本發(fā)明涉及轉(zhuǎn)基因水稻、玉米、棉花、大豆等作物的谷物散糧及其粗加工產(chǎn)品中的蛋白BT-Cry1Ab/Ac的快速檢測方法，屬于轉(zhuǎn)基因檢測領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

隨著各種各樣的轉(zhuǎn)基因食品大量涌入市場，轉(zhuǎn)基因食品的安全性日益?zhèn)涫荜P(guān)注，世界各國對轉(zhuǎn)基因食品的安全性存在較大的爭議。歐盟，日本等地區(qū)已制定相關(guān)法規(guī)對轉(zhuǎn)基因食品進(jìn)行嚴(yán)格的管理。因此，快速檢測轉(zhuǎn)基因作物/植物中轉(zhuǎn)基因蛋白的方法具有重要的意義。

蘇云金芽胞桿菌(Bacillus thuringiensis，簡稱Bt)是一種革蘭氏陽性菌，廣泛存在于土壤、塵埃、水域、沙漠、植物、昆蟲尸體中。二十世紀(jì)50年代，人們發(fā)現(xiàn)Bt菌的殺蟲活性與其伴胞晶體有關(guān)，并證實(shí)這種伴胞晶體由蛋白質(zhì)組成(包括Cry1Ab，Cry1C等)，通常被稱作殺蟲晶體蛋白(insecticidal crystal protein，ICP)。這種蛋白亦成為如今抗蟲轉(zhuǎn)基因作物中最為常用的抗蟲蛋白質(zhì)之一。

目前常用的Bt殺蟲晶體蛋白檢測方法包括基于DNA的PCR檢測方法及基于蛋白質(zhì)的酶聯(lián)免疫吸附法。PCR法能夠從作物種子開始到作物成熟整個過程中對轉(zhuǎn)基因成分進(jìn)行精確檢測，不受樣品的處理方法的影響，但易出現(xiàn)假陽性和假陰性等問題，且因經(jīng)高度處理過的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品及其衍生物，如植物油、糖或者淀粉等中不含任何DNA成分，因此PCR方法無法實(shí)現(xiàn)對此類轉(zhuǎn)基因食品的檢測。酶聯(lián)免疫吸附法可對樣本進(jìn)行批量處理，但其耗時較長，需要專業(yè)技術(shù)人員，且需特殊的儀器，因此該種檢測方法不利于在無相關(guān)專業(yè)技術(shù)用戶市場的推廣和使用。本發(fā)明采用膠體碳免疫層析技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)快速檢測，肉眼即可進(jìn)行判斷，無需專業(yè)技術(shù)人員的便于推廣的目的。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對上述情況，本發(fā)明提供一種快速檢測轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因蛋白 Bt-Cry1Ab/Ac的方法，采用膠體碳免疫層析技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)快速檢測，肉眼即可進(jìn)行判斷，無需專業(yè)技術(shù)人員的便于推廣的目的。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明的技術(shù)方案如下：

一種快速檢測轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因蛋白Bt-Cry1Ab/Ac的方法，包括以下步驟：

步驟一，膠體碳的制備；

步驟二，適合PH值條件下膠體碳標(biāo)記抗體的制備；

步驟三，抗體包被至反應(yīng)膜作為T線及二抗包被至反應(yīng)膜的C線；

步驟四，膠體碳試紙條的制備；

步驟五，從待檢植物中提取蛋白，制備蛋白提取液；

步驟六，將檢測試紙條插入蛋白提取液中反應(yīng)；

步驟七，適當(dāng)反應(yīng)時間后，進(jìn)行肉眼判斷結(jié)果。

優(yōu)選的，步驟二中所述抗體為鼠抗Bt-Cry1Ab/1Ac單克隆抗體；優(yōu)選的，步驟二中PH值為8～10，最優(yōu)選的PH值為9.0。

優(yōu)選的，步驟三中所述抗體亦為鼠抗Bt-Cry1Ab/1Ac單克隆抗體。

優(yōu)選的，步驟三中抗體包被量為100ug/1ml碳。

優(yōu)選的，步驟三中所述二抗為羊抗鼠IgG抗體。

優(yōu)選的，步驟六中所述反應(yīng)溫度為10℃～30℃，更優(yōu)選15℃-25℃。

優(yōu)選的，步驟七中所述反應(yīng)時間為3-15分鐘，更優(yōu)選5-10分鐘。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：采用膠體碳免疫層析技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)快速檢測，肉眼即可進(jìn)行判斷，無需專業(yè)技術(shù)人員的便于推廣的目的。采用膠體碳檢測試紙條，制備出表面帶有游離氨基基團(tuán)的膠體碳納米顆粒，膠體碳相對膠體金具備一系列優(yōu)越性：膠體碳較膠體金更易制備，更易實(shí)現(xiàn)規(guī)?；a(chǎn)且批間差?。荒z體碳黑白信噪比更高，而膠體金紅白對照不易辨別且易受全血檢測的影響；檢測動力學(xué)范圍更廣，大大降低了膠體金易出現(xiàn)的HOOK效應(yīng)的可能性；較膠體金更穩(wěn)定，可于室溫下保存更久；固態(tài)碳對環(huán)境友好，避免了膠體金技術(shù)出現(xiàn)的環(huán)境重金屬污染的情況?？焖贆z測轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因蛋白采用雙抗體夾心免疫層析的原理，樣本中的抗原在側(cè)向移動的過程中與膠體碳標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，繼續(xù)向前方流動和NC膜檢測線 上特異性抗體結(jié)合形成雙抗體夾心復(fù)合物進(jìn)而形成肉眼可見的條帶而進(jìn)行結(jié)果的判定。

附圖說明

圖1為膠體碳試紙條的結(jié)構(gòu)示意圖。

圖2為本發(fā)明與美國一龍同類產(chǎn)品性能比較圖。

圖3中本發(fā)明與北京奧創(chuàng)生物同類產(chǎn)品性能比較圖。

在圖中：1-PVC底板，2-樣品墊，3-硝酸纖維素膜，4-C線，5-T線，6-吸水濾紙，7-膠體碳墊，8-加樣區(qū)。

具體實(shí)施方式

為了使本發(fā)明實(shí)現(xiàn)的技術(shù)手段、創(chuàng)作特征、達(dá)成目的與功效易于明白了解，下面結(jié)合具體圖示，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。

參見圖1～圖3，一種快速檢測轉(zhuǎn)基因植物中轉(zhuǎn)基因蛋白Bt-Cry1Ab/Ac的方法，包括以下步驟：

步驟一，膠體碳的制備；

步驟二，適合PH值條件下膠體碳標(biāo)記抗體的制備；

步驟三，抗體包被至反應(yīng)膜作為T線及二抗包被至反應(yīng)膜的C線；

步驟四，膠體碳試紙條的制備；

步驟五，從待檢植物中提取蛋白，制備蛋白提取液；

步驟六，將檢測試紙條插入蛋白提取液中反應(yīng)；

步驟七，適當(dāng)反應(yīng)時間后，進(jìn)行肉眼判斷結(jié)果。

優(yōu)選的，步驟二中所述抗體為鼠抗Bt-Cry1Ab/1Ac單克隆抗體；優(yōu)選的，步驟二中PH值為8～10，最優(yōu)選的PH值為9.0。

優(yōu)選的，步驟三中所述抗體亦為鼠抗Bt-Cry1Ab/1Ac單克隆抗體。

優(yōu)選的，步驟三中抗體包被量為100ug/1ml碳。

優(yōu)選的，步驟三中所述二抗為羊抗鼠IgG抗體。

優(yōu)選的，步驟六中所述反應(yīng)溫度為10℃～30℃，更優(yōu)選15℃-25℃。

優(yōu)選的，步驟七中所述反應(yīng)時間為3-15分鐘，更優(yōu)選5-10分鐘。

作為優(yōu)選實(shí)施例，步驟一膠體碳的制備方法具體為：

1、向100g碳粉中加入超純水，定容至500ml，攪拌溶解30分鐘后離心(12000g，30分鐘)，收集上清于干凈的燒杯中；

向步驟1的溶液中加入0.5g十六烷基三乙基溴化銨(CTAB)，并定容至500ml，即溶液中碳粉的終濃度(質(zhì)量體積比)為20％，CTAB的終濃度(質(zhì)量體積比)為0.1％；

2、將步驟2所得溶液進(jìn)行超聲破碎：超聲變幅桿Φ6，輸出功率60％，超聲開時3秒，關(guān)時3秒，總時長5分鐘(寧波新芝超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，Scientz-IID)，使之成為懸浮狀的膠體碳納米顆粒溶液；電鏡下觀察，顆粒直徑覆蓋范圍由數(shù)十納米至數(shù)百納米不等；

3、、向步驟3所得溶液中加入100ml的無水乙醇，充分?jǐn)噭蚝?，加?0ml硅烷化試劑(購于Thermo公司，貨號48927)，攪拌速度200轉(zhuǎn)/分鐘，通入氮?dú)馇闆r下，55℃反應(yīng)8小時；待反應(yīng)結(jié)束后，用無水乙醇清洗3～5次，然后再用0.02M PBS(PH7.4)緩沖液洗滌3～5次，至此，制備完成表面帶有游離氨基基團(tuán)的膠體碳納米顆粒。

作為優(yōu)選實(shí)施例，步驟二適合PH值條件下膠體碳標(biāo)記抗體的制備具體方法為：

1、膠體碳最適PH值確定

向一系列不同PH值梯度的硼酸鹽緩沖液中先后加入0.1％納米碳懸液及0.1％TritonX-100。超聲處理(300W，超聲6秒停4秒，工作80個循環(huán))上述混合液后，200rpm離心10分鐘，收集上清并靜置24小時后，觀察無沉淀者即為最適PH值。本發(fā)明中，PH9時，膠體碳最為穩(wěn)定，無沉淀，因此PH 9作為標(biāo)記抗體最適PH值。

2、單克隆抗體的膠體碳標(biāo)記

向800ul 0.02M硼酸緩沖液(PH9.0，下同)中加入100ul抗Bt-Cry1Ab/Ac單克隆抗體M03(購買于華葵金配公司，1mg/ml)，渦旋振蕩混勻。向上述混合液中加入20ul 1.5％(質(zhì)量體積比)EDC溶液，于室溫條件下旋轉(zhuǎn)震蕩20分鐘；向上述混合液中加入200ul實(shí)施例所制備膠體碳納米顆粒，于恒溫?fù)u床中300轉(zhuǎn)，25℃放置2小時；向上述混合液中加入100ul含20％BSA的硼酸緩沖液，繼續(xù)于恒溫?fù)u床中300轉(zhuǎn)，25℃放置5小時；于12000g離心20分 鐘，留取沉淀，0.02M硼酸緩沖液反復(fù)重懸-離心，洗滌4次；最終，1ml 0.02M硼酸鹽緩沖液重懸沉淀并于超聲破碎儀(寧波新芝超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，Scientz-IID)中，超聲分散輸出功率60％，超聲開時3秒，關(guān)時3秒，總時長5分鐘；至此，即得膠體碳標(biāo)記的Bt-Cry1Ab/Ac抗體，置于4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

作為優(yōu)選實(shí)施例，膠體碳試紙條的制備方法具體為：

本發(fā)明檢測試紙條采用雙抗體夾心免疫層析的原理，樣本中的抗原在側(cè)向移動的過程中與膠體碳標(biāo)記的特異性抗體結(jié)合，形成抗原-抗體復(fù)合物，繼續(xù)向前方流動和NC膜檢測線上特異性抗體結(jié)合形成雙抗體夾心復(fù)合物進(jìn)而形成肉眼可見的條帶而進(jìn)行結(jié)果的判定。具體步驟包括：

1、制備用膠體碳標(biāo)記的Bt-Cry1Ab/Ac抗體M03。

2、碳標(biāo)墊及反應(yīng)膜的制備：

按照1∶100比例稀釋膠體碳標(biāo)記的鼠抗BT-Cry1Ab/Ac單克隆抗體M03，噴涂于膠體碳墊上，干燥后備用；按照1∶8000比例稀釋單克隆抗體M02(初濃度為1mg/ml，購買于華葵金配公司)及1∶10000比例稀釋羊抗鼠IgG(初濃度為1mg/ml)后分別包被于硝酸纖維素膜的T線及C線位置，干燥后備用。

3、貼膜及切膜：

從左向右依次將樣品墊，膠體碳墊，硝酸纖維素膜，吸水濾紙依次貼附于PVC底板上且相互之間依附搭接相連。完成之后將試紙切割成寬3mm的試紙條成品。

轉(zhuǎn)基因蛋白Bt-Cry1Ab/Ac快速檢測試紙條的性能評價：

將本發(fā)明所述轉(zhuǎn)基因蛋白Bt-Cry1Ab/Ac快速檢測試紙條分別與市售美國一龍公司及北京奧創(chuàng)生物同類產(chǎn)品進(jìn)行性能比較，具體如下：

1、與美國一龍公司同類產(chǎn)品比較

分別按照產(chǎn)品說明書，對陽性樣品1％Bt63大米(水稻品系為Bt63，別稱Bt秈優(yōu)63或者TT51-1)兩批次Riogene產(chǎn)品與美國一龍同類產(chǎn)品進(jìn)行測試比較，采用娃哈哈純凈水作為陰性對照，檢測結(jié)果如圖2。左一試紙條為美國一龍同類產(chǎn)品，其余均為本發(fā)明試紙條。結(jié)果可見，本發(fā)明檢測試紙條具有更好的靈敏度。

2、與北京奧創(chuàng)生物同類產(chǎn)品比較

分別按照產(chǎn)品說明書，測試陽性KMD1大米(水稻品系為KMD1，別稱克螟稻)。其中樣品1為5％KMD1大米，樣品2為1％KMD1大米；左側(cè)為北京奧創(chuàng)生物同類產(chǎn)品，右側(cè)為本發(fā)明檢測試紙條。檢測結(jié)果可見，本發(fā)明檢測試紙條亦具有更高的靈敏度。樣品1為5％KMD1大米，樣品2為1％KMD1大米；左側(cè)為北京奧創(chuàng)生物同類產(chǎn)品，右側(cè)為本發(fā)明檢測試紙條。

以上顯示和描述了本發(fā)明的基本原理、主要特征和本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)。本行業(yè)的技術(shù)人員應(yīng)該了解，本發(fā)明不受上述實(shí)施例的限制，上述實(shí)施例和說明書中描述的只是本發(fā)明的原理，在不脫離本發(fā)明精神和范圍的前提下本發(fā)明還會有各種變化和改進(jìn)，這些變化和改進(jìn)都落入要求保護(hù)的本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明要求的保護(hù)范圍由所附的權(quán)利要求書及其等同物界定。