本發(fā)明涉及一種植物磷轉(zhuǎn)運蛋白ZmPHT1；7及其編碼基因和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：磷是植物生長必需的大量元素之一，參與植物的細(xì)胞構(gòu)成、生長發(fā)育、物質(zhì)代謝和能量代謝等。植物細(xì)胞中的磷濃度一般維持在mM水平，而土壤溶液中有效磷的濃度極低，一般低于10μM，植物/作物經(jīng)常面臨低磷脅迫，土壤缺磷成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的重要限制因素。磷肥施入土壤后，無機(jī)磷容易被土壤中的重金屬等固定，成為不容易被植物/作物吸收的磷，造成磷肥的當(dāng)季利用效率低，一般為10％-25％。另外，大量施用磷肥會造成環(huán)境污染。玉米是禾本科草本植物，學(xué)名玉蜀黍，俗稱棒子、玉茭、苞米、苞谷。中國各地都有種植，尤以東北、華北和西南各省較多。玉米是粗糧中的保健佳品，食用玉米對人體健康頗為有利。玉米在我國糧食安全中起著極其重要的作用，是重要的飼料作物，又是食品、化工、燃料、醫(yī)藥等行業(yè)的重要原料。據(jù)統(tǒng)計，中國2012年玉米產(chǎn)銷量僅次于美國，2012年中國玉米產(chǎn)量200000千噸，消費201000千噸，說明玉米是重要的糧食作物。磷對玉米的生長發(fā)育、籽粒產(chǎn)量和質(zhì)量有重要作用。磷素充足時，玉米早熟，籽粒色澤和品質(zhì)好，產(chǎn)量高。玉米幼苗期缺磷，會導(dǎo)致玉米生長緩慢，硝態(tài)氮積累，蛋白質(zhì)合成受阻，葉片呈現(xiàn)紫紅色。雌雄穗分化時缺磷，則果穗發(fā)育受阻，穗頂繞縮，易形成空稈。授粉期缺磷，則授粉不良，果穗卷曲，導(dǎo)致缺行、缺?；蚨d尖，品質(zhì)下降。提高玉米的磷吸收和轉(zhuǎn)移速率將有助于提高玉米對磷肥的利用效率，減少磷肥的施用，減少環(huán)境污染。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種植物磷轉(zhuǎn)運蛋白ZmPHT1；7及其編碼基因和應(yīng)用。本發(fā)明提供的蛋白質(zhì)，命名為ZmPHT1；7蛋白，獲自玉米自交系B73，是如下(a)或(b)：(a)由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)；(b)將序列1的氨基酸序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與植物磷轉(zhuǎn)運相關(guān)的由序列1衍生的蛋白質(zhì)。為了使(a)中的蛋白質(zhì)便于純化，可在由序列表中序列1所示的氨基酸序列組成的蛋白質(zhì)的氨基末端或羧基末端連接上如表1所示的標(biāo)簽。表1標(biāo)簽的序列標(biāo)簽殘基序列Poly-Arg5-6(通常為5個)RRRRRPoly-His2-10(通常為6個)HHHHHHFLAG8DYKDDDDKStrep-tagII8WSHPQFEKc-myc10EQKLISEEDL上述(b)中的蛋白質(zhì)可人工合成，也可先合成其編碼基因，再進(jìn)行生物表達(dá)得到。上述(b)中的蛋白質(zhì)的編碼基因可通過將序列表中序列2所示的DNA序列中缺失一個或幾個氨基酸殘基的密碼子，和/或進(jìn)行一個或幾個堿基對的錯義突變，和/或在其5′端和/或3′端連上表1所示的標(biāo)簽的編碼序列得到。編碼ZmPHT1；7蛋白的基因也屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍，將其命名為ZmPHT1；7基因。所述ZmPHT1；7基因為如下1)或2)或3)的DNA分子：1)編碼區(qū)如序列表中序列2所示的DNA分子；2)在嚴(yán)格條件下與1)限定的DNA序列雜交且編碼植物磷轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的DNA分子；3)與1)或2)限定的DNA序列具有90％以上同源性且編碼植物磷轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的DNA分子。上述嚴(yán)格條件可為在6×SSC、0.5％SDS的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×SSC、0.1％SDS和1×SSC、0.1％SDS各洗膜一次。含有ZmPHT1；7基因的重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。可用現(xiàn)有的植物表達(dá)載體構(gòu)建含有ZmPHT1；7基因的重組表達(dá)載體。所述植物表達(dá)載體包括雙元農(nóng)桿菌載體和可用于植物微彈轟擊的載體等。所述植物表達(dá)載體還可包含外源基因的3’端非翻譯區(qū)域，即包含聚腺苷酸信號和任何其它參與mRNA加工或基因表達(dá)的DNA片段。所述聚腺苷酸信號可引導(dǎo)聚腺苷酸加入到mRNA前體的3’端。使用ZmPHT1；7基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時，在其轉(zhuǎn)錄起始核苷酸前可加上任何一種增強(qiáng)型啟動子或組成型啟動子，它們可單獨使用或與其它的植物啟動子結(jié)合使用；此外，使用ZmPHT1；7基因構(gòu)建重組表達(dá)載體時，還可使用增強(qiáng)子，包括翻譯增強(qiáng)子或轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子，但必需與編碼序列的閱讀框相同，以保證整個序列的正確翻譯。所述翻譯控制信號和起始密碼子的來源是廣泛的，可以是天然的，也可以是合成的。翻譯起始區(qū)域可以來自轉(zhuǎn)錄起始區(qū)域或結(jié)構(gòu)基因。為了便于對轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞或植物進(jìn)行鑒定及篩選，可對所用植物表達(dá)載體進(jìn)行加工，如加入可在植物中表達(dá)的編碼可產(chǎn)生顏色變化的酶 或發(fā)光化合物的基因、具有抗性的抗生素標(biāo)記物或是抗化學(xué)試劑標(biāo)記基因等。從轉(zhuǎn)基因植物的安全性考慮，可不加任何選擇性標(biāo)記基因，直接以逆境篩選轉(zhuǎn)化植株。所述重組表達(dá)載體具體可為將ZmPHT1；7基因插入pSuper1300載體的多克隆位點(例如HindⅢ和SpeI酶切位點之間)得到的重組質(zhì)粒。所述重組表達(dá)載體具體可為將ZmPHT1；7基因插入載體pCXUN的多克隆位點(例如XcmI酶切位點)得到的重組質(zhì)粒。本發(fā)明還保護(hù)ZmPHT1；7蛋白的應(yīng)用，為如下(c1)至(c7)中的至少一種：(c1)調(diào)控植物的磷含量；(c2)促進(jìn)植物的磷含量增加；(c3)調(diào)控植物的磷吸收速率；(c4)促進(jìn)植物的磷吸收速率增加；(c5)調(diào)控植物生長；(c6)促進(jìn)植物生長；(c7)促進(jìn)植物中的磷元素從老葉向新葉轉(zhuǎn)移。以上任一所述植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為擬南芥，例如瓦斯萊擬南芥。所述單子葉植物具體可為玉米，例如玉米自交系B73。本發(fā)明還保護(hù)一種培育轉(zhuǎn)基因植物的方法，是將ZmPHT1；7基因?qū)肽康闹参镏校玫睫D(zhuǎn)基因植物；所述轉(zhuǎn)基因植物滿足如下(d1)至(d5)中的至少一種表型：(d1)磷含量高于所述目的植物；(d2)磷吸收速率高于所述目的植物；(d3)磷轉(zhuǎn)移速率高于所述目的植物；(d4)生物量高于所述目的植物；(d5)生長能力高于所述目的植物。所述ZmPHT1；7基因具體可通過所述重組表達(dá)載體導(dǎo)入所述目的植物。所述方法中，所述重組表達(dá)載體可通過使用Ti質(zhì)粒、Ri質(zhì)粒、植物病毒載體、直接DNA轉(zhuǎn)化、顯微注射、電導(dǎo)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等常規(guī)生物學(xué)方法轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞或組織，并將轉(zhuǎn)化的植物組織培育成植株。所述ZmPHT1；7基因具體可通過所述重組質(zhì)粒導(dǎo)入所述目的植物中。所述目的植物為單子葉植物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為擬南芥，例如瓦斯萊擬南芥。所述單子葉植物具體可為玉米，例如玉米自交系B73。本發(fā)明還保護(hù)ZmPHT1；7蛋白、ZmPHT1；7基因、所述重組表達(dá)載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌或以上任一所述所述方法在育種中的應(yīng)用。所述育種具體可為培育磷高效植物。所述磷高效為磷吸收速率高和/或磷轉(zhuǎn)移速率高。所述植物為單子葉植 物或雙子葉植物。所述雙子葉植物具體可為擬南芥，例如瓦斯萊擬南芥。所述單子葉植物具體可為玉米，例如玉米自交系B73。本發(fā)明提供了玉米中參與植物磷吸收和磷轉(zhuǎn)運的蛋白和基因，對于進(jìn)一步闡明植物磷營養(yǎng)的分子機(jī)理并通過基因工程的技術(shù)手段培育磷營養(yǎng)高效的作物新品種具有重要的理論意義和實踐意義。附圖說明圖1為實施例2的結(jié)果。圖2為實施例3的步驟四中ZmPHT1；7插入鑒定、ZmPHT1；7基因表達(dá)鑒定、根部磷含量檢測和磷吸收指標(biāo)檢測的結(jié)果。圖3為實施例3的步驟四中低磷脅迫條件下，ZmPHT1；7玉米過量表達(dá)材料的表型和生理指標(biāo)測定的結(jié)果。具體實施方式以下的實施例便于更好地理解本發(fā)明，但并不限定本發(fā)明。下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。下述實施例中所用的試驗材料，如無特殊說明，均為自常規(guī)生化試劑商店購買得到的。以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。pSuper1300載體：參考文獻(xiàn)：Shietal.EthylenesignalingnegativelyregulatesfreezingtolerancebyrepressingexpressionofCBFandtype-AARRgenesinArabidopsis.PlantCell2012,24:2578-2595。農(nóng)桿菌菌株GV3101：參考文獻(xiàn)：Leeetal.，AgrobacteriumtumefacienspromotestumorinductionbymodulatingpathogendefenseinArabidopsisthaliana.PlantCell2009,21:2948-2962。擬南芥pht1；1Δ4Δ突變體(即文獻(xiàn)中的pht1；1Δ4Δmutant)：參考文獻(xiàn)：Shinetal.,PhosphatetransportinArabidopsis:Pht1；1andPht1；4playamajorroleinphosphateacquisitionfrombothlow-andhigh-phosphateenvironments.PlantJournal2004,39:629-642。實施例中的野生型擬南芥(WT)為瓦斯萊(Wassilewskija)擬南芥。農(nóng)桿菌EHA105：參考文獻(xiàn)：Nyabogaetal.,Agrobacterium-mediatedgenetictransformationofyam(Dioscorearotundata):animportanttoolforfunctionalstudyofgenesandcropimprovement.FrontiersinPlantScience.2014,5:463。玉米自交系B73(即文獻(xiàn)中的MaizeB73)：參考文獻(xiàn)：Weietal,ThePhysicalandGeneticFrameworkoftheMaizeB73Genome.PlosGenetics2009,5： e1000715。MS培養(yǎng)基(Pi濃度為1.25mM)的制備方法：將1650mgNH4NO3、1900mgKNO3、370mgMgSO4·7H2O、170mgKH2PO4、440mgCaCl2·2H2O、22.3mgMnSO4·4H2O、0.83mgKI、0.025mgCuSO4·5H2O、6.25mgH3BO5、0.025mgCoCl·6H2O、8.65mgZnSO4·7H2O、0.25mgNa2MoO4·2H2O、27.8mgFeSO4·7H2O和37.3mgNa2-EDTA溶于水并定容至1L。固體培養(yǎng)基中，每升加入8g瓊脂粉。LP培養(yǎng)基(低磷培養(yǎng)基，Pi濃度為10μM)的制備方法：改變KH2PO4的加入量，使得Pi濃度為10μM，其它同MS培養(yǎng)基。固體培養(yǎng)基中，每升加入8g瓊脂粉。Hogaland營養(yǎng)液(LiangandLi,Differencesincluster-rootformationandcarboxylateexudationinLupinusalbusL.underdifferentnutrientdeficiencies.PlantandSoil2003,248:221–227)：溶劑為水；溶質(zhì)及其濃度如下：K2SO40.75mM，KH2PO40.25mM，KCl0.1mM，MgSO40.65mM，Ca(NO3)22mM，F(xiàn)eNaEDTA0.1mM，H3BO31μM，MnSO41μM，ZnSO41μM，CuSO44μM，(NH4)6Mo2O45μM。低磷營養(yǎng)液：改變KH2PO4的加入量，使得磷濃度為2.5μM，其它同Hogaland營養(yǎng)液。實施例1、ZmPHT1；7蛋白及其編碼基因的發(fā)現(xiàn)一、ZmPHT1；7蛋白及其編碼基因的克隆TRizol(Invitrogen)法提取玉米B73幼苗的總RNA(100-200mg)，經(jīng)甲醛變性RNA瓊脂糖凝膠電泳檢查RNA的完整性。按照SUPERSCRIPTII的使用說明合成單鏈cDNA。將合成的單鏈cDNA稀釋10倍并作為模板DNA，采用Primer1和Primer2組成的引物對進(jìn)行PCR反應(yīng)。Primer1：5'-tataagcttATGGCGCGCGGGGGAGA-3'；Primer2：5'-gctctagaCTACACCATCTGGGTCTCCGAC-3'。PCR體系(50μL)：10μL5×PhusionHFBuffer，4μL2.5mMdNTPmix，2.5μLPrimer1(10μM)，2.5μLPrimer2(10μM)，1μL模板DNA，1.5μLDMSO，0.5μLPhusionDNAPolymerase(2U/μL)，余量為水。PCR程序：98℃預(yù)變性3min；98℃15s，63℃30s，72℃1min20s，35個循環(huán)；72℃延伸10min?；厥占s1620bp的PCR產(chǎn)物，連接到pMD18-T載體，依次進(jìn)行酶切和測序鑒定。測序結(jié)果表明，PCR產(chǎn)物中具有序列表的序列2所示的開放閱讀框，編碼序列表的序列1所示的蛋白質(zhì)。將序列表的序列1所示蛋白質(zhì)命名為ZmPHT1；7蛋白。將ZmPHT1；7蛋白的編碼基因命 名為ZmPHT1；7基因，其開放閱讀框如序列表的序列2所示。實施例2、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得和鑒定一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子并作為模板DNA，采用Primer1和Primer3組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。Primer1：5'-tataagcttATGGCGCGCGGGGGAGA-3'；Primer3：5-gactagtCTACACCATCTGGGTCTCCGAC-3’。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)體系(50μL)：10μL5×PhusionHFBuffer，4μL2.5mMdNTPmix，2.5μLPrimer1(10μM)，2.5μLPrimer3(10μM)，1μL模板DNA，1.5μLDMSO，0.5μLPhusionDNAPolymerase(2U/μL)，余量為水。PCR擴(kuò)增的反應(yīng)程序：98℃預(yù)變性3min；98℃15s，63℃30s，72℃1min20s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。2、用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和SpeI雙酶切步驟1得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，回收酶切產(chǎn)物。3、用限制性內(nèi)切酶HindⅢ和SpeI雙酶切pSuper1300載體,回收約11000bp的載體骨架。4、將步驟2回收的酶切產(chǎn)物和步驟3回收的載體骨架連接，得到重組質(zhì)粒Super:ZmPHT1；7。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒Super:ZmPHT1；7進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在pSuper1300載體的HindⅢ和SpeI酶切位點之間插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。三、轉(zhuǎn)基因擬南芥的獲得1、將重組質(zhì)粒Super:ZmPHT1；7導(dǎo)入農(nóng)桿菌菌株GV3101，得到重組農(nóng)桿菌。2、采用花芽浸泡法(CloughandBent,Floraldip:asimplifiedmethodforAgrobacterium-mediatedtransformationofArabidopsisthaliana.PlantJournal1998,16:735-743.)，用步驟1得到的重組農(nóng)桿菌侵染擬南芥pht1；1Δ4Δ突變體，收獲T1代種子。T2代表示T1代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株，T3代表示T2代自交產(chǎn)生的種子及由它所長成的植株。在含50μg/L潮霉素的MS固體培養(yǎng)基平板上篩選T1代植株并進(jìn)行T2代和T3代的分離比統(tǒng)計，在T3代得到轉(zhuǎn)Super:ZmPHT1；7擬南芥單拷貝純合株系，隨機(jī)取兩個株系并分別命名為pht1；1Δ4Δ/ZmPHT1；7-3和pht1；1Δ4Δ/ZmPHT1；7-14。四、轉(zhuǎn)空載體擬南芥的獲得用pSuper1300載體代替重組質(zhì)粒Super:ZmPHT1；7，其他同步驟三，得到轉(zhuǎn)空載 體擬南芥。五、轉(zhuǎn)基因擬南芥的鑒定分別將pht1；1Δ4Δ/ZmPHT1；7-3的T3代植株(或T3代種子)、pht1；1Δ4Δ/ZmPHT1；7-14的T3代植株(或T3代種子)、pht1；1Δ4Δ突變體植株(或種子)、轉(zhuǎn)空載體擬南芥的T3代植株(或T3代種子)和野生型擬南芥植株(或種子)進(jìn)行如下鑒定：(一)PCR鑒定提取植株的總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA，采用Primer1和Primer3組成的引物對進(jìn)行PCR鑒定。Primer1：5'-tataagcttATGGCGCGCGGGGGAGA-3'；Primer3：5-gactagtCTACACCATCTGGGTCTCCGAC-3’。PCR鑒定的反應(yīng)體系(20μL)：含10×PCR緩沖液2μL，2.5mMdNTPmix0.4μL，10μMPrimer1和Primer3各0.4μL，TaqDNA聚合酶(15U/μL)0.2μL，余量為水。PCR鑒定的反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性5min，95℃30s，63℃30s，72℃1min40s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。結(jié)果見圖1A。pht1；1Δ4Δ突變體和野生型擬南芥均沒有擴(kuò)增出約1620bp的目的條帶，pht1；1Δ4Δ/ZmPHT1；7-3和pht1；1Δ4Δ/ZmPHT1；7-14均擴(kuò)增出了約1620bp的目的條帶。(二)表型和生理性狀鑒定1、表型鑒定將種子播種于MS固體培養(yǎng)基平板并培養(yǎng)至萌發(fā)，將萌發(fā)生長7天的幼苗分成兩組，第一組移入MS固體培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)7天，第二組移入LP固體培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)7天，然后拍照。培養(yǎng)條件：16h光照(光強(qiáng)80μmol·m-2·s-1)/8h黑暗，22℃。照片見圖1B。萌發(fā)生長7天的幼苗在MS培養(yǎng)基上生長7天后，pht1；1Δ4Δ突變體較野生型擬南芥小，pht1；1Δ4Δ/ZmPHT1；7-3和pht1；1Δ4Δ/ZmPHT1；7-14不僅比pht1；1Δ4Δ突變體大且根數(shù)多而且比野生型擬南芥大且根數(shù)多。萌發(fā)生長7天的幼苗在LP培養(yǎng)基上生長7天后，pht1；1Δ4Δ突變體較野生型擬南芥小，pht1；1Δ4Δ/ZmPHT1；7-3和pht1；1Δ4Δ/ZmPHT1；7-14的冠部比pht1；1Δ4Δ突變體和野生型擬南芥大。在MS培養(yǎng)基上和在LP培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)空載體擬南芥的表型與pht1；1Δ4Δ突變體的表型均一致。2、生物量指標(biāo)檢測將種子播種于MS固體培養(yǎng)基平板并培養(yǎng)至萌發(fā)，將萌發(fā)生長7天的幼苗分成兩組(每組120株，各分三個平行)，第一組移入MS培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)7天，第二組移入LP固體培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)7天，然后整株取材，稱取鮮重，進(jìn)行統(tǒng)計。結(jié)果見圖1C。在MS固體培養(yǎng)基或LP培養(yǎng)基上，pht1；1Δ4Δ突變體較野生型擬南芥輕，pht1；1Δ4Δ/ZmPHT1；7-3和pht1；1Δ4Δ/ZmPHT1；7-14鮮重明顯高于野生型擬南芥和pht1；1Δ4Δ突變體。在MS培養(yǎng)基上和在LP培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)空載體擬南芥的結(jié)果數(shù)據(jù)均與pht1；1Δ4Δ突變體的結(jié)果數(shù)據(jù)無顯著差異。3、磷含量指標(biāo)檢測⑴將種子播種于MS固體培養(yǎng)基平板并培養(yǎng)至萌發(fā)，將萌發(fā)生長7天的幼苗分成兩組(每組120株，各分三個平行)，第一組移入MS培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)7天，第二組移入LP固體培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)7天，然后整株取材。⑵取步驟(1)得到的材料，80℃烘干過夜，然后在馬福爐中進(jìn)行灰化處理(先300℃、1小時，再575℃、6小時)，然后用1mL0.1MHCl浸提，得到浸提液。⑶取步驟(2)得到的浸提液，用釩鉬黃法進(jìn)行磷含量測定。釩鉬黃法：取96孔酶標(biāo)板，加入10μL浸提液、150μLH2O和40μL釩鉬酸銨顯色液，充分混勻，室溫反應(yīng)15分鐘，然后將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀，在波長410nm下測定吸光值。根據(jù)同時反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算磷含量。結(jié)果見圖1D。測定結(jié)果顯示，在正常供磷和低磷條件下，pht1；1Δ4Δ/ZmPHT1；7-3和pht1；1Δ4Δ/ZmPHT1；7-14的磷含量明顯高于野生型擬南芥和pht1；1Δ4Δ突變體，pht1；1Δ4Δ突變體的磷含量明顯低于野生型擬南芥，說明ZmPHT1；7有利于植物(擬南芥)的磷積累。在MS培養(yǎng)基上和在LP培養(yǎng)基上，轉(zhuǎn)空載體擬南芥的結(jié)果數(shù)據(jù)均與pht1；1Δ4Δ突變體的結(jié)果數(shù)據(jù)無顯著差異。4、磷吸收指標(biāo)檢測(分四個平行，每個平行中取15株)將種子播種于MS固體培養(yǎng)基平板并培養(yǎng)，萌發(fā)生長7天后，進(jìn)行磷吸收實驗。磷吸收實驗：將植株放入1.5mL預(yù)處理液中，室溫放置20min；吸棄預(yù)處理液，加入1.5mL磷吸收液，置于23℃光照培養(yǎng)箱(光強(qiáng)80μmol·m-2·s-1)中，在2小時和4小時時用預(yù)冷的解吸附劑終止對32P的吸收，并用解吸附劑漂洗植物樣品2次(每次30min)；用吸水紙吸掉殘留于植物樣品表面的液體，將植物樣品于80℃烘干；將烘干的植物樣品放入閃爍瓶，加入1mL閃爍液，用液閃儀進(jìn)行測定，記錄數(shù)據(jù)，根據(jù)進(jìn)入植物材料的32P量折算出進(jìn)入植物材料的磷元素含量。預(yù)處理液：溶劑為水，含5mMMES和0.1mMCaCl2，用Tris將pH值調(diào)至5.7。磷吸收液：溶劑為水，含5mMMES、0.1mMCaCl2和500μMKH2PO4，用Tris將pH值調(diào)至5.7，用前加入0.2μCi/mLH332PO4。解吸附劑：溶劑為水，含5mMMES、0.1mMCaCl2和1mMKH2PO4，用Tris將pH值調(diào)至5.7。結(jié)果見圖1E。測定結(jié)果顯示，pht1；1Δ4Δ/ZmPHT1；7-3和pht1；1Δ4Δ /ZmPHT1；7-14的磷吸收速率明顯高于野生型擬南芥和pht1；1Δ4Δ突變體，pht1；1Δ4Δ突變體的磷吸收速率明顯低于野生型擬南芥，說明提高ZmPHT1；7表達(dá)有利于植物(擬南芥)的磷吸收。轉(zhuǎn)空載體擬南芥的結(jié)果數(shù)據(jù)均與pht1；1Δ4Δ突變體的結(jié)果數(shù)據(jù)無顯著差異。實施例3、轉(zhuǎn)基因玉米的獲得和鑒定一、重組表達(dá)載體的構(gòu)建1、合成序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子并作為模板DNA，采用Primer1和Primer3組成的引物對進(jìn)行PCR擴(kuò)增，得到PCR擴(kuò)增產(chǎn)物。Primer1：5'-tataagcttATGGCGCGCGGGGGAGA-3'；Primer3：5-gactagtCTACACCATCTGGGTCTCCGAC-3’。2、使用Taq酶對步驟1得到的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的平末端進(jìn)行補(bǔ)A，使其具有A粘末端。3、采用限制性內(nèi)切酶XcmI(NEB公司)酶切載體pCXUN(GenBank:FJ905215.1)，使其線性化并具有T粘末端。4、通過TA克隆方法，將步驟2的產(chǎn)物與步驟3的產(chǎn)物連接，得到重組質(zhì)粒UBI:ZmPHT1；7。根據(jù)測序結(jié)果，對重組質(zhì)粒UBI:ZmPHT1；7進(jìn)行結(jié)構(gòu)描述如下：在載體pCXUN的XcmI酶切位點插入了序列表的序列2所示的雙鏈DNA分子。二、轉(zhuǎn)基因玉米的獲得1、將重組質(zhì)粒UBI:ZmPHT1；7導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105，得到重組農(nóng)桿菌。2、用步驟1得到的重組農(nóng)桿菌對受體材料的胚性愈傷組織進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化(FrameandWang,Agrobacteriumtumefaciens-mediatedtransformationofmaizeembryosusingastandardbinaryvectorsystem.PlantPhysiology2002,129:13-22.)，得到轉(zhuǎn)基因玉米。受體材料為玉米自交系B73。OE1、OE2和OE3為隨機(jī)取的三個純合轉(zhuǎn)基因玉米株系。三、轉(zhuǎn)空載體玉米的獲得用載體pCXUN代替重組質(zhì)粒UBI:ZmPHT1；7，其他同步驟二，得到轉(zhuǎn)空載體玉米。四、轉(zhuǎn)基因玉米的鑒定分別將OE1、OE2和OE3的T3代植株(或T3代種子)、玉米B73的植株(或種子)和轉(zhuǎn)空載體玉米的T3代植株(或T3代種子)進(jìn)行如下鑒定：(一)ZmPHT1；7插入鑒定1、將植株培養(yǎng)至三葉一心期，剪取葉片并提取基因組DNA。2、以步驟1提取的基因組DNA為模板，采用UbipF和Primer3組成的引物對(靶 序列約為1700bp)進(jìn)行PCR鑒定。UbipF：5’-TTGATCTTGATATACTTGGATG-3’；Primer3：5’-gactagtCTACACCATCTGGGTCTCCGAC-3’。PCR鑒定的反應(yīng)體系(20μL)：含10×PCR緩沖液2μL，2.5mMdNTPmix0.4μL，10μMUbipF和Primer3各0.4μL，TaqDNA聚合酶(15U/μL)0.2μL，余量為水。PCR鑒定的反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5min；95℃30s，63℃30s，72℃1min40s，35個循環(huán)；72℃延伸10min。結(jié)果見圖2A。結(jié)果顯示，OE1、OE2和OE3均有UBI1:ZmPHT1；7片段插入。(二)ZmPHT1；7基因表達(dá)鑒定1、將植株培養(yǎng)至三葉一心期，分別取根部和冠部，提取總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA。2、以步驟1得到的cDNA為模板，采用ABI公司7500型Real-TimePCRSystem(AppliedBiosystems,FosterCity,CA,USA)、ABIPOWERSYBRGREENPCRMASTERMIX試劑盒、Primer4和Primer5組成的引物對，進(jìn)行定量PCR(qRT-PCR)反應(yīng)。ZmUBQ基因為內(nèi)參基因。Primer4：5’-GAACCAGGACAGGAGCAAGA-3’；Primer5：5’-CCTCCTCTGAGTCTTCAGCC-3’。結(jié)果見圖2B。qRT-PCR結(jié)果顯示，OE1、OE2和OE3中ZmPHT1；7基因的表達(dá)量均顯著高于玉米自交系B73。轉(zhuǎn)空載體玉米中ZmPHT1；7基因的表達(dá)量與玉米自交系B73沒有差異。(三)生理指標(biāo)檢測1、根部磷含量檢測(每個株系120株，分三個平行)取在濕潤蛭石中萌發(fā)生長至一葉一心期的幼苗，去掉胚乳，移苗至1/2Hogaland營養(yǎng)液中培養(yǎng)2天，然后移苗至Hogaland營養(yǎng)液中培養(yǎng)至三葉一心期，然后取根。將根在80℃烘箱烘干至恒重，稱量干重并記錄數(shù)值。將根用剪刀剪碎，置于坩堝，灰化處理(灰化程序為：300℃2h，然后575℃10h)?；一蟮臉悠酚?0mL0.1NHCl浸提，所得浸提液用H2O稀釋至10倍體積，然后采用釩鉬黃法進(jìn)行磷含量測定。釩鉬黃法：取96孔酶標(biāo)板，加入160μL浸提液的10倍稀釋液和40μL釩鉬酸銨顯色液，充分混勻，反應(yīng)15分鐘，然后將酶標(biāo)板置于酶標(biāo)儀，在波長410nm下測定吸光值。根據(jù)同時反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各樣品的磷含量。結(jié)果見圖2C。實驗結(jié)果顯示,OE2和OE3的根部磷含量均明顯高于玉米自交系B73，轉(zhuǎn)空載體玉米的根部磷含量與玉米自交系B73沒有顯著差異，說明過量表達(dá)ZmPHT1；7基因能增加玉米根部的磷含量。2、磷吸收指標(biāo)檢測(每個株系120株，分三個平行)取在濕潤蛭石中萌發(fā)生長至一葉一心期的玉米幼苗，去掉胚乳，移苗至1/2Hogaland營養(yǎng)液中培養(yǎng)2天，然后移苗至Hogaland營養(yǎng)液培養(yǎng)至三葉一心期，然后進(jìn)行玉米磷吸收耗竭實驗。培養(yǎng)條件：28℃，光周期為14h光/10h黑暗。玉米磷吸收耗竭實驗：三棵苗為一組，先用磷吸收耗竭液(磷濃度調(diào)整為100μM，其它同1/2Hogaland營養(yǎng)液)輕柔漂洗玉米幼苗根部，用濾紙吸掉多余液體后，小心放入盛有500mL磷吸收耗竭液的三角瓶，置于搖床(100rpm/min)上，分別在0、0.5、3、8、12、16、21、25和30小時取樣品液，用鉬藍(lán)法測定樣品液中的磷含量。鉬藍(lán)法測定磷含量：取1.5mL離心管，加入350μL顯色反應(yīng)工作液和60μL樣品液，充分混勻，置于42℃水浴30min，然后吸取200μL反應(yīng)液，置于96孔酶標(biāo)板中，在波長820nm下測定吸光值。根據(jù)同時反應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)樣品計算出標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算各樣品液的磷濃度值。顯色反應(yīng)儲液：(NH4)6Mo7O24·4H2O3.5g，98％硫酸23.39mL，用H2O定容至1L；顯色反應(yīng)儲液加入1.4％抗壞血酸即為顯色反應(yīng)工作液，需要現(xiàn)用現(xiàn)配。測定結(jié)果見圖2D。實驗結(jié)果顯示，OE2和OE3的磷吸收速率明顯快于玉米自交系B73，轉(zhuǎn)空載體玉米的磷吸收速率與玉米自交系B73沒有顯著差異，說明過量表達(dá)ZmPHT1；7能提高玉米的磷吸收速率。3、低磷脅迫條件下，ZmPHT1；7玉米過量表達(dá)材料的表型和生理指標(biāo)測定取在濕潤蛭石中萌發(fā)生長到一葉一心期的植株，去掉胚乳，移苗至1/2Hogaland營養(yǎng)液中，繼續(xù)生長至兩葉一心期。選取長勢一致的植株移至低磷營養(yǎng)液、總體積為600L的水培循環(huán)系統(tǒng)中培養(yǎng)，進(jìn)行低磷表型檢測，9天后照相。照相后，將不同葉位的葉片(第1片到第8片)分別取材，在80℃烘箱烘干至恒重，稱量干重并記錄數(shù)值(生物量結(jié)果)。將樣品用剪刀剪碎，置于坩堝，進(jìn)行灰化處理(灰化程序為：先300℃2h，然后575℃10h)?；一蟮臉悠酚?.1MHCl浸提，浸提液用釩鉬黃法進(jìn)行磷含量測定(方法同步驟1)。圖3A為全植株照片。圖3B至圖3H依次為第一至第七葉位的葉片的照片，自左至右依次為B73、OE1、OE2和OE3。照片結(jié)果顯示，在低磷脅迫條件下，OE1、OE2和OE3的第一位葉(L1)和第二位葉(L2)葉邊緣枯黃，而玉米自交系B73的第一位葉和第二位葉依然呈現(xiàn)綠色，OE1、OE2和OE3的第七位葉和第八葉位的葉片大于玉米自交系B73。生物量的測定結(jié)果如3I，測定結(jié)果顯示，OE1、OE2和OE3的第一位葉和第二位葉的葉片干重小于玉米自交系B73，OE1、OE2和OE3的第七位葉和第八葉位的葉片的生物量明顯大于玉米自交系B73。磷含量測定結(jié)果如圖3J。測定結(jié)果顯示，OE1、OE2和OE3的第一位葉和第二位葉的磷含量顯著地低于玉米自交系B73，OE1、OE2和OE3的第三、四、五及六位葉的磷 含量與玉米自交系B73無明顯差異，OE1、OE2和OE3的第七位葉和第八葉位的的磷含量高于玉米自交系B73。上述結(jié)果表明，在低磷條件下，ZmPHT1；7的表達(dá)上調(diào)能提高玉米磷素從老葉運向幼葉的轉(zhuǎn)移。當(dāng)前第1頁1 2 3