁴相應的胺反應分別得到兩種產(chǎn) 物(即化合物2F與可通過NOE(核磁歐沃豪斯效應)來區(qū)分這兩種產(chǎn)物。

反應路線三：

步驟a：化合物3A與R³–H反應得到化合物3B；

步驟b：化合物3B與NH₂CH₂CH₂R⁴通過親核取代反應得到化合物3C；

步驟c：化合物3C與R²–H通過親核取代反應得到化合物3D；

步驟d：化合物3D通過水解等不同的反應得到化合物3E，即分別得到化合物23-化合物50。

其中，在步驟a中，當R³為三氮唑時，與2,4,6-三氯嘧啶反應得到兩種產(chǎn)物，即通過NOE來區(qū)分這兩種產(chǎn)物；當R³為吲唑時，與2,4,6-三氯嘧啶反應也得到兩種產(chǎn)物，即通過NOE來區(qū)分這兩種產(chǎn)物；

其中，R⁴可以為氰基、羧酸甲酯基或羧酸乙酯基，R¹、R²和R³如前述定義。

初步研究表明，以下的疾病、病癥和/或障礙由組蛋白去甲基化酶JMJD3抑制劑所介導：肺癌、肝癌、初級霍奇金淋巴瘤、一些血液學惡性腫瘤、炎癥以及自免疫疾病。

因此，本發(fā)明通式(I)表示的化合物、其立體異構體、可藥用鹽、前藥、溶劑化物、水合物、酯和晶型適用治療由組蛋白去甲基化酶JMJD3抑制劑所介導的疾病、病況及/或機能失調(diào)。

本發(fā)明的另一實施方案是提供一種藥物組合物，其包括治療有效量的通式(I)表示的化合物、其立體異構體、其可藥用鹽、前藥、溶劑化物、水合物、酯和晶型中的一種或多種，以及至少一種賦形劑、稀釋劑或載劑。

進一步地，本發(fā)明通式(I)表示的化合物、其立體異構體、可藥用鹽、前藥、溶劑化物、水合物、酯或晶型可用于單一治療或聯(lián)合治療中。當用于聯(lián)合治療中時，本發(fā)明通式(I)表示的化合物、其立體異構體、可藥用鹽、前藥、溶劑化物、水合物、酯和晶型通常與基于小分子化合物、輻射、抗體的療法(例如赫塞汀和利妥希瑪)抗癌接種、基因療法、細胞療法、激素療法或細胞因子療法一起使用。

典型的配方是通過混合本發(fā)明的通式(I)表示的化合物及載劑、稀釋劑或賦形劑而制備之。適宜的載劑、稀釋劑或賦形劑是本領域技術人員所熟知的，包括諸如碳水化合物、蠟、水溶性及/或可膨脹性聚合物、親水性或疏水性物質(zhì)、明膠、油、溶劑、水等的物質(zhì)。所用的特定載劑、稀釋劑或賦形劑，將依施用本發(fā)明的化合物的方式與目的而定。一般以本領域技術人員認為可安全(GRAS)地投藥至一哺乳類動物的溶劑為基礎，而選擇溶劑。一般而言，安全的溶劑是無毒性含水溶劑諸如水，以及其他可溶于水或與水混溶的無毒性溶劑。適宜的含水溶劑包括水、乙醇、丙二醇、聚乙二醇(如PEG400、PEG300)等中的一種或多種的混合物。該配方也可包括一種或多種緩沖劑、安定劑、表面活性劑、潤濕劑、潤滑劑、乳化劑、懸浮劑、防腐劑、抗氧化劑、遮光劑、助流劑、加工助劑、著色劑、增甜劑、香料劑、調(diào)味劑或其他已知的添加劑，以提供該藥物之一優(yōu)美的呈現(xiàn)形式(亦即本發(fā)明的化合物或其藥學組合物)，或協(xié)助該藥學產(chǎn)物(亦即藥物)之制造。

該配方可使用常規(guī)的溶解混合程序而制備。例如，在上述的一種或多種賦形劑的之存在下，將塊狀的藥物物質(zhì)(亦即本發(fā)明的通式(I)表示的化合物或該化合物的穩(wěn)定化形式(如與一環(huán)糊精衍生物或其他已知的復合劑的絡合物)溶于一適 宜溶劑中。典型地將本發(fā)明的通式(I)表示的化合物配制成藥學劑型，以提供該藥物的容易控制的劑量，及提供患者一種容易處理的產(chǎn)物。

依據(jù)本發(fā)明的方法，本發(fā)明的一種化合物或本發(fā)明的一種化合物與至少一種其他藥劑的組合(在此稱作“組合”)，優(yōu)選是以藥學組合物的形式投藥。因此，本發(fā)明的化合物或組合能以任一已知的口服、直腸、透皮、胃腸外(例如靜脈內(nèi)、肌內(nèi)或皮下)腦池內(nèi)、陰道內(nèi)、腹膜內(nèi)、膀胱內(nèi)、局部(例如粉末、油膏或液滴)、頰或鼻劑型，而分開或一起投藥至一病患。

適用于非經(jīng)腸注射的組合物，一般包括藥學上可接受的無菌含水或非水溶液、分散液、懸浮液或乳化液，及用于重組成為無菌的可注射性溶液或分散液的無菌粉末。適宜的含水或非水載劑或稀釋劑(包括溶劑與載體)，包括水、乙醇、多元醇(丙二醇、聚乙二醇、甘油等)中的一種或多種的混合物；植物油(諸如橄欖油)；及可注射性有機酯諸如油酸乙酯。例如可通過使用一涂層諸如卵磷脂，在分散液的情況下，維持所需的顆粒尺寸，或通過使用表面活性劑，維持適宜的流動性。

這些組成物亦可含有賦形劑，諸如防腐劑、潤濕劑、乳化劑及分散劑。可通過各種的殺細菌劑與殺真菌劑，例如對羥苯甲酸酯、氯丁醇、苯酚、山梨酸等，而避免微生物污染該組合物。這些組成物亦可包括等滲壓劑諸如糖類、氯化鈉等。還可通過使用能延遲吸收的藥劑，諸如單硬脂酸鋁與明膠，而延長可注射式藥學組合物之吸收。

用于口服投藥的固態(tài)劑型可包括膠囊、片劑、粉末及顆粒。在固態(tài)劑型中，本發(fā)明的化合物或組合是與至少一種惰性賦形劑、稀釋劑或載劑混合。適宜的賦形劑、稀釋劑或載劑包括諸如檸檬酸鈉或磷酸二鈣的物質(zhì)，或(a)填料或增量劑(如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、硅酸等)；(b)粘合劑(如羧甲基纖維素、褐藻酸鹽、明膠、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖、阿拉伯膠等)；(c)濕潤劑(如甘油等)；(d)崩解劑(如瓊脂、碳酸鈣、馬鈴薯或木薯淀粉、褐藻酸、特定的絡合硅酸鹽、碳酸鈉等)；(e)溶液阻滯劑(如石蠟等)；(f)加速吸收劑(如季銨化合物等)；(g)潤濕劑(如乙酰基醇、單硬脂酸甘油酯等)；(h)吸附劑(如高嶺土、膨潤土等)；及/或i)潤滑劑(如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂、固態(tài)聚乙二醇、月桂基硫酸鈉等)。在膠囊與 片劑的情況下，該劑型亦可包括緩沖劑。類似類型的固態(tài)組合物亦可作為軟式與硬式填充明膠膠囊中的填料，其使用乳糖以及高分子量聚乙二醇等作為賦形劑。

用于口服投藥的液態(tài)劑型包括藥學上可接受的乳化液、溶液、懸浮液、糖漿液與酏劑。除了本發(fā)明的化合物或其組合物之外，該液態(tài)劑型可含有本領域中常用的惰性稀釋劑，諸如水或其他溶劑；增溶劑及乳化劑諸如乙醇、異丙基醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、芐醇、苯甲酸芐基酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺；油類(如棉籽油、落花生油、玉米胚芽油、橄欖油、蓖麻油、芝麻油等)；甘油；四氫糠基醇；聚乙二醇與脫水山梨糖醇的脂肪酸酯；或這些物質(zhì)中的幾種的混合物等。

除了這些惰性稀釋劑之外，該組合物也可包括賦形劑，諸如潤濕劑、乳化劑、懸浮劑、增甜劑、調(diào)味劑與香料劑中的一種或多種。

就懸浮液而言，除了本發(fā)明的化合物或組合之外，可進一步含有載劑諸如懸浮劑，如乙氧基化異硬脂醇、聚氧乙烯山梨醣醇、脫水山梨醣醇酯、微晶纖維素、偏氫氧化鋁、膨潤土、瓊脂及黃耆膠，或這些物質(zhì)中幾種的混合物等。

用于直腸或陰道投藥之組合物優(yōu)選包括栓劑，可通過將本發(fā)明的化合物或組合與適宜的非刺激性賦形劑或載劑混合而制備，賦形劑或載劑諸如可可豆脂、聚乙二醇或栓劑蠟，其在一般室溫為固態(tài)而在體溫為液態(tài)，及因此可在直腸或陰道中熔化而釋出活性化合物。

本發(fā)明化合物和本發(fā)明化合物與血液性癌癥或者炎癥藥物的組合用于局部投藥之劑型，可包括油膏、粉末、噴劑及吸入劑。該藥物可在無菌條件下與藥學上可接受的賦形劑、稀釋劑或載劑以及所需要的任一防腐劑、緩沖劑或推進劑混合。眼用配方、眼用油膏、粉末與溶液，亦意欲涵蓋于本發(fā)明的范圍內(nèi)。

已知地，本發(fā)明的化合物(或組合物)可置入飲水中，借此隨同每日的飲水供應而攝入治療劑量的該化合物。該化合物可直接計量置入飲水中，優(yōu)選以液態(tài)水溶性濃縮物(諸如水溶性鹽的水溶液)的形式。

可通過將藥物分散于一種藥學上可接受的油諸如花生油、芝麻油、玉米油等中，而制備糊狀配方。

可通過將本發(fā)明的一種化合物或組合物與一種稀釋劑諸如碳蠟、棕櫚蠟等混合，而制備含有有效量的本發(fā)明的一種化合物、藥學組合物或組合的丸劑；亦可添加一種潤滑劑諸如硬脂酸鎂或硬脂酸鈣，以增進制丸制程。

本發(fā)明的又一目的在于提供所述的由通式(I)表示的化合物、其立體異構體、可藥用鹽、前藥、溶劑化物、水合物、酯或晶型作為組蛋白去甲基化酶的選擇性抑制劑的用途，以及在制備治療由組蛋白去甲基化酶JMJD3介導的相關疾病的藥物中的用途。由組蛋白去甲基化酶JMJD3介導的相關疾病包括但不限于肺癌、肝癌、初級霍奇金淋巴瘤、血液學惡性腫瘤、炎癥以及自身免疫等疾病。

本發(fā)明的再一目的在于提供了由通式(I)表示的化合物、其立體異構體、可藥用鹽、前藥、溶劑化物、水合物、酯或晶型用于制備治療肺癌、肝癌、初級霍奇金淋巴瘤、血液學惡性腫瘤、炎癥以及自身免疫等疾病的藥物的用途。

本發(fā)明也涵蓋經(jīng)同位素標記的本發(fā)明化合物，除了一個或多個原子是被原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)不同于自然中常見的原子質(zhì)量或質(zhì)量數(shù)之一原子所置換的事實之外，其是與此述者相同?？杉{入本發(fā)明的化合物中的同位素實例，包括氫、碳、氮、氧、磷、硫、氟、碘及氯之同位素，其分別諸如：²氫、³氫、¹¹碳、¹³碳、 ¹⁴碳、¹³氮、¹⁵氮、¹⁵氧、¹⁷氧、¹⁸氧、³¹磷、³²磷、³⁵硫、¹⁸氟、¹²³碘、¹²⁵碘及 ³⁶氯。

某些同位素標記的本發(fā)明的化合物(例如用³H和¹⁴C標記的那些)用于化合物和/或底物組織分布試驗。特別優(yōu)選氚化(即³H)和碳-14(即¹⁴C)同位素，因為它們?nèi)菀字苽浜蜋z測。而且，較重的同位素如氘(即²H)進行取代可以提供由較大的代謝穩(wěn)定性導致的某些治療優(yōu)點(例如體內(nèi)半衰期增加或劑量需求減小)，因而在某些情況下可能是優(yōu)選的。正電子發(fā)射同位素，例如¹⁵O、¹³N、¹¹C和¹⁸F用于正電子發(fā)射體層攝影術(PET)研究，以檢查底物受體占用率。同位素標記的本發(fā)明的化合物一般可以遵循類似于在方案和/或下文實施例中所公開的方法，通過用同位素標記的試劑替代非同位素標記的試劑來制備。

具體實施方式

不需進一步詳細說明，認為本領域熟練技術人員借助前面的描述，可以最大程度地利用本發(fā)明。因此，下面提供的實施例僅僅是進一步闡明本發(fā)明而己，并不意味著以任何方式限制本發(fā)明范圍。

原料可以從商業(yè)途徑獲得，或者通過本領域已知的方法制備，或根據(jù)本文所 述方法制備。

化合物的結構通過核磁共振(¹H-NMR)和/或質(zhì)譜(MS)來確定。NMR測定是用Varian公司的Mercury-400型核磁共振儀，測定溶劑為氘代氯仿(CDCl₃)、氘代甲醇(CD₃OD)、氘代二甲亞砜(DMSO-d₆)或氘代乙腈(CD₃CN)，TMS為內(nèi)標。MS的測定用Thermo Finnigan LCQ-Deca XP型(ESI)液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀。柱層析分離純化產(chǎn)物使用的是ISCORf 75快速制備色譜儀，載體采用青島海洋化工廠的200-300目硅膠。微波加熱使用的是Biotage Initiator微波合成儀。

制備實施例：

實施例1

合成路線：

試劑與條件：a)1.金屬鈉，氯化銨，甲醇，室溫16小時然后70℃回流3小時；2.丙二酸二乙酯，金屬鈉，乙醇，70℃反應4小時；b)三氯氧磷，五氯化磷，106℃回流16小時；c)3-氨基丙腈，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，二氧六環(huán)，80℃反應4小時；d)2,3,4,5-四氫-1H-苯并[D]氮雜卓，N,N-二異丙基乙胺 (DIPEA)，異丙醇，160℃反應1小時；e)疊氮化鈉，氯化銨，N,N-二甲基甲酰胺(DMF)，100℃反應24小時。

a)2-氰基吡啶(1g,9.62mmol)溶于20mL無水甲醇中，然后向其緩慢加入甲醇鈉溶液(0.42g,1.92mmol,25％-30％w/w甲醇)，室溫攪拌1.5小時左右，在室溫中依次加入氯化銨(0.77g,14.41mmol)，丙二酸二乙酯(7.32mL,47.80mmol)，甲醇鈉(4.15g,76.89mmol)，回流8.5小時后再加入丙酸二乙酯(7.32mL,47.80mmol)，甲醇鈉(4.15g,76.89mmol)，再回流16小時，冷卻至室溫蒸干溶劑，加入80mL乙醇打漿10分鐘，過濾，用乙醇(40mL*3)洗滌，得到化合物B 1.73g，為淺黃色固體，收率為95％。MS(ESI):m/z 190.13[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.63(s,2H),8.75(d,J＝4.8Hz,1H),8.25(d,J＝7.9Hz,1H),8.07(td,J＝7.8,1.6Hz,1H),7.66(dd,J＝7.4,4.8Hz,1H),5.40(s,1H).

b)向25mL圓底燒瓶中依次加入化合物B(1g,5.29mmol)，三氯氧磷(4.82mL,52.9mmol)和五氯化磷(1.10g,5.29mmol)，然后106℃回流過夜，蒸干溶劑，用飽和碳酸氫鈉調(diào)pH到7～8，用乙酸乙酯(40mL*2)萃取，合并有機層，依次用水80mL、飽和食鹽水80mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝8:1)洗脫，得到化合物C 0.96g，為白色固體，收率80％。MS(ESI):m/z 226.19[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.70(d,J＝4.0Hz,1H),8.30(t,J＝10.7Hz,1H),7.71(t,J＝7.3Hz,1H),7.29(dd,J＝7.1,5.0Hz,1H),7.26(s,1H).

c)化合物C(0.83g,3.67mmol)溶于5mL二氧六環(huán)中，依次加入3-氨基丙腈(0.33mL,4.41mmol)和N,N-二異丙基乙胺(0.13mL,7.34mmol)，80℃反應4小時，冷卻至室溫，用乙酸乙酯(40mL*2)萃取，合并有機層，依次用水80mL、飽和食鹽水80mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝2:1)洗脫，得到化合物D 0.29g，為白色固體，收率30％。MS(ESI):m/z 260.17[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.86–8.74(m,1H),8.39(d,J＝7.9Hz,1H),7.84(td,J＝7.8,1.8Hz,1H),7.40(ddd,J＝7.5,4.8,1.1Hz,1H),6.46(s,1H),5.91(s,1H),3.84(d,J＝6.2Hz,2H),2.80(t,J＝6.4Hz,2H).

d)化合物D(0.09g,0.35mmol)溶于2mL異丙醇中，依次加入2,3,4,5-四 氫-1H-苯并[D]氮雜卓(0.10g,0.69mmol)和N,N-二異丙基乙胺(0.12mL,0.69mmol)，微波160℃反應1小時，冷卻至室溫，加硅膠蒸干通過快速硅膠柱色譜純化使用二氯甲烷/甲醇(V/V＝15:1)洗脫，得到化合物E 0.10g，為白色固體，收率80％。MS(ESI):m/z 371.35[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.68(d,J＝4.7Hz,1H),8.26(d,J＝7.9Hz,1H),7.89(t,J＝7.8Hz,1H),7.48–7.41(m,1H),7.19–7.15(m,2H),7.13–7.10(m,2H),5.79(s,1H),3.83(s,4H),3.60(d,J＝6.0Hz,2H),2.94(d,J＝8.3Hz,4H),2.83(t,J＝6.4Hz,2H).

e)化合物E(0.05g,0.13mmol)溶于2mL無水DMF中，依次加入氯化銨(0.03g,0.51mmol)和疊氮化鈉(0.03g,0.51mmol)，110℃過夜，冷卻至室溫，用乙酸乙酯(20mL*2)萃取，合并有機層，依次用水40mL、飽和食鹽水40mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用二氯甲烷/甲醇(V/V＝8:1)洗脫，得到化合物F 0.05g，為白色固體，收率80％。MS(ESI):m/z 414.24[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CD₃OD)δ8.77(d,J＝4.3Hz,1H),8.53(d,J＝7.8Hz,1H),8.10(t,J＝7.1Hz,1H),7.72–7.64(m,1H),7.20–7.16(m,2H),7.15–7.10(m,2H),5.88(s,1H),4.03(s,4H),3.87(t,J＝6.6Hz,2H),3.11–3.05(m,4H),2.65(s,2H).

制備實施例：

實施例2

試劑與條件：a)碳酸二乙酯，氫化鈉，室溫1小時，90℃反應4小時；b)硫脲，碳酸鉀，水，105℃反應4小時；c)2-氯乙酸，水，105℃回流過夜，濃鹽酸，回流12小時；d)三氯氧磷，五氯化磷，106℃回流16小時；e)beta-丙氨酸乙酯鹽酸鹽，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，二氧六環(huán)，80℃反應4小時；f)2,3,4,5-四氫-1H-苯并[D]氮雜卓，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，異丙醇，160℃反應1小時；g)氫氧化鋰，四氫呋喃(THF)，水，室溫過夜。

a)氫化鈉(0.46g,19.0mmol)在0℃條件下溶于碳酸二乙酯(19.0mL,157.6mmol)，向其中緩慢滴加2-乙?；邕?1g,0.13mmol)，室溫1小時，90℃反應4小時，冷卻至室溫，加入5mL醋酸，蒸干溶劑，用乙酸乙酯(40mL*2)萃取，合并有機層，依次用水80mL、飽和食鹽水80mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝8:1)洗脫，得到化合物B 1.41g，為棕紅色液體，收率90％。MS(ESI):m/z 199.97[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.97(d,J＝2.9Hz,1H),7.71(d,J＝3.0Hz,1H),4.16(q,J＝7.1Hz,2H),4.11(s,2H),1.20(t,J＝7.1Hz,3H).

b)硫脲(0.44g,5.75mmol)在70℃溶于20mL水中，向其中加入化合物B(1.16g,5.82mmol)和碳酸鉀(0.79g,5.71mmol)，105℃反應4小時，冷卻至室溫，過濾，用水(20mL*3)洗滌，固體干燥，得到化合物C 0.57g，為棕褐色固體，收率70％。MS(ESI):m/z 210.01[M+H]^-；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.67(s,1H),12.19(s,1H),8.12(s,2H),6.44(d,J＝1.8Hz,1H).

c)化合物C(0.5g,2.37mmol)溶于10mL水中，加入2-氯乙酸(0.45g,4.74mmol)，105℃回流過夜，然后加入濃鹽酸2mL，回流12小時，冷卻至室溫，過濾，用水(10mL*3)洗滌，固體干燥，得到化合物D 0.28g，為淺黃色固體，收率60％。MS(ESI):m/z 194.06[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ11.29(s,2H),8.09(s,2H),6.13(d,J＝1.2Hz,1H).

d)向25mL圓底燒瓶中依次加入化合物D(0.2g,1.02mmol)，三氯氧磷(0.93mL,10.2mmol)和五氯化磷(0.21g,1.02mmol)，然后106℃回流過夜，蒸干溶劑，用飽和碳酸氫鈉調(diào)pH到7～8，用乙酸乙酯(10mL*2)萃取，合并有機層，依次用水20mL、飽和食鹽水20mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝8:1)洗脫，得到化合物E 0.21g，為白色固體，收率90％。MS(ESI):m/z 232.16[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.10(d,J＝2.4Hz,1H),8.05(d,J＝3.0Hz,1H),7.67(t,J＝2.7Hz,1H).

e)化合物E(0.2g,0.86mmol)溶于2mL二氧六環(huán)中，依次加入beta-丙氨酸乙酯鹽酸鹽(0.26g,1.72mmol)和N,N-二異丙基乙胺(0.45mL,2.58mmol)，80℃反應4小時，冷卻至室溫，用乙酸乙酯(10mL*2)萃取，合并有機層，依次用水20mL、飽和食鹽水20mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝2:1)洗脫，得到化合物F 0.09g，為白色固體，收率32％。MS(ESI):m/z 313.05[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.97(d,J＝3.1Hz,1H),7.52(d,J＝3.1Hz,1H),7.39(s,1H),5.79(s,1H),4.17(q,J＝7.1Hz,2H),3.79(d,J＝6.1Hz,2H),2.67(t,J＝5.9Hz,2H),1.27(t,J＝7.2Hz,3H).

f)化合物F(0.06g,0.20mmol)溶于2mL異丙醇中，依次加入2,3,4,5-四氫-1H-苯并[D]氮雜卓(0.06g,0.40mmol)和N,N-二異丙基乙胺(0.07mL,0.40mmol)，微波160℃反應1小時，冷卻至室溫，加硅膠蒸干通過快速硅膠柱色譜純化使用二氯甲烷/甲醇(V/V＝15:1)洗脫，得到化合物G 0.07g，為白色固體，收率80％。MS(ESI):m/z 424.29[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ7.92(d,J＝3.2Hz,1H),7.43(d,J＝3.2Hz,1H),7.14(s,4H),6.88(s,1H),5.31(s,1H),4.17(q,J＝7.1Hz,2H),3.89(s,4H),3.76(q,J＝6.3Hz,2H),3.04–2.91(m,4H),2.70(t,J＝6.3Hz,2H),1.27(t,J＝7.2Hz,3H).

g)化合物G(0.05g,0.12mmol)溶于2mL四氫呋喃和0.5mL水中，加入氫氧化鋰(0.03g,1.2mmol)，室溫過夜，加入1N鹽酸調(diào)pH到7～8，用乙酸乙酯 (10mL*2)萃取，合并有機層，依次用水20mL、飽和食鹽水20mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用二氯甲烷/甲醇(V/V＝8:1)洗脫，得到化合物H 0.04g，為白色固體，收率90％。MS(ESI):m/z 396.28[M+H]⁺； ¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.17(s,1H),7.98(d,J＝3.2Hz,1H),7.84(d,J＝3.2Hz,1H),7.19–7.13(m,2H),7.13–7.08(m,2H),6.81(s,1H),3.83(s,4H),3.51(dd,J＝12.9,6.8Hz,2H),2.93(s,4H),2.57(t,J＝7.0Hz,2H).

除了以下區(qū)別欄之外，按照與制備實施6類似的方法制備下列化合物：

制備實施例：

實施例23

試劑與條件：a)吡唑，四氫呋喃(THF)，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，80℃反應4小時；b)beta-丙氨酸乙酯鹽酸鹽，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，二氧六環(huán)，80℃反應4小時；c)2,3,4,5-四氫-1H-苯并[D]氮雜卓，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，異丙醇，160℃反應1小時；d)氫氧化鋰，四氫呋喃(THF)，水，室溫過夜。

a)吡唑(1g,14.69mmol)溶于10mL四氫呋喃中，向其中加入2,4,6-三氯嘧啶(2.25g,12.24mmol)和N,N-二異丙基乙胺(4.26mL,24.48mmol)，80℃反應4小時，冷卻至室溫，蒸干溶劑，用乙酸乙酯(50mL*2)萃取，合并有機層，依次用水100mL、飽和食鹽水100mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝15:1)洗脫，得到化合物B 1.63g，為白色固體，收率62％。MS(ESI):m/z 215.16[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.55–8.49(m,1H),7.88(s,1H),7.82(d,J＝1.1Hz,1H),6.54(dd,J＝2.8,1.6Hz,1H).

b)化合物B(1g,4.65mmol)溶于10mL二氧六環(huán)中，依次加入beta-丙氨酸乙酯鹽酸鹽(1.43g,9.3mmol)和N,N-二異丙基乙胺(2.43mL,13.95mmol)，80℃反應4小時，冷卻至室溫，用乙酸乙酯(50mL*2)萃取，合并有機層，依次用水100mL、飽和食鹽水100mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝2:1)洗脫，得到化合物C 0.45g，為白色固體，收率33％。MS(ESI):m/z 296.13[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.46(s,1H),7.75(s,1H),7.21(s,1H),6.46(s,1H),5.79(s,1H),4.16(q,J＝7.1Hz,2H),3.77(q,J＝6.2Hz,2H),2.65(t,J＝6.1Hz,2H),1.26(t,J＝7.1Hz,3H).

c)化合物C(0.40g,1.35mmol)溶于3mL異丙醇中，依次加入2,3,4,5-四氫-1H-苯并[D]氮雜卓(0.397g,2.7mmol)和N,N-二異丙基乙胺(0.47mL,2.7mmol)，微波160℃反應1小時，冷卻至室溫，加硅膠蒸干通過快速硅膠柱色譜純化使用二氯甲烷/甲醇(V/V＝15:1)洗脫，得到化合物D 0.46g，為白色固體，收率84％。MS(ESI):m/z 407.32[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.50(s,1H),7.72(s,1H),7.13(s,4H),6.62(s,1H),6.41(d,J＝1.1Hz,1H),5.30(t,J＝6.1Hz,1H),4.17(q,J＝7.1Hz,2H),3.87(s,4H),3.75(q,J＝6.3Hz,2H),3.02–2.91(m,4H),2.68(t,J＝6.3Hz,2H),1.27(t,J＝7.1Hz,3H).

d)化合物D(0.3g,0.74mmol)溶于4mL四氫呋喃和1mL水中，加入氫氧化鋰(0.178g,7.4mmol)，室溫過夜，加入1N鹽酸調(diào)pH到7～8，用乙酸乙酯(20mL*2)萃取，合并有機層，依次用水40mL、飽和食鹽水40mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用二氯甲烷/甲醇(V/V＝8:1)洗脫，得到化合物E 0.252g，為白色固體，收率90％。MS(ESI):m/z 379.30[M+H]⁺； ¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.45(s,1H),7.78(s,1H),7.19–7.14(m,2H),7.13–7.09(m,2H),6.83(s,1H),6.52(s,2H),3.80(s,4H),3.51(d,J＝6.1Hz,2H),2.92(s,4H),2.52(d,J＝6.9Hz,2H).

除了以下區(qū)別欄之外，按照與制備實施35類似的方法制備下列化合物：

制備實施例：

實施例33

試劑與條件：a)三氮唑，四氫呋喃(THF)，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，0℃反應4小時；b)beta-丙氨酸乙酯鹽酸鹽，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，二氧六環(huán)，80℃反應4小時；c)2,3,4,5-四氫-1H-苯并[D]氮雜卓，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，異丙醇，160℃反應1小時；d)氫氧化鋰，四氫呋喃(THF)，水，室溫過夜

a)2(H)-1,2,3-三唑(1g,14.49mmol)溶于10mL四氫呋喃中，向其中加入2,4,6-三氯嘧啶(2.66g,14.49mmol)和N,N-二異丙基乙胺(1.26mL,7.245mmol)， 0℃反應4小時，冷卻至室溫，蒸干溶劑，用乙酸乙酯(50mL*2)萃取，合并有機層，依次用水100mL、飽和食鹽水100mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝15:1)洗脫，得到化合物B1.31g，為白色固體，收率42％。MS(ESI):m/z 216.16[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.58(s,1H),8.15(s,1H),7.87(s,1H).

b)化合物B(1g,4.63mmol)溶于10mL二氧六環(huán)中，依次加入beta-丙氨酸乙酯鹽酸鹽(1.42g,9.26mmol)和N,N-二異丙基乙胺(2.42mL,13.89mmol)，80℃反應4小時，冷卻至室溫，用乙酸乙酯(50mL*2)萃取，合并有機層，依次用水100mL、飽和食鹽水100mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝4:1)洗脫，得到化合物C 0.495g，為白色固體，收率36％。MS(ESI):m/z 297.04[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.47(d,J＝29.5Hz,1H),7.80(s,1H),7.41(s,1H),6.04(d,J＝53.1Hz,1H),4.15(d,J＝6.7Hz,2H),3.77(q,J＝6.2Hz,2H),2.65(t,J＝6.1Hz,2H),1.25(t,J＝7.1Hz,3H).

c)化合物C(0.40g,1.35mmol)溶于3mL異丙醇中，依次加入2,3,4,5-四氫-1H-苯并[D]氮雜卓(0.397g,2.7mmol)和N,N-二異丙基乙胺(0.47mL,2.7mmol)，微波160℃反應1小時，冷卻至室溫，加硅膠蒸干通過快速硅膠柱色譜純化使用二氯甲烷/甲醇(V/V＝15:1)洗脫，得到化合物D 0.47g，為白色固體，收率85％。MS(ESI):m/z 408.16[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.48(s,1H),7.78(d,J＝1.1Hz,1H),7.15(s,4H),6.84(s,1H),5.35(t,J＝6.3Hz,1H),4.17(q,J＝7.1Hz,2H),3.89(s,4H),3.74(q,J＝6.3Hz,2H),3.04–2.95(m,4H),2.67(t,J＝6.2Hz,2H),1.27(s,3H).

d)化合物D(0.3g,0.74mmol)溶于4mL四氫呋喃和1mL水中，加入氫氧化鋰(0.178g,7.4mmol)，室溫過夜，加入1N鹽酸調(diào)pH到7～8，用乙酸乙酯(20mL*2)萃取，合并有機層，依次用水40mL、飽和食鹽水40mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用二氯甲烷/甲醇(V/V＝8:1)洗脫，得到化合物E 0.255g，為白色固體，收率91％。MS(ESI):m/z 380.13[M+H]⁺； ¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.16(s,1H),8.64(d,J＝50.8Hz,1H),7.94(s,1H),7.22–7.14(m,2H),7.14–7.10(m,2H),6.72(s,1H),3.84(s,4H),3.52(dd,J＝12.8,6.7Hz,2H),2.94(s,4H),2.55(t,J＝6.8Hz,2H)..

除了以下區(qū)別欄之外，按照與制備實施41類似的方法制備下列化合物：

制備實施例：

實施例40

試劑與條件：a)三氮唑，四氫呋喃(THF)，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，0℃反應4小時；b)beta-丙氨酸乙酯鹽酸鹽，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，二 氧六環(huán)，80℃反應4小時；c)2,3,4,5-四氫-1H-苯并[D]氮雜卓，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，異丙醇，160℃反應1小時；d)氫氧化鋰，四氫呋喃(THF)，水，室溫過夜

a)2(H)-1,2,3-三唑(1g,14.49mmol)溶于10mL四氫呋喃中，向其中加入2,4,6-三氯嘧啶(2.66g,14.49mmol)和N,N-二異丙基乙胺(1.26mL,7.245mmol)，0℃反應4小時，冷卻至室溫，蒸干溶劑，用乙酸乙酯(50mL*2)萃取，合并有機層，依次用水100mL、飽和食鹽水100mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝15:1)洗脫，得到化合物B1.31g，為白色固體，收率42％。MS(ESI):m/z 216.13[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.59(d,J＝1.1Hz,1H),7.86(d,J＝1.1Hz,1H),7.46(s,1H).

b)化合物B(1g,4.63mmol)溶于10mL二氧六環(huán)中，依次加入beta-丙氨酸乙酯鹽酸鹽(1.42g,9.26mmol)和N,N-二異丙基乙胺(2.42mL,13.89mmol)，80℃反應4小時，冷卻至室溫，用乙酸乙酯(50mL*2)萃取，合并有機層，依次用水100mL、飽和食鹽水100mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝4:1)洗脫，得到化合物C 0.495g，為白色固體，收率36％。MS(ESI):m/z 297.06[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.52(d,J＝1.1Hz,1H),7.79(d,J＝1.1Hz,1H),6.42(s,1H),6.12(s,1H),4.17(q,J＝7.1Hz,2H),3.74(d,J＝111.2Hz,2H),2.67(t,J＝6.0Hz,2H),1.26(t,J＝7.2Hz,3H).

c)化合物C(0.40g,1.35mmol)溶于3mL異丙醇中，依次加入2,3,4,5-四氫-1H-苯并[D]氮雜卓(0.397g,2.7mmol)和N,N-二異丙基乙胺(0.47mL,2.7mmol)，微波160℃反應1小時，冷卻至室溫，加硅膠蒸干通過快速硅膠柱色譜純化使用二氯甲烷/甲醇(V/V＝15:1)洗脫，得到化合物D 0.47g，為白色固體，收率85％。MS(ESI):m/z 408.11[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.50(d,J＝1.1Hz,1H),7.77(d,J＝1.1Hz,1H),7.15(s,4H),5.48(s,1H),5.39(t,J＝5.9Hz,1H),4.17(q,J＝7.1Hz,2H),3.87(s,4H),3.68(dd,J＝12.2,6.1Hz,2H),3.07–2.93(m,4H),2.66(t,J＝6.3Hz,2H),1.27(t,J＝7.2Hz,3H).

d)化合物D(0.3g,0.74mmol)溶于4mL四氫呋喃和1mL水中，加入氫氧化鋰(0.178g,7.4mmol)，室溫過夜，加入1N鹽酸調(diào)pH到7～8，用乙酸乙酯 (20mL*2)萃取，合并有機層，依次用水40mL、飽和食鹽水40mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用二氯甲烷/甲醇(V/V＝8:1)洗脫，得到化合物E 0.255g，為白色固體，收率91％。MS(ESI):m/z 380.07[M+H]⁺； ¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ8.71(s,1H),7.88(s,1H),7.24(s,1H),7.14(d,J＝13.9Hz,4H),5.73(s,1H),3.80(s,4H),3.50(s,2H),2.94(s,4H),2.53(s,2H).

除了以下區(qū)別欄之外，按照與制備實施46類似的方法制備下列化合物：

制備實施例：

實施例45

試劑與條件：a)吲唑，四氫呋喃(THF)，碳酸銫，室溫反應4小時；b)beta-丙氨酸乙酯鹽酸鹽，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，二氧六環(huán)，80℃反應4小時；c)2,3,4,5-四氫-1H-苯并[D]氮雜卓，N,N-二異丙基乙胺(DIPEA)，異丙醇，160℃反應1小時；d)氫氧化鋰，四氫呋喃(THF)，水，室溫過夜。

a)吲唑(1g,8.46mmol)溶于10mL四氫呋喃中，向其中加入2,4,6-三氯嘧啶(1.55g,8.46mmol)和碳酸銫(2.76g,8.46mmol)，室溫反應4小時，蒸干溶劑，用乙酸乙酯(50mL*2)萃取，合并有機層，依次用水100mL、飽和食鹽水100mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝15:1)洗脫，得到化合物B 1.41g，為白色固體，收率63％。MS(ESI):m/z 265.21[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.63(d,J＝8.5Hz,1H),8.22(s,1H),7.84(s,1H),7.74(d,J＝7.9Hz,1H),7.57(t,J＝7.8Hz,1H),7.35(t,J＝7.4Hz,1H).

b)化合物B(1g,3.77mmol)溶于10mL二氧六環(huán)中，依次加入beta-丙氨酸乙酯鹽酸鹽(1.16g,7.54mmol)和N,N-二異丙基乙胺(1.97mL,11.31mmol)，80℃反應4小時，冷卻至室溫，用乙酸乙酯(50mL*2)萃取，合并有機層，依次用水100mL、飽和食鹽水100mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用石油醚/乙酸乙酯(V/V＝8:1)洗脫，得到化合物C 0.443g，為白色固體，收率34％。MS(ESI):m/z 346.17[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.69(d,J＝8.5Hz,1H),8.21(s,1H),7.76(d,J＝7.9Hz,1H),7.53(t,J＝7.8Hz,1H),7.40–7.28(m,2H),5.84(s,1H),4.19(q,J＝7.2Hz,2H),3.86(s,2H),2.74(s, 2H),1.29(d,J＝7.1Hz,3H).

c)化合物C(0.40g,1.16mmol)溶于5mL異丙醇中，依次加入2,3,4,5-四氫-1H-苯并[D]氮雜卓(0.341g,2.32mmol)和N,N-二異丙基乙胺(0.404mL,2.32mmol)，微波160℃反應1小時，冷卻至室溫，加硅膠蒸干通過快速硅膠柱色譜純化使用二氯甲烷/甲醇(V/V＝15:1)洗脫，得到化合物D 0.47g，為白色固體，收率89％。MS(ESI):m/z 457.36[M+H]⁺；¹H NMR(400MHz,CDCl₃)δ8.83(d,J＝8.6Hz,1H),8.19(s,1H),7.75(d,J＝8.0Hz,1H),7.49(t,J＝7.8Hz,1H),7.26(t,J＝7.5Hz,1H),7.14(s,4H),6.70(s,1H),5.35(t,J＝6.0Hz,1H),4.20(q,J＝7.1Hz,2H),3.89(s,4H),3.84(dd,J＝12.2,6.0Hz,2H),3.05–2.94(m,4H),2.76(t,J＝6.2Hz,2H),1.29(t,J＝7.4Hz,3H).

d)化合物D(0.3g,0.74mmol)溶于4mL四氫呋喃和1mL水中，加入氫氧化鋰(0.178g,7.4mmol)，室溫過夜，加入1N鹽酸調(diào)pH到7～8，用乙酸乙酯(20mL*2)萃取，合并有機層，依次用水40mL、飽和食鹽水40mL萃取，無水硫酸鈉干燥。殘留物通過快速硅膠柱色譜純化，使用二氯甲烷/甲醇(V/V＝8:1)洗脫，得到化合物E 0.252g，為白色固體，收率90％。MS(ESI):m/z 429.35[M+H]⁺； ¹H NMR(400MHz,DMSO-d₆)δ12.25(s,1H),8.95(s,1H),8.42(s,1H),7.86(d,J＝7.6Hz,1H),7.49(t,J＝7.9Hz,1H),7.30(t,J＝7.4Hz,1H),7.22–7.15(m,2H),7.15–7.09(m,2H),6.61(s,1H),3.83(s,4H),3.57(s,2H),2.96(s,4H),2.62(s,2H).

除了以下區(qū)別欄之外，按照與制備實施50類似的方法制備下列化合物：

藥理試驗實施例

一.組蛋白去甲基化酶體外測活方法

采用AlphaLISA方法即根據(jù)檢測生物素化的組蛋白H3賴氨酸27位三甲基化去甲基化程度來判斷組蛋白去甲基化酶JMJD3的活性，從而可以判斷出抑制劑的抑制活性。AlphaLISA方法原理是將鏈霉親和素Alpha供體有孔小珠和生物素化的組蛋白H3K27me3相連，當用680nM的激光照射供體有孔小珠時會釋放出氧氣，氧氣會到達可結合到組蛋白H3K27me2的抗體上，此抗體與AlphaLISA受體有孔小珠相連，導致釋放可被檢測到的增加的化學發(fā)光的615nM信號。根據(jù)此信號強弱得到組蛋白H3K27me2的量從而得到抑制劑抑制活性。這里是抑制劑先與組蛋白去甲基化酶JMJD3孵化，然后加入組蛋白H3K27me3多肽底物和2-酮戊二酸、二價鐵離子和抗壞血酸鹽得到抑制率。

藥理學數(shù)據(jù)：以下表1中公布了部分本發(fā)明化合物的藥理學試驗結果(N.D.代表未測試，Inh代表抑制率，單位為％)，測試中采用的對照為組蛋白去甲基化酶抑制劑GSK-J1。

表1 JMJD3活性抑制率測試結果

二.化合物對脂多糖(LPS)誘導的小鼠RAW264.7細胞模型的影響作用

在巨噬細胞中JMJD3通過依賴核因子KB(NF-KB)機制的促炎反應導致JMJD3快速表達增加且JMJD3被募集到多于70％的LPS誘導的基因的轉錄起始位點而直接參與轉錄反應。LPS誘導的基因的轉錄導致細胞因子包括腫瘤壞死因子α(TNF-α)含量增加，通過檢測化合物2、23、33、40相應的羧酸乙酯前藥，即化合物2-r、23-r、33-r、40-r對LPS誘導的小鼠細胞中細胞因子含量的變化來判斷化合物對JMJD3細胞抑制活性?；衔?-r、23-r、33-r、40-r結構式如下：

藥理學數(shù)據(jù)見下表2-3：

表2巨噬細胞生存率實驗

表3巨噬細胞中TNF-α的含量變化/TNF-α(pg/ml)

注：從表3的巨噬細胞中TNF-α的含量的抑制情況可以看出，化合物2-r，23-r，33-r和44-r在測試的濃度下與GSK-J4相比具有更好的抑制活性。