本發(fā)明涉及構建轉纖維素酶基因水稻的方法，屬于轉纖維素酶水稻的分子生物學技術領域，具體涉及一種利用外切葡聚糖酶提高水稻秸稈降解轉化效率的方法。

背景技術：

纖維素酶廣泛存在于多種微生物中，由以下三種酶組成：(1)內切-1，4-β-D-葡聚糖酶(endo-1,4-β-D-glucanases,EC 3.2.1.4,EG)，它作用于纖維素鏈上的β-1,4-葡聚糖苷鍵，隨機水解無定形纖維素，釋放纖維寡糖形成新的還原端；(2)1，4-β-D-纖維二糖水解酶或外切葡聚糖酶(1,4-β-D-cellobiohydrolases或exoglucanase,EC 3.2.1.91,CBH)，它沿著纖維素鏈行進，從還原端或非還原端水解結晶纖維素，釋放纖維二糖；(3)1,4-β-D-葡萄糖苷酶(1,4-β-D-glucosidases,EC 3.2.1.21,BGL)，主要水解纖維二糖、纖維寡糖和其它低聚糖，產生葡萄糖^[1](Warren et al.,1996)。纖維素通過這三種酶的協(xié)同作用，最終降解為葡萄糖。

目前，絕大多數(shù)商業(yè)纖維素酶都產自木霉，小部分產自黑曲霉。雖然在纖維素酶菌株的選育、纖維素酶組分及降解機制、纖維素酶合成的調節(jié)與調控以及纖維素酶應用等諸多分支課題都取得了重要進展，但迄今尚未找到一種微生物或酶來有效利用纖維素這一巨大的可再生資源^[2](靳振江等，2007)。最近幾年，利用轉基因植物作為生物反應器生產纖維素酶成為一種更具潛力的發(fā)展方向^[3](王煒，2007)。以轉基因植物作為生物反應器生產纖維素酶具有以下優(yōu)勢：首先是表達酶的轉基因植物可以用作飼料原料，直接飼喂，或者直接作為生物乙醇的生物質原料而省去或減少目前酶制劑的發(fā)酵生產和添加；其次是生產規(guī)模不受限制，成本比較低^[4，5](Whitelam et al.,1993；Himmel et al.,2007)。來源于微生物的內切葡聚糖酶，外切葡聚糖酶和來自人類的β-葡萄糖苷酶已相繼在多種作物中得到表達，CBHI在植物體內表達的研究進展見表1。迄今為止，尚無在植物體內表達外切葡聚糖酶對植物秸稈降解轉化效率影響的報道。

表1.CBHI在植物體內的表達

參考文獻：

1.Warren RAJ.Microbial hydrolysis of polysaccharides.Annual Review.Microbiology,1996,50:183–212

2.靳振江.纖維素酶降解纖維素的研究進展.廣西農業(yè)科學，2007，38(2)：127-130

3.王煒.在轉基因水稻種子里表達生產纖維素酶.浙江大學碩士學位論文.2007

4.Whitelam GC,Cockburn B,Gandecha AR,Owen MR.Heterologous protein production in Transgenic plants Whitelam.Biotechnology and Genetic Engineering Reviews,1993,11:1-29

5.Himmel ME,Ding SY,Johnson DK,et al.Biomass recalcitrance.Engineering plants and enzymes for biofuels production.Science,2007,315:804-807.

6.Ziegelhoffer,T.,Will,J.and Austin-Phillips,S.Expression of bacterial cellulase genes in transgenic alfalfa(Medicago sativa L.),potato(Solanum tuberosum L.)and tobacco(Nicotiana tabacumL.).Molecular Breeding,1999,5:309–318.

7.蔣西然.耐高溫纖維素酶在煙草中的表達.大連理工大學碩士學位論文.2011

8.Dai Z,Hooker BS,Quesenberry RD,Gao J.Expression of Trichoderma reesei exo-cellobiohydrolase I in transgenic tobacco leaves and calli.Applied Biochemistry and Biotechnology,1999,77:689-699

9.Hood EE,Love R,Lane J,Bray J,Clough R,Pappu K,Drees C,Hood KR,Yoon S,Ahmad A,Howard JA.Subcellular targeting is a key condition for high‐level accumulation of cellulase protein in transgenic maize seed.Plant Biotechnology Journal,2007,5(6):709-719.

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的就在于克服現(xiàn)有技術存在的缺點和不足，提供一種利用外切葡聚糖酶提高水稻秸稈降解轉化效率的方法，即利用轉基因技術對水稻細胞壁進行遺傳改良，提高秸稈生物質的可降解性，減少外源添加的纖維素酶用量，為利用植物生產纖維素乙醇做理論以及技術上的探索。

本發(fā)明的目的是這樣實現(xiàn)的：

一、利用外切葡聚糖酶提高水稻秸稈降解轉化效率的方法(簡稱方法)

本方法包括下列步驟：

①從里氏木霉中克隆CBH Ⅰ基因全長cDNA，并根據(jù)水稻密碼子使用頻率表，用定點突變的方法對CBH Ⅰ基因的密碼子進行優(yōu)化，即將外切葡聚糖酶CBH Ⅰ的第77位亮氨酸的密碼子CTA優(yōu)化為CTC，將第319位精氨酸的密碼子CGA優(yōu)化為CGC，如序列1；

②構建CBH Ⅰ基因在葉綠體中通過光誘導表達的載體，并轉化水稻中花11，獲得轉基因水稻CBH Ⅰ；

③將獲得的轉基因水稻CBH Ⅰ的秸稈粉末經外源纖維素復合酶和1％Tween 80處理，測定己糖產量；

④測定獲得的轉基因水稻CBH Ⅰ的秸稈的細胞壁纖維素含量。

所述的步驟①：

一種外切葡聚糖酶(exoglucanase，或纖維二糖水解酶cellobiohydrolase，EC 3.2.1.91,CBH)基因Ⅰ編碼區(qū)序列，如序列1，CDS長度為1545bp，該基因來源于里氏木霉，根據(jù)水稻密碼子使用頻率表，將CBH Ⅰ基因中使用頻率小于15％的密碼子，用定點突變的方法優(yōu)化為水稻中的常用密碼子。

所述的步驟②：

植物表達載體為pC1300T-osrbcs-chl-CBH Ⅰ ful，其中所帶的基因來源于序列1(不包括CBH Ⅰ信號肽序列和包含部分3’非編碼區(qū)序列，長度為1599bp)；

根據(jù)表達載體轉化水稻，獲得轉基因水稻植株的方法。

轉基因水稻CBH Ⅰ于2016年11月03日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國武漢武漢大學郵編：430072)，保藏編號為CCTCC NO：P201623。

所述的步驟③：

表達載體在培育高降解轉化效率植物材料中的應用。

所述的步驟④測定獲得的轉基因水稻CBH Ⅰ的秸稈的細胞壁纖維素含量。

本發(fā)明具有下列優(yōu)點和積極效果：

1、對CBH Ⅰ基因的密碼子進行了優(yōu)化；

2、增加外源CBH Ⅰ基因在水稻中的表達量，使轉基因水稻秸稈降解轉化效率提高84.94％。

附圖說明

圖1是外源纖維素酶和1％Tween 80處理轉基因水稻秸稈的酶解效率；

圖2是定點突變方法示意圖，

A：定點突變引物設計示意圖，

B：序列擴增及拼接示意圖；

圖3是植物表達載體的構建示意圖。

轉基因水稻CBH Ⅰ于2016年11月03日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心(地址：中國 武漢 武漢大學 郵編：430072)，保藏編號為CCTCC NO：P201623。

具體實施方式：

實施例1：CBH Ⅰ基因全長cDNA的克隆和優(yōu)化

1、從里氏木霉中克隆CBH Ⅰ基因全長cDNA，用定點突變的方法對CBH Ⅰ基因的密碼子進行了優(yōu)化。

其中CBH Ⅰ基因全長cDNA優(yōu)化的密碼子為：

第77位的亮氨酸的密碼子CTA優(yōu)化為CTC，第319位的精氨酸的CGA優(yōu)化為CGC；

2、對CBH Ⅰ基因的密碼子進行了優(yōu)化的定點突變方法

——如基因有兩個位點需定點突變，需合成3對引物，克隆到載體，見圖2-A；其中引物1F與3R添加載體所需的酶切位點，引物2F與1R、3F與2R完全互補配對，將需突變的堿基置于引物中間，引物的長度大于20bp；

——分別以1F和1R,2F和2R,3F和3R為引物，進行PCR,得到片段，見圖2-B；

——純化回收PCR產物1，2，3

——以PCR產物1，2，3為引物和摸板進行PCR，因為PCR產物1，2，3的末端彼此互補，能夠得到基因全長，反應幾個循環(huán)即可；

——以上一步的PCR產物為模板，1F和3R為引物，進行PCR擴增，所得PCR產物經過回收，酶切，連接載體。

實施例2：表達載體的構建

1、水稻Rbcs啟動子超表達里氏木霉的CBH Ⅰ，定位到葉綠體

載體(pC1300T-osrbcs-chl-CBH Ⅰ ful)的構建(見圖3)：

——以日本晴的基因組DNA為模板，合成引物擴增rbcs啟動子(含信號肽-47個AA)。

——合成引物擴增CBH Ⅰ全長(密碼子優(yōu)化，含終止密碼子，不含信號肽)，序列見序列1

正向引物：GGGGTACC(KpnΙ)CAGTCGGCCTGCACTCT

反向引物：ATGATACGGGCTCACCAA

——將啟動子和CBH Ⅰ全長cDNA序列分別連接T載體后，酶切，轉入表達載體pC1300T。

實施例3：植物表達載體轉化農桿菌

1、農桿菌活化

將保存的農桿菌(EHA105)在固體LB培養(yǎng)基上畫線(加抗生素：Kan，如果不加抗生素就有可能造成這些菌株的Ti質粒丟失，導致農桿菌缺乏侵染性)，抗生素濃度為：50μg/mL，28℃培養(yǎng)1-2天，然后轉移到新的加有抗生素的固體LB培養(yǎng)基上再培養(yǎng)2天；

2、農桿菌感受態(tài)細胞的制備

將100μL接種于1mLLB液體培養(yǎng)基中，150rpm 28℃振蕩培養(yǎng)過夜；

吸取1mL菌液接種到100mL液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600＝0.5；

將菌液置冰上30min，使培養(yǎng)物冷卻到0℃；

4℃，5000rpm離心30s，棄去上清液；

沉淀用60mL 0.1M CaCl₂懸浮，冰浴30min；

5000rpm離心30s，棄去上清液；

每管用100μL含15％甘油的20mMCaCl₂懸浮，用于轉化；

制備好的感受態(tài)細胞可馬上使用，也可按每管200μL分裝于無菌離心管中，于4℃保存48小時內使用，長期貯存時必須在液氮中速凍后轉-80℃保存，使用時從-80℃取出，置冰上融化后使用；

3、DNA直接轉化農桿菌

200μL農桿菌感受態(tài)細胞中加入質粒DNA 0.1～1μg(5-10uL)，之后冰浴30min；

放入液氮中7-8min，然后立即放入37℃水浴鍋中水浴5min；

取出離心管，冰上放置2min，加入0.8mLLB，28℃，150rpm振蕩培養(yǎng)3～4hr；

取出菌液于Kan抗生素的LB平板上涂板，在培養(yǎng)箱中28℃條件下倒置培養(yǎng)，2天左右菌落可見；

4、重組農桿菌鑒定

挑取單菌落，接種于含相應抗生素的LB液體培養(yǎng)基中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜；

小量提取質粒DNA，加GTE同時加5μL溶菌酶(50μg/mL-1，貯藏濃度為50mg/mL或10mg/mL)；

質粒酶切或PCR鑒定。

實施例4：水稻成熟胚愈傷組織的誘導、分化、生根及移栽方法

1、愈傷誘導

將成熟的水稻種子去殼，先用無菌水沖洗3遍，然后用70％的乙醇處理1分鐘，不時搖動；

無菌水沖洗3遍，每次30秒，不時搖動；

0.1％升汞溶液消毒12分鐘(或2.5％NaClO消毒30min)，不時搖動；

無菌水沖洗5遍以上，每次30秒，不時搖動；

將種子放在滅菌濾紙上吸干水分，然后放在誘導培養(yǎng)基上；

28℃，暗培養(yǎng)4周；

2、愈傷繼代

挑選亮黃色、緊實且相對干燥的胚性愈傷(即散落到培養(yǎng)基上的愈傷，不要選從種子上發(fā)出來的愈傷)，放于繼代培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)2周，溫度28℃；

3、預培養(yǎng)

挑選緊實且相對干燥的胚性愈傷，放于預培養(yǎng)基上黑暗下培養(yǎng)4-14天，溫度28℃；

4、愈傷與農桿菌共培養(yǎng)

1)農桿菌培養(yǎng)

在帶有對應抗性選擇的LB培養(yǎng)基上預培養(yǎng)農桿菌兩天，溫度28℃；

將農桿菌轉移至裝有懸浮培養(yǎng)基的帶塞試管或離心管里，重懸農桿菌，調節(jié)農桿菌的懸浮液至OD₆₀₀為0.8-1.0；

2)農桿菌侵染

將預培養(yǎng)的愈傷轉移至滅菌好的三角瓶內；

將愈傷在農桿菌懸浮液中浸泡30分鐘；

轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吹干(30min-1h)；

然后放置在已鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)基上培養(yǎng)3天，溫度19-20℃。

5)選擇培養(yǎng)

將共培養(yǎng)的愈傷轉移至滅菌好的三角瓶內；

滅菌水洗滌愈傷至看不見農桿菌；

浸泡在含400ppm羧芐青霉素的滅菌水中30分鐘；

轉移愈傷至滅菌好的濾紙上吸干(1h以上)；

轉移愈傷至選擇培養(yǎng)基上選擇培養(yǎng)2次，每次2周。(第一次羧芐青霉素篩選濃度為400ppm，第二次為250ppm)；

6)分化培養(yǎng)

將抗性愈傷轉移至預分化培養(yǎng)基上黑暗處培養(yǎng)5-7天(可省略)；

轉移預分化培養(yǎng)的愈傷至分化培養(yǎng)基上，光照下培養(yǎng)，溫度26℃；

7)生根培養(yǎng)

剪掉分化時產生的根(留1-2mm)；

然后將其轉移至生根培養(yǎng)基中光照下培養(yǎng)2周，溫度26℃；

8)移栽

待苗高10-12cm，根系發(fā)生較好，打開瓶蓋，洗掉根上的殘留培養(yǎng)基(注意不要傷根)，移栽花盆中。在最初的幾天，蒙上保鮮膜，保持水分濕潤。

實施例5：轉基因陽性苗的鑒定

1、基因插入鑒定

檢測引物：潮霉素通用引物和基因特異性引物；

2、表達鑒定

基因特異引物。

實施例6：水稻秸桿降解轉化效率的測定

水稻秸桿粉末在60℃烘干至恒重，秸稈經外源纖維素復合酶(和氏璧公司)和1％Tween 80水解后，測產糖量；

稱取秸稈粉末0.3000g(每個處理3個重復)于15mL離心管，加入6mL的dH₂0，室溫，150r/min，2h；3 000g離心5min，去上清，沉淀用6mL dH₂0洗1次，去上清；最后用6mL pH 4.5的醋酸緩沖液洗1次，去上清；

一組殘渣(3個重復)加入3mL 2.4g/L(w/v)纖維素復合酶溶液，用pH4.5的醋酸緩沖液定容至6mL[最終酶濃度為1.2g/L(w/v)]，另外加入1％Tween 80(v/v)放入搖床，150r/min，50℃酶解48h。

酶解48h后，3000g離心5min，收集上清液，測定兩組處理后的酶解液己糖和戊糖含量。

實施例7：細胞壁纖維素含量的測定

1、去除可溶性糖

將已過40目篩的樣品在50℃條件下烘干至衡重?；靹?，稱取0.1000g干重樣品，加入適量pH＝7.0的0.5M磷酸緩沖液充分碾磨，轉移于10mL離心管中，定容到10.0mL，混勻樣品。4000rpm離心5min。沉淀再依次用5.0mL磷酸緩沖液洗2次，5.0mL蒸餾水洗2次，去除掉可溶性糖。

2、去除脂溶性物質

于沉淀中加入5.0mL氯仿-甲醇(1：1v/v)，25℃，150rpm，振蕩1h。4000rpm離心5min,棄上清液。將沉淀再依次用5.0mL甲醇洗1次，5mL丙酮洗1次，最后用5.0mL蒸餾水洗1次，棄所有上清液，去除掉脂溶性物質。

3、去除淀粉

于沉淀中加入5.0mL DMSO-H₂O(9：1v/v)，混勻樣品。25℃搖床中，150rpm輕輕振蕩過夜(12h)，離心后，收集上清液，沉淀再依次用5.0mL DMSO-H₂O洗2次，5.0mL蒸餾水洗3次，去掉所有上清液。

4、去除草酸銨可溶性分子

于沉淀中加入5.0mL 0.5％(w/v)草酸銨溶液，在沸水中加熱1h，在這期間每隔10min搖勻，以免在溶液表面的堆集。冷卻后，4000rpm離心5min,倒掉上清液。沉淀再依次用5.0mL 0.5％草酸銨洗1次，5.0mL蒸餾水洗2次，去掉所有上清液。

5、去除堿溶半纖維素

于沉淀中加入5.0mL 4M KOH(內含1mg/mL的NaHB₄)，在25℃搖床中150rpm振蕩1h。4000rpm離心5min，倒掉上清液。沉淀再依次用5.0mL 4M KOH洗1次，5.0mL蒸餾水洗2次，倒掉所有上清液。

6、提取纖維素

于沉淀中加入5.0mL的67％硫酸?；靹颍?5℃，150r/min振蕩2h，定容到100mL，測定己糖含量，即為細胞壁纖維素的含量。

序列表

<110>華中農業(yè)大學

<120>利用外切葡聚糖酶提高水稻秸稈降解轉化效率的方法

<140>

<141>

<160>3

<210>1

<211>1599

<212>CBH Ⅰ基因CDS(包括部分3’非編碼區(qū))，密碼子進行了優(yōu)化

<400>

ATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCTCAGTCGGCCTGCACTCTCCAATCGGAGACTCACCCGCCTCTGACATGGCAGAAATGCTCGTCTGGTGGCACGTGCACTCAACAGACAGGCTCCGTGGTCATCGACGCCAACTGGCGCTGGACTCACGCTACGAACAGCAGCACGAACTGCTACGATGGCAACACTTGGAGCTCGACCCTCTGTCCTGACAACGAGACCTGCGCGAAGAACTGCTGTCTGGACGGTGCCGCCTACGCGTCCACGTACGGAGTTACCACGAGCGGTAACAGCCTCTCCATTGGCTTTGTCACCCAGTCTGCGCAGAAGAACGTTGGCGCTCGCCTTTACCTTATGGCGAGCGACACGACCTACCAGGAATTCACCCTGCTTGGCAACGAGTTCTCTTTCGATGTTGATGTTTCGCAGCTGCCGTGCGGCTTGAACGGAGCTCTCTACTTCGTGTCCATGGACGCGGATGGTGGCGTGAGCAAGTATCCCACCAACACCGCTGGCGCCAAGTACGGCACGGGGTACTGTGACAGCCAGTGTCCCCGCGATCTGAAGTTCATCAATGGCCAGGCCAACGTTGAGGGCTGGGAGCCGTCATCCAACAACGCGAACACGGGCATTGGAGGACACGGAAGCTGCTGCTCTGAGATGGATATCTGGGAGGCCAACTCCATCTCCGAGGCTCTTACCCCCCACCCTTGCACGACTGTCGGCCAGGAGATCTGCGAGGGTGATGGGTGCGGCGGAACTTACTCCGATAACAGATATGGCGGCACTTGCGATCCCGATGGCTGCGACTGGGACCCATACCGCCTGGGCAACACCAGCTTCTACGGCCCTGGCTCAAGCTTTACCCTCGATACCACCAAGAAATTGACCGTTGTCACCCAGTTCGAGACGTCGGGTGCCATCAACCGCTACTATGTCCAGAATGGCGTCACTTTCCAGCAGCCCAACGCCGAGCTTGGTAGTTACTCTGGCAACGGGCTCAACGATGATTACTGCACAGCTGAGGAGGCAGAATTCGGCGGATCCTCTTTCTCAGACAAGGGCGGCCTGACTCAGTTCAAGAAGGCTACCTCTGGCGGCATGGTTCTGGTCATGAGTCTGTGGGATGATTACTACGCCAACATGCTGTGGCTGGACTCCACCTACCCGACAAACGAGACCTCCTCCACACCCGGTGCCGTGCGCGGAAGCTGCTCCACCAGCTCCGGTGTCCCTGCTCAGGTCGAATCTCAGTCTCCCAACGCCAAGGTCACCTTCTCCAACATCAAGTTCGGACCCATTGGCAGCACCGGCGACCCTAGCGGCGGCAACCCTCCCGGCGGAAACCCGCCTGGCACCACCACCACCCGCCGCCCAGCCACTACCACTGGAAGCTCTCCCGGACCTACCCAGTCTCACTACGGCCAGTGCGGCGGTATTGGCTACAGCGGCCCCACGGTCTGCGCCAGCGGCACAACTTGCCAGGTCCTGAACCCTTACTACTCTCAGTGCCTGTAAAGCTCCGTGGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCAT；

210>2

<211>25

<212>正向引物

<400>GGGGTACCCAGTCGGCCTGCACTCT；

210>3

<211>18

<212>反向引物

<400>ATGATACGGGCTCACCAA。

序列表

<110>華中農業(yè)大學

<120>利用外切葡聚糖酶提高水稻秸稈降解轉化效率的方法

<140>

<141>

<160>3

<210>1

<211>1599

<212> CBHⅠ基因CDS （包括部分3’非編碼區(qū)），密碼子進行了優(yōu)化

<400>

ATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCTCAGTCGGCCTGCACTCTCCAAT

CGGAGACTCACCCGCCTCTGACATGGCAGAAATGCTCGTCTGGTGGCACGTGCACTCAACAGACAGGCTCCGT

GGTCATCGACGCCAACTGGCGCTGGACTCACGCTACGAACAGCAGCACGAACTGCTACGATGGCAACACTTGG

AGCTCGACCCTCTGTCCTGACAACGAGACCTGCGCGAAGAACTGCTGTCTGGACGGTGCCGCCTACGCGTCCA

CGTACGGAGTTACCACGAGCGGTAACAGCCTCTCCATTGGCTTTGTCACCCAGTCTGCGCAGAAGAACGTTGG

CGCTCGCCTTTACCTTATGGCGAGCGACACGACCTACCAGGAATTCACCCTGCTTGGCAACGAGTTCTCTTTC

GATGTTGATGTTTCGCAGCTGCCGTGCGGCTTGAACGGAGCTCTCTACTTCGTGTCCATGGACGCGGATGGTG

GCGTGAGCAAGTATCCCACCAACACCGCTGGCGCCAAGTACGGCACGGGGTACTGTGACAGCCAGTGTCCCCG

CGATCTGAAGTTCATCAATGGCCAGGCCAACGTTGAGGGCTGGGAGCCGTCATCCAACAACGCGAACACGGGC

ATTGGAGGACACGGAAGCTGCTGCTCTGAGATGGATATCTGGGAGGCCAACTCCATCTCCGAGGCTCTTACCC

CCCACCCTTGCACGACTGTCGGCCAGGAGATCTGCGAGGGTGATGGGTGCGGCGGAACTTACTCCGATAACAG

ATATGGCGGCACTTGCGATCCCGATGGCTGCGACTGGGACCCATACCGCCTGGGCAACACCAGCTTCTACGGC

CCTGGCTCAAGCTTTACCCTCGATACCACCAAGAAATTGACCGTTGTCACCCAGTTCGAGACGTCGGGTGCCA

TCAACCGCTACTATGTCCAGAATGGCGTCACTTTCCAGCAGCCCAACGCCGAGCTTGGTAGTTACTCTGGCAA

CGGGCTCAACGATGATTACTGCACAGCTGAGGAGGCAGAATTCGGCGGATCCTCTTTCTCAGACAAGGGCGGC

CTGACTCAGTTCAAGAAGGCTACCTCTGGCGGCATGGTTCTGGTCATGAGTCTGTGGGATGATTACTACGCCA

ACATGCTGTGGCTGGACTCCACCTACCCGACAAACGAGACCTCCTCCACACCCGGTGCCGTGCGCGGAAGCTG

CTCCACCAGCTCCGGTGTCCCTGCTCAGGTCGAATCTCAGTCTCCCAACGCCAAGGTCACCTTCTCCAACATC

AAGTTCGGACCCATTGGCAGCACCGGCGACCCTAGCGGCGGCAACCCTCCCGGCGGAAACCCGCCTGGCACCA

CCACCACCCGCCGCCCAGCCACTACCACTGGAAGCTCTCCCGGACCTACCCAGTCTCACTACGGCCAGTGCGG

CGGTATTGGCTACAGCGGCCCCACGGTCTGCGCCAGCGGCACAACTTGCCAGGTCCTGAACCCTTACTACTCT

CAGTGCCTGTAAAGCTCCGTGGCGAAAGCCTGACGCACCGGTAGATTCTTGGTGAGCCCGTATCAT；

210>2

<211>25

<212> 正向引物

<400> GGGGTACCCAGTCGGCCTGCACTCT；

210>3

<211>18

<212>反向引物

<400> ATGATACGGGCTCACCAA。