用超臨界流體色譜制備具有抗病毒活性的新型煙草倍半萜-H技術(shù)領(lǐng)域本發(fā)明屬于煙草化學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種從煙草中首次提取得到的倍半萜類化合物。同時(shí)，本發(fā)明還涉及該化合物的制備方法和在抗輪狀病毒中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：
煙草是世界上化學(xué)成分最為復(fù)雜的植物，次生代謝產(chǎn)物非常豐富，經(jīng)過幾十年的研究，人們目前從煙草中鑒定出來的單體化學(xué)物質(zhì)就超過3000多種，而且還有許多成分尚未鑒定出來。超臨界流體色譜是以超臨界流體(例如CO2)作為流動相的色譜方法，超臨界流體兼有氣體的低粘度和高擴(kuò)散系數(shù)，約為液體的10～100倍，又有與液體相近的高密度和強(qiáng)溶解能力，因此超臨界流體色譜兼?zhèn)錃庀嗌V和高效液相色譜兩者的優(yōu)點(diǎn)。它既可以分離液相色譜不易分離的高相對分子質(zhì)量化合物，也可以分離氣相色譜不易分離的的熱不穩(wěn)定、強(qiáng)極性或非揮發(fā)性化合物。因此，超臨界流體色譜非常適合用于天然產(chǎn)物中化合物的分離制備。倍半萜(sesquiterpenes)是指分子中含15個碳原子的天然萜類化合物。倍半萜類化合物分布較廣，在植物體內(nèi)常以醇、酮、內(nèi)酯等等形式存在于揮發(fā)油中，是揮發(fā)油中高沸點(diǎn)部分的主要組成部分。多具有較強(qiáng)的香氣和生物活性，是醫(yī)藥、食品、化妝品工業(yè)的重要原料。為了研究這類化合物的構(gòu)效關(guān)系，可進(jìn)一步研究和開發(fā)更多的倍半萜類化合物，并從中尋找有效的先導(dǎo)化合物和活性基團(tuán)。本發(fā)明利用超臨界流體色譜，從云南烤煙煙葉中分離得到了一種新的倍半萜類化合物，該化合物至今尚未見到相關(guān)報(bào)道，值得一提的是該化合物具有顯著的抗輪狀病病毒活性。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明的第一方面在于提供一種新的倍半萜類化合物，該化合物從云南烤煙煙葉中分離得到，其分子式為C15H20O3，經(jīng)過分析化學(xué)鑒定，其具有下述結(jié)構(gòu)：該化合物為淺黃色膠狀物，本發(fā)明人將其中文名命名為煙草倍半萜-H，其英文名為nicotianasesterpeneH。本發(fā)明的第二方面提供了上述第一方面所述的倍半萜類化合物的制備方法，該方法包括如下步驟：(1)制備煙草提取物浸膏：以煙草葉片為原料，將其粉碎或切成小段，并用第一溶劑浸泡并提取所述煙草3～5次，每次24h～72h，將提取液合并、過濾并濃縮后得到所述煙草提取物浸膏；其中所述第一溶劑是選自甲醇、乙醇或丙酮的有機(jī)溶劑與水的混合物，其中有機(jī)溶劑占該第一溶劑的60wt％～100wt％，且第一溶劑：煙草＝2～4:1，重量比；(2)硅膠柱層析：將上述煙草提取物浸膏用選自純甲醇、純乙醇或純丙酮的第二溶劑溶解后與為煙草提取物浸膏的0.8～1.2重量倍的60～120目硅膠拌樣，將拌樣后的混合物再與為煙草提取物浸膏的2～4重量倍的160～300目硅膠混合后干法裝柱，然后用體積比依次為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿-丙酮溶液進(jìn)行梯度洗脫，將其中體積為8:2的氯仿-丙酮溶液洗脫時(shí)得到的洗脫液稱為第一洗脫液。(3)超臨界流體色譜分離純化：將上述第一洗脫液通入超臨界流體色譜進(jìn)行分離純化，該超臨界流體色譜采用10mm×150mm，5μm的Silica2-EP色譜柱，流動相二氧化碳/甲醇(88/12％，質(zhì)量比)，流動相流速為25mL/min，紫外檢測器檢測波長為254nm，第一洗脫液液每次進(jìn)樣200～500μL，收集每次進(jìn)樣后色譜峰保留時(shí)間為15.4min時(shí)所對應(yīng)的洗脫液，稱為第二洗脫液，將該第二洗脫液脫除溶劑后即得所述倍半萜化合物。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明還包括以下進(jìn)一步提純的步驟：將在所述超臨界流體色譜分離之后得到的所述倍半萜化合物再次溶于甲醇溶液，并以甲醇溶液的為流動相，通過凝膠柱進(jìn)行層析分離，提到進(jìn)一步提純的所述倍半萜化合物。本發(fā)明的第三方面提供了第一方面所述的倍半萜類化合物在制備抗輪狀病毒藥物中的用途。附圖說明圖1為本發(fā)明倍半萜類化合物的核磁共振碳譜；圖2為本發(fā)明倍半萜類化合物的核磁共振氫譜；圖3為本發(fā)明倍半萜類化合物的主要HMBC相關(guān)圖示。具體實(shí)施方式本發(fā)明所制備的倍半萜類化合物的結(jié)構(gòu)通過以下方法測定出來的。紫外光譜(溶劑為甲醇),λmax(logε)210(4.22)和257(3.63)；紅外光譜(溴化鉀壓片)νmax3386，2928，1657，1600，1546，1433，1158，1064，和936cm-1；高分辨質(zhì)譜(HRESIMS)給出準(zhǔn)分子離子峰m/z247.1327[M-H]-(計(jì)算值247.1334)。結(jié)合1H和13CNMR譜給出一個分子式C15H20O3，不飽和度為6。其紅外光譜顯示有羥基(3386cm-1)，羰基(1657cm-1)和苯環(huán)(1600，1546，1433cm-1)功能團(tuán)；紫外光譜在257nm處有強(qiáng)吸收，也證實(shí)化合物中存在共軛結(jié)構(gòu)。從1H和13CNMR譜(數(shù)據(jù)歸屬見表-1)信號可以看出化合物中有一個1,2,3,4,5-五取代的苯環(huán)、一個3-羥基-1-丙酮基、三個甲基、兩個亞甲基、一個季碳；除去苯環(huán)的不飽和度4和羰基的不飽和度1，化合物中還應(yīng)有一個環(huán)。根據(jù)H-3和C-2、C-4、C-8、C-9、C-13,14，以及H-1和C-2、C-3、C-7、C-8、、C-13,14的HMBC相關(guān)(圖-3)可證實(shí)C-1、C-2、C-3和C-13,14苯環(huán)間形成了一個偕二甲基的5元碳環(huán)，該化合物應(yīng)為偕二甲基二氫茚結(jié)構(gòu)?；衔锏哪负舜_定后，剩余的甲基、3-羥基-1-丙酮基和羥基為母核上的取代基。根據(jù)H-11和C-5的HMBC相關(guān)可證實(shí)3-羥基-1-丙酮基取代在母核的C-5位；根據(jù)H-15和C-5、C-6和C-7，以及H-7和C-15的HMBC相關(guān)，可證實(shí)該甲基取代在母核的C-6位；根據(jù)酚羥基氫和C-4、C-5和C-9的HMBC相關(guān)，可證實(shí)酚羥基取代在母核的C-7位。至此本化合物的結(jié)構(gòu)得以確定。表1.化合物的1HNMR和13CNMR數(shù)據(jù)(C5D5N)本發(fā)明化合物是首次被分離出來的，通過上述核磁共振和質(zhì)譜測定方法確定了為倍半萜類化合物，并表征了其具體結(jié)構(gòu)。經(jīng)對抗輪狀病毒的實(shí)驗(yàn)，其TC50值為216.8μg/mL、IC50值為6.52μg/mL，治療指數(shù)TI為33.7；其治療指數(shù)超過對照病毒唑的治療指數(shù)19.16；化合物具有很好的抗輪狀病毒活性。以上結(jié)果揭示了本發(fā)明的化合物在制備抗輪狀病毒藥物中有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)簡單活性較好，可作為抗輪狀病毒藥物研發(fā)的先導(dǎo)性化合物用于抗輪狀病毒藥物制劑研發(fā)。下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但不以任何方式對本發(fā)明加以限制，基于本發(fā)明教導(dǎo)所作的任何變換或改進(jìn)，均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。本發(fā)明所用原料不受地區(qū)和品種限制，任何來源地的煙草均可以實(shí)現(xiàn)本發(fā)明，下面以來源于云南中煙工業(yè)有限責(zé)任公司的煙草原料對本發(fā)明做進(jìn)一步說明。除非另有說明，本發(fā)明中所采用的百分?jǐn)?shù)均為質(zhì)量百分?jǐn)?shù)。實(shí)施例1煙草樣品來源于云南玉溪，品種為玉溪K326。將煙草取樣2.0kg粉碎以95％的甲醇提取5次，每次提取24h，提取液合并，過濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏105g。浸膏用重量比2.0倍量的純甲醇溶解后用120g的100目粗硅膠拌樣，0.4kg的160目硅膠裝柱進(jìn)行硅膠柱層析，用體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脫，薄層色譜(TLC)監(jiān)測合并相同的部分，得到8個部分，其中體積配比為8:2的氯仿-丙酮洗脫部分用沃特斯SFC80Q超臨界流體制備色譜分離，以二氧化碳/甲醇為流動相(88/12％，質(zhì)量比)，Silica2-EP(10mm×150mm，5μm)制備柱為固定相，流動相流速為25mL/min，紫外檢測器檢測波長為254nm，每次進(jìn)樣200μL，收集每次進(jìn)樣后色譜峰保留時(shí)間為15.4min時(shí)所對應(yīng)的洗脫液，多次累加后蒸干，即得本發(fā)明所述的倍半萜化合物粗品；該粗品再用純甲醇溶解，以純甲醇為流動相，用葡聚糖凝膠柱層析純化可得純品。實(shí)施例2煙草樣品來源于云南大理，品種為云煙200，將煙草取樣3.5kg切碎，以95％的乙醇提取4次，每次提取48h，提取液合并，過濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏250g。浸膏用重量比2.0倍量的純甲醇溶解后用250g的80目粗硅膠拌樣，0.5kg的200目硅膠裝柱進(jìn)行硅膠柱層析，用體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脫，TLC監(jiān)測合并相同的部分，得到8個部分，其中體積配比為8:2的氯仿-丙酮洗脫部分用沃特斯SFC80Q超臨界流體制備色譜分離，以二氧化碳/甲醇為流動相(88/12％，質(zhì)量比)，Silica2-EP(10mm×150mm，5μm)制備柱為固定相，流動相流速為25mL/min，紫外檢測器檢測波長為254nm，每次進(jìn)樣200μL，收集每次進(jìn)樣后色譜峰保留時(shí)間為15.4min時(shí)所對應(yīng)的洗脫液，多次累加后蒸干，即得本發(fā)明所述的倍半萜化合物粗品；該粗品再用純甲醇溶解，以純甲醇為流動相，用SephadexLH-20凝膠柱層析純化可得更高純度的該新化合物。實(shí)施例3煙草樣品來源于云南昆明，品種為紅花大金元，將煙草取樣5kg粉碎，以75％的丙酮用超聲提取3次，每次提取72h，提取液合并，過濾，減壓濃縮成浸膏，得浸膏380g。浸膏用重量比1.6倍量的純甲醇溶解后用400g的90目粗硅膠拌樣，2.4kg的180目硅膠裝柱進(jìn)行硅膠柱層析，用體積配比為1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1、1:2的氯仿-丙酮梯度洗脫，TLC監(jiān)測合并相同的部分，得到8個部分，其中體積配比為8:2的氯仿-丙酮洗脫部分用沃特斯SFC80Q超臨界流體制備色譜分離，以二氧化碳/甲醇為流動相(88/12％，質(zhì)量比)，Silica2-EP(10mm×150mm，5μm)制備柱為固定相，流動相流速為25mL/min，紫外檢測器檢測波長為254nm，每次進(jìn)樣200μL，收集每次進(jìn)樣后色譜峰保留時(shí)間為15.4min時(shí)所對應(yīng)的洗脫液，多次累加后蒸干，即得本發(fā)明所述的倍半萜化合物粗品；該粗品再用純甲醇溶解，以純甲醇為流動相，用SephadexLH-20凝膠柱層析純化可得更高純度的該新化合物。實(shí)施例4取實(shí)施例1制備的化合物，為淺黃色膠狀物。本發(fā)明所制備的倍半萜類化合物的結(jié)構(gòu)通過以下方法測定出來的。紫外光譜(溶劑為甲醇),λmax(logε)210(4.22)和257(3.63)；紅外光譜(溴化鉀壓片)νmax3386，2928，1657，1600，1546，1433，1158，1064，和936cm-1；高分辨質(zhì)譜(HRESIMS)給出準(zhǔn)分子離子峰m/z247.1327[M-H]-(計(jì)算值247.1334)。結(jié)合1H和13CNMR譜給出一個分子式C15H20O3，不飽和度為6。其紅外光譜顯示有羥基(3386cm-1)，羰基(1657cm-1)和苯環(huán)(1600，1546，1433cm-1)功能團(tuán)；紫外光譜在257nm處有強(qiáng)吸收，也證實(shí)化合物中存在共軛結(jié)構(gòu)。從1H和13CNMR譜(數(shù)據(jù)歸屬見表-1)信號可以看出化合物中有一個1,2,3,4,5-五取代的苯環(huán)、一個3-羥基-1-丙酮基、三個甲基、兩個亞甲基、一個季碳；除去苯環(huán)的不飽和度4和羰基的不飽和度1，化合物中還應(yīng)有一個環(huán)。根據(jù)H-3和C-2、C-4、C-8、C-9、C-13,14，以及H-1和C-2、C-3、C-7、C-8、、C-13,14的HMBC相關(guān)(圖-3)可證實(shí)C-1、C-2、C-3和C-13,14苯環(huán)間形成了一個偕二甲基的5元碳環(huán)，該化合物應(yīng)為偕二甲基二氫茚結(jié)構(gòu)?；衔锏哪负舜_定后，剩余的甲基、3-羥基-1-丙酮基和羥基為母核上的取代基。根據(jù)H-11和C-5的HMBC相關(guān)可證實(shí)3-羥基-1-丙酮基取代在母核的C-5位；根據(jù)H-15和C-5、C-6和C-7，以及H-7和C-15的HMBC相關(guān)，可證實(shí)該甲基取代在母核的C-6位；根據(jù)酚羥基氫和C-4、C-5和C-9的HMBC相關(guān)，可證實(shí)酚羥基取代在母核的C-7位。至此本化合物的結(jié)構(gòu)得以確定。實(shí)施例5取實(shí)施例2制備的化合物，為黃色膠狀物。測定方法與實(shí)施例4相同，確認(rèn)實(shí)施例2制備的化合物為所述的倍半萜類化合物——煙草倍半萜-H。實(shí)施例6取實(shí)施例3制備的化合物，為黃色膠狀物。測定方法與實(shí)施例4相同，確認(rèn)實(shí)施例3制備的化合物為所述的煙草倍半萜-H。實(shí)施例7取實(shí)施例1-3制備的任一倍半萜類化合物進(jìn)行抗輪狀病毒活性試驗(yàn)，試驗(yàn)情況如下：抗輪狀病毒采用體外細(xì)胞測試法，即樣品與病毒同時(shí)作用于MA104細(xì)胞后，通過Alarmablue法檢測樣品對病毒感染致細(xì)胞死亡的保護(hù)作用，從而測定樣品對HRV的活性作用。(a)藥物的細(xì)胞毒性檢測MA104細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)形成單層后，加入不同濃度的樣品液，繼續(xù)培養(yǎng)3天后，更換含Alamarblue的培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)2～3小時(shí)后檢測其530/590nm處的熒光值，從而檢測樣品對MA104細(xì)胞的毒性，并計(jì)算半數(shù)細(xì)胞毒濃度(TC50)。(b)藥物抗輪狀病毒作用檢測MA104細(xì)胞在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中培養(yǎng)形成單層后，100TCID50的病毒液和不超過20％細(xì)胞毒性的梯度濃度藥物溶液同時(shí)加到MA104細(xì)胞上，繼續(xù)培養(yǎng)4-6天后，更換含Alamarblue的培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)2～3小時(shí)后檢測其530/590nm處的熒光值，并計(jì)算半數(shù)抑制濃度(IC50)。(c)根基TC50/IC50計(jì)算化合物的治療指數(shù)。結(jié)果表明，本發(fā)明化合物的TC50值為218.5μg/mL、IC50值為6.48μg/mL，治療指數(shù)TI為33.7；化合物具有很好的抗輪狀病毒活性。以上結(jié)果揭示了本發(fā)明的化合物在制備抗輪狀病毒藥物中有良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明化合物結(jié)構(gòu)簡單活性較好，可作為抗輪狀病毒藥物研發(fā)的先導(dǎo)性化合物用于抗輪狀病毒藥物制劑研發(fā)。