本發(fā)明涉及生物醫(yī)學和分子生物學領(lǐng)域，具體地說，涉及一種新型核酸熒光定量檢測方法。
背景技術(shù)：
：熒光定量PCR技術(shù)自問世以來，就因為其高靈敏性，高特異性和高精確性的特點，已被廣泛應(yīng)用于微生物病原體測定、腫瘤基因檢測、免疫分析、基因表達、突變及其多態(tài)性等多個研究領(lǐng)域。熒光定量PCR技術(shù)的化學原理包括探針類和非探針類兩種。探針類技術(shù)主要包括Taqman探針法、分子信標法，兩者都是利用與靶序列特異雜交的探針所產(chǎn)生的熒光信號，來實現(xiàn)熒光定量檢測。非探針類主要包括Sybgreen法，Lux熒光法，兩者是利用熒光染料或者發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物而實現(xiàn)了熒光定量檢測。探針類技術(shù)由于在擴增過程中增加了探針的識別步驟，特異性更高。因此，探針法已經(jīng)成為熒光定量PCR檢測的主流技術(shù)。但是，由于探針的設(shè)計非常復(fù)雜，同時要求探針必須有一定的長度和較高的退火溫度。這無疑增加了探針的設(shè)計難度和選擇區(qū)域，特別是在高突變的靶序列上，很難有效地開展探針設(shè)計。而非探針類技術(shù)由于只需要設(shè)計上下游引物就能開展熒光定量檢測，設(shè)計簡單易行而受到研究人員的喜愛。但是，由于非探針類技術(shù)使用的熒光染料或發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物，會導致非特異性結(jié)果或檢測結(jié)果穩(wěn)定性差，這也直接導致了非探針類技術(shù)在醫(yī)學檢測領(lǐng)域應(yīng)用受到限制。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的是提供一種新型核酸熒光定量檢測方法，與常用Taqman探針法、分子信標法、LUX等方法相比，無需設(shè)計熒光探針，只需上下游引物就能高效地完成熒光定量擴增檢測。本發(fā)明的另一目的是提供一種新型核酸熒光定量擴增檢測系統(tǒng)。本發(fā)明的構(gòu)思如下：將上游引物5’端標記上熒光基團或淬滅基團，下游引物5’端標記上淬滅基團或熒光基團，然后進行PCR、RT-PCR擴增或進行其他形式的核酸擴增。由于上下游引物每完成一次擴增后，就會在擴增片段的兩側(cè)分別帶有熒光基團和淬滅基團，就會產(chǎn)生熒光基團的淬滅。通過熒光基團淬滅，來完成對PCR過程進行實時定量檢測。由于在PCR擴增的指數(shù)時期，模板的Ct值和該模板的起始拷貝數(shù)存在線性關(guān)系，所以成為定量的依據(jù)。該發(fā)明與探針法相比，不需額外設(shè)計復(fù)雜的熒光探針，只需上下游引物就能高效的完成熒光定量擴增檢測。(圖1)為了實現(xiàn)本發(fā)明目的，本發(fā)明提供一種新型核酸熒光定量檢測方法，在核酸(包括DNA和RNA)熒光定量擴增檢測系統(tǒng)中，設(shè)置一對或多對上下游引物，每對引物的上游引物序列和下游引物序列的5’端分別標記熒光基團和淬滅基團，或者每對引物的上游引物序列和下游引物序列的5’端分別標記淬滅基團和熒光基團；每完成一次擴增后，就會在擴增產(chǎn)物的兩端分別帶有熒光基團和淬滅基團，通過熒光基團淬滅，來對PCR反應(yīng)過程進行實時定量檢測。本發(fā)明所述熒光基團選自FAM、Alexa546、CY5、ROX、JOE、HEX、TET等，所述淬滅基團選自TAMARA、BHQ-1、BHQ-2、BHQ-3、Eclipse等。優(yōu)選地，本發(fā)明所述上游引物序列和下游引物序列的長度為10-30個堿基，擴增產(chǎn)物的長度為30-90個堿基。本發(fā)明所述核酸熒光定量擴增檢測系統(tǒng)包括PCR、RT-PCR、等溫擴增等常見的核酸擴增體系。本發(fā)明所述核酸熒光定量擴增檢測系統(tǒng)可以是單色熒光擴增，或者多色熒光同步擴增。本發(fā)明還提供一種新型核酸熒光定量擴增檢測系統(tǒng)，所述檢測系統(tǒng)包含一對或多對上下游引物，每對引物的上游引物序列和下游引物序列的5’端分別標記熒光基團和淬滅基團，或者每對引物的上游引物序列和下游引物序列的5’端分別標記淬滅基團和熒光基團?？蓪⒈景l(fā)明的核酸熒光定量擴增檢測系統(tǒng)用于病原微生物、腫瘤檢測、遺傳疾病檢測、檢驗檢疫等多個領(lǐng)域的定性和定量檢測。本發(fā)明與探針法(Taqman探針法、分子信標法等)相比，無需額外設(shè)計復(fù)雜的熒光探針，給熒光定量PCR的設(shè)計和檢測帶來巨大便利。同時，由于沒有熒光探針對PCR的擴增干擾，將極大的提高熒光定量PCR的檢測靈敏度。也降低了多色熒光定量檢測的互相干擾。本發(fā)明與非探針法相比，避免了由于添加熒光染料而導致的非特異結(jié)果。也解決了Lux熒光法的，由于復(fù)雜的發(fā)夾結(jié)構(gòu)引物設(shè)計，而帶來的檢測結(jié)果不穩(wěn)定等問題。因此，本發(fā)明既有探針類技術(shù)的高特異性，又具有非探針類技術(shù)的設(shè)計簡便性。本發(fā)明從根本上解決了現(xiàn)有熒光探針定量PCR技術(shù)存在的設(shè)計復(fù)雜、成本高等缺陷問題。本發(fā)明提供的新型核酸熒光定量擴增檢測系統(tǒng)具有設(shè)計簡單、檢測靈敏度高，特異性強，穩(wěn)定性好等優(yōu)點。與目前主流的探針法和非探針法熒光定量檢測技術(shù)相比，本發(fā)明成本更加低廉，設(shè)計簡單易行，擴增效率更高，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)學、遺傳、檢驗檢疫等多個領(lǐng)域。附圖說明圖1為本發(fā)明核酸熒光定量擴增檢測系統(tǒng)的工作原理。圖2為本發(fā)明實施例1中檢測HBV國家參考品的結(jié)果。圖3為本發(fā)明實施例1中檢測HBV國家參考品的檢測濃度及其理論濃度的擬合曲線。圖4為本發(fā)明實施例1中對4種濃度HBV陽性血清樣本的重復(fù)性測試檢測結(jié)果。圖5為本發(fā)明實施例2中對三種病毒血清樣本的多重PCR檢測結(jié)果；其中，A為HBV檢測結(jié)果，B為HCV檢測結(jié)果，C為HIV檢測結(jié)果。具體實施方式以下實施例用于說明本發(fā)明，但不用來限制本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實施例均按照常規(guī)實驗條件，如Sambrook等分子克隆實驗手冊(SambrookJ&RussellDW,MolecularCloning:aLaboratoryManual,2001)，或按照制造廠商說明書建議的條件。實施例1乙型肝炎病毒的熒光定量PCR檢測1、病毒核酸樣本的制備使用東北制藥集團遼寧生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)的“核酸提取試劑盒(磁珠法)，備案號：遼本械備20160001”進行乙肝病毒核酸的提取和純化工作。具體操作參照產(chǎn)品說明書進行。2、PCR反應(yīng)液的配制按照表1完成PCR反應(yīng)液組份的配制。然后在每個PCR反應(yīng)管中分裝40μlPCR反應(yīng)液。表110×Buffer5.0μldNTPs(含有dATP、dCTP、dGTP、dUTP，每種組份各2mM)4.0μl熱啟動TaqDNA聚合酶(5U/μl)1.0μlUNG酶(1U/μl)0.2μl上游引物HBV-For(20μm，5’端標記FAM)0.5μl下游引物HBV-Rev(20μm，5’端標記BHQ-1)0.5μl去RNase水28.8μl其中，上游引物HBV-For、下游引物HBV-Rev的序列分別為:HBV-For：5’-ACCTCTCTTTACGCGGTCTCC-3’；HBV-Rev：5’-TGCACACGGTCCGGCAGATGAG-3’，擴增產(chǎn)物大小為56bp。3、加樣和檢測向含有PCR反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中，加入提取的病毒核酸樣本10μl，蓋緊管蓋，置于熒光定量PCR儀上進行擴增檢測。擴增程序見表2。表2一、國家參考品檢測以中國食品藥品檢定研究院的“乙型肝炎病毒(HBV)核酸定量參考品(L0-L6)”為待測樣本，采用上述方法進行檢測。最后分析參考品的檢測值和理論值之間的雙對數(shù)線性關(guān)系。要求雙對數(shù)線性關(guān)系(R2)≥0.97視為符合。檢測結(jié)果見圖2、圖3和表.3，其理論濃度和檢測濃度的雙對數(shù)曲線線性相關(guān)系數(shù)(R2)為0.999，表明本發(fā)明的新定量方法準確可靠，定量結(jié)果可以準確溯源到國家參考品。表3參考品質(zhì)量標準(IU/ml)理論濃度對數(shù)值實際檢測值檢測濃度對數(shù)值L0(0.7762～6.165)E+088.3421.73E+088.24L1(0.1479～1.175)E+087.6193.68E+077.566L2(0.1585～1.259)E+076.6494.55E+066.658L3(0.1659～1.318)E+065.6724.34E+055.637L4(0.1820～1.479)E+054.7153.72E+044.571L5(0.1514～1.230)E+043.6364.45E+033.648L6(0.3890～3.090)E+022.0431.37E+022.137二、樣本重復(fù)性檢測以東北制藥集團遼寧生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)的“乙型肝炎病毒(HBV)核酸(DNA)檢測試劑盒(熒光探針法)”標定的HBV陽性血清為初始樣本，用陰性血清將其稀釋成為1.0E+06、1.0E+05、1.0E+04和1.0E+03IU/ml四個梯度樣本。每個樣本重復(fù)三次，最后計算Ct值變異系數(shù)。結(jié)果如圖4所示。Ct值的變異系數(shù)分別為0.34％、0.41％、0.38％和0.46％，變異系數(shù)均控制在1％以內(nèi)，表明利用本發(fā)明方法檢測血清樣本的重復(fù)性和精密度很好。實施例2多重熒光定量RT-PCR檢測1、病毒核酸樣本的制備使用東北制藥集團遼寧生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)的“核酸提取試劑盒(磁珠法)，備案號：遼本械備20160001”進行病毒核酸的提取和純化工作。具體操作參照產(chǎn)品說明書進行。2、RT-PCR反應(yīng)液的配制按照表.4完成RT-PCR反應(yīng)液組份的配制。然后在每個PCR反應(yīng)管中分裝40μlRT-PCR反應(yīng)液。表.45×Buffer10.0μldNTPs(含有dATP、dCTP、dGTP、dUTP，每種組份各2mM)4.0μl熱啟動TaqDNA聚合酶(5U/μl)0.6μlUNG酶(1U/μl)0.1μlM-MLV(200U/μl)0.6μlRNase抑制劑(40U/μl)0.2μl上游引物HBV-For(20μm，5’端標記FAM)0.3μl下游引物HBV-Rev(20μm，5’端標記BHQ-1)0.3μl上游引物HCV-For(20μm，5’端標記HEX)0.3μl下游引物HCV-Rev(20μm，5’端標記BHQ-1)0.3μl上游引物HIV-For(20μm，5’端標記Cy5)0.3μl下游引物HIV-Rev(20μm，5’端標記BHQ-1)0.3μl去RNase水22.7μl其中，上游引物HBV-For、下游引物HBV-Rev的序列分別為:HBV-For：5’-ACCTCTCTTTACGCGGTCTCC-3’；HBV-Rev：5’-TGCACACGGTCCGGCAGATGAG-3’，擴增產(chǎn)物大小為56bp。上游引物HCV-For、下游引物HCV-Rev的序列分別為：HCV-For：5’-AGTAGTGTTGGGTCGCGAAAGG-3’；HCV-Rev：5’-TCTACGAGACCTCCCGGGGCAC-3’，擴增產(chǎn)物大小為76bp。上游引物HIV-For、下游引物HIV-Rev的序列分別為：HIV-For：5’-CTGAGCCTGGGAGCTCTCTGGC-3’；HIV-Rev：5’-CAAGTTTATTGAGGCTTAAG-3’，擴增產(chǎn)物大小為58bp。3、加樣和檢測向含有RT-PCR反應(yīng)液的PCR反應(yīng)管中，加入提取的病毒核酸樣本10μl，蓋緊管蓋，置于熒光定量PCR儀上進行擴增檢測。擴增程序見表.5。表.5以東北制藥集團遼寧生物醫(yī)藥有限公司生產(chǎn)的“乙型肝炎病毒(HBV)核酸(DNA)檢測試劑盒(熒光探針法)”標定的HBV陽性血清(病毒濃度：1.0E+05IU/ml)與HIVWHO國際標準品(病毒濃度：1.85E+05IU/ml)和HCVWHO國際標準品(病毒濃度：1.55E+05IU/ml)進行混合，制備成混合病毒血清樣本S1。用陰性血清將混合病毒血清進行三個梯度稀釋，分別制備成樣本S2，S3和S4。然后采用上述方法進行檢測。最后各自分析病毒檢測值和理論值之間的雙對數(shù)線性關(guān)系。要求雙對數(shù)線性關(guān)系(R2)≥0.97視為符合。檢測結(jié)果見圖5和表.6，其HBV、HCV和HIV理論濃度和檢測濃度的雙對數(shù)曲線線性相關(guān)系數(shù)(R2)分別為0.990、0.998和0.997。表明本發(fā)明適合進行多重熒光定量檢測，檢測結(jié)果準確可靠。表.6雖然，上文中已經(jīng)用一般性說明及具體實施方案對本發(fā)明作了詳盡的描述，但在本發(fā)明基礎(chǔ)上，可以對之做一些修改或改進，這對本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是顯而易見的。因此，在不偏離本發(fā)明精神的基礎(chǔ)上所做的這些修改或改進，均屬于本發(fā)明要求保護的范圍。序列表<110>東北制藥集團遼寧生物醫(yī)藥有限公司<120>一種新型核酸熒光定量檢測方法<130>KHP171111087.7TQ<160>8<170>PatentInversion3.3<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1acctctctttacgcggtctcc21<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2tgcacacggtccggcagatgag22<210>3<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>3acctctctttacgcggtctcc21<210>4<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>4tgcacacggtccggcagatgag22<210>5<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>5agtagtgttgggtcgcgaaagg22<210>6<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>6tctacgagacctcccggggcac22<210>7<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>7ctgagcctgggagctctctggc22<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>8caagtttattgaggcttaag20當前第1頁1 2 3