本發(fā)明屬于植物基因工程與人體醫(yī)學(xué)交叉領(lǐng)域，更具體地，涉及一種蕓香科植物引起人體上火的基因片段及其在蕓香科植物遺傳改良育種中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

2011年中國柑橘產(chǎn)量以300萬噸穩(wěn)居世界第一位，中國第二位。占柑橘比重較大的溫州蜜柑富含預(yù)防骨質(zhì)疏松、抗癌、預(yù)防心腦血管疾病等功效的功能性成分[2,6]，但消費者過多食用后，會出現(xiàn)皮膚發(fā)癢、口腔潰瘍、喉嚨干疼等“上火”癥狀，使人易感煩躁、失眠，影響人們?nèi)粘Ｉ?，從而影響柑橘等水果的保健功效和種植效益?！吧匣稹笔侵嗅t(yī)概念，其癥狀除了皮膚不明顯反應(yīng)外，和國際上研究的Allergy(過敏)反應(yīng)類似。柑橘被國際上列為過敏食品之一，意大利食用橙子引起過敏的達到17％[1]，芬蘭3歲幼童過敏率為3％[4]。

已有技術(shù)中，對蕓香科植物(如溫州蜜柑)誘導(dǎo)“上火”的具體成分尚不清楚，國內(nèi)也無報道。吃柑橘引起人體上火在日常生活中是一個比較常見的現(xiàn)象，也逐漸引起人們的重視。泰茂林等認(rèn)為血液內(nèi)源自蛋白質(zhì)的降解產(chǎn)物和肽類激素等中分子增多，是上火癥的主要因素之一[12]。從粗提物水平研究園藝植物“上火”已有少量報道，利用巨噬細胞株RAW264.7發(fā)現(xiàn)，“上火”水果荔枝、龍眼粗提物顯著提高前列腺素E2的合成以及上調(diào)COX-2的表達[8]。目前，這類上火物質(zhì)研究還處于粗體物階段，具體功能成分及其結(jié)構(gòu)尚不清楚。

柑橘是世界消費量最大的水果，但“多吃橘子會上火”的認(rèn)識常常造成人們對柑橘的評價降低，影響柑橘消費，降低了人們對柑橘的喜愛。因此，發(fā)掘柑橘中“上火”基因，并利用其對蕓香科植株進行遺傳改良，對提高食品安全具有重要的意義。

參考文獻：

[1]Adler,B.R.,T.Assadullahi,et al.1991.Evaluation of a multiple food specific IgE antibody test compared to parental perception,allergy skin tests and RAST.Clinical and experimental allergy:journal of the British Society for Allergy and Clinical Immunology,21(6):683-688.

[2]Lian,F.,K.-Q.Hu,et al.2006.beta-Cryptoxanthin suppresses the growth of immortalized human bronchial epithelial cells and non-small-cell lung cancer cells and up-regulates retinoic acid receptor beta expression.International Journal of Cancer,119(9):2084-2089.

[3]Livak,T.D.S.K.J.(2008)."Analyzing real-time PCR data by the comparative CT method."Nature Protocols 3:1101-1108.

[4]Ma,D.,Y.Li,et al.2011.Purification and characterization of two new allergens from the salivary glands of the horsefly,Tabanusyao.Allergy,66(1):101-109.

[5]Saarinen,U.M.and M.Kajosaari.1980.Does dietary elimination in infancy prevent or only postpone a food allergy？A study of fish and citrus allergy in 375children.Lancet,1(8161):166-167.

[6]Suzuki,M.,H.Fujii,et al.2010.Lipocalin-type prostaglandin D synthase and egg white cystatin react with IgE antibodies from children with egg allergy.Allergology International,59:175-183.

[7]Uchiyama,S.and M.Yamaguchi.2008.Anabolic effect of beta-cryptoxanthin in osteoblastic MC3T3-E1 cells is enhanced with 17 beta-estradiol,genistein,or zinc sulfate in vitro:the unique effect with zinc on Runx2 and alpha 1(I)collagen mRNA expressions.Molecular and Cellular Biochemistry,307(1-2):209-219.

[8]Warner,T.D.and J.A.Mitchell.2008.COX-2 selectivity alone does not define the cardiovascular risks associated with non-steroidal anti-inflammatory drugs.The Lancet,371(9608):270-273.

[9]Wu,M.-C.2002.Differential effects of foods traditionally regarded as‘heating’and‘cooling’on prostaglandin E2 production by a macrophage cell line.Journal of biomedical science,9(6):596-606.

[10]程運江,伊華林,et al.2001.幾種木本果樹DNA的有效提取.華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,20(5):481-483.

[11]劉永忠,劉慶,et al.2006.一種適合于成熟臍橙果皮和果肉的RNA提取方法華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,25(3):300-304.

[12]龐然,張淑玲,et al.2009.草木犀正丁醇提取物對小鼠巨噬細胞促炎介質(zhì)的影響.中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志,20(19):2893-2896.

[13]泰茂林,肖莉,et al.1990.“上火”證與中分子物質(zhì)關(guān)系初步探討.廣東醫(yī)學(xué),11(6):31-32.

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對“吃柑橘上火現(xiàn)象”對柑橘消費和人體健康的負面影響，本發(fā)明的目的在于提供了一種蕓香科植物引起人體上火的基因及其應(yīng)用，通過基因沉默技術(shù)獲得了能夠進一步改良蕓香科植物(如溫州蜜柑國慶一號、尤力克檸檬)是否引起人體上火反應(yīng)這一性狀的miRNA基因序列及利用該miRNA基因序列得到的miRNA構(gòu)建的沉默載體，對具有引起人體上火反應(yīng)能力的這兩種和其它蕓香科植物的遺傳育種改良有重要意義。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的一個方面，提供了一種蕓香科植物引起人體上火的基因全長，其特征在于，具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列，或者由于增加、缺失或替換一個或多個核苷酸導(dǎo)致的與SEQ ID No.6所示的核苷酸序列同源性不小于80％、且功能相同的衍生核苷酸序列。

本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了基于上述蕓香科植物引起人體上火基因片段的編碼序列，其特征在于，該編碼序列具有如SEQ ID No.9所示的核苷酸序列，或者由于增加、缺失或替換一個或多個核苷酸導(dǎo)致的與SEQ ID No.9所示的核苷酸序列同源性不小于80％、且功能相同的衍生核苷酸序列。

本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了一種蕓香科植物引起人體上火的蛋白質(zhì)，其特征在于，該蛋白質(zhì)是由SEQ ID No.10所示的核苷酸序列直接編碼的蛋白質(zhì)，或者是與由SEQ ID No.10所示的核苷酸序列直接編碼的蛋白質(zhì)同源性在80％至100％、且功能相同的蛋白質(zhì)。

本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了一種用于沉默上述蕓香科植物引起人體上火基因片段的miRNA基因序列，其特征在于，該miRNA基因序列具有如SEQ ID No.11或SEQ ID No.12所示的核苷酸序列，用于獲得miRNA。

本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明提供了一種利用上述miRNA基因序列獲得的miRNA構(gòu)建的沉默載體。

本發(fā)明的另一方面，本發(fā)明提供了上述沉默載體在蕓香科植物育種改良中的應(yīng)用。

通過本發(fā)明所構(gòu)思的以上技術(shù)方案，與現(xiàn)有技術(shù)相比，由于準(zhǔn)確分離出了蕓香科植物中引起人體上火的天然蛋白質(zhì)對應(yīng)的基因片段(即具有如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列或相應(yīng)的衍生核苷酸序列，該基因片段存在于具有引起人體上火這一性狀的天然蕓香科植物中，是蕓香科植物誘發(fā)人體上火的主要原因之一)，進一步細化了具有引起人體上火反應(yīng)這一性狀的蕓香科植物其遺傳基因上的特點，找出了部分蕓香科植物具有能夠引起人體上火這一性狀的根本原因，對改良具有引起人體上火反應(yīng)這一性狀的蕓香科植物具有重要意義，人們可以利用上述基因片段對蕓香科植物的進行遺傳轉(zhuǎn)化，沉默引起人體上火的基因Citsh1的表達，從而利用生物技術(shù)育出不引起人體上火反應(yīng)的蕓香科植物。

本發(fā)明中用于沉默蕓香科植物引起人體上火基因片段(如SEQ ID No.6所示的核苷酸序列)的miRNA基因序列(由于該miRNA是人造miRNA，因此也可稱為amiRNA)，是基于Web MicroRNA Designer網(wǎng)站設(shè)計的兩個用于沉默Citsh1基因的small RNAs(例如與SEQ ID No.11或SEQ ID No.12對應(yīng))，該small RNAs用于構(gòu)建Artificial microRNAs(amiRNAs)載體沉默Citsh1基因，分別為pK2GW7-ami-citsh1-1和pK2GW7-ami-citsh1-2。本發(fā)明所采用的amiRNA技術(shù)方法相對于其他的基因沉默方法具有高效、精確和可控等特點，可以有效的沉默蕓香科植物中Citsh1基因，對蕓香科植物遺傳改良具有重要意義。

本發(fā)明中的沉默載體是利用上述miRNA基因序列對應(yīng)獲得的miRNA構(gòu)建而成，例如，可以是利用在線軟件WMD3-Web MicroRNA Designer設(shè)計靶向柑橘Citsh1基因的兩個amiRNA，以及用于over-lapping PCR的引物I,II,III,IV。該沉默載體可用于沉默如SEQ ID No.6所示的蕓香科植物引起人體上火的基因片段，從而對蕓香科植物育種進行改良。例如，該沉默載體可遺傳轉(zhuǎn)化尤力克檸檬(上胚軸法)，對其潛在的引起人體上火功能進行遺傳改良，所采用的方法及其所獲得的改良植株；或?qū)⒃摮聊d體用于遺傳轉(zhuǎn)化溫州蜜柑愈傷組織并誘導(dǎo)獲得再生植株，對其引起人體上火功能進行遺傳改良，獲得改良植株；愈傷組織可以通過根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)遺傳轉(zhuǎn)化得出，然后誘導(dǎo)抗性愈傷生胚，生芽，生根，進而可以獲得完整植株。

綜上，本發(fā)明通過對蕓香科植物誘導(dǎo)人體上火的關(guān)鍵基因Citsh1進行分離克隆，并針對該基因構(gòu)建基因沉默載體，通過例如農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化對蕓香科植物進行遺傳育種改良，獲得不引起人體上火的蕓香科植物。

附圖說明

圖1是本發(fā)明克隆Citsh1基因、Citsh1基因沉默載體構(gòu)建和其在蕓香科植物遺傳改良育種中的應(yīng)用技術(shù)流程圖；

圖2 Citsh1基因全長克隆瓊脂糖凝膠電泳圖。Citsh1基因全長約1000bp。

圖3 Citsh1基因編碼區(qū)序列(coding sequence，CDS，編碼序列)克隆瓊脂糖凝膠電泳圖。圖中J代表本地早，G代表溫州蜜柑，C代表紅夏橙，Y代表高斑柚。Citsh1基因CDS長度約300～400bp之間。

圖4 Citsh1基因沉默載體構(gòu)建瓊脂糖凝膠電泳圖。經(jīng)過四輪PCR反應(yīng)，通過overlaping技術(shù)合成的兩個Artificial microRNA瓊脂糖凝膠電泳圖。

圖5 Artificial microRNAs(amiRNAs)法設(shè)計Citsh1基因沉默片段。圖表示合成的Artificial microRNAs示意圖，虛線區(qū)域是人工設(shè)計的microRNA。

圖6 Artificial microRNAs(amiRNAs)法構(gòu)建Citsh1基因沉默載體。所構(gòu)建沉默載體結(jié)構(gòu)圖。

圖7多種柑橘果實Citsh1基因相對表達量分析。取溫州蜜柑(國慶1號)、紅橘、甜橙(紅夏橙)、高斑柚、尤力克檸檬五種柑橘果實果肉，分別對其Citsh1基因進行相對表達量分析。

圖8遺傳轉(zhuǎn)化改良檸檬過程。圖8A為侵染后上胚軸培養(yǎng)，圖8B為生芽培養(yǎng)基培養(yǎng)，圖8C為伸長培養(yǎng)基培養(yǎng)，圖8D為抗性芽切下后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)集中生根，8E為生根成功后的陽性苗，圖8F為陽性苗進行為其30d的煉苗。

圖9轉(zhuǎn)基因植株Citsh1基因沉默效果分析。分別取轉(zhuǎn)基因前后檸檬葉片，分析其Citsh1基因沉默效果。

圖10遺傳轉(zhuǎn)化溫州蜜柑愈傷組織篩選示意圖。圖10A為生長良好的溫州蜜柑愈傷組織，用于轉(zhuǎn)基因；圖10B為農(nóng)桿菌侵染后，對愈傷組織進行抗性篩選；圖10C為挑出繁殖的抗性愈傷進行繼代培養(yǎng)。

具體實施方式

為了使本發(fā)明的目的、技術(shù)方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結(jié)合附圖及實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應(yīng)當(dāng)理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。此外，下面所描述的本發(fā)明各個實施方式中所涉及到的技術(shù)特征只要彼此之間未構(gòu)成沖突就可以相互組合。

圖1描繪了通過柑橘提取物單一成分蛋白質(zhì)譜分析、分離克隆Citsh1基因、Artificial microRNAs(amiRNAs)法構(gòu)建Citsh1基因沉默載體以及其在蕓香科植物遺傳改良育種中的應(yīng)用的流程。其中，目標(biāo)的柑橘提取物單一成分蛋白質(zhì)(即能夠引起人體上火反應(yīng)的天然Citsh1蛋白)質(zhì)譜信息通過以下方法步驟獲得：

(1)蕓香科植物果實預(yù)處理：

首先將蕓香科植物果實榨汁，將得到的果汁用紗布過濾得到濾液；然后，將所述濾液冷凍干燥得到固體粉末；

(2)將所述步驟(1)得到的固體粉末通過酚提取法再次提取總蛋白得到蛋白粉末；接著，利用凝膠色譜柱法分離所述蛋白粉末得到目標(biāo)蛋白的粗提取粉末，其中粗提取得到的目標(biāo)蛋白粉末是收集第114分鐘～第147分鐘凝膠色譜柱分離液得到的；

其中，所述總蛋白的再次提取包括：在0℃下向5～7mL的酚提取緩沖液中加入5g所述步驟(1)中得到的固體粉末，配制所述酚提取緩沖液的原料包括蔗糖、EDTA、PMSF、DTT、Triton X-100和pH值為7.5的Tris-HCl，該酚提取緩沖液中Tris的濃度為20mmol/L，蔗糖的濃度為250mmol/L，EDTA的濃度為10mmol/L，PMSF的濃度為1mmol/L，DTT的濃度為1mmol/L，Triton X-100的質(zhì)量百分濃度為1％；接著再向其中加入5mL飽和酚溶液，混合后離心處理，得到水相上層、白色雜質(zhì)中間層以及酚層下層；然后，回收該酚層下層作為收集液，接著向該收集液中加入4倍～5倍體積 醋酸胺濃度為0.1mol/L的甲醇溶液，并在-20℃下靜置12h，得到蛋白沉淀；然后將該沉淀用丙酮清洗后干燥得到蛋白粉末；

所述目標(biāo)蛋白的粗提取包括：將所述蛋白粉末配制成濃度為5mg/mL的蛋白水溶液，取8mL所述蛋白水溶液作為試樣；接著，利用凝膠色譜柱分離該蛋白水溶液試樣，控制流速為1mL/min，然后按時間依次收集100管層析液，每管收集3min，其中第38管～第49管層析液冷凍干燥即得到目標(biāo)蛋白的粗提取粉末；

接著，再將得到的目標(biāo)蛋白粗提取粉末配制成100μL濃度為10mg/mL的上樣液；然后，通過高效液相色譜法利用流動相分離該上樣液并按時間依次收集分離液，所述流動相是由濃度為0.05％的三氟乙酸的乙腈溶液和濃度為0.1％的三氟乙酸的水溶液按體積比10:90配制而成；具體是將所述上樣液溶解在所述流動相中，并通過半制備型COSMOIL C18的柱子，該柱子的溫度為30℃；接著，將其中第4.5分鐘～第5.0分鐘收集到的所述分離液透析去除其中的流動相和無機鹽，然后冷凍干燥濃縮即得到目標(biāo)蛋白的精提取粉末。

該目標(biāo)蛋白的精提取粉末即柑橘提取物Citsh1蛋白固體粉末，將此粉末送往上海中科新生命生物科技有限公司進行質(zhì)譜shotgun分析。

實施例1：柑橘“上火”單一物質(zhì)Cs8g14040蛋白質(zhì)譜分析及其生物信息分析

1.質(zhì)譜分析柑橘“上火”單一物質(zhì)

質(zhì)譜技術(shù)(MS)是目前最重要的蛋白質(zhì)組學(xué)鑒定技術(shù)。其基本原理是將樣品分子離子化后，根據(jù)不同的離子質(zhì)荷比(m/z)的差異來分離并確定分子量?，F(xiàn)今的生物質(zhì)譜有多鐘方法，其中以基質(zhì)輔助激光解吸電離(MALDI)/飛行時間質(zhì)譜測量法(TOF)和電子噴霧電離質(zhì)譜測量法(ESI)為主。

本實驗將柑橘提取物單一成分蛋白質(zhì)(即引起人體上火的天然Citsh1蛋白)處理后做基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)檢測(由上海中科新生命生物科技有限公司做質(zhì)譜檢測)、鑒定蛋白質(zhì)，然后用質(zhì)譜測定肽片段的精確質(zhì)量，將實驗獲得的肽質(zhì)量指紋譜數(shù)據(jù)和甜橙全基因組數(shù)據(jù)庫(http://citrus.hzau.edu.cn/cgi-bin/gb2/gbrowse/orange/)中蛋白質(zhì)進行序列比對，所檢索的蛋白質(zhì)按其匹配的優(yōu)劣進行排序(見表1)，其中以檢索分?jǐn)?shù)較高者作為最終鑒定的蛋白，同時得到匹配基因注冊號為Cs8g14040.3。

表1柑橘單一成分質(zhì)譜及蛋白鑒定

表2為柑橘單一成分質(zhì)譜及蛋白鑒定。根據(jù)基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)的肽質(zhì)量指紋譜與柑橘全基因組數(shù)據(jù)庫(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)比較知，Protein Score最高的是Cs8g14040.3，較高的得分的是Cs8g14040.2、Cs8g14040.1，由此可知該基因的注冊號是Cs8g14040(如序列表SEQ ID NO.1所示)，Cs8g14040.1(如序列表SEQ ID NO.2所示)、Cs8g14040.2(如序列表SEQ ID NO.3所示)、Cs8g14040.3(如序列表SEQ ID NO.4所示)是Cs8g14040基因的三個轉(zhuǎn)錄本，且Cs8g14040.3是對應(yīng)匹配的轉(zhuǎn)錄本。

2.利用生物信息學(xué)方法確定Cs8g14040.3基因結(jié)構(gòu)

對照比較Cs8g14040的基因組序列和編碼序列(CDS,coding sequence)，Cs8g14040基因全長972bp，由2個外顯子組成。Cs8g14040基因編碼三個轉(zhuǎn)錄本，分別為Cs8g14040.1、Cs8g14040.2、Cs8g14040.3。鑒于Cs8g14040.3是后續(xù)研究的基因，因此分析其序列發(fā)現(xiàn)，Cs8g14040.3的兩個外顯子分別位于序列表SEQ ID NO.1所示序列的178-440、586-688bp處；其編碼序列位于第一個外顯子及第二外顯子中，分別位于序列表SEQ ID NO.1所示序列的178-440bp、586-688bp處。Cs8g14040.3基因的5’非翻譯區(qū)(untranslated region,5’-UTR)長177bp，位于序列表SEQ ID NO.1所示序列的1-177bp處；Cs8g14040.3基因的內(nèi)含子(intron)長145bp，位于序列表SEQ ID NO.1所示序列的441-585bp處；Cs8g14040.3基因的3’非翻譯區(qū)(3’-UTR)長284bp，位于序列表SEQ ID NO.1所示序列的689-972bp處。Cs8g14040.3基因編碼一個由121個氨基酸組成未注釋功能的蛋白(如SEQ ID NO.5所 示)。

實施例2：克隆Citsh1基因全長及其編碼序列(Coding sequence,CDS)

關(guān)于基因命名的說明，本發(fā)明中克隆溫州蜜柑中Cs8g14040同源基因命名為Citsh1，且Cs8g14040.1對應(yīng)Citsh1.1、Cs8g14040.2對應(yīng)Citsh1.2、Cs8g14040.3對應(yīng)Citsh1.3。由于Citsh1編碼三個轉(zhuǎn)錄本，而第三個轉(zhuǎn)錄本Citsh1.3是蛋白質(zhì)譜鑒定的目的基因序列，因此本發(fā)明后續(xù)研究中使用的Citsh1若無特別說明指代的是Citsh1.3，便于統(tǒng)一名稱。

實施例2主要有以下幾個步驟：

1.克隆Citsh1基因全長

1.1國慶一號溫州蜜柑DNA的提取

選擇溫州蜜柑嫩葉，采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家柑橘育種中心資源圃的成年母樹，置于-4℃冰箱存放。DNA提取方法參照程運江的方法(參考文獻10)。

⑴.液氮充分研磨樣品后，取0.1g樣品于1.5ml離心管中；⑵.將600μl CTAB提取液(含15g/L CTAB和1.5％體積的巰基乙醇)，預(yù)熱至90℃左右加入事先研磨好的樣品中。將離心管放入65℃水浴鍋中水浴60-90min，每隔30min取出上下輕輕混勻幾次；⑶.水浴完成后，加入700μl氯仿/異戊醇(24/1)溶液，上下混勻10min，11000g離心15min，吸取上清液至另一新的離心管中后再重復(fù)一次該步驟；⑷.加入60μl NaCl(5M)和1ml-20℃冰凍無水乙醇，輕輕顛倒數(shù)次，混勻后-20℃冰凍30min沉淀DNA；⑸.11000g離心5min，棄上清液，加入1ml 70％乙醇浸泡約10h(中途更換2-3次70％乙醇)；⑹.棄70％乙醇，并適當(dāng)風(fēng)干沉淀，每管加入50μl TE和5μl 20μg/ml RNaseA，37℃ 6h或過夜；⑺.檢測DNA質(zhì)量和濃度，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2采用TA克隆法克隆Citsh1基因全長

1.2.1 PCR

擴增基因Citsh1引物對如表2所示。20μl的反應(yīng)體系中包括：1μl cDNA，2μl緩沖液，1.2μl MgCl₂，0.4μl dNTP，0.4μl Taq聚合酶(前述緩沖液和Taq聚合酶購自Fermentas公司,Lithuania)加0.5μl上述引物(如表3所示)。PCR反應(yīng)在ABI 9700(Applied Biosystem)擴增儀上按以下程序完成：94℃，5分鐘，94℃變性30秒，60℃退火50秒，72℃延伸60秒，35個循環(huán)；循環(huán)完成后72℃延伸10分鐘(如表4所示)。

表2 Citsh1基因引物序列

表3克隆Citsh1基因全長PCR反應(yīng)體系

表4克隆Citsh1基因全長PCR反應(yīng)條件

1.2.2 PCR產(chǎn)物的回收與純化

產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，經(jīng)1.2％的瓊脂糖凝膠電泳后，用潔凈的刀片在紫外燈下將片段小心切下放入2.0ml離心管，操作按上海生物工程技術(shù)有限公司凝膠回收試劑盒說明書進行：⑴.按500μl/100mg瓊脂糖凝膠的比例加入Binding Buffer，置于55℃水浴中，加熱溶膠，每2min混勻一次，直至膠徹底融化；⑵.將含有目的片段的Binding Buffer轉(zhuǎn)移至放在2ml收集管內(nèi)的UNIQ-10柱中，室溫放置2-3min，12000g/min離心0.5min；⑶.取下UNIQ-10柱，倒掉收集管中的廢液，將UNIQ-10柱放入同一收集管中，加入500μl的Wash buffer，室溫12000g/min離心0.5min；⑷.重復(fù)步驟3次；⑸.取下UNIQ-10柱，再次將UNIQ-10柱放入收集管中，室溫12000g/min離心2-3min；⑹.將UNIQ-10柱放入一個1.5ml的無菌的離心管中，在柱子膜中央加25μl的無菌水，55℃水浴放置5min；⑺.室溫12000g/min離心2-3min，1.5ml離心管中收集的液體即為回收的DNA片段。

1.2.3感受態(tài)細胞的制備

感受態(tài)大腸桿菌細胞制備：⑴.挑取DH5α大腸桿菌原種菌，用接種環(huán)在LB瓊脂板上劃線培養(yǎng)，挑取白色飽滿的新鮮單菌落，接種到100ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃恒溫搖床培養(yǎng)至OD600達到0.4-0.5；⑵.將搖渾濁的菌液轉(zhuǎn)移至一預(yù)冷的無菌50ml離心管，冰浴10min，4℃4500g/min離心10min，倒掉上清以回收沉淀；⑶.加入10ml預(yù)冷的0.l mol/L CaCl₂懸浮細菌沉淀，冰浴30min，4℃4500g/min離心10min，倒掉上清再次回收細菌沉淀；⑷.加入3ml 0.1mol/LCaCl₂溶液重新懸浮細菌沉淀；⑸.加甘油至終濃度15％-20％，混勻分裝成每管100μl，凍存于-80℃。

1.2.4目的產(chǎn)物的克隆

將純化的產(chǎn)物與pMD18-T載體(購自寶生物工程大連有限公司即TaKaRa公司)進行連接反應(yīng)，按說明書操作，連接反應(yīng)體系中插入Citsh1基因與pMD18-T載體的摩爾比為3:1連接反應(yīng)總體積是10μl，其中包括5μl的Solution I，4μl純化的PCR產(chǎn)物，1μl pMD18-T載體，16℃連接過夜。

之后：⑴.取出大腸桿菌的感受態(tài)，放置冰上凍融，加入10μl連接產(chǎn)物，用移液槍輕輕吸打混勻，在冰上放置30min；⑵.熱激：將離心管在42℃下水浴90s；⑶.冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉(zhuǎn)移至冰浴，2-3min；⑷.復(fù)蘇：每管加450μl液體LB培養(yǎng)基，在37℃搖床200轉(zhuǎn)/min搖動1h；⑸.鋪皿：取100μl菌液均勻涂布于已制備好的LB平板上；⑹.培養(yǎng)：37℃下倒置培養(yǎng)16h左右；⑺陽性克隆的鑒定：用滅菌200μl槍頭挑選白色單菌落，放入盛有5ml液體LB培養(yǎng)基(50μg/ml氨芐青霉素)的10ml滅菌離心管中，約20管，在37℃搖床上培養(yǎng)過夜(12-16h)。

菌液PCR檢測體系：20μl的反應(yīng)體系中包括1μl菌液，2μl緩沖液，1.2μl MgCl₂，0.4μl dNTP，0.4μl Taq聚合酶(前述緩沖液和Taq聚合酶購自Fermentas公司,Lithuania)加0.5μl上述引物(如表5所示)。PCR反應(yīng)在ABI 9700(Applied Biosystem)擴增儀上按以下程序完成：94℃，5分鐘，94℃變性30秒，60℃退火50秒，72℃延伸60秒，35個循環(huán)；循環(huán)完成后72℃延伸15分鐘(如表6所示)。產(chǎn)生的PCR產(chǎn)物，經(jīng)1％的瓊脂糖凝膠電泳后，凝膠電泳檢測(圖2)。

表5克隆Citsh1基因全長菌液PCR反應(yīng)體系

表6克隆Citsh1基因全長菌液PCR反應(yīng)條件

選出10個克隆測序(由上海生工生物股份有限公司完成)，測序結(jié)果表明，本發(fā)明克隆Citsh1基因全長為972bp(見SEQ ID NO.6所示)。

2.克隆Citsh1基因編碼序列

2.1采用TRIzol法提取RNA及反轉(zhuǎn)錄合成cDNA

選擇溫州蜜柑的成熟果實，在其成熟期采自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)國家柑橘育種中心資源圃的成年母樹，用液氮冷凍后，置于-80℃冰箱存放。

總RNA提取參照劉永忠的方法(參考文獻11)。初提?。孩?向10ml離心管(DEPC水浸泡后滅菌)中加入5ml抽提液；⑵.液氮研磨好樣品后，稱取適量(0.5-1g)溫州蜜柑汁胞加入抽提液中；⑶.上下劇烈振蕩混勻30s，室溫靜置15min；⑷.加入2-3ml氯仿，劇烈振蕩15-30s后，室溫靜置10min；⑸4℃，11000g離心15min，取上清至另一10ml離心管中；⑹.重復(fù)步驟4和5一次；⑺.加入等體積冷凍異丙醇，混勻后靜置5-10min；⑻.4℃，11000g離心20min，棄上清；⑼.沉淀用預(yù)冷的75％乙醇(滅菌DEPC水配置)漂洗，并浸泡30min；(10).10000g離心5min，棄乙醇后，稍風(fēng)干后進入純化步驟。

純化：⑴.加入400μl TESAR，充分渦旋溶解沉淀物，渦旋時間至少3min；⑵.分別加入400μl Bu/CTAB和Aq/CTAB，渦旋3min；⑶.將混合液轉(zhuǎn)移至1.5ml的離心管中(DEPC水處理后滅菌)；⑷.室溫下，15000g離心10-15min；⑸.將上層溶液轉(zhuǎn)移至另一個新的1.5ml離心管中；⑹.加入50μl 3M NaAc和1ml預(yù)冷無水乙醇，-80℃冰凍1h；⑺.4℃15000g離心30min，棄上清，稍風(fēng)干；⑻.加30-100μl滅菌DEPC水溶解；⑼.電泳檢測總RNA質(zhì)量，NanoDrop1000測定總RNA濃度；RNA于-80℃保存。

2.2反轉(zhuǎn)錄RT-PCR

將上述總RNA用DNaseI(Invitrogen,美國)處理30分鐘以去除基因組DNA污染。然后將RNA樣品按照RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒(Fermentas,Lithuania)的操作方法反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA：取1-1.5μg總RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板(20μl體系)，反轉(zhuǎn)錄完成后加入80μl雙蒸水稀釋，存于-20℃冰箱備用。

2.3采用TA克隆法克隆Citsh1基因編碼序列

本發(fā)明研究人員克隆Citsh1基因CDS序列參照克隆Citsh1基因DNA全長的方法(瓊脂糖凝膠電泳圖如圖3所示)，PCR引物為Citsh1-F、Citsh1-R和Citsh1.2-F、Citsh1.2-R(如表2)。

選出20個克隆測序(由上海生工生物股份有限公司完成)，測序結(jié)果表明，本發(fā)明克隆到Citsh1.1、Citsh1.2、Citsh1.3。其中Citsh1.1編碼序列(CDS，coding sequence)為381bp(見SEQ ID NO.7所示)、其中Citsh1.2編碼序列(CDS，coding sequence)為339bp(見SEQ ID NO.8所示)、其中Citsh1.3編碼序列(CDS，coding sequence)為366bp(見SEQ ID NO.9所示)。

實施例3利用amiRNA技術(shù)構(gòu)建Citsh1基因沉默載體

1.amiRNA的分子設(shè)計及克隆

利用在線軟件WMD3-Web MicroRNA Designer設(shè)計靶向柑橘Citsh1基因的amiRNA，所設(shè)計的amiRNA有兩條，分別為amiRNA-1"TGTTCGTTTAAGCGTTGGCAC"(見SEQ ID NO.11所示)和amiRNA-2"TAACTTGCAATAGGGTCACCT"(見SEQ ID NO.12所示)，進而獲得amiRNA*以及用于over-lapping PCR的引物I,II,III,IV(表7)。通用引物A和B分別與pRS300質(zhì)粒中MIR319a外圍序列配對。

表7構(gòu)建沉默載體重疊PCR引物

采用Overlaping PCR的方法(表8)，將A,B,C和D反應(yīng)將目的片段整合為一段全新DNA片段(表9、10、11、12)，技術(shù)路線參照WMD3-Web MicroRNA Designer提供的方法。

表8 Overlaping PCR方法

表9反應(yīng)A,B和C的PCR程序

表10反應(yīng)D的PCR程序

表11反應(yīng)A,B和C的PCR體系(50μl)

表12反應(yīng)D的PCR體系(50μl)

以獲得的PCR產(chǎn)物為模板，attB-miRsh-F、attB-miRsh-R為引物進行PCR擴增，分別凝膠電泳后(圖4)，用膠回收試劑盒(上海生物工程技術(shù)有限公司凝膠回收試劑盒)分別收片段attb-ami-citsh1-1和attb-ami-citsh1-2(圖5)。

2.利用gateway重組技術(shù)構(gòu)建沉默載體

Gateway克隆技術(shù)是invitrogen公司的專利，因此后續(xù)操作參照invitrogen公司提供的方法。

將回收的片段通過BP反應(yīng)特異重組在pDNOR207(購自invitrogen公司)上，分別命名為pDNOR207-ami-citsh1-1和pDNOR207-ami-citsh1-2。獲得pDNOR207-ami-citsh1-1和pDNOR207-ami-citsh1-2正確載體質(zhì)粒后，通過LR反應(yīng)特異重組，將ami-citsh1-1和ami-citsh1-2整合到pK2GW7(購自invitrogen公司)載體中，得到pK2GW7-ami-citsh1-1和pK2GW7-ami-citsh1-2(圖6)。至此，成功獲得Citsh1基因沉默載體。

實施例4采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法沉默尤力克檸檬Citsh1基因表達

1.多種柑橘果實Citsh1基因表達量分析

分別采集成熟時期的溫州蜜柑、甜橙(紅夏橙)、紅橘、高斑柚、尤力克檸檬果實，將分離的果實汁胞分別用液氮凍存，隨后按照實施例2中方法提取RNA，以及對提取的RNA進行反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。取1-1.5μg總RNA作為反轉(zhuǎn)錄模板(20μl體系)，反轉(zhuǎn)錄完成后加入40μl滅菌雙蒸水(ddH2O)稀釋，存于-20℃冰箱備用。

Citsh1基因的表達分析：基因的表達分析在ABI 7500實時定量PCR儀(Applied Biosystems,CA,USA)上完成。定量引物見表13，基因擴增體系見表14，擴增的反應(yīng)程序如下：50℃2min，95℃1min；95℃15s；60℃ 1min(40個循環(huán))。2×SYBR Green PCR Mix(貨號4367659)購自appliedbiosystems。每個樣品的cDNA擴增反應(yīng)進行3次獨立重復(fù)?；虻谋磉_量采用2-△△Ct方法計算[3]。之后使用origin9.0軟件對各表達量進行顯著性分析(P＝0.01)。

表13 Citsh1基因定量引物序列

表14實時熒光定量PCR反應(yīng)體系

分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Citsh1在溫州蜜柑(國慶1號)的果肉中表達量最高，尤力克檸檬中次之，而紅橘、甜橙(紅夏橙)、高斑柚中Citsh1基因表達量顯著低于前兩種(P<0.01)(圖7)，表明除了溫州蜜柑，尤力克檸檬也是能夠?qū)е氯梭w“上火”的柑橘品種。由于日常生活中人們食用檸檬的量較小，并未引起顯著的人體上火現(xiàn)象。在本案例中擬使用分子生物學(xué)技術(shù)干涉檸檬中Citsh1基因表達，改良其潛在的導(dǎo)致人體“上火”的功能，作為基于Citsh1基因在柑橘生物技術(shù)改良的第一個實施案例。

2.遺傳轉(zhuǎn)化

2.1農(nóng)桿菌菌液制備

pK2GW7-ami-citsh1-1和pK2GW7-ami-citsh1-2兩個Citsh1基因沉默載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105的方法可參考仝鑄，2008年華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文。

制備農(nóng)桿菌菌液：取出含有目標(biāo)質(zhì)粒的菌液在固體LB平板(含有卡那霉素50mg/L)上劃線，28℃暗培養(yǎng)2d；挑單克隆于新的固體LB平板(含有卡那霉素50mg/L)上劃線，28℃暗培養(yǎng)2d，獲得單菌落；用手術(shù)刀片刮取所有菌體于MT懸浮培養(yǎng)基中，180rpm，28℃振蕩培養(yǎng)1.5-2h備用(用紫外分光光度計測定菌液濃度，調(diào)整至OD600在0.6-0.8)。

2.2檸檬上胚軸遺傳轉(zhuǎn)化

柑橘播種苗上胚軸的遺傳轉(zhuǎn)化以及材料后期培養(yǎng)可參考仝鑄博士畢業(yè)論文(2008)的方法。具體操作步驟如下。

侵染：將外植體浸泡在預(yù)先制備好的農(nóng)桿菌菌液中；侵染20min后，用無菌濾紙吸干上胚軸切斷表面的菌液，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)培養(yǎng)基中于21℃培養(yǎng)3d(圖8A)。

篩選培養(yǎng)：將共培養(yǎng)后的莖段轉(zhuǎn)入上胚軸篩選培養(yǎng)基，26±2℃暗培養(yǎng)1周后轉(zhuǎn)入光/暗(16h/8h)培養(yǎng)(圖8B，圖8C)；

生根培養(yǎng)：將大于1cm的抗性芽切下后轉(zhuǎn)入生根培養(yǎng)集中生根(圖8D，圖8E)，或用于嫁接(試管苗或大砧木)。

移栽：將生長健壯的自根苗和試管嫁接苗取出，洗凈根部的培養(yǎng)基，轉(zhuǎn)入清水中煉苗3d，移栽至盛有滅菌腐殖質(zhì)土的小塑料杯中，上部加蓋一個塑料杯(塑料杯軋孔)，澆透水后，轉(zhuǎn)入溫室中培養(yǎng)；1個月后，將蓋子去掉，視小苗生長情況將其移栽至大盆(圖8F)。

2.3.檸檬中Citsh1基因表達干涉效果檢測

目前成功獲得抗性植株一株(圖8F)，有二十余株再生抗性芽在生根中，預(yù)期還可獲得少量再生植株。采集其葉片，提取RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后，通過ABI 7500實時定量PCR儀分析其葉片組織Citsh1基因表達量，結(jié)果顯示改良后的檸檬植株的葉片中Citsh1基因表達量較野生型檸檬葉片表達量低(圖9)。由于檸檬再生植株生長發(fā)育緩慢，獲得成熟果實時間較久，因此目前沒有果實相關(guān)的數(shù)據(jù)可檢測，但可以預(yù)期再生檸檬的成熟果實中Citsh1基因表達量較野生型檸檬果實中表達量低。通過此方法可達到沉默檸檬中Citsh1基因表達，改良其潛在的導(dǎo)致人體“上火”的功能的目的。

實施例5改良溫州蜜柑導(dǎo)致人體“上火”的功能

由于溫州蜜柑是無籽品種，不能采用與改良尤力克檸檬相同方法即下胚軸遺傳轉(zhuǎn)化，獲得改良植株，因此本實施例特設(shè)計出一種新的改良策略。具體過程是首先通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)化溫州蜜柑愈傷組織沉默其Citsh1基因表達，然后誘導(dǎo)愈傷組織長出胚狀體，獲得再生芽，進而再生芽誘導(dǎo)生根獲得完整植株。

5.1農(nóng)桿菌介導(dǎo)的溫州蜜柑胚性愈傷遺傳轉(zhuǎn)化

根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的柑橘胚性愈傷遺傳轉(zhuǎn)化可參照段艷欣，2006年華中農(nóng)業(yè)大學(xué)博士學(xué)位論文。

外植體準(zhǔn)備：胚性愈傷組織于MT固體基本培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，培養(yǎng)溫度為25±1℃，取培養(yǎng)20d左右生長旺盛的愈傷組織懸浮于MT液體培養(yǎng)基中，于110rpm搖床上預(yù)培養(yǎng)4d后用于農(nóng)桿菌侵染轉(zhuǎn)化(圖10A)。

農(nóng)桿菌準(zhǔn)備：取懸浮活化后的農(nóng)桿菌單菌落接種于固體LB培養(yǎng)基上(含 50mg/LKm)，28℃暗培養(yǎng)2d。刮取培養(yǎng)好的農(nóng)桿菌于MT液體基本培養(yǎng)基中(不含抗生素)，180rpm懸浮培養(yǎng)1.5-2h。

侵染與共培養(yǎng)：OD600＝0.6-0.8的農(nóng)桿菌浸泡愈傷組織30min后，用無菌濾紙吸干愈傷上多余的菌液。將愈傷轉(zhuǎn)移至共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，于21±1℃暗培養(yǎng)3d(圖10B)。

篩選培養(yǎng)，再生與純化：將共培養(yǎng)后的愈傷組織轉(zhuǎn)移至篩選培養(yǎng)基中，26±1℃暗培養(yǎng)篩選。期間將生長迅速的愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基中。約3個月左右，抗性愈傷從已褐化的愈傷組織中長出。從每份長出的抗性愈傷團中挑取一小塊愈傷組織轉(zhuǎn)移至新的篩選培養(yǎng)基中進行純化培養(yǎng)，純化后的愈傷組織長大后再重復(fù)純化一次(圖10C)。

目前愈傷組織正在篩選中(圖10C)，預(yù)期可以獲得轉(zhuǎn)基因沉默Citsh1基因抗性愈傷。

5.2誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因沉默Citsh1基因抗性愈傷組織為再生體系

誘導(dǎo)轉(zhuǎn)基因沉默Citsh1基因抗性溫州蜜柑愈傷組織為再生體系方法參照劉歆碩士論文(2005)。

胚狀體分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)胚狀體30-60d，之后用胚狀體增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)，然后使用生芽培養(yǎng)基培養(yǎng)生芽，生根培養(yǎng)基生根，進而獲得完整植株。

此部分還未進行，但可預(yù)期獲得再生植株，且該再生植株已沉默Citsh1基因表達，改良了其導(dǎo)致人體“上火”功能。

綜上，本發(fā)明以溫州蜜柑(Citrus unshiu Marc)為材料，基于蛋白質(zhì)色譜分離出的上火單一成分蛋白質(zhì)進行蛋白質(zhì)譜shotgun分析。利用質(zhì)譜得到的氨基酸序列，通過柑橘基因組(http://citrus.hzau.edu.cn/orange/)海量數(shù)據(jù)進行tBLASTn，預(yù)測得到的同源片段中基因完整ORF，并通過NCBI上BLAST驗證，最終鑒定蕓香科植物中引起人體上火的基因Citsh1。采用TA克隆的方法，得到Citsh1基因全長及編碼區(qū)(coding sequence，CDS)的準(zhǔn)確序列。本發(fā)明利用在線軟件WMD3-Web MicroRNA Designer設(shè)計了靶向Citsh1基因的兩個amiRNA，并通過over-lapping PCR的方法合成了兩個amiRNA的前體。之后利用gateway的方法構(gòu)建了兩個用于沉默Citsh1基因的載體pK2GW7-ami-citsh1-1和pK2GW7-ami-citsh1-2。通過Realtime-PCR分析了多種柑橘果實中的Citsh1的基因表達量，發(fā)現(xiàn)尤力克檸檬中Citsh1的基因表達量較高，是一種潛在的導(dǎo)致人體上火的蕓香科植株。本發(fā)明通過遺傳轉(zhuǎn)化對尤力克檸檬進行改良，成功獲得轉(zhuǎn)基因植株一株且其葉片中Citsh1的基因表達量顯著下降(檸檬自苗期到果實成熟過程需要多年生長，本發(fā)明中的沉默載體所用的啟動子是35S啟動子，可以預(yù)期檸檬果實中Citsh1的基因會有較好的沉默效果)。除此之外，本發(fā)明還提出一種改良溫州蜜柑導(dǎo) 致人體上火功能的策略，通過轉(zhuǎn)化其愈傷組織，然后誘導(dǎo)其生胚，生芽，生根，進而獲得改良的溫州蜜柑植株。本發(fā)明通過克隆柑橘中“上火”基因，并利用其對蕓香科植株進行遺傳改良，對提高食品安全具有重要的意義。

本發(fā)明序列共提供12條核苷酸和氨基酸序列，其中SEQ ID No.1為Cs8g14040基因全長核苷酸序列，SEQ ID No.2～4分別對應(yīng)Cs8g14040.1、Cs8g14040.2和Cs8g14040.3的核苷酸序列，SEQ ID No.5為Cs8g14040.3氨基酸序列；SEQ ID No.6為Citsh1基因全長核苷酸序列，SEQ ID No.7～9分別對應(yīng)Citsh1.1、Citsh1.2和Citsh1.3的核苷酸序列，SEQ ID No.10為Citsh1.3氨基酸序列；SEQ ID No.11～12分別為amiRNA-1和amiRNA-2的基因序列。本發(fā)明中的蕓香科植物，既包括柑橘屬植物(如橘、柑、柚、橙、檸檬等)，也包括其他常見柑橘類植物(如枳、金橘等)。本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易理解，以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。