本發(fā)明涉及有機(jī)生物功能材料
技術(shù)領(lǐng)域：
，特別是涉及一種具有氨基和脂質(zhì)結(jié)構(gòu)的生物可降解的氨基脂質(zhì)類化合物及其制備方法和應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：一些生物活性物質(zhì)自身難以進(jìn)入細(xì)胞或者靶向組織，例如蛋白質(zhì)，多肽，DNA，RNA，難溶性分子等，因此輸送載體被設(shè)計(jì)并用于運(yùn)送各種生物活性物質(zhì)至細(xì)胞或者體內(nèi)。其中，含有脂質(zhì)的兩親性分子可以在水中組裝形成不同尺寸和形態(tài)的顆粒，并能有效結(jié)合生物活性物質(zhì)，其復(fù)合物可以增強(qiáng)與細(xì)胞的作用從而能夠進(jìn)入細(xì)胞后再釋放出生物活性物質(zhì)。這就使得一些生物活性物質(zhì)可以進(jìn)入細(xì)胞調(diào)控生理過(guò)程，從而使這些生物活性物質(zhì)用作藥物治療或者生理調(diào)節(jié)成為可能。DNA和RNA干擾(RNAi)作為遺傳物質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)或體內(nèi)調(diào)控著各種生理活動(dòng)，尤其基因組學(xué)的發(fā)展使得基因，蛋白質(zhì)和疾病的關(guān)系更加清晰。這樣，可以通過(guò)針對(duì)性的設(shè)計(jì)序列，高效并特異性地調(diào)控靶向基因的表達(dá)，這使得DNA和RNAi具有作為藥物的巨大潛力。但是，由于DNA和RNA較大的分子量和體積，并且在體內(nèi)容易降解，自身帶負(fù)電的磷酸骨架難以和同樣帶負(fù)電的細(xì)胞膜作用，無(wú)法進(jìn)入細(xì)胞。這已經(jīng)成為制約DNA和RNAi臨床應(yīng)用的最大的限制因素。雖然DNA和RNA載體的功能上有一些細(xì)微的差異，但由于它們的性質(zhì)和輸送目的有著很多相似之處，與之對(duì)應(yīng)的載體的結(jié)構(gòu)和功能亦有很多相似點(diǎn)。目前，非病毒的納米顆粒載體成為當(dāng)前研究的熱點(diǎn)，這些載體大部分通過(guò)正電荷與DNA或者RNA結(jié)合，并且正電荷也有助于載體和帶負(fù)電的細(xì)胞膜結(jié)合，所以目前的大部分載體中都含有可以被質(zhì)子化的氮原子。另一方面，載體和DNA或者RNA復(fù)合物需要形成納米顆粒才容易被細(xì)胞吸收。基于以上兩點(diǎn)，在多胺上進(jìn)行疏水修飾成為一種非常有效的制備DNA/RNA載體的方法。其中，多胺一般為含有仲胺，伯胺等含有活潑氫的片段，常用的有不同分子量的聚乙烯亞胺，氨基醇，烷基胺等。疏水修飾則膽固醇，聚酯，脂肪烴等。蘭格等人通過(guò)一種簡(jiǎn)單的方法，使用不同長(zhǎng)度的烷基鏈修飾多種含氨基化合物，得到了不同取代度的氨基脂質(zhì)類化合物文庫(kù)，其中一些化合物在細(xì)胞和動(dòng)物水平上都能夠有效的攜帶siRNA并使目的基因沉默(Akinc,Zumbuehletal.2008；Whitehead,Sahayetal.2011)，但這些載體不具有生物可降解性或者降解速度較慢。本發(fā)明人的研究組也曾使用丙烯辛胺修飾低分子量的聚乙烯亞胺，顯著改善了聚乙烯亞胺的siRNA輸送能力。但是，盡管這些氨基脂質(zhì)類化合物展現(xiàn)了良好的siRNA輸送能力，可由于這些氨基脂質(zhì)類化合物的生物降解性能不佳，顯示出了比前體更大的毒性，這些載體的毒性成為siRNA臨床引用中的一個(gè)潛在的問(wèn)題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：基于此，本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺陷，提供一種生物可降解的氨基脂質(zhì)類化合物，該類化合物可以在細(xì)胞內(nèi)的還原性條件下斷裂降解，從而能夠在體內(nèi)通過(guò)代謝降低其毒性。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取以下技術(shù)方案：一種生物可降解的氨基脂質(zhì)類化合物，選自如下化合物及其藥學(xué)上可接受的鹽：其中：A為-N(R5)2，R5獨(dú)立地選自：氫、?；⒓坠柰榛?、磺酰基、氨基保護(hù)基團(tuán)、取代或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜烯基、取代或未取代的雜炔基、被取代的或未被取代的碳環(huán)基、取代或未取代的雜環(huán)基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、或是以下通式iii'基團(tuán)：其中：R3獨(dú)立地選自：氫、取的或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜烯基、取代或未取代的雜炔基、取代或未取代的碳環(huán)基、取代或未取代的雜環(huán)基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基；R4獨(dú)立地選自：氫、?；?、甲硅烷基、巰基保護(hù)基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜烯基、取代或未取代的雜炔基、取代或未取代的碳環(huán)基、取代或未取代的雜環(huán)基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、膽固醇、親水性聚合物或疏水性聚合物；q獨(dú)立地選自：1-6的整數(shù)；V獨(dú)立地選自：O或者NH，L1相同或者不同的獨(dú)立選自：r獨(dú)立地選自：1-6的整數(shù)；R1獨(dú)立地選自：氫、C1-6烷基；R2、R6獨(dú)立地選自：氫、?；?、甲硅烷基、磺酰基、氨基保護(hù)基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜烯基、取代或未取代的雜炔基、取代或未取代的碳環(huán)基、取代或未取代的雜環(huán)基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、取代或未取代的聚乙烯亞胺、或是通式iii'基團(tuán)；n選自：0-45的整數(shù)；Z獨(dú)立地選自：氫、?；?、甲硅烷基、磺?；被Ｗo(hù)基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜烯基、取代或未取代的雜炔基、取的或未取代的碳環(huán)基、取代或未取代的雜環(huán)基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、或是通式iii'基團(tuán)；并且，A，L1或者Z中至少有一個(gè)片段含有通式iii'所示的基團(tuán)。上述氨基脂質(zhì)類化合物可通過(guò)將式X化合物與氨基化合物邁克爾加成反應(yīng)，使式X化合物中碳-碳雙鍵斷裂后與氨基化合物中氨基或者單取代氨基加成反應(yīng)制得；在其中一些實(shí)施例中，A為-N(R5)2，R5獨(dú)立地選自：氫，甲基，乙基，或者通式iii'基團(tuán)；Z獨(dú)立地選自：氫，甲基，乙基，或者通式iii'基團(tuán)；L1相同或者不同的獨(dú)立選自：r選自：1，2或者3；R1選自：氫，甲基，或乙基；R2、R6獨(dú)立地選自：氫、甲基、乙基、取代或未取代的聚乙烯亞胺、或是通式iii'基團(tuán)。在其中一些實(shí)施例中，R3選自：氫或甲基，q選自：2；V選自：O或NH；R4選自：2位取代吡啶，C6-18直鏈烷烴。在其中一些實(shí)施例中，R2獨(dú)立地選自：取代或未取代的聚乙烯亞胺，該取代或未取代的聚乙烯亞胺基團(tuán)為如下式xii結(jié)構(gòu)：其中：t選自：1-50的整數(shù)；P獨(dú)立地選自：氫、?；⒓坠柰榛?、磺酰基、氨基保護(hù)基、取代或未取代的烷基、取代或未取代的鏈烯基、取代或未取代的炔基、取代或未取代的雜烷基、取代或未取代的雜烯基、取代或未取代的雜炔基、取代或未取代的碳環(huán)基、取代或未取代的雜環(huán)基、取代或未取代的芳基、取代或未取代的雜芳基、或是通式iii'基團(tuán)，優(yōu)選為氫、未取代的C1-6烷基或通式iii'基團(tuán)。R9獨(dú)立地選自：氫、如下通式ii'基團(tuán)、或是通式iii'基團(tuán)：上述式xii結(jié)構(gòu)中，如R9選取是非ii'基團(tuán)結(jié)構(gòu)，則xii基團(tuán)不再延長(zhǎng)；如果R9選取是的ii'基團(tuán)結(jié)構(gòu)，則其中的R2或者R6基團(tuán)可以繼續(xù)是xii結(jié)構(gòu)，并且xii中的R9還可以繼續(xù)是ii'基團(tuán)結(jié)構(gòu)并按此種方式一直延伸，直到xii結(jié)構(gòu)中的R9是非ii’基團(tuán)結(jié)構(gòu)，則該基團(tuán)截止。在其中一些實(shí)施例中，所述通式iii'基團(tuán)的數(shù)目比氨基上活性氫的個(gè)數(shù)少1。即保留一個(gè)氨基上的活潑氫不參與反應(yīng)。本發(fā)明還公開了一種上述生物可降解的氨基脂質(zhì)類化合物的制備方法，將通式I的氨基化合物與通式X化合物反應(yīng)，使式X化合物中碳-碳雙鍵斷裂后與I的氨基化合物中氨基邁克爾加成反應(yīng)；其反應(yīng)路線如下：其中，R7獨(dú)立地選自：氫、C1-6烷基、或是通式ii'基團(tuán)：并且，通式I的氨基化合物中，R5、R2，R6及其所包含的次級(jí)R2和R6基團(tuán)、Z中至少有一個(gè)是氫。在其中一些實(shí)施例中，通式I所示的氨基化合物是支化或者線性的聚乙烯亞胺或者以下多胺：本發(fā)明的氨基脂質(zhì)類化合物通過(guò)上述路線反應(yīng)制得，具體來(lái)說(shuō)，是將前體氨基化合物與一種或多種通式X的二硫鍵單體化合物反應(yīng)，生成本發(fā)明的氨基脂質(zhì)類化合物。每個(gè)前體溶解在有機(jī)溶劑(如四氫呋喃，二氯甲烷，甲醇，乙醇，氯仿，己烷，甲苯，苯，四氯化碳，甘醇二甲醚，乙醚等)中，加入不同當(dāng)量的一個(gè)或多個(gè)二硫鍵單體，反應(yīng)混合物在室溫或者加熱條件下反應(yīng)，得到不同取代度的氨基脂質(zhì)類化合物。并且如技術(shù)人員在本領(lǐng)域中所理解的，取代的程度可通過(guò)合成的反應(yīng)條件來(lái)控制(例如，溫度，原料，濃縮，溶劑等)。本發(fā)明還公開了一種上述生物可降解的氨基脂質(zhì)類化合物作為載體在制備試劑或藥物輸送系統(tǒng)中的應(yīng)用。所述試劑或藥物可以是治療，診斷，或預(yù)防劑，可以是有機(jī)分子(例如，膽固醇，藥物)，無(wú)機(jī)分子，核酸，蛋白質(zhì)，肽，核苷酸，靶向制劑，同位素標(biāo)記的有機(jī)或無(wú)機(jī)分子，疫苗，免疫劑，等等。且該輸送系統(tǒng)的形式可以為復(fù)合物，皮米顆粒，納米顆粒，微粒，膠束或脂質(zhì)體輸送等。并且，該氨基脂質(zhì)類化合物以及由其制備的復(fù)合物，脂質(zhì)體，膠束，微粒，皮米顆粒和納米顆粒等，由于它通常需要靶向于特定的細(xì)胞，一類細(xì)胞，或組織，可以被修改以包括靶向劑。本領(lǐng)域已知多種靶向劑引導(dǎo)藥物組合物進(jìn)入特定的細(xì)胞(參見(jiàn)例如庫(kù)騰(Cotten)等人酶學(xué)方法(MethodsEnzym.)217：618，1993；其以引用的方式并入本文中)。靶向劑可以存在于在整個(gè)顆粒，或者可以是僅在表面上。靶向劑可以是蛋白質(zhì)，肽，糖類，糖蛋白，脂質(zhì)，小分子，核酸等。靶向劑可用于靶向特定細(xì)胞或組織，或者可以被用來(lái)促進(jìn)顆粒的細(xì)胞內(nèi)吞作用或吞噬作用。由于本發(fā)明的生物可降解的氨基脂質(zhì)類化合物具有以下性質(zhì)，使得它們特別適用于藥物輸送裝置的制備。這些性質(zhì)包括：1)氨基脂質(zhì)類化合物的強(qiáng)結(jié)合能力以及能夠“保護(hù)”不穩(wěn)定試劑的能力；2)能夠緩沖在核內(nèi)體中pH的能力；3)充當(dāng)“質(zhì)子海綿”的能力，并可導(dǎo)致內(nèi)涵體破裂；4)，以中和帶負(fù)電荷的藥物的電荷的能力。并且，在其中一些實(shí)施例中，該氨基脂質(zhì)類化合物可被制備為包含待輸送藥物的顆粒。這些顆粒還可包含其它材料，如合成的聚合物(例如PEG，PLGA等)、天然聚合物(例如磷脂等)、或其它試劑(例如膽固醇)等。在其中一些實(shí)施例中，所述顆粒的直徑范圍為50-370nm。在其中一些實(shí)施例中，所述試劑或藥物為多核苷酸。該多核苷酸可以是任何核酸，包括，RNA和DNA。該多核苷酸可以是任何大小或任何序列的，并且它們可以是單鏈或雙鏈的。還可以通過(guò)化學(xué)或生物學(xué)方法進(jìn)行修改，這些修飾導(dǎo)致增加的多核苷酸的穩(wěn)定性，修飾包括甲基化，磷酸化，封端等在其中一些實(shí)施例中，所述多核苷酸和生物可降解的氨基脂質(zhì)類化合物形成的復(fù)合物粒徑為50nm-370nm，優(yōu)選100nm-370nm。在其中一些實(shí)施例中，所述氨基脂質(zhì)類化合物中的氨基與所述多核苷酸中的磷酸基團(tuán)的比值為1:1-50:1。在其中一些實(shí)施例中，該氮磷比介于約5:1至約45：1之間，在約15:1至約45：1之間，或約20:1至約40:1之間。增加氮：磷比，經(jīng)證明可以增加核酸結(jié)合力，但是會(huì)對(duì)傳遞遺傳物質(zhì)產(chǎn)生積極的影響的同時(shí)對(duì)傳遞帶來(lái)的毒性作用增加。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有以下有益效果：本發(fā)明的生物可降解的氨基脂質(zhì)類化合物，可以在適宜的條件下形成納米顆粒，膠束，脂質(zhì)體，有攜帶生物活性物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞或者體內(nèi)的能力，其中由于含有可降解的二硫鍵，可以在細(xì)胞內(nèi)斷裂，從而具有良好的生物相容性和較低的毒性。因而適宜作為藥物輸送系統(tǒng)的載體，例如用于多聚核苷酸的輸送中。并且，本發(fā)明的氨基脂質(zhì)類化合物與多核苷酸(如RNA特別是siRNA)具有很好的結(jié)合能力，在氨基脂質(zhì)類化合物的巰基降解后即可有效釋放多核苷酸。該氨基脂質(zhì)類化合物與多核苷酸的復(fù)合物粒徑在100-370nm之間時(shí)，其電勢(shì)大于零，有利于復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞。該復(fù)合物還具有很好的轉(zhuǎn)染效果及較低的細(xì)胞毒性。附圖說(shuō)明圖1是bPEI600-C8-4的1HNMR(在CDCl3中)的核磁共振譜圖；圖2是PEI600-C8-8的1HNMR(在CDCl3中)的核磁共振譜圖；圖3是bPEI600-C12-4的1HNMR(在CDCl3中)的核磁共振譜圖；圖4是bPEI600-C12-8的1HNMR(在CDCl3中)的核磁共振譜圖；圖5是bPEI600-C16-4的1HNMR(在CDCl3中)的核磁共振譜圖；圖6是bPEI600-LIPID與siRNA復(fù)合物的凝膠電泳圖；其中：a,b,c,d,e,f分別為bPEI600-C8-4、bPEI600-C8-8、bPEI600-C12-4、bPEI600-C12-8、bPEI600-C16-4和bPEI600的凝膠電泳圖，每幅圖的第一泳道是未加入氨基脂質(zhì)類化合物的siRNA對(duì)照，圖上所標(biāo)數(shù)字對(duì)應(yīng)著復(fù)合物的氮磷比。圖7是bPEI600-C12-8/siRNA復(fù)合物加入50mMDTT孵化一小時(shí)后的凝膠電泳圖；其中：第一泳道是未加入氨基脂質(zhì)類化合物的siRNA對(duì)照。圖8是氮磷比＝10:1的bPEI600-LIPID/siRNA復(fù)合物在HEPES(50mM，pH＝6.8)緩沖液中的粒徑與電勢(shì)表征。圖9是bPEI600-C12-8加入50mMDTT孵化48小時(shí)后測(cè)試粒徑的相關(guān)曲線；圖10是bPEI600-C12-8未加入50mMDTT孵化48小時(shí)后測(cè)試粒徑的相關(guān)曲線；圖11是siRNA轉(zhuǎn)染終濃度為50nM時(shí)，bPEI600-LIPID/siRNA復(fù)合物熒光素酶基因的沉默效果；圖12是siRNA終濃度為10nM時(shí)，TEPA-LIPID/siRNA復(fù)合物熒光素酶基因的沉默效果；圖13是流式細(xì)胞儀測(cè)試的帶熒光標(biāo)記的CY3-siRNA/bPEI600-LIPID復(fù)合物在氮磷比＝10:1時(shí)，轉(zhuǎn)染24小時(shí)后細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度；圖14是帶熒光標(biāo)記的Cy3-siRNA經(jīng)bPEI600-LIPID轉(zhuǎn)染(氮磷比＝10:1)24小時(shí)后細(xì)胞內(nèi)的熒光分布；其中：灰色大圓點(diǎn)為細(xì)胞核，灰白色小圓點(diǎn)為Cy3-siRNA。圖15是bPEI600-LIPID/siRNA復(fù)合物48小時(shí)孵化后的的細(xì)胞毒性。具體實(shí)施方式術(shù)語(yǔ)“獨(dú)立地選自”在本文中用于表示各不同標(biāo)號(hào)的R基團(tuán)(如R2和R6等)或者片段(如L1)之間，或通式中重復(fù)出現(xiàn)的同一標(biāo)號(hào)的R基團(tuán)(如R5等)或者片段(如L1)可相同或不同。術(shù)語(yǔ)“烷基”是指具有1至50個(gè)碳原子直鏈或支鏈的飽和烴基(“C1-50烷基“)。術(shù)語(yǔ)“鏈烯基”是指含有2至50個(gè)碳原子直鏈或支鏈的烴基并具有一個(gè)或多個(gè)碳-碳雙鍵(“C2-50鏈烯基“)。術(shù)語(yǔ)“炔基”是指含有2至50個(gè)碳原子直鏈或支鏈的烴基并具有一個(gè)或多個(gè)碳-碳三鍵(“C2-50炔基“)。術(shù)語(yǔ)“雜烷基”是指如本文所定義的烷基，其中主鏈還包括1個(gè)或多個(gè)(例如，1-25個(gè))雜原子(如氧，硫，氮，硼，硅，磷)。術(shù)語(yǔ)“雜烯基”是指如本文定義的鏈烯基，其中，主鏈還包括1個(gè)或多個(gè)(例如，1-25個(gè))雜原子(如氧，硫，氮，硼，硅，磷)。術(shù)語(yǔ)“雜炔基”是指如文中定義的炔基，其中，主鏈還包括1個(gè)或多個(gè)(例如，1-25個(gè))的雜原子(如氧，硫，氮，硼，硅，磷)。術(shù)語(yǔ)“碳環(huán)基”是指含有3至10個(gè)環(huán)碳原子的且不具有芳香性的環(huán)狀烴基(“C3-10碳環(huán)基“)，并且在該非芳香環(huán)系統(tǒng)中沒(méi)有雜原子。術(shù)語(yǔ)“雜環(huán)基”是指一種基團(tuán)，具有3～14個(gè)環(huán)碳原子的非芳香族環(huán)系統(tǒng)并且環(huán)上有1至4個(gè)雜原子，其中每個(gè)雜原子獨(dú)立地選自氮，氧和硫(“3-14元雜環(huán)基“)。包含一個(gè)或多個(gè)氮原子的雜環(huán)基團(tuán)，如果化合價(jià)允許的話，連接點(diǎn)可以是碳或氮原子。雜環(huán)基可以是單環(huán)的(“單環(huán)雜環(huán)基”)或多環(huán)(例如，稠合，橋接或螺環(huán)系統(tǒng)，諸如雙環(huán)系統(tǒng)(“雙環(huán)雜環(huán)基”)或三環(huán)系統(tǒng)(“三環(huán)雜環(huán)基”))，可以是飽和的或包含一個(gè)或多個(gè)碳-碳雙鍵或三鍵的。雜環(huán)基的多環(huán)系統(tǒng)可以在一個(gè)或者兩個(gè)環(huán)上包含一個(gè)或多個(gè)雜原子。術(shù)語(yǔ)“芳基”是指包含單個(gè)或多環(huán)的(例如，雙環(huán)或三環(huán))4n+2芳香環(huán)系統(tǒng)(例如，在環(huán)狀軌道共享6，10或14個(gè)π電子)，并且芳環(huán)體系具有6-14個(gè)環(huán)碳原子且不含雜原子(“C6-14芳基“)。術(shù)語(yǔ)“雜芳基”是指含有5-14元單環(huán)或多環(huán)(例如，雙環(huán)或三環(huán))的4n+2芳香環(huán)系統(tǒng)(例如，在環(huán)狀軌道共享6，10或14個(gè)π電子)，并且芳環(huán)體系具有環(huán)碳原子和1-4個(gè)環(huán)雜原子，其中每個(gè)環(huán)雜原子獨(dú)立地選自氮，氧和硫(“5-14元雜芳基”)。包含一個(gè)或多個(gè)氮原子的雜芳基，如果過(guò)化學(xué)價(jià)允許，連接點(diǎn)可以是碳或氮原子。雜芳基的多環(huán)系統(tǒng)的一個(gè)環(huán)或者兩個(gè)環(huán)可以包括一個(gè)或多個(gè)雜原子。烷基、鏈烯基、炔基、雜烷基、雜烯基、雜炔基、碳環(huán)基、雜環(huán)基、雜芳基，如本文所定義，是可以被任意取代的。在一般情況下，“取代的”一詞，意味著至少有一個(gè)氫存在于基團(tuán)(例如，碳原子或氮原子)，被替換為一個(gè)允許的取代基，例如，取代基在取代后產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物，例如，取代后的化合物不能自發(fā)的進(jìn)行轉(zhuǎn)化，例如發(fā)生重排，環(huán)化，消除或其它反應(yīng)。除非另有指明，否則“取代的”基團(tuán)具有一個(gè)或多個(gè)可取代的位置，并且當(dāng)在任何給定結(jié)構(gòu)中多于一個(gè)以上位置被取代時(shí)，取代基可以是相同的或在每個(gè)取代位都不同。“取代的”一詞可以涵蓋有機(jī)化合物的所有允許的取代物，也涵蓋了任何本文所述的可以產(chǎn)生穩(wěn)定的化合物的取代。對(duì)于滿足本發(fā)明的目的，雜原子如氮可具有氫取代基和/或如本文所述的任何合適的取代基，只要其滿足雜原子的化合價(jià)并形成穩(wěn)定的結(jié)構(gòu)即可。術(shù)語(yǔ)“?；笔侵高@樣的基團(tuán)，其中直接連接到母體分子上的碳是SP2雜化，且被氧，氮或硫原子所取代，例如，選自酮類的基團(tuán)(-C(═O)Raa-)，羧酸(-CO2H)，醛類(-CHO)，酯(-CO2Raa，-C(═O)SRaa，-C(═S)SRaa)，酰胺類(-C(═O)N(Rbb)2，-C(═O)NRbbSO2Raa，-C(═S)N(Rbb)2)，和亞胺(-C(═NRbb)Raa，-C(═NRbb)ORaa，-C(═NRbb)N(Rbb)2)，其中Raa和Rbb如本文所定義等。術(shù)語(yǔ)“甲硅烷基”是指基團(tuán)-Si(Raa)3，其中Raa是如本文所定義。術(shù)語(yǔ)“亞烷基”是指二價(jià)飽和脂肪族基團(tuán)，可視為烯烴打開雙鍵后所得到的二價(jià)基團(tuán)，或者視為烷烴不同碳原子上去掉兩個(gè)氫所得到的二價(jià)產(chǎn)物。術(shù)語(yǔ)“保護(hù)基”是指暫時(shí)阻斷特定官能部分(例如O、S或N)以使得可在多官能化合物中的另一反應(yīng)性位點(diǎn)選擇性進(jìn)行反應(yīng)。在某些實(shí)施例中，保護(hù)基以良好產(chǎn)率選擇性反應(yīng)以產(chǎn)生對(duì)所計(jì)劃的反應(yīng)穩(wěn)定的受保護(hù)物質(zhì)；保護(hù)基應(yīng)通過(guò)不會(huì)攻擊其它官能團(tuán)的容易得到且優(yōu)選無(wú)毒的試劑以良好產(chǎn)率選擇性去除；保護(hù)基形成容易分離的衍生物(更優(yōu)選地不會(huì)產(chǎn)生新的立體對(duì)稱中心)；并且保護(hù)基具有極少額外官能團(tuán)，從而避免其它反應(yīng)位點(diǎn)。如本文所詳述，可利用氧、硫、氮和碳保護(hù)基。術(shù)語(yǔ)“巰基保護(hù)基”包括但不限于半硫縮醛如1-乙氧基乙基和甲氧基甲基硫酯，或硫代碳酸酯，芐基、取代芐基、三苯甲基及叔丁基硫醚，乙酰基，苯甲酰基。氨基保護(hù)基指暫時(shí)阻斷氨基官能部分以使得可在多官能化合物中的另一反應(yīng)性位點(diǎn)選擇性進(jìn)行反應(yīng)的取代基。另外，多種保護(hù)基描述于有機(jī)合成中的保護(hù)基(ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis)，第3版Τ·W.格林(Greene，Τ.W.)和P.G.伍茲(Wuts，P.G.)編，約翰威利父子出版社(JohnWiley&Sons)，紐約(NewYork)：1999中，所述文獻(xiàn)的整體內(nèi)容以引用的方式并入本文中。術(shù)語(yǔ)“聚合物”是指由至少3個(gè)(例如，至少10個(gè)，20個(gè)，30個(gè)，40個(gè)，50個(gè)，60個(gè)，70個(gè)，80個(gè)，90個(gè)，100個(gè)，等等)共價(jià)結(jié)合的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元組成的化合物。如“親水性聚合物”指重復(fù)單元中含有至少一種可以形成氫鍵的基團(tuán)(例如氧，氮，硫)的聚合物。親水性的聚合物一般具有良好的生物相容性，包括但不限于多肽，纖維素聚合物，多糖，聚丙烯酸，聚乙烯醇，聚乙烯基吡咯烷酮，聚乙二醇等；如“疏水性聚合物”指重復(fù)單元中不含有可以形成氫鍵的基團(tuán)的聚合物，如聚碳酸酯，聚乳酸，聚己內(nèi)酯，聚3-羥基丁酸酯等。術(shù)語(yǔ)“磺?；笔侵高x自-SO2N(Rbb)2，-SO2Raa，和-SO2ORaa的基團(tuán)，其中Raa和Rbb如本文所定義。Raa獨(dú)立地選自：C1-10烷基，C2-10鏈烯基，C2-9炔基，C3-10碳環(huán)基，3-14元雜環(huán)基，C6-14芳基，5-14元雜芳基，或兩個(gè)Raa基團(tuán)一起形成3-14元雜環(huán)基或5-14元雜芳環(huán)，其中每個(gè)烷基，鏈烯基，炔基，碳環(huán)基，雜環(huán)基，芳基，雜芳基都可以具有0，1，2，3，4或5個(gè)獨(dú)立的Rdd取代基。Rbb獨(dú)立地選自：氫，-OH，-ORaa，-N(Rcc)2，-CN，-C(═O)Raa，-C(═O)N(Rcc)2，-CO2Raa，-SO2Raa，-C(═NRcc)ORaa，-C(═NRcc)N(Rcc)2，-SO2N(Rcc)2，-SO2Rcc，-SO2ORcc，-SORaa，-C(═S)N(Rcc)2，-C(═O)SRcc，-C(═S)SRcc，-P(═O)2Raa，-P(═O)(Raa)2，-P(═O)2N(Rcc)2，-P(═O)(NRcc)2，C1-10烷基，鏈烯基，C2-9炔基，C3-10碳環(huán)基，3-14元雜環(huán)基，C6-14芳基，和5-14元雜芳基，或兩個(gè)Rbb基團(tuán)連接以形成3-14元雜環(huán)基或5-14元雜芳環(huán)，其中每個(gè)烷基，鏈烯基，炔基，碳環(huán)基，雜環(huán)基，芳基，雜芳基都可以具有0，1，2，3，4或5個(gè)獨(dú)立的Rdd取代基。Rcc獨(dú)立地選自氫，C1-10烷基，C2-10鏈烯基，C2-9炔基，C3-10碳環(huán)基，3-14元雜環(huán)基，C6-14芳基，和5-14元雜芳基，或兩個(gè)Rcc基團(tuán)連接以形成3-14元雜環(huán)基或5-14元雜芳環(huán)，其中每個(gè)烷基，鏈烯基，炔基，碳環(huán)基，雜環(huán)基，芳基，雜芳基都可以具有0，1，2，3，4或5個(gè)獨(dú)立的Rdd取代基；Rdd獨(dú)立地選自：鹵素，-CN，-NO2，-N3，-SO2H，-SO3H，-OH，-ORee，-ON(Rff)2，-N(Rff)2，N(Rff)3+x-，-N(ORee)Rff，-SH，-SRee，-SSRee，-C(═O)Ree，-CO2H，-CO2Ree，-OC(═O)Ree，-OCO2Ree，-C(═O)N(Rff)2，-OC(═O)N(Rff)2，-NRffC(═O)Ree，-NRffCO2Ree，-NRffC(═O)N(Rff)2，-C(═NRff)ORee，-OC(═NRff)Ree，-OC(═NRff)ORee，-C(═NRff)N(Rff)2，-OC(═NRff)N(Rff)2，-NRffC(═NRff)N(Rff)2，-NRffSO2Ree，-SO2N(Rff)2，-SO2Ree，-SO2ORee，-OSO2Ree，-S(═O)Ree，-Si(Ree)3，-OSi(Ree)3，-C(═S)N(Rff)2，-C(═O)SRee，-C(═S)SRee，-SC(═S)SRee，-P(═O)2Ree，-P(═O)(Ree)2，-OP(═O)(Ree)2，-OP(═O)(ORee)2，C1-6烷基，C1-6全鹵代烷基，C2-6鏈烯基，C2-6炔基，C3-10碳環(huán)基，3-9元雜環(huán)基，C6-10芳基，5-10元雜芳基，其中每個(gè)烷基，鏈烯基，炔基，碳環(huán)基，雜環(huán)基，芳基，和雜芳基都可以具有0，1，2，3，4或5個(gè)獨(dú)立的Rgg取代基，或兩個(gè)偕Rdd取代基可用═O或═S替代。Ree獨(dú)立地選自：C1-6烷基，C1-6全鹵代烷基，C2-6鏈烯基，C2-6炔基，C3-10碳環(huán)基，C6-10芳基，3-10元雜環(huán)基，和3-10元雜芳基，其中每個(gè)烷基，鏈烯基，炔基，碳環(huán)基，雜環(huán)基，芳基，和雜芳基可以具有0，1，2，3，4或5個(gè)Rgg取代基；Rff獨(dú)立地選自：氫，C1-6烷基，C1-6全鹵代烷基，C2-6鏈烯基，C2-6炔基，C3-10碳環(huán)基，3-9元雜環(huán)基，C6-10芳基和5-10元雜芳基，或兩個(gè)Rff基團(tuán)一起形成3-14元雜環(huán)基或5-14元雜芳環(huán)，其中每個(gè)烷基，鏈烯基，炔基，碳環(huán)基，雜環(huán)基，芳基，和雜芳基可以具有0，1，2，3，4或5個(gè)Rgg取代基；Rgg獨(dú)立地選自：鹵素，CN，-NO2，-N3，-SO2H，-SO3H，-OH，-OC1-6烷基，-ON(C1-6烷基)2，-N(C1-6烷基)2，-N(C1-6烷基)3+-X-，-NH(C1-6烷基)2+X-，-NH2(C1-6烷基)+X-，-NH3+X-，-N(OC1-6烷基)(C1-6烷基)，N(OH)(C1-6烷基)，NH(OH)，-SH，-SC1-6烷基，-SS(C1-6烷基)，-C(═O)(C1-6烷基)，-CO2H，-CO2(C1-6烷基)，-OC(═O)(C1-6烷基)，-OCO2(C1-6烷基)，-C(═O)NH2，-C(═O)N(C1-6烷基)2，-OC(═O)NH(C1-6烷基)，-NHC(═O)(C1-6烷基)，-N(C1-6烷基)C(═O)(C1-6烷基)，-NHCO2(C1-6烷基)，-NHC(═O)N(C1-6烷基)2，NHC(═O)NH(C1-6烷基)，-NHC(═O)NH2C(═NH)O(C1-6烷基)，-OC(═NH)(C1-6烷基)，-OC(═NH)OC1-6烷基，-C(═NH)N(烷基)2，-C(═NH)NH(C1-6烷基)，-C(═NH)NH2，-OC(═NH)N(C1-6烷基)2，-OC(NH)NH(C1-6烷基)，OC(NH)NH2，NHC(NH)N(C1-6烷基)2，NHC(═NH)NH2，-NHSO2(C1-6烷基)，-SO2N(1-6烷基)2，-SO2NH(C1-6烷基)，-SO2NH2，-SO2烷基，-SO2OC1-6烷基，-OSO2烷基，-SOC1-6烷基，-Si(C1-6烷基)3，-OSi(C1-6烷基)3C(═S)N(C1-6烷基)2，-C(═S)NH(C1-6烷基)，-C(═S)NH2，-C(═O)O(C1-6烷基)，-C(═S)SC1-6烷基，-SC(═S)SC1-6烷基，-P(═O)2(C1-6烷基)，-P(═O)(C1-6烷基)2，-OP(═O)(C1-6烷基)2，-OP(═O)(OC1-6烷基)2，C1-6烷基，C1-6全鹵代烷基，C2-6鏈烯基，C2-6炔基，C3-10碳環(huán)基，C6-10芳基，3-10元雜環(huán)基，5元-10元雜芳基；或者兩個(gè)偕Rgg取代基可被═O或═S替代。其中X-為抗衡離子，即帶負(fù)電荷的基團(tuán)，它與一個(gè)帶正電荷的季胺結(jié)合，以保持電中性。示例性的抗衡離子包括鹵離子(例如，F(xiàn)-，Cl-，Br-，I-)，NO3-，ClO4-，OH-，H2PO4-，HSO4-，磺酸離子(例如，甲磺酸，三氟甲，對(duì)甲苯磺酸鹽，苯磺酸鹽，10-樟腦磺酸鹽，萘-2-磺酸鹽，萘-1-磺酸，5-磺酸，乙烷-1-磺酸，2-磺酸酯，和其它類似物)，和其它羧酸根離子(例如，乙酸鹽，丙酸乙酯，苯甲酸鹽，甘油酸，乳酸，酒石酸，乙醇酸，和其它類似物)。以下結(jié)合具體實(shí)施例對(duì)上述方案做進(jìn)一步說(shuō)明。應(yīng)理解，這些實(shí)施例是用于說(shuō)明本發(fā)明而不限于限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中采用的實(shí)施條件可以根據(jù)具體廠家的條件進(jìn)一步調(diào)整，未注明的實(shí)施條件通常為常規(guī)實(shí)驗(yàn)中的條件。以下實(shí)施例中所用部分試劑和儀器如下：正辛硫醇，正十二硫醇，丙烯酰氯，四乙烯五胺：購(gòu)于上海晶純實(shí)業(yè)有限公司。支化聚乙烯亞胺bPEI600(polyethyleneimine，PEI，Mn＝600)，正十六硫醇：購(gòu)于阿法埃莎(天津)化學(xué)有限公司。2,2'-二硫二吡啶：購(gòu)自南京康滿林化工實(shí)業(yè)有限公司。三乙胺：為分析純，使用氫化鈣回流24h后使用。丙酮，二氯甲烷，甲醇，石油醚，乙酸乙酯，乙醇等其他原料皆為分析純，未純化。巰基乙醇，4-羥乙基哌嗪乙磺酸(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonicacid，HEPES)，二硫蘇糖醇(DTT)：均購(gòu)于廣州威佳科技有限公司。胎牛血清(FBS)，胰蛋白酶，磷酸鹽緩沖液(PBS，pH＝7.2)，LipofectamineTM2000(LIPO)，RoswellParkMemorialInstitute1640培養(yǎng)基(RPMI1640)：均購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司。Cellcountingkit-8(CCK-8)試劑盒：購(gòu)于日本Dojindo公司。遺傳霉素G418購(gòu)自Amresco公司?；瘜W(xué)合成的常規(guī)siRNA，帶Cy3熒光標(biāo)記的siRNA：購(gòu)于廣州市銳博生物科技有限公司。穩(wěn)定表達(dá)螢火蟲螢光素酶的人肺腺癌細(xì)胞株(A549-luc)：由本實(shí)驗(yàn)室以前通過(guò)遺傳霉素G418篩選獲得，細(xì)胞在37℃，5％潮濕的CO2下培養(yǎng)，使用含有10％FBS的RPMI1640培養(yǎng)基。1HNMR由BrukerAVANCEIII400M測(cè)定。粒徑和電勢(shì)由馬爾文ZetasizerNanoZS90激光粒度儀測(cè)定。螢火蟲螢光素酶發(fā)光效率由Veritas9100-002熒光照度計(jì)測(cè)定。帶熒光的siRNA細(xì)胞攝入效率分別由BDFACSCalibur流式細(xì)胞儀和LEICATCSSP2AOBS激光共聚焦顯微鏡測(cè)定。實(shí)施例1氨基脂質(zhì)類化合物的合成一、含有二硫鍵的脂質(zhì)丙烯酸酯的合成按照以下合成路線1制備：(1)化合物4a的制備：中間體2-(辛基二硫烷基)吡啶(2a)的制備：2,2’-二硫二吡啶(12g,54.55mmol,2eq)溶解在150mL乙醇中，辛硫醇(4.7mL,27.37mmol,1eq)溶解在20mL二氯甲烷中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將正辛硫醇慢慢滴加入二硫二吡啶的溶液中，反應(yīng)液隨著滴加的進(jìn)行變?yōu)榱咙S色，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)24-48小時(shí)，TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。辛硫醇反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液濃縮，通過(guò)柱色譜梯度洗脫分離，使用5％-10％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動(dòng)相，得到產(chǎn)物2a,為淡黃色液體，收率為67％。中間體2-(辛基二硫烷基)乙烷-1-醇(3a)的制備：將化合物2a(4.05g,15.88mmol,1eq)溶解于50mL二氯甲烷中，巰基乙醇(1.15mL,16.54mmol,1.05eq)溶解于10mL甲醇中，然后滴加入化合物2a的溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。原料反應(yīng)完畢后將反應(yīng)液濃縮，通過(guò)柱色譜梯度洗脫分離，使用10％-20％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動(dòng)相，得到產(chǎn)物3a，為無(wú)色液體，收率為75％。2-(辛基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯4a的制備：將化合物3a(2g,9mmol,1eq)溶解于干燥的二氯甲烷DCM，然后加入三乙胺TEA(1.87mL,13.45mmol,1.5eq)，將反應(yīng)液冰浴冷卻至0℃，滴加丙烯酰氯(0.73mL,9mmol,1eq),滴加完畢后反應(yīng)溫度升至室溫，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)液水洗干燥后濃縮，通過(guò)柱色譜梯度洗脫分離，使用5％-10％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動(dòng)，得到產(chǎn)物4a為淡黃色液體，收率為86％。產(chǎn)物表征數(shù)據(jù)為：1HNMR(400MHZ,CDCl3,PPM)δ6.43(d,1H),6.13(m,1H),5.84(d,1H),4.42(t,2H),2.94(t,2H),2.70(t,2H),1.67(m,2H),1.37(t,8H),1.27(m,8H),0.88(t,3H)。(2)化合物4b的制備：中間體2-(十二基二硫烷基)吡啶2b的制備：2,2’-二硫二吡啶(10g,45.45mmol,2eq)溶解在120mL乙醇中，正十二硫醇(5.44mL,22.75mmol,1eq)溶解在20mL二氯甲烷中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將十二硫醇慢慢滴加入二硫二吡啶的溶液中，反應(yīng)液隨著滴加的進(jìn)行變?yōu)榱咙S色，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)24-48小時(shí)，TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。正十二硫醇反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液濃縮，通過(guò)柱色譜梯度洗脫分離，使用5％-10％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動(dòng)相，得到產(chǎn)物2b,為淡黃色液體，收率為80％。中間體2-(十二基二硫烷基)乙烷-1-醇3b的制備：將化合物2b(5g,16.07mmol,1eq)溶解于50mL二氯甲烷中，巰基乙醇(1.18mL,16.79mmol,1.05eq)溶解于10mL甲醇中，然后滴加入化合物2b的溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。原料反應(yīng)完畢后將反應(yīng)液濃縮，通過(guò)柱色譜梯度洗脫分離，使用10％-20％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫，得到產(chǎn)物3b，為白色固體，收率為82％。2-(十二基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯4b的制備：將化合物3b(2g,7.19mmol,1eq)溶解于干燥的二氯甲烷DCM，然后加入三乙胺TEA(1.49mL,10.68mmol,1.5eq)，將反應(yīng)液冰浴冷卻至0℃，滴加丙烯酰氯(0.59mL,7.19mmol,1eq),滴加完畢后反應(yīng)溫度升至室溫，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)液水洗干燥后濃縮，通過(guò)柱色譜梯度洗脫分離，使用5％-10％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動(dòng)相，得到產(chǎn)物4b為淡黃色液體，收率為77％。產(chǎn)物表征數(shù)據(jù)為：1HNMR(400MHZ,CDCl3,PPM)δ6.43(d,1H),6.12(m,1H),5.84(d,1H),4.42(t,2H),2.94(t,2H),2.70(t,2H),1.67(m,2H),1.37(t,8H),1.26(m,16H),0.88(t,3H)。(3)化合物4c的制備：中間體2-(十六基二硫烷基)吡啶2c的制備：2,2’-二硫二吡啶(10g,45.45mmol,2eq)溶解在120mL乙醇中，正十六硫醇(6g,23.25mmol,1eq)溶解在30mL二氯甲烷中，在氮?dú)獗Ｗo(hù)下，將十六硫醇慢慢滴加入二硫二吡啶的溶液中，反應(yīng)液隨著滴加的進(jìn)行變?yōu)榱咙S色，室溫?cái)嚢柘路磻?yīng)24-48小時(shí)，TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。正十六硫醇反應(yīng)完畢后，將反應(yīng)液濃縮，通過(guò)柱色譜梯度洗脫分離，使用5％-10％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動(dòng)相，得到產(chǎn)物2b，為淡黃色液體，收率為64％。中間體2-(十六基二硫烷基)乙烷-1-醇3c的制備：將化合物2c(4.7g,12.80mmol,1eq)溶解于30mL二氯甲烷中，巰基乙醇(0.95mL,13.46mmol,1.05eq)溶解于10mL甲醇中，然后滴加入化合物2c的溶液中，氮?dú)獗Ｗo(hù)下攪拌反應(yīng)24小時(shí)，TLC跟蹤反應(yīng)進(jìn)程。原料反應(yīng)完畢后將反應(yīng)液濃縮，通過(guò)柱色譜梯度洗脫分離，使用10％-20％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動(dòng)相梯度洗脫，得到產(chǎn)物3c，為白色固體，收率為78％。2-(十六基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯4c的制備：將化合物3c(2.7g,8.08mmol,1eq)溶解于干燥的二氯甲烷DCM，然后加入三乙胺TEA(1.68mL,12.08mmol,1.5eq)，將反應(yīng)液冰浴冷卻至0℃，滴加丙烯酰氯(0.66mL,8.09mmol,1eq),滴加完畢后反應(yīng)溫度升至室溫，氮?dú)獗Ｗo(hù)下反應(yīng)過(guò)夜。反應(yīng)液水洗干燥后濃縮，通過(guò)柱色譜梯度洗脫分離，使用5％-10％乙酸乙酯的石油醚溶液作為流動(dòng)相，得到產(chǎn)物4c，為白色固體，收率為83％。產(chǎn)物表征數(shù)據(jù)為：1HNMR(400MHZ,CDCl3,PPM)δ6.43(d,1H),6.12(m,1H),5.84(d,1H),4.42(t,2H),2.94(t,2H),2.70(t,2H),1.67(m,2H),1.37(t,8H),1.26(m,24H),0.88(t,3H)。二、bPEI600-LIPID的合成(1)bPEI600-LIPID的合成按照以下合成路線2制備：其中，R2獨(dú)立是氫、取代或未取代的聚乙烯亞胺、或是：上述bPEI600為平均分子量為600D的支化聚乙烯亞胺。表格1.不同取代度和脂質(zhì)修飾的bPEI600-LIPID的其中：bPEI600-C8-4表示將平均分子量為600D的支鏈聚乙烯亞胺與2-(辛基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯(4a)按照摩爾比為4：1的比例投料制備得到的氨基脂類化合物，其核磁共振譜圖如圖1所示；bPEI600-C8-8表示將平均分子量為600D的支鏈聚乙烯亞胺與2-(辛基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯(4a)按照摩爾比為8：1的比例投料制備得到的氨基脂類化合物，其核磁共振譜圖如圖2所示；bPEI600-C12-4表示將平均分子量為600D的支鏈聚乙烯亞胺與2-(十二基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯(4b)按照摩爾比為4：1的比例投料制備得到的氨基脂類化合物，其核磁共振譜圖如圖3所示；bPEI600-C12-8表示將平均分子量為600D的支鏈聚乙烯亞胺與2-(十二基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯(4b)按照摩爾比為8：1的比例投料制備得到的氨基脂類化合物，其核磁共振譜圖如圖4所示；bPEI600-C16-4表示將平均分子量為600D的支鏈聚乙烯亞胺與2-(十六基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯(4c)按照摩爾比為4：1的比例投料制備得到的氨基脂類化合物，其核磁共振譜圖如圖5所示；。上述bPEI600-LIPID的合成方法：將bPEI600與相應(yīng)比例的脂質(zhì)化合物加入燒瓶中，加入乙醇溶解，反應(yīng)3-12小時(shí)，使用NMR監(jiān)測(cè)丙烯酸酯的雙鍵特征峰，待其特征峰消失或者相對(duì)含量不再變化時(shí)，將反應(yīng)物在40℃以下濃縮至最小體積，然后用大量鹽酸丙酮溶液沉淀，離心后沉淀物真空干燥后用少量DCM溶解，再次使用鹽酸丙酮溶液沉淀，離心干燥后得到最終產(chǎn)物。三、TEPA-LIPID的合成按照以下合成路線3制備：上述TEPA-C12的合成方法：取干燥過(guò)的TEPA(30mg，0.159mmol，1eq)以及263.1mg的2-(十二基二硫烷基)乙基丙烯酰酸酯(化合物4b)(263.1mg，0.792mmol，5eq)，用5mL乙醇溶解，室溫反應(yīng)24小時(shí)，粗產(chǎn)物使用柱色譜(80％DCM,，18％甲醇，2％氨水作為流動(dòng)相)分離，獲得不同取代度的氨基脂質(zhì)類化合物，R為通式iii'基團(tuán)，其中，R4為十二烷基，q為2，V為氧，R3為氫。表格2.不同取代度的TEPA-C12的質(zhì)譜表征名稱m/z[M+H+]TEPA-C12-4(異構(gòu)體3)15181519TEPA-C12-5(異構(gòu)體2)18501853TEPA-C12-6(異構(gòu)體1)21822187實(shí)施例2聚合物-siRNA復(fù)合物的制備將siRNA用無(wú)RNase水(無(wú)核糖核酸酶)配制成儲(chǔ)存液(20μM)，然后用HEPES緩沖液(pH＝6.8,50mM)稀釋到預(yù)定的濃度，并將氨基脂質(zhì)類化合物的水溶液用鹽酸調(diào)節(jié)pH至7-8，,再用同樣的緩沖液按照預(yù)定的氮磷比稀釋，將氨基脂質(zhì)類化合物溶液等體積的加入到siRNA溶液中，渦旋2-3秒，然后在37℃下孵化20-30分鐘，即得聚合物-siRNA復(fù)合物。實(shí)施例3siRNA結(jié)合能力測(cè)試將20pmolsiRNA溶解在5μLHEPES緩沖液(pH＝6.8,50mM)中，并加入梯度濃度的等體積的氨基脂質(zhì)類化合物溶液，。在37℃孵化30分鐘后，加入2μL6×上樣緩沖液(40％甘油，0.05％二甲苯青FF，30mMEDTA二鈉，1：1000SYBRGoldstain)，混合均勻后，2％瓊脂糖凝膠上樣，加入TBE緩沖液(trizma堿5.4g,硼酸2.75g,EDTA二鈉0.375gand1L去離子水)，在120V電壓下進(jìn)行10分鐘電泳，紫外曝光后取得siRNA的熒光圖片。結(jié)果如圖6所示，所有氨基脂質(zhì)類化合物均可以在氮磷比小于等于2的比例下完全結(jié)合siRNA。為了進(jìn)一步驗(yàn)證氨基脂質(zhì)類化合物降解后對(duì)于siRNA的結(jié)合能力，將bPEI600-C12-8在50MmDTT孵化1小時(shí)后，目的使脂質(zhì)與bPEI相連的二硫鍵斷裂，再通過(guò)凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)測(cè)定其siRNA結(jié)合能力。圖7顯示了bPEI600-C12-8加入DTT之后對(duì)于siRNA的凝膠阻滯效果，從圖中可以發(fā)現(xiàn)，降解后的氨基脂質(zhì)對(duì)于siRNA的結(jié)合能力迅速下降，在氮磷比等于32也無(wú)法完全結(jié)合siRNA，這說(shuō)明降解后的氨基脂質(zhì)復(fù)合物可以有效釋放siRNA。實(shí)施例4動(dòng)態(tài)光散射和zeta電勢(shì)測(cè)試對(duì)于動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)，按照上述實(shí)施例2的復(fù)合物制備方法，siRNA的最終濃度是50nM，與轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)的濃度一致，總體積為1mL。采用文獻(xiàn)(Nguyen,Steeleetal.2008)中描述的方法測(cè)定了siRNA復(fù)合物的粒徑和電勢(shì)。圖8顯示了siRNA復(fù)合物在氮磷比等于10的粒徑和電勢(shì)，所有siRNA-氨基脂質(zhì)復(fù)合物的粒徑在100nm到370nm之間，大部分復(fù)合物的電勢(shì)大于零，這有利于復(fù)合物進(jìn)入細(xì)胞。為了驗(yàn)證氨基脂質(zhì)化合物的降解，bPEI600-C12-8分別在含有50mMDTT的緩沖液和未加入DTT的緩沖液中放置兩天,然后測(cè)定其在緩沖液中中的粒徑。圖9、10的結(jié)果顯示，降解后的氨基脂質(zhì)的散射光子數(shù)僅為120kcps，而對(duì)照組則為946.1kcps，前者已經(jīng)無(wú)法滿足光散射發(fā)測(cè)定粒徑的要求，這說(shuō)明降解后的氨基脂質(zhì)溶液中基本沒(méi)有納米顆粒的存在。圖9、10的相關(guān)曲線也證實(shí)了這一點(diǎn)。實(shí)施例5細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)轉(zhuǎn)染之前，將A549-luc細(xì)胞提前24小時(shí)種在96孔板中，每孔大約5000個(gè)細(xì)胞，重復(fù)三個(gè)復(fù)孔。具體的轉(zhuǎn)染過(guò)程如下：siRNA用HEPES緩沖液稀釋到500nM濃度，加入等體積的氨基脂質(zhì)類化合物溶液，混合后室溫靜置20分鐘，加入含有10％FBS的RoswellParkMemorialInstitutemedium1640培養(yǎng)基，siRNA的最終濃度為50nM。除去板中舊的培養(yǎng)基，向每個(gè)孔中加入含有復(fù)合物的培養(yǎng)基，加藥后細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，換液繼續(xù)培養(yǎng)48小時(shí)。螢光素酶的表達(dá)通過(guò)Promegaluciferase試劑盒測(cè)定。將螢光素酶底物用RPMI1640稀釋一倍，除去細(xì)胞中的所有培養(yǎng)基，每孔加入70μL底物，震蕩10分鐘，然后轉(zhuǎn)移到光學(xué)檢測(cè)板上通過(guò)熒光照度計(jì)檢測(cè)化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度，轉(zhuǎn)染效率以未加藥細(xì)胞的熒光強(qiáng)度作為參照歸一化處理得到。結(jié)果如圖11所示，其中bPEI600-C8-8和bPEI600-C12-8顯示出了和商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine2000相當(dāng)?shù)幕虺聊Ч?，而且沒(méi)有表現(xiàn)出明顯的細(xì)胞毒性。按照上述方法，在低濃度siRNA轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)中，如圖12所示，TEPA-C12-5和TEPA-C12-6在siRNA最終濃度為10nM也顯示了良好的基因敲除能力，優(yōu)于或者約等于商業(yè)轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000在推薦濃度下的沉默效果。實(shí)施例6流式細(xì)胞術(shù)實(shí)驗(yàn)將A549-luc細(xì)胞以每孔2×106個(gè)密度種在6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24小時(shí)。復(fù)合物的制備使用Cy3標(biāo)記的siRNA，同樣按照上述的過(guò)程，相應(yīng)質(zhì)量的氨基脂質(zhì)類化合物和siRNA分別溶解在50μLHEPES緩沖液中等體積混合。室溫靜置20分鐘后，6孔板內(nèi)的舊培養(yǎng)基換為1.8mL新鮮培養(yǎng)基，再加入剛才制備的復(fù)合物溶液，最終Cy3-siRNA的濃度為25nM，混合均勻后培養(yǎng)24小時(shí)。轉(zhuǎn)染完畢后，用冷的PBS溶液洗滌4-5次細(xì)胞，用胰蛋白酶消化并收集所有細(xì)胞到EP管中，PBS洗滌一次，用70％乙醇固定半小時(shí)后洗滌，最終懸浮在PBS中，300目過(guò)濾后進(jìn)行流式細(xì)胞儀分析。結(jié)果如圖13所示，氨基脂質(zhì)類化合物處理后細(xì)胞的熒光強(qiáng)度是對(duì)照的2-4倍，這說(shuō)明本發(fā)明合成的氨基脂質(zhì)化合物可以有效攜帶siRNA進(jìn)入細(xì)胞。實(shí)施例7共聚焦顯微鏡實(shí)驗(yàn)將24mm×24mm的蓋玻片放入6孔板內(nèi)，A549-luc細(xì)胞以每孔1×106個(gè)密度種在6孔板內(nèi)的蓋玻片上，培養(yǎng)24小時(shí)。復(fù)合物的制備使用Cy3標(biāo)記的siRNA，同樣按照上述的過(guò)程，相應(yīng)質(zhì)量的氨基脂質(zhì)和siRNA分別溶解在50μLHEPES緩沖液中等體積混合。室溫靜置20分鐘后，6孔板內(nèi)的舊培養(yǎng)基換為1.8mL新鮮培養(yǎng)基，再加入剛才制備的復(fù)合物溶液，最終cy3-siRNA的濃度為分別為25nM，混合均勻后培養(yǎng)24小時(shí)。轉(zhuǎn)染完畢后，用冷的PBS溶液洗滌4-5次細(xì)胞，然后每孔用2mL4％多聚甲醛固定半個(gè)小時(shí)，吸出多聚甲醛，加入1mL2mg/mL甘氨酸水溶液浸泡5分鐘，以終止固定，用PBS洗滌兩到三次，加入1：5000的DAPI溶液使細(xì)胞核染色十分鐘，PBS洗滌兩到三次，加入70％乙醇水溶液震蕩半個(gè)小時(shí)，重復(fù)一次，以除掉未進(jìn)入細(xì)胞的Cy3-siRNA。取干凈的載玻片滴小滴甘油，取出蓋玻片，小心倒扣在載玻片的甘油上面，有細(xì)胞的那一面朝下。細(xì)胞片在激光共聚焦顯微鏡下觀察，分別在405nm和543nm激發(fā)。結(jié)果如圖14所示，僅采用Cy3-siRNA孵化的細(xì)胞的細(xì)胞核周圍沒(méi)有發(fā)現(xiàn)代表Cy3-siRNA的灰白色斑點(diǎn)出現(xiàn)，而使用氨基脂質(zhì)化合物-Cy3-siRNA復(fù)合物孵化的細(xì)胞的細(xì)胞核周圍則出現(xiàn)了較多灰白色斑點(diǎn)，即為Cy3-siRNA，此結(jié)果進(jìn)一步驗(yàn)證了流式的結(jié)果，證明bPEI600-LIPID均能攜帶siRNA進(jìn)入細(xì)胞。實(shí)施例8細(xì)胞毒性測(cè)試將A549-luc細(xì)胞以每孔5000個(gè)種在96孔板中，重復(fù)三個(gè)復(fù)孔。24小時(shí)培養(yǎng)后使細(xì)胞完全貼壁。按照上面的方法分別制備不同氮磷比的復(fù)合物溶液，加入含有10％FBS的RPMI培養(yǎng)基使siRNA的最終濃度為50nM。在細(xì)胞生長(zhǎng)48小時(shí)后，用CCK-8試劑盒測(cè)試毒性。具體方法如下，先配制含有10％CCK-8母液的培養(yǎng)基，吸出舊培養(yǎng)基，再加入CCK-8溶液，在37℃孵化1-2小時(shí)，用超級(jí)酶標(biāo)儀檢測(cè)450nm的吸光度，通過(guò)以下公式計(jì)算細(xì)胞毒性:CellViability(％)＝(OD450(sample)/OD450(untreated))×100％.結(jié)果如圖15所示，可降解的氨基脂質(zhì)的細(xì)胞毒性比以前合成的不可降解的氨基脂質(zhì)PEI-OA-8的細(xì)胞毒性有顯著的降低。其中，PEI-OA-8的結(jié)構(gòu)為：其中，R’為氫或者n’為1，R’在通式中的平均個(gè)數(shù)約為8。以上所述實(shí)施例僅表達(dá)了本發(fā)明的幾種實(shí)施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對(duì)本發(fā)明專利范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對(duì)于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進(jìn)，這些都屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。因此，本發(fā)明專利的保護(hù)范圍應(yīng)以所附權(quán)利要求為準(zhǔn)。當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3