本發(fā)明涉及植物育種技術領域，具體而言，涉及一種納豆激酶的轉基因方法。

背景技術：

納豆激酶(nattokinase簡稱NK)是從日本食品中納豆提取和純化的酶(EC 3.4.21.62)。在中國得到豆豉當中也含有納豆激酶。Nattō是從發(fā)酵大豆制成的，通過將細菌納豆芽孢桿菌加入到煮沸的大豆中通過發(fā)酵產(chǎn)生。并且作為傳統(tǒng)食品已經(jīng)安全使用了幾千年。納豆激酶由作用于大豆的細菌產(chǎn)生。盡管其名稱為激酶，但納豆激酶不是激酶，而是枯草桿菌蛋白酶家族的絲氨酸蛋白酶。它表現(xiàn)出很強的纖維蛋白溶解活性【1】。

納豆激酶由于其存在于食物當中，可以由胃腸道吸收。納豆激酶的體外、體內(nèi)溶栓性，以及動物和臨床試驗已經(jīng)證明其具有溶解血栓，降低血粘度，改善血液循環(huán)，軟化和增加血管彈性等作用。在體內(nèi)作用迅速、持續(xù)時間長，還能激活體內(nèi)的tPA，使之溫和、持續(xù)地提高血液的纖溶活性【1】?？诜{豆激酶膠囊可以可以預防心血管疾病，中風，以及老年癡呆。在一個病例中，每天連續(xù)服用阿司匹林和400mg的納豆激酶連續(xù)7天以預防中風的患者出現(xiàn)急性腦出血【2】。目前納豆激酶在亞洲，歐洲，以及美洲都可以買到。

納豆激酶由aprN基因編，其首先從枯草芽孢桿菌納豆中克隆并由Nakamura等人測序(1992)【3】。全長多肽含有29個殘基的信號肽，其有助于蛋白質(zhì)從細胞膜分泌出來，77個殘基的前肽，在蛋白質(zhì)折疊過程中作為分子內(nèi)伴侶起關鍵作用。成熟的納豆激酶由275個氨基酸按照固定排列方式組成，分子量是27kDa。納豆提取的納豆激酶被認為是安全，溶栓強，低成本，預防治療心臟和心血管疾病，幫助血液循環(huán)系統(tǒng)的最佳膳食補充劑。傳統(tǒng)的納豆發(fā)酵過程簡單直接，可以在家里做。將煮熟的大豆用納豆芽孢桿菌接種并在室溫下孵育一天進行發(fā)酵，直到豆用粘性和粘性物質(zhì)谷氨酸聚合物覆蓋。納豆工業(yè)生產(chǎn)是優(yōu)化發(fā)酵條件，包括最佳溫度，pH和調(diào)節(jié)發(fā)酵時間，以增加NK產(chǎn)量。納豆可以在pH 6～12下保持活性，耐高達60℃的高溫，它在60℃以上失去活性【1】。目前市售的NK產(chǎn)品在室溫下保持活性至少6個月。

目前，納豆在日本以外的地方均以膠囊形式被消費。與簡單的發(fā)酵過程相比，從納豆?jié){中提取和純化納豆是復雜且低效的。更多的操作單位涉及有機溶劑均化，鹽析，蛋白質(zhì)離子交換和透析等，這些冗長的過程減少納豆產(chǎn)量以及降低其活性，最終產(chǎn)品中過量的副產(chǎn)物也可能導致過敏。為了增加納豆的產(chǎn)量和簡化其下游純化過程，越來越多的科研人員利用基因工程重組技術來生產(chǎn)納豆激酶。大腸桿菌(Escherichia coli)的最簡單和最便宜的宿主系統(tǒng)已被廣泛用于重組納豆激酶的生產(chǎn)。雖然納豆激酶可以在大腸桿菌中表達，但是大量的重組蛋白聚集在一起，導致產(chǎn)生不溶性，無活性包涵體【4】。大多數(shù)蛋白質(zhì)在包涵體溶解和再折疊期間損失，而且重組納豆激酶的纖維蛋白溶解活性遠低于從納豆分離的NK。枯草芽孢桿菌是另一種有吸引力的表達宿主，因為它具有產(chǎn)生分泌蛋白的能力。Wu等人(2011)改變納豆激酶(PaprN)啟動子的-10元素(TACAAT)為共識-10區(qū)(TATAAT)，成功增強納豆激酶在重組枯草芽孢桿菌(643mg/L)中的表達【5】。然而，枯草芽孢桿菌本身產(chǎn)生大量天然蛋白酶，可以水解重組蛋白。真核表達系統(tǒng)也已經(jīng)應用于納豆激酶的產(chǎn)生。Li等(2007)修改了桿狀病毒表達系統(tǒng)，在昆蟲細胞中表達可溶性，具有高度活性的納豆激酶【6】。然而，使用昆蟲細胞生產(chǎn)納豆激酶成本太高，不具有實用性。相比較于大腸桿菌系統(tǒng)，酵母能夠?qū)χ亟M擔保進行翻譯后修飾，并具有折疊重組蛋白的機制。巴斯德畢赤酵母(P.pastoris)具有在發(fā)酵培養(yǎng)中生長高密度和產(chǎn)生大量重組蛋白的優(yōu)點。Luo等人(2003)【7】報道在巴斯德畢赤酵母中表達納豆激酶并檢測纖維蛋白溶解活性。但是因為巴斯德畢赤酵母需要利用甲醇來誘導表達，殘留的甲醇對人體非常有害。所以利用酵母表達納豆激酶沒有繼續(xù)研究。

利用植物系統(tǒng)生產(chǎn)重組人類藥物蛋白質(zhì)已成為一個有吸引力的替代品，并已研究了30多年。然而，各種困難，如低產(chǎn)量，限制生物安全法規(guī)，花粉污染和下游加工，阻礙了其實際應用。由于生物信息學，蛋白質(zhì)組學和基因組學的快速發(fā)展正在鋪平利用植物生產(chǎn)藥用蛋白從實驗室到工業(yè)應用的途徑。2012年5月，胡蘿卜衍生的重組taliglucerase alfa(商品名：ELELYSO^TM)成為FDA批準的治療戈謝病的第一個植物重組酶。真正吸引科學家注意的是2014年埃博拉病毒流行病。埃博拉病毒致死約為50％，在此期間造成11,000人死亡。當時沒有有效的治療方法可以治療埃博拉病毒，除了Zmapp，一種煙草里面提取的轉基因藥用抗體。Zmapp給藥后7名埃博拉患者恢復100％。因此，Zmapp被FDA于2015年9月授予快速臨床試驗。鑒于這些成功，研究人員大力研究使用植物作為人類藥物的工廠。目前，許多植物來源的重組治療性蛋白質(zhì)在臨床試驗下，并且?guī)讉€已經(jīng)得到FDA批準【8】。

利用植物系統(tǒng)生產(chǎn)重組人類藥物蛋白質(zhì)的一個非常有利的方面是，初期研究不需要大量的財政投資來進行。植物可以在溫室中生長或在實驗室中生長。相對于大腸桿菌，酵母或哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，植物維持成本低，并且用于制備重組蛋白的來源(植物葉或種子)是潛在無限的。植物表達系統(tǒng)在生產(chǎn)速度，成本和安全性方面具有超過原核和其它真核細胞系統(tǒng)的幾個主要優(yōu)點。植物可以正確地折疊和裝配復雜蛋白質(zhì)，例如分泌抗體，生產(chǎn)免疫球蛋白。植物還具有翻譯后修飾的能力。同時，植物當中不存在侵染人類的動物病原體(朊病毒，病毒和支原體)，因此提高了安全性。一般來說，利用植物系統(tǒng)生產(chǎn)重組人類藥物蛋白質(zhì)及其衍生產(chǎn)品的成本僅為利用哺乳動物細胞培養(yǎng)系統(tǒng)的0.1％和微生物系統(tǒng)的2％～10％【8】。

納豆激酶可以通過消化道進入循環(huán)系統(tǒng)，所以本研究利用轉基因大豆和黃瓜植物來生產(chǎn)納豆激酶。在大豆中，重組蛋白產(chǎn)量可達到總溶解蛋白的4％【9】。大豆是重組納豆激酶生產(chǎn)的理想平臺，因為天然納豆激酶由發(fā)酵大豆產(chǎn)生?？梢源笠?guī)模的從大豆中純化提取納豆激酶。而且大豆制劑，例如豆?jié){，粉末或面粉，已經(jīng)生產(chǎn)成為嬰兒食品，使用后幾乎沒有副作用。使用大豆制劑技術用于納豆激酶的應用，省略了從轉基因大豆種子中純化重組納豆激酶的步驟，大大節(jié)省了開支。利用轉基因黃瓜來表達納豆激酶是可以食用納豆激酶是理想的產(chǎn)品，因為食用省略了純化和儲存納豆激酶的繁瑣和復雜的過程。而且因為黃瓜本身是食品，其植物可以在當?shù)厣L，從而抵消長距離運輸和儲存的成本。食用含有納豆激酶的黃瓜安全性高，因為一般來說，引起植物疾病的病原體不會感染人類，而且黃瓜可以保持納豆激酶的活性。其植物細胞壁可以保護納豆激酶存在于消化系統(tǒng)中很長一段時間不被降解，從而有利于進入循環(huán)系統(tǒng)【10】。

有鑒于此，特提出本發(fā)明。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種修飾過的納豆激酶基因，并提供配套的表達系統(tǒng)，以在特定植物中表達納豆激酶。

為了實現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術方案：

描寫獨權的技術方案。

一段分離的DNA片段，用于表達納豆激酶，其序列為SEQ ID NO：1所示。

Natto(aprN)基因序列是根據(jù)Genbank Sequence ID:KJ174339.1.在基因的3’端分別加上6×His tag(組氨酸標簽)，KDEL(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號)。

一種載體，其包含如上所述的DNA片段。

優(yōu)選的，如上所述的載體，所述載體為pUC57。

優(yōu)選的，如上所述的載體，其通過下列步驟構建得到：

a)、將SEQ ID NO：2所示的菜豆種子特異性啟動子phas連入pCambia3300的EcoRI/SacI位點，得到pPhas；

b)、以如上所述的載體為模板擴增出納豆激酶基因以及6×His片段，連接入pPhas的SacI/BamHI位點，得到pPhas-aprN；

c)、將胭脂堿合酶終止子nosT片段連接入pPhas-Natto的BamHI/PstI位點即得。

優(yōu)選的，如上所述的載體，其通過下列步驟構建得到：

a)、將SEQ ID NO：3所示的番茄果實特異性啟動子LA22CD07連入pCambia2200的SacI/KpnI位點，得到pLA22CD07；

b)、以如上所述的載體為模板擴增出納豆激酶基因以及6×His片段，連接入pLA22CD07的KpnI/BamHI位點，得到pLA22CD07-aprN；

c)、將胭脂堿合酶終止子nosT片段連接入pLA22CD07-aprN的BamHI/PstI位點即得。

一種宿主細胞，其被如上所述的載體所轉化；

優(yōu)選的，所述宿主細胞為農(nóng)桿菌。

一種轉基因方法，用于將納豆激酶基因轉入目的植物，包括：

1)、將如上所述的載體通過宿主細胞介導導入目的植物的細胞；

2)、生出轉基因植物；

3)、選擇出轉基因植物；

4)、可選的，增殖步驟3)獲得的植物以獲得后代。

本發(fā)明的轉基因植物使用植物生物技術領域技術人員已知的轉化方法制備。任何方法可被用于將重組表達載體轉化進植物細胞中，以產(chǎn)生本發(fā)明的轉基因植物。轉化方法可包括直接和間接的轉化方法。合適的直接方法包括聚乙二醇誘導的DNA攝入、脂質(zhì)體介導的轉化、使用基因槍導入、電穿孔、以及顯微注射等。在本發(fā)明的具體實施方式中，本發(fā)明使用了基于農(nóng)桿菌的轉化技術。農(nóng)桿菌可包含質(zhì)粒和本發(fā)明提供的DNA片段，所述質(zhì)粒和DNA片段在用農(nóng)桿菌轉染后被轉移至植物的植株或種子，而DNA片段被整合進植物細胞的基因組中。本發(fā)明的核苷酸序列尤其適用于雙子葉的植物細胞，更優(yōu)選的為葫蘆科植物或豆科植物，但不排除在其它物種中也具有表達納豆激酶的作用。

優(yōu)選的，如上所述的轉基因方法，所述目的植物為黃瓜或大豆。

納豆激酶可以通過消化道進入循環(huán)系統(tǒng)，所以本研究利用轉基因大豆和黃瓜植物來生產(chǎn)納豆激酶。在大豆中，重組蛋白產(chǎn)量可達到總溶解蛋白的4％【9】。大豆是重組納豆激酶生產(chǎn)的理想平臺，因為天然納豆激酶由發(fā)酵大豆產(chǎn)生。可以大規(guī)模的從大豆中純化提取納豆激酶。而且大豆制劑，例如豆?jié){，粉末或面粉，已經(jīng)生產(chǎn)成為嬰兒食品，使用后幾乎沒有副作用。使用大豆制劑技術用于納豆激酶的應用，省略了從轉基因大豆種子中純化重組納豆激酶的步驟，大大節(jié)省了開支。利用轉基因黃瓜來表達納豆激酶是可以食用納豆激酶是理想的產(chǎn)品，因為食用省略了純化和儲存納豆激酶的繁瑣和復雜的過程。而且因為黃瓜本身是食品，其植物可以在當?shù)厣L，從而抵消長距離運輸和儲存的成本。食用含有納豆激酶的黃瓜安全性高，因為一般來說，引起植物疾病的病原體不會感染人類，而且黃瓜可以保持納豆激酶的活性。其植物細胞壁可以保護納豆激酶存在于消化系統(tǒng)中很長一段時間不被降解，從而有利于進入循環(huán)系統(tǒng)【10】。

如上所述轉基因方法制備得到的轉基因植株。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明具體實施方式或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對具體實施方式或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實施方式，對于本領域普通技術人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。

圖1為黃豆種子特異性表達納豆激酶載體pCAM-phas-aprN構建流程；

3’T：煙草花椰菜花葉病毒35S終止子；bar：除草劑草丁膦基因：35S’：煙草花椰菜花葉病毒35S啟動子；phas：菜豆種子特異性啟動子；aprN：納豆激酶基因；6×His：組氨酸標記；nosT(nopaline synthase terminator)：胭脂堿合酶終止子；RB和LB分別是植物DNA的左右邊界；

圖2為黃瓜表達納豆激酶載體pCAM-LA22CD07-aprN構建流程；

3’T：煙草花椰菜花葉病毒35S終止子；NptII(Neomycinphosphotransferase II Gene)：霉素磷酸轉移酶II基因：35S’：煙草花椰菜花葉病毒35S啟動子；LA22CD07：西紅柿果實特異性啟動子；aprN：納豆激酶基因；6×His：組氨酸標記；nosT(nopaline synthase terminator)：胭脂堿合酶終止子；RB和LB分別是植物DNA的左右邊界；

圖3為利用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)檢測純化的重組納豆激酶實驗結果圖；1:蛋白分子量標準；2：純化轉基因納豆激酶黃豆蛋白(5μg)；3：純化轉基因納豆激酶黃瓜(5μg)；4：非轉基因大豆蛋白(5μg)；5：非轉基因黃瓜蛋白(5μg)；

圖4為植物中提取的重組納豆激酶溶血纖維平板實驗結果圖；1：非轉基因大豆提取液蛋白50μg；2：非轉基因黃瓜提取液蛋白50μg；3：轉基因納豆激酶黃豆蛋白提取液50μg；4：轉基因納豆激酶黃瓜蛋白提取液50μg；5：標準納豆激酶50μg；

圖5為植物中提取的重組納豆激酶溶血實驗結果圖；1：非轉基因大豆提取液蛋白50μL；2：非轉基因黃瓜提取液蛋白50μL；3：轉基因納豆激酶黃豆蛋白提取液50μL；4：轉基因納豆激酶黃瓜蛋白提取液50μL；5：標準納豆激酶50μL。

具體實施方式

本發(fā)明以pUC57-Natto質(zhì)粒為模板，將編碼納豆激酶aprN(全長)基因用PCR方法擴增出來，然后克隆到植物載體系統(tǒng)中。利用豇豆啟動子(Phas)將納豆激酶定位在大豆種子中表達。利用果實特異性啟動子(LA22CD07)激活納豆激酶在后期成熟的黃瓜中表達。黃豆的抗性基因為Bar，可以抗除草劑。黃瓜的抗性基因為nptII，對卡那霉素具有抗性。構建好的植物表達載體用限制性內(nèi)切酶酶切來鑒定其正確性。

除非另有限定，本發(fā)明使用的所有技術和科學術語具有與所公開的實施方案所屬領域的普通技術人員通常理解的相同的含義。雖然與本發(fā)明所述的方法和材料類似或等同的方法和材料可用于本實施方式的實踐或測試中，但下文仍然描述了合適的方法和材料。本發(fā)明提及的所有出版物、專利申請、專利以及其他參考文獻通過引用全部內(nèi)容結合于本文中。在沖突的情況下，本說明書(包括定義)將起支配作用。此外，材料、方法以及實施例僅僅是說明性的，而不旨在限制。實施方式的其他特征和優(yōu)點將從以下詳細的說明書和權利要求中變得明顯。

為了促進理解本文描述的實施方式這一目的，將參考某些實施方式，并且將使用特定語言來描述這些實施方式。本文所使用的術語僅用于描述具體實施方式目的，而不旨在限制本公開的范圍。

在描述本發(fā)明的化合物、組合物、蛋白質(zhì)、肽等以及方法之前，應當理解，這些實施方式不限于所描述的特定方法、方案以及試劑，這是因為它們可以變化。還應當理解，本文所使用的術語僅用于描述特定實施方式目的，并且不旨在限制本實施方式或權利要求的范圍。

下面將結合實施例對本發(fā)明的實施方案進行詳細描述，但是本領域技術人員將會理解，下列實施例僅用于說明本發(fā)明，而不應視為限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

實施例

Natto(aprN)基因序列是根據(jù)Genbank Sequence ID:KJ174339.1.在基因的3’端分別加上6×His tag(組氨酸標簽)，KDEL(內(nèi)質(zhì)網(wǎng)滯留信號)，該序列如SEQ ID NO：1所示。再在基因的5’端加上KpnI酶切位點，在基因的3’端分別加上SacI、PacI和BamHI酶切位點。整個序列經(jīng)過人工合成(Genscript，Piscataway，NJ 08854，USA)聯(lián)入克隆載體pUC57(http://www.genscript.com/)的EcoRV酶切位點中，我們命名為pUC57-Natto。

黃豆種子表達納豆激酶載體(pCAM-phas-aprN)構建過程(圖1)。

1.以菜豆(Phaseolus vulgaris)總DNA為模板，利用菜豆種子特異性啟動子(phas)引物：

Phas F:5’-gcc GAATTC ATTGTACTCCCAGTATCATTAT-3’

(劃線為添加的酶切位點EcoRI)

Phas R:5’-gcc GAGCTC AGTAGAGTAGTAGTACTCTGGATG-3’

(下劃線為添加的酶切位點SacI)

擴增出的片段經(jīng)序列測定后，雙酶切(EcoRI/SacI)片段連接入pCambia3300(購自Cambia，Australia)的EcoRI/SacI位點，生成pPhas。

2.以pUC57-Natto DNA為模板，利用納豆激酶基因引物：

PhasNat F:5’-gcc GAGCTC ATGAGAAGCAAAAAATTGTGGA-3’

(下劃線為添加的酶切位點SacI)

PhasNat R:5’-gcc-GGATCC TCATAGCTCATCTTTATGGTGG-3’

(下劃線為添加的酶切位點BamHI)

擴增納豆激酶以及6×His片段，連接人pPhas的SacI/BamHI位點，得到pPhas-aprN。

3.以pCambia1301載體DNA(購自Cambia，Australia)為模板，利用胭脂堿合酶終止子nosT的引物：

NosT F:5’-gccGGATCC CGTTCAAACATTTGGCAATA-3’

(下劃線為添加的酶切位點BamHI)

NosT R:5’-gccCTGCAG CTGCAGCCCGATCTAGTAACATAGATGA-3’

(下劃線為添加的酶切位點PstI)

擴增出nosT片段，擴增出的片段經(jīng)序列測定后，雙酶切連接入pPhas-Natto的BamHI/PstI位點，得到黃豆種子特異性表達納豆激酶載體pCAM-phas-aprN。

黃瓜表達納豆激酶載體(pCAM-LA22CD07-aprN)構建過程(圖2)。

1.以番茄(Lycopersicon esculentum)總DNA為模板，利用番茄果實特異性啟動子(LA22CD07)引物：

LA22CD07F:5’-gcc-GAGCTC CGTGCGTTGCACGTTTATCT-3’

(下劃線為添加的酶切位點SacI)

LA22CD07R:5’-gcc-GGTACCTAATGGAAGAAATCAAGCT-3’

(下劃線為添加的酶切位點KpnI)

擴增出的片段經(jīng)序列測定后連接入pCambia2200(購自Cambia，Australia)的SacI/KpnI位點，生成pLA22CD07。

2.以pUC57-Natto DNA為模板，利用納豆激酶基因引物:

PhasNat F:5’-gcc-GGTACC ATGAGAAGCAAAAAATTGTGGA-3’

(下劃線為添加的酶切位點KpnI)

PhasNat R:5’-gcc-GGATCC TCATAGCTCATCTTTATGGTGG-3’

(下劃線為添加的酶切位點BamI)

擴增納豆激酶以及6×His片段，連接人pLA22CD07的KpnI/BamHI位點，得到pLA22CD07-aprN。

3.利用胭脂堿合酶終止子nosT的引物擴增的nosT片段(見上)連接入pLA22CD07-aprN的BamHI/PstI位點，得到黃瓜表達納豆激酶載體，pCAM-LA22CD07-aprN。

將表達載體利用電擊方法導入農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)EHA101菌株。

將構建好的植物表達載體pCAM-phas-aprN和pCAM-LA22CD07-aprN利用電擊方法分別導入農(nóng)桿菌(A.tumefaciens)EHA105菌株中。農(nóng)桿菌制備步驟：

1.從-80℃冰箱中取出EHA101以及LBA4404感受態(tài)細胞，置于冰上解凍；

2.將40μl解凍的EHA101和LBA4404感受態(tài)細胞轉移至0.1CM的電極杯中，一起置于冰上預冷.

3.取1μl純化后的質(zhì)粒加入0.1CM的電極杯中，與感受態(tài)細胞混勻。

4.打開電轉儀，調(diào)至Manual，調(diào)節(jié)電壓為2.1kV。

5.擦干電極杯，放入電轉儀。按一下pulse鍵，聽到蜂鳴聲后，向電擊杯中迅速加入250μl的LB液體培養(yǎng)基，重懸細胞后，轉移到1.5ml的離心管中。

6.28℃，220rpm復蘇1小時。

7.取50μl轉化產(chǎn)物涂板(LB平板含有卡那霉素kanamycin 50mg/L和利福平rifampicin 25mg/L)，放于28℃培養(yǎng)過夜，2～3天后查看轉化結果，挑單菌落培養(yǎng)。

利用農(nóng)桿菌介導轉化方法分別將含有納豆激酶基因(aprN)的植物表達載體轉入雙子葉植物黃豆【11】和黃瓜當中【12】。通過公開發(fā)表的方法【11，12】，分別得到25株具有卡那霉素抗性的黃瓜植株和抗除草劑(草丁膦)的大豆植株。通過CTAB的方法提取植物基因組總DNA。利用地高辛標記的納豆激酶基因基因探針DNA雜交技術(Southern Blot)確定得到T0代轉基因大豆和黃瓜植物。T0植株在溫室里面分別培養(yǎng)6個月(黃瓜)和8個月(大豆)后，得到黃瓜果實和黃豆種子。

根據(jù)Conlone(2007)【13】發(fā)表的蛋白提純的方法，分別從黃瓜果實和黃豆種子中提取出總可溶性蛋白。使用Ni-NTA進行親和層析，將組氨酸標簽(His-Tag)的融合納豆激酶擔保純化出來。通過聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的方法，來鑒定重組蛋白。SDS-PAGE電泳顯示(圖3)，從黃瓜果實和黃豆種子中表達的重組融合蛋白大約為30kDa，符合我們最初的設計。也表明植物成功的表達出來成熟的納豆激酶蛋白。

納豆激酶活性通過改進的纖維蛋白板方法檢測【14】。將0.5％瓊脂糖在50mL的PBS緩沖液中中煮沸，并在40℃水浴中冷卻。將1mg/mL纖維蛋白原，0.1IU/mL凝血酶和0.1IU/mL纖溶酶原混合其中。將混合物緩慢倒入培養(yǎng)皿中，靜置，直到瓊脂糖固化。在培養(yǎng)板中用無菌打孔器形成孔(3mm直徑)。將然后用將大豆種子以及黃瓜果實中純化的納豆激酶分別以50μg加載到每個孔中，并將板在室溫下溫育過夜。商用納豆激酶作為陽性對照。結果顯示來自黃豆種子以及黃瓜果實的重組納豆激酶蛋白都可以降解纖維蛋白(如圖4所示)。純化的重組蛋白在纖維蛋白板上顯示出半透明的溶解區(qū)域，表明纖維蛋白已被降解為可溶性肽。相比之下，來自非轉基因黃豆種子以及黃瓜蛋白均不顯示纖維蛋白切割活性。溶血實驗證明，純化的重組蛋白可以溶解血塊，而非轉基因黃豆種子以及黃瓜蛋白均不能溶解血塊(圖5)。

綜上所述，通過使用種子以及果實特異性啟動子，我們成功的將納豆激酶分別轉入黃豆以及黃瓜果實當中。以這種方式產(chǎn)生的重組納豆激酶可以降解纖維蛋白以及溶解血塊。因此，我們證明利用轉基因植物可生產(chǎn)有活性，安全，廉價并可以直接服用的納豆激酶?；谥参锓N子平臺可大規(guī)模生產(chǎn)低成本的功能性納豆激酶。富含納豆激酶的蔬菜水果可以直接為人們食用，即保留了納豆激酶的活性，又可延遲納豆激酶在消化道系統(tǒng)中被消化液降解。

最后應說明的是：以上各實施例僅用以說明本發(fā)明的技術方案，而非對其限制；盡管參照前述各實施例對本發(fā)明進行了詳細的說明，但本領域的普通技術人員應當理解：其依然可以對前述各實施例所記載的技術方案進行修改，或者對其中部分或者全部技術特征進行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應技術方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實施例技術方案的范圍。

參考文獻：

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SEQUENCE LISTING

<110> 杭州晟源光熱新能源科技股份有限公司

<120> 一種納豆激酶的轉基因方法

<160> 3

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 1176

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 1

atgagaagca aaaaattgtg gatcagcttg ttgtttgcgt taacgttaat ctttacgatg 60

gcgttcagca acatgtctgc gcaggctgcc ggaaaaagca gtacagaaaa gaaatacatt 120

gtcggattta agcagacaat gagtgccatg agttccgcca agaaaaagga tgttatttct 180

gaaaaaggcg gaaaggttca aaagcaattt aagtatgtta acgcggccgc agcaacattg 240

gatgaaaaag ctgtaaaaga attgaaaaaa gatccgagcg ttgcatatgt ggaagaagat 300

catattgcac atgaatatgc gcaatctgtt ccttatggca tttctcaaat taaagcgccg 360

gctcttcact ctcaaggcta cacaggctct aacgtaaaag tagctgttat cgacagcgga 420

attgactctt ctcatcctga cttaaacgtc agaggcggag caagcttcgt tccttctgaa 480

acaaacccat accaggacgg cagttctcac ggtacgcatg tcgccggtac gattgccgct 540

cttaataact caatcggtgt tctgggcgta gcgccaagcg catcattata tgcagtaaaa 600

gtgcttgatt caacaggaag cggccaatat agctggatta ttaacggcat tgagtgggcc 660

atttccaaca atatggatgt tatcaacatg agccttggcg gacctactgg ttctacagcg 720

ctgaaaacag tagttgataa agcggtttcc agcggtatcg tcgttgctgc cgcagccgga 780

aacgaaggtt catccggaag cacaagcaca gtcggctacc ctgcaaaata tccttctact 840

attgcagtag gtgcggtaaa cagcagcaac caaagagctt cattctccag cgtaggttct 900

gagcttgatg taatggctcc tggcgtgtcc atccaaagca cacttcctgg aggcacttac 960

ggcgcttata acggaacgtc catggcgact cctcacgttg ccggagcagc agcgctaatt 1020

ctttctaagc acccgacttg gacaaacgcg caagtccgtg atcgtttaga aagcactgca 1080

acatatcttg gaaactcttt ctactatgga aaagggttaa tcaacgtaca agcagctgca 1140

caacaccatc accaccacca taaagatgag ctatga 1176

<210> 2

<211> 1498

<212> DNA

<213> Vigna unguiculata

<400> 2

attgtactcc cagtatcatt atagtgaaag ttttggctct ctcgccggtg gttttttacc 60

tctatttaaa ggggttttcc acctaaaaat tctggtatca ttctcacttt acttgttact 120

ttaatttctc ataatctttg gttgaaatta tcacgcttcc gcacacgata tccctacaaa 180

tttattattt gttaaacatt ttcaaaccgc ataaaatttt atgaagtccc gtctatcttt 240

aatgtagtct aacattttca tattgaaata tataatttac ttaattttag cgttggtaga 300

aagcataaag atttattctt attcttcttc atataaatgt ttaatataca atataaacaa 360

attctttacc ttaagaagga tttcccattt tatattttaa aaatatattt atcaaatatt 420

tttcaaccac gtaaatctca taataataag ttgtttcaaa agtaataaaa tttaactcca 480

taattttttt attcgactga tcttaaagca acacccagtg acacaactag ccattttttt 540

ctttgaataa aaaaatccaa ttatcattgt atttttttta tacaatgaaa atttcaccaa 600

acaatcattt gtggtatttc tgaagcaagt catgttatgc aaaattctat aattcccatt 660

tgacactacg gaagtaactg aagatctgct tttacatgcg agacacatct tctaaagtaa 720

ttttaataat agttactata ttcaagattt catatatcaa atactcaata ttacttctaa 780

aaaattaatt agatataatt aaaatattac ttttttaatt ttaagtttaa ttgttgaatt 840

tgtgactatt gatttattat tctactatgt ttaaattgtt ttatagatag tttaaagtaa 900

atataagtaa tgtagtagag tgttagagtg ttaccctaaa ccataaacta taacatttat 960

ggtggactaa ttttcatata tttcttattg cttttacctt ttcttggtat gtaagtccgt 1020

aactagaatt acagtgggtt gccatggcac tctgtggtct tttggttcat gcatgggtct 1080

tgcgcaagaa aaagacaaag aacaaagaaa aaagacaaaa cagagagaca aaacgcaatc 1140

acacaaccaa ctcaaattag tcactggctg atcaagatcg ccgcgtccat gtatgtctaa 1200

atgccatgca aagcaacacg tgcttaacat gcactttaaa tggctcaccc atctcaaccc 1260

acacacaaac acattgcctt tttcttcatc atcaccacaa ccacctgtat atattcattc 1320

tcttccgcca cctcaatttc ttcacttcaa cacacgtcaa cctgcatatg cgtgtcatcc 1380

catgcccaaa tctccatgca tgttccaacc accttctctc ttatataata cctataaata 1440

cctctaatat cactcacttc tttcatcatc catccatcca gagtactact actctact 1498

<210> 3

<211> 2226

<212> DNA

<213> Solanum lycopersicum

<400> 3

cgtgcgttgc acgtttatct cttaactatt ttataaaatt tgtacttgat agacttccta 60

ttggtagtta ttcatgtcaa attattttga aaaataaaag aaattgctac tataaagtgt 120

ctttggaaaa tgaaaaccct ttccaatctt tatatagttc tttttcgatg atttttgaat 180

ttctttttaa tgtaattata taagtgaggt cttaaaaaaa ttatacatat gcatccttac 240

ttctaggatg taacttgtaa atgtaaatat atatatagat atagaaaagg catgtaactt 300

gtaaatgaaa atataaatat agatatagag aagaagaaac ttgatattaa catatgacaa 360

tataatggaa gtatcaacgt aactccaaca atcctttgtc acaacctaca tataattaat 420

attgttattg taataatata tgatctcttt gtcatgcttt ccctattaaa gcaatgaaat 480

gttattagaa tgactcgctg ttatatatct tgcaaattaa taaattacat tgatagttaa 540

cgaagaagtt gagggtcaca ttaattagta catgacagga cattaagaga atcaatactt 600

attggagaga agtttgatgg tcacacacat caattggtga aactgatata attaatcaaa 660

taaattgaat aacatctgga agagaattaa atgggcgtaa aaggaatgac aaatagaagt 720

taatcttttt tttatctttt tttaaaacga ttaattaact tttaaaggat gatatgtatt 780

atttattgtt ttatattatg ttgatttatt gtaggaataa aatggtaatt cagcttttgt 840

actttgaatt tttccactta taatataata agattcttgc ggcttgttga ccaataattg 900

acaaaatata ttgaaattta ttgtaaataa tttttttgac taaagtgcaa aacaacttca 960

taaatatgtg tttttgaaat taaaaaaaaa aatctatatt attctctaac aattactttt 1020

attattataa tgtatctgta tagtccatgt agtttcattt tattttatca aagttaaaat 1080

attaatttat aatttaaata tcttaacatt tatcaaagac tgacattttt tttcttatat 1140

tcagatgttt aataataaat agtcttgatc atttactgtt caaatctaga gacaaaatcg 1200

taatcactca attgtgtatt aaaatttaga catgttaatc ttaatgaaaa caaatgaaac 1260

ctaagctata tatgacaata catgttgcta acatgtatca tctgacacat tatttaattt 1320

ttatcattgt atcttactat gtgtatatgc atcaaataaa atatacgcat gtataaatat 1380

acatatgtat ctgataaaag tgtacaagtt tgtatgttaa aaatctaaat atcggtgaat 1440

cgtaaaaaaa aaaagagaat gttgattgtt ttgtttattt tcttagaaga agttgtgata 1500

tgtcagatcc attataattg ttataagcat gattttctcg ttaattatta actttcaatt 1560

atactattta attatacacg ctccttagtt aatgcaaata catataaatt atatttattt 1620

tgagaaatta atgagacttc tttgccatga tcgaaacttg tagtaaaatt taaacgatcc 1680

atcgaaatat gctttttgca agttaagatg gaattcagca atagtgtaaa ctatgatttg 1740

tttgcctgtt gggtgtacgg aaattttaag tgagtatgat tgacatacat tataatgtct 1800

tttagatgtt aaatttagat ttcttttcaa ttaaagatga aaagtcacat accaaaagta 1860

ttaaactaga aatattacaa tagctcaaga aataaaaatg ttatttttcg ttatttattt 1920

atgcaacgaa tgtttaaaaa tgcaaacaaa agtttctttt atataaaatt gaattgaaaa 1980

tatctaataa ataatatctt tagattaaat tatcatgctt ttagacgcaa aattaagata 2040

tgtaataatt cgagaatcag aatgaaatta tcccacctac tctaaaatta aaagatacaa 2100

taatttacct aaatcaaaac gacgccgtag tactgtacct tttggacttt ggatgttgta 2160

tctatttgga aacgaagcaa ctcatccttc tttcataaaa tcgatctagc ttgatttctt 2220

ccatta 2226