本發(fā)明屬于植物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種利用棉花GhPEPC基因創(chuàng)造棉花高油材料的方法。

背景技術(shù)：

目前我國(guó)食用油短缺，對(duì)外依存的比例已經(jīng)達(dá)到60％以上，如果可以改善油料作物的種子含油量，將可以緩解我國(guó)食用油短缺問(wèn)題。棉花是我國(guó)重要的戰(zhàn)略經(jīng)濟(jì)作物，它不僅給人類提供了纖維，棉籽中也含有較為豐富的油脂和蛋白質(zhì)。棉花一直被認(rèn)為是種纖維作物，然而，棉花也是我國(guó)五大油料作物之一，即：油菜、大豆、芝麻、花生、棉籽。我國(guó)多數(shù)棉種的棉籽油含量在30％左右，如果能將油分提高一個(gè)百分點(diǎn)，那么產(chǎn)生的經(jīng)濟(jì)效益將相當(dāng)可觀。然而，長(zhǎng)期以來(lái)我們主要把重點(diǎn)放在了纖維的產(chǎn)量和品質(zhì)改良上，對(duì)棉籽的重視相對(duì)較少，導(dǎo)致理論研究和育種上都落后于棉纖維的研究。棉籽仁脂肪含量35％左右，蛋白質(zhì)含量45％左右，精煉棉籽油一般呈橙黃色或棕色。棉籽油有較好的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是高質(zhì)量的食用油(王彥霞，等.RNA干涉技術(shù)與棉花高油育種.棉花學(xué)報(bào).2011,23(2)：178-183.)。

磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)是控制丙酮酸生成草酰乙酸的酶，也是蛋白質(zhì)合成過(guò)程中的第一個(gè)關(guān)鍵酶。乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)是棉籽油脂肪酸合成途徑中的第一個(gè)關(guān)鍵酶。陳錦清等人于1999年得到了磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶(PEPCase)與乙酰輔酶A羧化酶(ACCase)共同控制植物體中蛋白質(zhì)合成和脂肪合成碳源的分配比例的結(jié)論(陳錦清，郎春秀，胡張華等.反義PEP基因調(diào)控油菜籽粒蛋白質(zhì)/油脂含量比率的研究.農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報(bào).1999,7(4):316-320.)。因此，植物的碳源主要流向兩個(gè)支路：蛋白質(zhì)合成支路和油脂合成支路；如果降低蛋白質(zhì)合成支路中的關(guān)鍵基因的表達(dá)，理論上會(huì)有更多的碳源會(huì)流向油脂合成支路，進(jìn)而提高種子中的油分含量。

RNAi(RNA Interference)干涉技術(shù)是多種干涉技術(shù)中干涉效率較高的一項(xiàng)技術(shù)。RNAi本身也可分為兩種，一種是帶有內(nèi)含子的發(fā)卡式雙鏈RNA(ihpRNA)，一種是不帶有內(nèi)含子的發(fā)卡RNA(hpRNA)。就沉默效率而言，帶有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的RNA沉默結(jié)構(gòu)效率最高，最高可達(dá)90％-100％；不帶內(nèi)含子結(jié)構(gòu)的沉默效率較低。pHellsgate 4載體是pHellsgate系列的一種，可以形成帶有內(nèi)含子的發(fā)卡式雙鏈RNA，通過(guò)在目的基因的引物兩端分別加上一個(gè)特殊的接頭attB1：5’-GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TNN-3’，attB2：5’-GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAA AGC TGG GTN-3’,擴(kuò)增出帶有這種特殊接頭的目的基因，經(jīng)過(guò)特殊BP酶反應(yīng)，把原始載體上帶有attP1和attP2的一段致死基因ccdB置換下來(lái)(Chris A，等.High-throughput vectors for efficient gene silencing in plants.Funct.Plant Biol.2002,29,1217-1225)我們簡(jiǎn)稱此反應(yīng)為BP反應(yīng)。

張銀波2005年克隆了油菜PEPC基因并構(gòu)建了其對(duì)應(yīng)RNA i載體(張銀波等,.油菜PEPase基因的克隆及其對(duì)應(yīng)RNA i載體的構(gòu)建.中國(guó)油料作物學(xué)報(bào).2005,27(1))。張勇2008年克隆了甘藍(lán)型油菜PEPC保 守序列并構(gòu)建了其對(duì)應(yīng)RNA i載體(張勇等，甘藍(lán)型油菜PEPC基因保守序列的克隆和種子特異性ihpRNA表達(dá)載體的構(gòu)建.分子植物育種2008,6(4)：775-780)；Deng 2011年克隆了藻類PEPC2基因并構(gòu)建了RNAi載體，使油分含量提高了14％-28％(Deng,等.The mRNA abundance of pepc2gene is negatively correlated with oil content in Chlamydomonas reinhardtii.BIOMASS&BIOENERGY.2011,35(5)1811-1817.)。目前國(guó)內(nèi)對(duì)棉籽油重視還不夠，本發(fā)明“新”在于用新的PEPC基因的保守序列和新型RNAi載體pHellsgate 4，功能驗(yàn)證表明此方法確實(shí)可以降低PEPC基因的表達(dá)量，也能達(dá)到降低蛋白質(zhì)含量進(jìn)而提高油份含量的目的，申請(qǐng)人認(rèn)為如果油份含量得到提高，那么對(duì)我國(guó)食用油短缺問(wèn)題將具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值和戰(zhàn)略意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是從陸地棉(Gossypium hirsutum)植物中分離克隆一個(gè)包含該功能蛋白同源基因保守編碼區(qū)段的cDNA片段(在本發(fā)明中所述的“cDNA片段”與“核苷酸序列”以及“cDNA分子”同義)，這個(gè)基因參與蛋白質(zhì)的合成過(guò)程。對(duì)這個(gè)基因的編碼序列進(jìn)行分析得到保守區(qū)域的堿基序列，為了區(qū)分于整個(gè)編碼區(qū)域，我們把保守區(qū)域命名為GhPPC基因。利用這個(gè)基因可以降低蛋白質(zhì)的含量，使棉籽油的含量提高3個(gè)百分點(diǎn)。

本發(fā)明的技術(shù)方案如下所述：

本發(fā)明包括陸地棉克隆的PEPC類基因和一種新型高效RNAi干涉載體pHellsgate 4的應(yīng)用。本發(fā)明編碼基因的cDNA序列如SEQ ID NO：1所示，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，該RNAi載體表達(dá)的雙鏈RNA(dsRNA)能顯著棉花內(nèi)源的降低PEPC基因的表達(dá)量，從而降低蛋白質(zhì)的合成，使光合作用的同化產(chǎn)物進(jìn)入油脂的合成路徑，進(jìn)而提高棉花種子中油脂的含量。利用本發(fā)明的RNA干涉(RNAi)載體和PEPC基因保守域，通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化可應(yīng)用于提高棉花種子中油脂的含量。

具體地，本發(fā)明涉及分離和應(yīng)用部分GhPEPC1基因的cDNA片段，即GhPPC，該片段具有降低蛋白質(zhì)合成的能力。其中，所述的GhPPC基因是下列核苷酸序列之一：

1)序列表SEQ NO：1中共308個(gè)堿基所示的cDNA序列(圖1中A圖)，對(duì)棉花基因組中的GhPPC同源基因進(jìn)化分析發(fā)現(xiàn)，該基因與其它基因的同源性較低(圖1中B圖)

本發(fā)明克隆的基因cDNA可在降低棉花(優(yōu)選為陸地棉)蛋白質(zhì)含量提高油分含量上的應(yīng)用，其應(yīng)用步驟如下所述：

(1)通過(guò)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)查找陸地棉PEPC1基因序列(GenBank:AF008939.1)，并Blast其全長(zhǎng)cDNA區(qū)得到它的保守區(qū)域，在其保守區(qū)域內(nèi)選擇了一個(gè)長(zhǎng)度為308bp的cDNA片段并用PCR(Polymerase Chain Reaction)方法進(jìn)行基因克隆。將這一序列與高效RNAi表達(dá)載體pHellsgate 4連接后轉(zhuǎn)化植株。

(2)攜帶有本發(fā)明GhPPC基因的表達(dá)載體可通過(guò)使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化等常規(guī)生物技術(shù)方法導(dǎo)入植物宿主細(xì)胞。具體轉(zhuǎn)化步驟如下：挑選飽滿、健康的棉花種子剝?nèi)シN皮后，用0.1％的HgCl2浸泡10min，再用無(wú)菌水洗滌3次。接種于無(wú)菌苗萌發(fā)培養(yǎng)基上，黑暗條件下，置于28℃恒溫箱中培養(yǎng)4-6d,取無(wú)菌苗下胚軸切成0.5-0.8cm小段接種于0.5OD的用農(nóng)桿菌活化培養(yǎng)基(MGL)懸浮的農(nóng)桿菌菌液中，侵染 10mim后，用無(wú)菌濾紙吸干下胚軸表面的菌液，將下胚軸接種在含有共培培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，21℃共培養(yǎng)48h，最后將下胚軸放入含有頭孢霉素500mg/L的無(wú)菌水中，沖洗3遍,吸干表面水份后，接種到選擇培養(yǎng)基中，每1個(gè)月繼代1次，獲得的胚性愈傷組織轉(zhuǎn)移到胚萌發(fā)及成苗培養(yǎng)基，直到獲得胚性愈傷及體細(xì)胞胚胎發(fā)生。

本發(fā)明中的培養(yǎng)基組分及配比如下所示：

無(wú)菌苗萌發(fā)培養(yǎng)基：1/2MS大量元素，附加15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel。

愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基：MSB+24-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+3％Glucose+0.3％Phytagel

農(nóng)桿菌活化培養(yǎng)基(MGL)：胰化蛋白胨5g/L+NaCl 5g/L+MgSO₄.7H₂O 0.1g/L+KH₂PO₄+0.25g/L+甘露醇5g/L+甘氨酸1.0g/L,pH值5.6

共培養(yǎng)培養(yǎng)基：MSB+2，4-D 0.1mg/l+KT 0.1mg/l+50mg/l AS+3％Glucose+0.25％Phytagel，pH5.6

選擇培養(yǎng)基：MSB+2，4-D 0.1mg/L+KT 0.1mg/L+3％Glucose+0.3％Phytagel，卡那霉素50mg/L和頭孢霉素400mg/L，pH 5.9

胚萌發(fā)及成苗培養(yǎng)基：1/2MS無(wú)機(jī)鹽+B5有機(jī)物，附加15g/L葡萄糖，2.5g/L的Phytagel。

MSB的成分如下：MS培養(yǎng)基+B5維生素，簡(jiǎn)寫(xiě)為MSB.

上述培養(yǎng)基在添加完各組分后，補(bǔ)加蒸餾水定容至1L，在121℃高壓蒸汽下滅菌15分鐘。培養(yǎng)基中涉及到的抗生素的滅菌采用過(guò)濾滅菌，在超凈工作臺(tái)內(nèi)的無(wú)菌環(huán)境下加入到冷卻到60℃的高壓滅菌后的培養(yǎng)基中使用。

培養(yǎng)物的培養(yǎng)條件，除愈傷組織誘導(dǎo)階段不需要光照外，其他的培養(yǎng)階段的培養(yǎng)條件為28±2℃，光照強(qiáng)度為冷光源135μmol m-2s-1，每天光照14h(特殊需要的培養(yǎng)條件除外)。

(3)對(duì)轉(zhuǎn)基因后代反轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)進(jìn)行檢測(cè)其表達(dá)，具體步驟如下：提取轉(zhuǎn)基因植株的總RNA并作反轉(zhuǎn)錄，以cDNA為模板通過(guò)熒光定量PCR對(duì)目的基因的表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)；

引物序列如下：

PPC引物：Q-RT-PPC-F:5’-AGGAGGGGGACCCACGC-3’；

Q-RT-PPC-R:5’-ATTTGGTGAGACAGGGGGATG-3’

PEPC1引物：Q-RT-PEPC1-F:5’-CTGGAAGACACCCTTATTTTGACC-3’；

Q-RT-PEPC1-R:5’-TGACGCAAAGCAACATCCATTA-3’

反應(yīng)體系(20uL)：

(4)利用RT-PCR檢測(cè)鑒定為陽(yáng)性單株用于轉(zhuǎn)錄組分析，

具體步驟如下：

轉(zhuǎn)基因棉花及陰性對(duì)照的葉片分離總RNA，然后獲得mRNA,對(duì)mRNA進(jìn)行片段化處理，然后隨機(jī)合成雙鏈cDNA,構(gòu)建cDNA文庫(kù)，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，在Illumina HiSeq2000平臺(tái)上進(jìn)行高通量測(cè)序，每個(gè)樣品獲得5Gb的數(shù)據(jù)量。對(duì)獲得的高通量數(shù)據(jù)進(jìn)行生物信息學(xué)分析：步驟為：A.原始數(shù)據(jù)整理、過(guò)濾及質(zhì)量評(píng)估；B.與參考基因組比對(duì)；C.蛋白編碼基因的表達(dá)量分析；D.蛋白編碼基因的表達(dá)量差異分析；E.差異表達(dá)基因的富集分析(GO、KEGG)；F.差異表達(dá)基因的聚類分析(熱圖)。通過(guò)轉(zhuǎn)錄組分析對(duì)棉花油份合成通路的所有基因進(jìn)行解析。

(5)考察轉(zhuǎn)基因材料的農(nóng)藝性狀和鑒定轉(zhuǎn)基因材料種籽中油份含量。

分別對(duì)轉(zhuǎn)基因材料和非轉(zhuǎn)基因材料的棉纖維長(zhǎng)度和百粒重等進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)對(duì)轉(zhuǎn)基因材料和非轉(zhuǎn)基因材料的總蛋白質(zhì)的含量、各脂肪酸含量和棉籽油總量的測(cè)量。具體步驟如下：取0.1g材料加入500uL蛋白提取液研磨充分，搖勻，在冰上放至沉淀，離心15min(4℃，13200rpm/min)；吸取上清，重復(fù)離心15min(4℃，13200rpm/min)，取上清于4℃冰箱保存。然后用考馬斯亮藍(lán)G-250和酶標(biāo)儀定標(biāo)測(cè)蛋白質(zhì)濃度，結(jié)果如圖10中的C圖所示。

脂肪酸的測(cè)定方法為：

(1)將組織充分研磨，稱總重，轉(zhuǎn)移到10mL玻璃試管。

(2)向試管中加入1.5mL硫酸、甲醇混合溶液(比例1:39，內(nèi)含0.01％的BHT)和400uL二甲苯溶液，向試管中充入氮?dú)猓瑪Q緊蓋子。

(3)90℃，水浴1h。加入4mL ddH2O和500uL正戊烷，混勻，1000rpm/min，離心5min。

(4)吸取600uL上清轉(zhuǎn)移到測(cè)樣瓶中，常溫放置。脂肪酸測(cè)定結(jié)果如圖10中的D圖。

棉籽油總量的測(cè)量：

(1)將濃硫酸脫絨后的種子晾曬2-3d。

(2)取飽滿的種子用核磁共振分析儀測(cè)量。首先，打開(kāi)儀器，使其運(yùn)行穩(wěn)定；其次，定標(biāo)曲線；最后稱量種重進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果如圖10中的E圖。

本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明克隆的GhPPC基因可以降低蛋白質(zhì)的含量，并提高棉籽油的含量，同時(shí)能夠利用基因工程技術(shù)有目的提高其他油料作物(優(yōu)選為陸地棉)的含油量。

本發(fā)明所使用的干涉表達(dá)載體pHellsgate 4能夠高效率的沉默GhPPC基因，使提高棉籽油份含量成為可能。

附圖說(shuō)明

序列表SEQ ID NO：1是本發(fā)明克隆的陸地棉GhPPC基因的核苷酸序列，序列長(zhǎng)度為308bp。

圖1：利用ClustalX軟件(公開(kāi)使用軟件)對(duì)克隆的GhPPC編碼序列與陸地棉PEPC1保守序列進(jìn)行比對(duì)結(jié)果示意圖。圖1中的A圖顯示本發(fā)明所克隆的GhPPC基因和已經(jīng)公布的陸地棉PEPC1在核苷酸水平的比對(duì)結(jié)果，它們的同源性為100％；圖1中的B圖為GhPPC基因在棉花基因組中的其它拷貝的同源性比較，結(jié)果表明我們克隆的這個(gè)基因與其它同源基因的相似性較低。

圖2：本發(fā)明克隆基因的TA克隆和所使用的干涉表達(dá)載體p35S-GhPPC的構(gòu)建示意圖。圖中：圖2中的A圖是含有GhPPC基因的pGEM-T Easy質(zhì)粒圖譜，將該質(zhì)粒命名為pGEM-T-GhPPC；圖2中的B圖是表達(dá)載體pHellsgate 4質(zhì)粒圖譜；圖2中的C圖是含有GhPPC基因的p35S-GhPPC重組表達(dá)載體T-DNA區(qū)段圖譜。

圖3：為本發(fā)明中的涉及的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化，進(jìn)而獲得轉(zhuǎn)基因的棉花植株。圖3中的A:圖棉花下胚軸與農(nóng)桿菌共培養(yǎng)后，轉(zhuǎn)入抗性篩選培養(yǎng)基中；圖3中的B圖:抗性愈傷組織形成；圖3中的C圖:抗性愈傷組織分化成胚狀體；圖3中的D圖:棉花細(xì)胞通過(guò)體細(xì)胞胚胎發(fā)生獲得再生植株；圖3中的E圖:T0代再生植株移栽到溫室中生產(chǎn)；圖3中的F圖:T1代轉(zhuǎn)基因群體移栽到大田，進(jìn)行農(nóng)藝性狀考察。

圖4：干涉表達(dá)轉(zhuǎn)基因陸地棉T0植株GhPPC基因陽(yáng)性檢測(cè)和表達(dá)量檢測(cè)示意圖。圖4中的A圖各泳道情況：第1-5泳道為轉(zhuǎn)基因陸地棉的5個(gè)不同株系，第7泳道為野生型陸地棉對(duì)照。圖4中的B圖為普通PCR檢測(cè)不同轉(zhuǎn)基因株系中基因的表達(dá)量差異，其中Actin1是陸地棉的肌動(dòng)蛋白基因，作為內(nèi)參基因以參考各樣品的上樣量是否一致。圖4中的C圖為real-time PCR檢測(cè)轉(zhuǎn)基因株系中基因的表達(dá)量差異。

圖5：轉(zhuǎn)基因株系的T0southern雜交結(jié)果與GhPPC-1株系T1southern雜交結(jié)果。圖5中的A圖為轉(zhuǎn)基因株系的T0southern雜交結(jié)果；圖5中的B圖為GhPPC-1株系T1southern雜交結(jié)果，可見(jiàn)分離出兩個(gè)相同單拷貝單株，后續(xù)把這兩株相同的單拷貝作為另一個(gè)新株系，標(biāo)記為GhPPC-7。

圖6：通過(guò)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，比較基因的轉(zhuǎn)錄水平，鑒定出獲得上調(diào)及下調(diào)的基因數(shù)目。

圖7：對(duì)GhPPC基因在整個(gè)棉花基因組中的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)后獲得的數(shù)據(jù)。

圖8：對(duì)非轉(zhuǎn)基因?qū)φ蘸娃D(zhuǎn)基因材料的轉(zhuǎn)錄水平的差異繪制的熱圖(heat-map)。

圖9：根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)繪制的植物油脂合成路徑圖。

圖10：GhPPC-1和GhPPC-7株系T1代的性狀考察。圖10中的A圖為纖維長(zhǎng)度的測(cè)量。圖10中的B圖為脫絨后的棉籽百粒重。圖10中的C圖為葉片蛋白質(zhì)總量。圖10中的D圖為棉籽各種脂肪酸含量。圖10中的E圖為棉籽油總量。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例定義了本發(fā)明，并描述了本發(fā)明在克隆含有GhPPC基因保守編碼區(qū)段的DNA片段，以及驗(yàn)證GhPPC基因功能的方法。根據(jù)以下的描述和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定本發(fā)明的基本特征，并且在不偏離本發(fā)明精神和范圍的情況下，可以對(duì)本發(fā)明做出各種改變和修改，以使其適用不同的用途和條件。

實(shí)施例1 GhPPC基因的克隆

本申請(qǐng)人從陸地棉(Gossypium hirsutum)中克隆得到了一段308bp的序列【所用引物為：GhPPC-F：(5’-TTGAATACTTCCGCCTAGCA-3’),GhPPC-R：(5’-AGCGATTCCAGGGTCTCC-3’)】。對(duì)得到的DNA片段進(jìn)行TA克隆測(cè)序，并與NCBI上的序列進(jìn)行比對(duì)，驗(yàn)證是否是GhPPC基因序列(見(jiàn)圖1中的A圖),同時(shí)我們將GhPPC基因在棉花中的同源基因進(jìn)行了進(jìn)化分析，發(fā)現(xiàn)有多個(gè)拷貝，我們選取了其中兩個(gè)拷貝為RNA干涉的靶標(biāo)，即GhPPC1和GhPPC2基因(見(jiàn)圖1中的B圖)。

1.提取陸地棉葉片的總RNA(改良的異硫氰酸胍法)及cDNA的獲得：

改良的異硫氰酸胍法：

1.1將新鮮的葉片或-70度冷凍的葉片用液氮研磨成粉末，稱取0.10-0.15g粉末與2.0mL離心管中，加入1.0mL RNA裂解液，再加入100uL的2.0mol/L醋酸鈉，充分混勻，于冰上靜置15min。

1.2向離心管中加入700uL的氯仿，蓋緊離心管蓋，劇烈搖動(dòng)10min，冰上靜置5min，離心10min(4℃，13200r/min).

1.3離心結(jié)束后取上清與新的離心管中，加入700uL的氯仿再抽提一次(與步驟1.2相同)。

1.4離心后取上層水相于1.5mL離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇，混勻，-20℃放置20min，離心10min(4℃，13200r/min)，管壁上的白色沉淀即為RNA。

1.5RNA沉淀經(jīng)75％乙醇清洗兩次再風(fēng)干，加入適量的ddH₂O(DEPC)徹底溶解RNA。

1.6在每份樣品中加入DNAase(1U/1uL,購(gòu)自Promega公司)3uL，37℃溫預(yù)30min，再加入ddH₂O(DEPC)至900uL。

1.7加入500uLTE飽和酚：氯仿(體積比1：1)，劇烈搖動(dòng)15min，離心10min(4℃，13200r/min)。

1.8取上層水相于1.5mL離心管中，加入500uL的氯仿再抽提一次(與步驟1.7相同)。

1.9取上層水相于1.5mL離心管中，加入等體積預(yù)冷的異丙醇和1/10體積的2.0mol/L醋酸鈉，充分混勻。-20℃放置20min，離心10min(4℃，13200r/min)，管壁上的白色沉淀即為RNA。

1.10RNA沉淀經(jīng)75％乙醇清洗兩次再風(fēng)干，加入適量的ddH₂O(DEPC)徹底溶解RNA，保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

cDNA的獲得：利用反轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)自Promega公司,USA)將其反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為：70℃5min，42℃60min,70℃10min。

2.陸地棉GhPPC基因序列的獲得：

設(shè)計(jì)引物序列：GhPPC-F：(5’-TTGAATACTTCCGCCTAGCA-3’),GhPPC-R：(5’-AGCGATTCCAGGGTCTCC-3’)。PCR條件為95℃5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，32個(gè)循環(huán)；72℃10min。將擴(kuò)增獲得的PCR產(chǎn)物連入pGEM-T Easy載體(購(gòu)自美國(guó)promega公司)，篩選陽(yáng)性克隆并測(cè)序，得到如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列。

實(shí)施例2：GhPPC基因植物干涉載體的構(gòu)建

根據(jù)得到的SEQ ID NO：1設(shè)計(jì)引物用于構(gòu)建表達(dá)載體，在引物兩端分別加上BP反應(yīng)的接頭堿基，引物序列分別為GhPPC-BP-F：(5’-GGGG ACA AGT TTG TAC AAA AAA GCA GGC TNNTTGAATACTTCCGCCTAGCA-3’),GhPPC-BP-R：(5’-GGGG AC CAC TTT GTA CAA GAAAGC TGG GTNAGCGATTCCAGGGTCTCC-3’)。以pGEM-T-GhPPC質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR條件為95℃5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，32個(gè)循環(huán)；72℃10min。經(jīng)PCR擴(kuò)增得到正確的含有BP接頭的GhPPC片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)BP反應(yīng)連接至pHellsgate 4載體上(BP酶購(gòu)自Invitrogen公司，美國(guó)，25℃4小時(shí))后轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top10感受態(tài)細(xì)胞，以GhPPC的特異引物(GhPPC-F和GhPPC-R)進(jìn)行PCR檢測(cè)來(lái)挑取陽(yáng)性克隆，PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，32個(gè)循環(huán)；72℃10min。并活化提取質(zhì)粒。提取的質(zhì)粒分別用Xhol 1(NEB公司)和Xbal 1(NEB公司)單酶切6h驗(yàn)證酶切片段大小是否相同，相同則證明p35S-GhPPC重組表達(dá)載體構(gòu)建成功，本發(fā)明所用載體結(jié)構(gòu)如圖2所示。

實(shí)施例3 GhPPC基因的遺傳轉(zhuǎn)化及篩選鑒定

1、無(wú)菌苗的準(zhǔn)備

供試材料為野生型陸地棉YZ1(豫早1號(hào)，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院棉花研究所)。在離體培養(yǎng)條件下播種棉花無(wú)菌苗：在超凈工作臺(tái)上將去殼后的種仁用0.1％升汞消毒8min，再用無(wú)菌水清洗3-4次，將所得的無(wú)菌種仁(或稱外植體)接種于無(wú)菌苗培養(yǎng)基中，2天后扶苗，去種皮，5天后可以得到下胚軸。

2、農(nóng)桿菌的活化與侵染

從超低溫冰箱內(nèi)取出保存的含有目標(biāo)基因的表達(dá)載體p35S-GhPPC，通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌LBA4404，涂皿spe⁺抗性，2天后挑取單克隆，菌液PCR挑取陽(yáng)性克隆，PCR反應(yīng)條件為：95℃5min；95℃30sec，55℃30sec，72℃20sec，32個(gè)循環(huán)；72℃10min。后于含spe⁺抗性LB固體培養(yǎng)基上劃線，28℃暗培養(yǎng)36-48h，待皿內(nèi)長(zhǎng)出清晰的單菌落，挑取單菌落在含spe⁺抗性LB液體培養(yǎng)基中過(guò)夜培養(yǎng)(28℃，200rpm)待后續(xù)使用。將菌液5000rpm離心5min，棄上清培養(yǎng)基。加入10ml MGL培養(yǎng)基(活化液)和25uL As，重懸農(nóng)桿菌LBA4404，在搖床中復(fù)蘇1-2小時(shí)(28℃，200rpm)。將下胚軸切成大小約0.8cm切段，用活化后的農(nóng)桿菌侵染8min，倒出風(fēng)干，轉(zhuǎn)入共培養(yǎng)基中于28℃下暗培養(yǎng)。

3、農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化過(guò)程

具體轉(zhuǎn)化步驟為常用方法，轉(zhuǎn)化過(guò)程的測(cè)試參見(jiàn)圖10。

4、轉(zhuǎn)基因植株的陽(yáng)性檢測(cè)

取轉(zhuǎn)基因T0植株新鮮葉片提取DNA(使用植物基因組DNA提取試劑盒，購(gòu)自天根生化科技(北京)有限公司產(chǎn)品)，用35s啟動(dòng)子的上游引物(35s-F:5’-CTGACGTAAGGGATGACGC-3’)和目的基因GhPPC的下游引物(5’-AGCGATTCCAGGGTCTCC-3’)進(jìn)行PCR陽(yáng)性檢驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)圖4中的A圖和圖4中的B圖所示。

實(shí)施例4：轉(zhuǎn)基因植株的表達(dá)量分析和拷貝數(shù)檢測(cè)

GhPPC基因表達(dá)量分析

取轉(zhuǎn)基因T0植株葉片提取RNA，RNA的抽提方法參考改良的異硫氰酸胍法，為常規(guī)方法。

cDNA的合成步驟為：以2ug總RNA為模版，與2ul 500ug/ml oligo-dT(15)引物(購(gòu)自Promega公司)，DEPC-water混合，總體積為15μl；然后70℃變性5min冰上驟冷，短暫離心，使溶液歸于管底；再加5μl M-MLV 5×Reaction Buffer，1.25uL dNTP,0.625uL重組RNasin核酸酶抑制劑,1uL M-MLV反轉(zhuǎn)錄酶(購(gòu)自Promega公司，USA)，補(bǔ)水至25uL。輕彈離心管混合溶液，42℃溫浴1h合成第一鏈；反應(yīng)結(jié)束后70℃處理10min，使反轉(zhuǎn)錄酶失活。稀釋到200uL，-20℃?zhèn)溆谩Ｒ陨鲜龇崔D(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，用引物Q-RT-PPC-F(5'-AGGAGGGGGACCCACGC-3')和Q-RT-PPC-R(5'-ATTTGGTGAGACAGGGGGATG-3')對(duì)GhPPC基因進(jìn)行特異的PCR擴(kuò)增(擴(kuò)增產(chǎn)物大小為190bp)，PCR反應(yīng)體系：95℃5min；95℃30sec，60℃30sec，72℃12sec，32個(gè)循環(huán)；72℃10min。同時(shí)用陸地棉UB7(Genebank:DQ11644)作為內(nèi)參基因，其引物分別為Q-RT-UB7-F(5'-GAAGGCATTCCACCTGACCAAC)和Q-RT-UB7-R(5'-CTTGACCTTCTTCTTCTTGTGCTTG-3')，PCR反應(yīng)體系為：95℃5min；95℃30sec，60℃30sec，72℃20sec，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。獲得的PCR產(chǎn)物取10μl以0.8％瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。電泳檢測(cè)結(jié)果如圖3中的B圖。結(jié)果表明：本發(fā)明克隆的GhPPC基因在不同轉(zhuǎn)基因系中的表達(dá)量有差異，即干涉效率不一樣。其中，PPC-6干涉的就不明顯。后續(xù)做了轉(zhuǎn)基因株系T0植株的real-time PCR，結(jié)果如圖3中的C圖。結(jié)果表明，除PPC-6沒(méi)被干涉掉，其余株系干涉效率較高。另外，對(duì)GhPPC-1和GhPPC-7的T1也做了real-time PCR，結(jié)果見(jiàn)圖4中的C圖和圖4中的D圖。

轉(zhuǎn)基因植株的拷貝數(shù)檢測(cè)：

1.棉花基因組DNA的提取

1.1稱取0.25g棉花葉片，加入800uL DNA抽提液(DNA抽提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司)，研磨充分后轉(zhuǎn)入離心管中，用槍頭吸打混勻，離心8min(室溫，12000rpm)。

1.2棄上清，加入65℃預(yù)熱的GP1700uL，用牙簽像一個(gè)方向旋轉(zhuǎn)輕輕攪拌，至無(wú)塊狀。65℃水浴20min，中間每隔幾分鐘顛倒混勻一次，離心8min(室溫，12000rpm)。

1.3取上清加入到新的離心管中，加酚氯仿800uL，輕搖15min，離心8min(室溫，12000rpm)。

1.4再取上清，加入800uL氯仿，輕搖15min，離心8min(室溫，12000rpm)。

1.5將上一步所得上層水相轉(zhuǎn)入新的離心管中，加入700uL的GP2，充分混勻。

1.6將混勻的液體轉(zhuǎn)入吸附柱CB3中，12000rpm離心30sec，棄掉廢液。

1.7向吸附柱CB3中加入500uL的緩沖液GD(DNA抽提試劑盒，天根生化科技(北京)有限公司)，12000rpm離心30sec，棄掉廢液。

1.8向吸附柱CB3中加入600uL的PW(使用前檢查是否加無(wú)水乙醇)，12000rpm離心30sec，棄掉廢液。再重復(fù)一遍。然后空離心2min；將吸附柱置于室溫晾干。

1.9將吸附柱CB3轉(zhuǎn)移到新的1.5mL的離心管中，想吸附膜中間部位加入50uL洗脫液TE,室溫放置 3min，12000rpm離心2min，將DNA收集到離心管中。

2、拷貝數(shù)分析：southern雜交

流程如下：

DNA酶切，檢測(cè)酶切情況，電泳分離，轉(zhuǎn)膜，洗膜，預(yù)雜交，探針制備，探針標(biāo)記，雜交，洗膜，壓磷屏，最后掃描。

轉(zhuǎn)基因各株系T0,T1代的拷貝數(shù)鑒定見(jiàn)圖5中的A圖和圖5中的B圖。

實(shí)施例5：利用RNA-SEQ技術(shù)對(duì)轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因?qū)φ盏霓D(zhuǎn)錄組進(jìn)行比較研究

1、利用高通量測(cè)序(RNA-SEQ)的手段，對(duì)非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照和轉(zhuǎn)基因株系進(jìn)行轉(zhuǎn)錄水平的比較。通過(guò)分離相同時(shí)期的葉片總RNA，獲得mRNA,最后反轉(zhuǎn)成cDNA，然后加上接頭，或者先將RNA反轉(zhuǎn)成cDNA，然后再片段化并加上接頭.獲得的cDNA片段隨機(jī)打斷，進(jìn)入Illumina公司的Hiseq 2000測(cè)序儀進(jìn)行序列測(cè)定。RNA-SEQ測(cè)序的初步結(jié)果如表1所示，6個(gè)測(cè)序樣品一共獲得了30G的數(shù)據(jù)，每個(gè)樣品獲得的讀長(zhǎng)數(shù)均超過(guò)千萬(wàn)，以陸地棉基因組為參考序列，所獲得讀長(zhǎng)有92％以上可以比對(duì)到棉花基因組上，說(shuō)明我本發(fā)明的測(cè)序質(zhì)量很高。

表1 對(duì)照和非轉(zhuǎn)基因材料的RNA-seq的結(jié)果統(tǒng)計(jì)

2、對(duì)非轉(zhuǎn)基因陰性對(duì)照和轉(zhuǎn)基因的三個(gè)轉(zhuǎn)系的差異表達(dá)基因分析。

對(duì)RNA-SEQ獲得不同基因的表達(dá)量水平差異進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)表達(dá)量有2倍差異的基因進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果如圖6所示，表達(dá)上調(diào)的基因數(shù)目是57個(gè)，而下調(diào)的基因數(shù)目為22個(gè)，見(jiàn)圖6。由于PPC基因有多個(gè)同源基因，因此我們對(duì)17個(gè)PPC基因的同源基因的表達(dá)量(轉(zhuǎn)錄水平)進(jìn)行比較分析，發(fā)現(xiàn)只有本研究中的基因有顯著的下調(diào)，說(shuō)明本發(fā)明的RNAi載體效果顯著，而且特異性較高(圖7)。通過(guò)比較轉(zhuǎn)基因材料和非轉(zhuǎn)基因材料中的和能量代謝相關(guān)基因的表達(dá)差異分析，獲得了heat-map(熱圖，見(jiàn)圖8所示)。從圖8中很明顯地發(fā)現(xiàn)兩類材料中，與碳水化合物合成及脂類合成相關(guān)基因的表達(dá)呈現(xiàn)明顯差異，這種差異的形成正是我們成功干涉PPC基因引起的。

3、通過(guò)整合轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，證實(shí)RNAi技術(shù)能調(diào)節(jié)棉花初生代謝路徑

植物的碳源主要流向兩個(gè)支路：蛋白質(zhì)合成支路和油脂合成支路；如果降低蛋白質(zhì)合成支路中的關(guān)鍵基因的表達(dá)，理論上會(huì)有更多的碳源會(huì)流向油脂合成支路，進(jìn)而提高種子中的油分含量。PPC基因處于植物能量代謝的關(guān)鍵位置(圖9中A圖)，主要調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)合成，本發(fā)明通過(guò)RNAi技術(shù)，抑制(下調(diào))PPC基因的表達(dá)，降低了植物細(xì)胞中蛋白質(zhì)的合成，從而提高油脂合成的能力(圖9中的B圖)，轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)充分說(shuō)明了這一推斷的正確性。棉花油份的新思路，新途徑！

實(shí)施例6：利用轉(zhuǎn)基因株系對(duì)轉(zhuǎn)基因GhPPC棉花植株的農(nóng)藝性狀及種子蛋白及油份進(jìn)行考察

1.GhPPC干涉表達(dá)和野生型陸地棉纖維長(zhǎng)度和百粒重。

纖維長(zhǎng)度如圖10中A圖。

百粒重稱量為隨機(jī)挑取100粒飽滿的脫絨棉籽，稱量總重量。三次重復(fù)。結(jié)果如圖10中的B圖。

2.GhPPC干涉表達(dá)和野生型陸地棉總蛋白質(zhì)的含量測(cè)量。

取0.1g材料加入500uL蛋白提取液研磨充分，搖勻，在冰上放至沉淀，離心15min(4℃，13200rpm/min)；吸取上清，重復(fù)離心15min(4℃，13200rpm/min)，取上清于4℃冰箱保存。然后用考馬斯亮藍(lán)G-250和酶標(biāo)儀，定標(biāo)測(cè)蛋白質(zhì)濃度，結(jié)果如圖10中的C圖。

3.GhPPC干涉表達(dá)和野生型陸地棉各脂肪酸含量和棉籽油總量的測(cè)量。

脂肪酸的測(cè)定方法：

(1)將組織充分研磨，稱總重，轉(zhuǎn)移到10mL玻璃試管。

(2)向試管中加入1.5mL硫酸、甲醇混合溶液(體積比1:39，內(nèi)含0.01％的BHT)和400uL二甲苯溶液，向試管中充入氮?dú)?，擰緊蓋子。

(3)90℃，水浴1h。

(5)加入4mL ddH2O和500uL正戊烷，混勻，1000rpm/min，離心5min。

(6)吸取600uL上清轉(zhuǎn)移到測(cè)樣瓶中，常溫放置。脂肪酸測(cè)定結(jié)果如圖10中D圖。

棉籽油總量的測(cè)量：

(1)將濃硫酸脫絨后的種子晾曬2-3d。

(2)取飽滿的種子用核磁共振分析儀測(cè)量。首先，打開(kāi)儀器，使其運(yùn)行穩(wěn)定；其次，定標(biāo)曲線；最后稱量種重進(jìn)行測(cè)量。結(jié)果如圖10中的E圖。

以上結(jié)果說(shuō)明陸地棉GhPPC基因具有降低蛋白質(zhì)含量和提高油份含量的能力，利用本發(fā)明克隆的基因和所使用的載體可用于棉花或其他油料作物的蛋白質(zhì)或油脂的改良。