在生物化學家和化學生物學家中，一直在探尋能夠潛在地在生物體系中進行的化學反應。這些化學反應可以在生命科學的各個分支中具有巨大應用。然而，極少有反應可以符合復雜的生物體系的嚴苛要求，即水性介質、近中性pH、環(huán)境溫度、無金屬催化、無毒性副產(chǎn)物以及對于靶官能團具有優(yōu)異的選擇性。蛋白質及其周圍環(huán)境是一種這樣的復雜體系，其中，以生物相容性方式進行目標化學反應仍然是一種挑戰(zhàn)。蛋白質結構中的許多位點已成為該目的的目標，其中，半胱氨酸殘基的巰基是最常見的基團之一，主要是因為其高度親核性和相對低的天然豐度(參見Chalker,J.M.等,Chemistry–AnAsianJournal4,630-640,doi:10.1002/asia.200800427(2009)和Fodje,M.N.等,ProteinEngineering15,353-358,doi:10.1093/protein/15.5.353(2002))。然而，符合所有上述要求的蛋白質的通用反應仍然難以捉摸。最常見的方法學，其缺點和挑戰(zhàn)可歸類如下：(a)經(jīng)典反應試劑，例如馬來酰亞胺、丙烯酰胺、α-鹵代羰基化合物主要存在以下缺陷：缺乏選擇性、其自身穩(wěn)定性和毒性副產(chǎn)物；(b)修飾半胱氨酸殘基的金屬催化反應顯示優(yōu)異的選擇性(例如，B.G.Davis研究組采用釕催化劑的烯丙基硫醚的交叉置換(Lin,Y.A.等,JournaloftheAmericanChemicalSociety130,9642-9643,doi:10.1021/ja8026168(2008))和C.M.Che研究組采用金催化劑的巰基-丙二烯偶聯(lián)(On-YeeChan,A.等,ChemicalCommunications49,1428-1430,doi:10.1039/C2CC38214H(2013))。然而，必須使用金屬絡合物導致這些反應不適合許多生物學應用；(c)采用缺電子炔類(Shiu,H.-Y.等,Chemistry–AEuropeanJournal15,3839-3850,doi:10.1002/chem.200800669(2009))，或溴代馬來酰亞胺(Tedaldi,L.M.等,ChemicalCommunications,6583-6585,doi:10.1039/B915136B(2009)和Smith,M.E.B.等,JournaloftheAmericanChemicalSociety132,1960-1965,doi:10.1021/ja908610s(2010))和二硫代馬來酰亞胺衍生物(Robin,M.P.等,JournaloftheAmericanChemicalSociety135,2875-2878,doi:10.1021/ja3105494(2013))。這些反應顯示優(yōu)異的選擇性并且在過量硫基存在下具有可逆性的優(yōu)點。然而，因為細胞內環(huán)境中大量谷胱甘肽的存在，所述可逆性在體內應用時導致限制。兩個研究組(Ovaa和Mootz)近來同時且獨立地發(fā)現(xiàn)，通過原位巰基-炔偶聯(lián)，可利用末端炔(修飾的泛激素中)不可逆地抑制半胱氨酸蛋白酶(Ekkebus,R.等,JournaloftheAmericanChemicalSociety135,2867-2870,doi:10.1021/ja309802n(2013)和Sommer,S.等,Bioorganic&MedicinalChemistry21,2511-2517,(2013))，這非常令人印象深刻而意外，因為大多認為炔在生物學條件下是惰性的。然而，所述偶聯(lián)并不通用，因為已提出帶正電荷的蛋白袋(氧代陰離子)是該意外反應所必需的(Arkona,C.等,AngewandteChemieInternationalEdition,doi:10.1002/anie.201303544(2013))。長期以來的目標是通過其化學修飾來理解和調節(jié)蛋白質功能，我們研究組過去報道了采用Mukaiyama醛醇縮合的肽和蛋白質的N-末端的修飾(Alam,J.等,JournaloftheAmericanChemicalSociety132,9546-9548,doi:10.1021/ja102733a(2010))。然而，仍然急迫地需要找到一種選擇性地和不可逆地結合半胱氨酸的有希望的正交手柄和相關標記策略，而不需要特殊的局部條件(例如，帶正電荷的蛋白袋)。附圖的簡要說明圖1顯示了蛋白質中半胱氨酸殘基的選擇性修飾。圖2描繪了丙二烯酰胺1a與半胱氨酸甲酯的反應(A)和與谷胱甘肽(B)的反應。圖3是顯示修飾的谷胱甘肽的MS/MS的MS圖譜。圖4是顯示用丙二烯酰胺1a修飾的肽CGKSRF的MS/MS的MS圖譜。圖5是顯示用丙二烯酰胺1a修飾的肽KSCGRF的MS/MS的MS圖譜。圖6是顯示用丙二烯酰胺1a修飾的肽YDSQCFHRW的MS/MS的MS圖譜。圖7是顯示用丙二烯酰胺1b修飾的肽YDSQCFHRW的MS/MS的MS圖譜。圖8是顯示用丙二烯酰胺1c修飾的肽YDSQCFHRW的MS/MS的MS圖譜。圖9是顯示用丙二烯酰胺1d修飾的肽YDSQCFHRW的MS/MS的MS圖譜。圖10顯示了用丙二烯酰胺1a的牛胰島素的修飾。圖11是顯示用丙二烯酰胺1a修飾的牛胰島素鏈A的MS/MS的MS圖譜。圖12是顯示用丙二烯酰胺1a修飾的牛胰島素鏈B的MS/MS的MS圖譜。圖13描繪了用丙二烯酰胺1a修飾的牛血清白蛋白的MS/MS結果。圖14描繪了BSA(A)和TEM1β-內酰胺酶(B)的標記。發(fā)明描述在本發(fā)明的第一方面，提供了式I的化合物，其中:R1,R2和R3獨立地代表H、鹵素、CN、C1-12烷基、C2-12烯基、C2-12炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：OH、＝O、鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、OR6a、S(O)qR6b、S(O)2NR6cR6d、NR6eS(O)2R6f、NR6gR6h、芳基和Het1)、Cy1(其中Cy1基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：OH、＝O、鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、OR7a、S(O)qR7b、S(O)2NR7cR7d、NR7eS(O)2R7f、NR7gR7h、芳基和Het2)、Heta(其中Heta基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：OH、═O、鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、OR8a、S(O)qR8b、S(O)2NR8cR8d、NR8eS(O)2R8f、NR8gR8h、芳基和Het3)、OR9a、S(O)qR9b、S(O)2NR9cR9d、NR9eS(O)2R9f和NR9gR9h；R4和R5獨立地代表H、C1-12烷基、C2-12烯基、C2-12炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：OH、＝O、鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、＝O、OR10a、S(O)qR10b、S(O)2NR10cR10d、NR10eS(O)2R10f、NR10gR10h、芳基和Het4或熒光基團)、芳基、Cy2(其中后兩組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：OH、═O、鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、OR11a、S(O)qR11b、S(O)2NR11cR11d、NR11eS(O)2R11f、NR11gR11h、芳基和Het5)、Hetb(其中Hetb基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：OH、═O、鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、OR12a、S(O)qR12b、S(O)2NR12cR12d、NR12eS(O)2R12f、NR12gR12h、芳基和Het6)、OR13a和S(O)qR13b，或者R4和R5可以和它們所連接的碳原子一起代表3至10元雜環(huán)，所述雜環(huán)可以是芳族、完全飽和或者部分不飽和并且可以額外地包含一個或多個選自O、S和N的雜原子，所述雜環(huán)任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三組基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：OH、═O、鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)；Het1至Het6獨立地代表含有一個或多個選自O、S和N的雜原子的4至14元雜環(huán)基團，所述雜環(huán)基團可以包含一個、兩個或三個環(huán)并且可以被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、C1-6烷基、C2-6烯基(其中后兩組基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素和Het7)和OR14；Het7獨立地代表含有一個或多個選自O、S和N的雜原子的4至14元雜環(huán)基團，所述雜環(huán)基團可以包含一個、兩個或三個環(huán)并且可以被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、C1-6烷基、C2-6烯基(其中后兩組基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素)、S(O)qR15a和OR15b；Cy1和Cy2每次出現(xiàn)時獨立地代表3至6元芳族、完全飽和或部分不飽和的碳環(huán)；R6a至R6h、R7a至R7h、R8a至R8h、R9a至R9h、R10a至R10h、R11a至R11h、R12a至R12h、R13a至R13h每次出現(xiàn)時獨立地代表H、C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-6環(huán)烷基(其中后四組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：OH、═O、鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、OR16a、S(O)qR16b、S(O)2NR16cR16d、NR16eS(O)2R16f、NR16gR16h、芳基和Het8)、C3-10環(huán)烷基、C4-10環(huán)烯基(其中后兩組基團未取代或者任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、OH、═O、C1-6烷基和C1-6烷氧基)或Hetc，或R6-12c和R6-12d，R6-12g和R6-12h可以與它們所連接的氮原子一起代表3至14元雜環(huán)，所述雜環(huán)可以是芳族、完全飽和或部分不飽和并且可以額外地含有一個或多個選自O、S和N的雜原子，所述雜環(huán)任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、硝基、CN、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基(其中后三組基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：OH、═O、鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)；或者R10g代表H并且R10h代表C(S)NR17aR17b；Heta至Hetc獨立地代表含有一個或多個選自O、S和N的雜原子的4至14元雜環(huán)；Het8獨立地代表含有一個或多個選自O、S和N的雜原子的4至14元雜環(huán)，所述雜環(huán)可以含有一個、兩個或三個環(huán)并且可以被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、C1-6烷基，其中后一組基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、-OR18a和-NR18bR18c；R14、R15a、R15b、R16a至R16h、R18a至R18c每次出現(xiàn)時獨立地代表H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基,其中后三組基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、硝基、CN、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基(其中后三組基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：OH、═O、鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、C3-6環(huán)烷基、或C4-6環(huán)烯基(其中后兩組基團未取代或者任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、OH、═O、C1-4烷基和C1-4烷氧基),R17a代表H；R17b代表Het9或熒光基團；Het9代表含有一個或多個選自O、S和N的雜原子的4至22元雜環(huán)，所述雜環(huán)可以含有1至5個環(huán)并且可以被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、C1-6烷基(其中后一組基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、OR19a和NR19bR19c)、＝O、OR20a和NR20bR20c；R19a至R19c以及R20a至R20c每次出現(xiàn)時獨立地代表H、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基(其中后三組基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、硝基、CN、C1-4烷基、C2-4烯基、C2-4炔基(其中后三組基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：OH、═O、鹵素、C1-4烷基和C1-4烷氧基)、C3-6環(huán)烷基、或C4-6環(huán)烯基(其中后兩組基團未取代或者任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素、OH、═O、C1-4烷基和C1-4烷氧基)；q每次出現(xiàn)時代表0、1或2，或者上述化合物藥學上可接受的鹽、溶劑合物或藥物功能衍生物，前提是式I的化合物不是4,4-二氯-N-(丙-2-基)丁-2,3-二烯酰胺、N-叔丁基-4,4-二氯丁-2,3-二烯酰胺或4,4-二氯-N-(4-甲基苯基)丁-2,3-二烯酰胺。可以涉及的藥學上可接受的鹽包括酸加成鹽和堿加成鹽。這些鹽可以通過常規(guī)方式形成，例如通過式I的化合物的游離酸或游離堿形式與一個或多個當量的合適的酸或堿反應，任選地在溶劑中，或者在所述鹽不溶的介質中，然后采用標準技術去除所述溶劑、或者所述介質(例如，抽真空，冷凍干燥或者過濾)。鹽也可以通過鹽形式的式I的化合物的抗衡離子與另一種抗衡離子的交換來制備，例如采用合適的離子交換樹脂。藥學上可接受的鹽的例子包括衍生自礦物酸和有機酸的酸加成鹽以及衍生自金屬如鈉、鎂或優(yōu)選鉀和鈣的鹽。酸加成鹽的例子包括與乙酸、2、2-二氯乙酸、己二酸、藻酸、芳基磺酸(例如苯磺酸、萘-2-磺酸、萘-1、5-二磺酸和對甲苯磺酸)、壞血酸(例如L-壞血酸)、L-天冬氨酸、苯甲酸、4-乙酰胺基苯甲酸、丁酸、(+)-樟腦酸、樟腦磺酸、(+)-(1S)-樟腦-10-磺酸、癸酸、己酸、辛酸、肉桂酸、檸檬酸、環(huán)拉酸、十二烷基硫酸、乙烷-1、2-二磺酸、乙烷磺酸、2-羥基乙烷磺酸、甲酸、延胡索酸、粘酸、龍膽酸、葡庚糖酸、葡糖酸(例如D-葡糖酸)、葡糖醛酸(例如D-葡糖醛酸)、谷氨酸(例如L-谷氨酸)、α-氧代戊二酸、乙醇酸、馬尿酸、氫溴酸、鹽酸、氫碘酸、羥乙磺酸、乳酸(例如(+)-L-乳酸和(±)-DL-乳酸)、乳糖酸、馬來酸、蘋果酸(例如(-)-L-蘋果酸)、丙二酸、(±)-DL-扁桃酸、偏磷酸、甲烷磺酸、1-羥基-2-萘酸、煙酸、硝酸、油酸、乳清酸、草酸、棕櫚酸、撲酸、磷酸、丙酸、L-焦谷氨酸、水楊酸、4-氨基-水楊酸、癸二酸、硬脂酸、丁二酸、硫酸、單寧酸、酒石酸(例如(+)-L-酒石酸)、硫氰酸、十一碳烯酸和戊酸形成的酸加成鹽。鹽的具體例子是衍生自礦物酸如鹽酸、氫溴酸、磷酸、偏磷酸、硝酸和硫酸的鹽；衍生自有機酸如酒石酸、乙酸、檸檬酸、蘋果酸、乳酸、富馬酸、苯甲酸、乙醇酸、葡糖酸、琥珀酸、芳基磺酸的鹽；和衍生自金屬如鈉、鎂或者優(yōu)選鉀和鈣的鹽。如上所述，式I的化合物還涵蓋了化合物及其鹽的任意溶劑合物。優(yōu)選的溶劑合物是在本發(fā)明化合物的固態(tài)結構中引入非毒性藥學上可接受的溶劑分子(下文中稱為溶劑化溶劑)的溶劑合物。這種溶劑的例子包括水、醇(例如乙醇、異丙醇和丁醇)和二甲基亞砜。溶劑合物可以采用溶劑或者含有溶劑化溶劑的溶劑的混合物重結晶本發(fā)明的化合物來制備。在任意給定情況下是否形成溶劑合物可以采用公知的標準技術如熱重分析(TGE)、差示掃描量熱法(DSC)和X-射線結晶學對化合物的結晶進行分析。溶劑合物可以是化學計量或非化學計量的溶劑合物。尤其優(yōu)選的溶劑合物是水合物，水合物的例子包括半水合物、一水合物和二水合物。對于溶劑合物以及制備和表征它們的方法的更詳細討論可以參見Bryn等,《藥物的固態(tài)化學》(Solid-StateChemistryofDrugs),第二版,SSCI出版,美國印地安那州西拉斐特公司(IncofWestLafayette,IN,USA),1999,ISBN0-967-06710-3。本文所述式I化合物的“藥物功能衍生物”包括酯衍生物和/或具有、或者提供與本發(fā)明相關化合物相同的生物學功能和/或活性的衍生物。因此，在本發(fā)明中，該術語也可包括式I化合物的前藥。式I化合物的術語“前藥”包括口服或胃腸外給予后，并且在預定的時間內(例如，在6-24小時的給藥間隔內(即每天給予一至四次))，在體內代謝形成實驗可檢測量所述化合物的任意化合物。式I化合物的前藥可以通過修飾化合物上存在的官能團來制備，這樣，當所述前藥給予哺乳動物對象時在體內切去所述修飾。修飾通常通過用前藥取代基處理母體化合物來實現(xiàn)。前藥包括式I化合物中的羥基、氨基、巰基、羧基或羰基基團鍵合至可以在體內被切去的任意基團以分別再生所述游離巰基、氨基、巰基、羧基或羰基的式I的化合物。前藥的例子包括但不限于：羥基官能團的酯和氨基甲酸酯，羧基官能團的酯，N-酰基衍生物和N-曼尼希堿。關于前藥的一般信息可以參見例如Bundegaard,H.《前藥的設計》(“DesignofProdrugs”)，p.I-92,Elsevier,NewYork-Oxford(1985)。為了簡便起見，在下文中將式I的化合物以及所述化合物藥學上可接受的鹽、溶劑合物和藥物功能衍生物統(tǒng)稱為“式I的化合物”。式I的化合物可包含雙鍵，因此可以是圍繞每個單獨的雙鍵的E(異側(entgegen))和Z(同側(zusammen))幾何異構體。所有這些異構體及其混合物包括在本發(fā)明的范圍內。式I的混合物可以含有一個或多個不對稱碳原子，因此可以是光學和/或非對映異構體。非對映異構體可以采用常規(guī)技術，例如色譜法或分步結晶法進行分離。各種立體異構體可以通過采用常規(guī)技術(例如分步結晶或HPLC技術)分離外消旋或其他化合物的混合物來分離。或者，所需的光學異構體可以通過以下方式制備：合適的光學活性原料在不會導致外消旋化或差向異構化的條件下的反應(即“手性池”方法)，合適的原料與“手性助劑”的反應(所述手性助劑可以在后續(xù)合適的階段去除)，通過衍生化(即拆分，包括動態(tài)拆分)，例如用純手性酸，然后通過常規(guī)方式如色譜法分離非對映異構衍生物，或者通過與合適的手性試劑或手性催化劑的反應，所有均在本領域技術人員已知的條件下。所有立體異構體及其混合物包括在本發(fā)明的范圍內。在本發(fā)明的第二方面，提供了使用式I的化合物作為游離巰基的不可逆結合劑的應用。在本發(fā)明的某些實施方式中：(i)游離巰基是肽或蛋白質的一部分；(ii)所述應用為體外或體內；(iii)所述應用是在水性介質中或者在生理學條件下或其等價形式。在本發(fā)明的第三方面，提供了式I的化合物作為藥物的應用。本發(fā)明的上述方面提及的化合物的應用可以在醫(yī)學治療方法中采用。因此，根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了：(i)式I的化合物在制備用于治療通過抑制半胱氨酸蛋白酶得到緩解的病癥或疾病的藥物中應用；(ii)治療通過拮抗半胱氨酸蛋白質得到緩解的病癥或疾病的方法，所述方法包括給予需要這種治療的患者有效量的式I的化合物；和(iii)式I的化合物在治療通過抑制半胱氨酸蛋白質得到緩解的病癥或疾病中的應用。本領域技術人員應理解，術語“通過抑制半胱氨酸蛋白酶得到緩解的病癥或疾病”包括：寄生蟲病(牙周炎；瘧疾；錐蟲心臟病(chagasheart))；神經(jīng)系統(tǒng)疾病(阿爾茨海默??；傳染性海綿狀腦病)、癌癥、炎癥和免疫系統(tǒng)疾病(如多發(fā)性硬化癥)；動脈粥樣硬化；肺氣腫；肌營養(yǎng)不良癥；骨質疏松癥；和類風濕性關節(jié)炎。為了避免疑問，在本發(fā)明的上下文中，術語“治療”包括在需要這種治療的患者中的治愈性和姑息性治療，以及對相關疾病狀態(tài)易感的患者的預防性治療和/或診斷。術語“患者”包括哺乳動物(例如人)患者。在本文中，術語“對象”或“患者”是本領域公知的，在這里可互換使用，用于表示哺乳動物，包括狗、貓、大鼠、小鼠、猴、牛、馬、山羊、綿羊、豬、駱駝，最優(yōu)選人。在一些實施方式中，對象是需要治療或者患有疾病或病癥的對象。然而，在其他實施方式中，對象可以是正常對象。該術語不表示特定年齡或性別。因此，不論是成人還是新生兒，不論是男性還是女性，都包括在內。術語“有效量”是指對治療的患者產(chǎn)生療效(例如足以治療或預防疾病)的化合物的量。所述療效可以是客觀的(即通過測試或標記物可測量的)或主觀的(即治療對象表示出跡象或感覺到效果)。在本文所用術語“鹵素”指氟、氯、溴或碘。除非另有說明，術語“芳基”在本文中使用時包括C6-14(例如C6-10)芳基基團。該基團可以是單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)，具有6-14個環(huán)碳原子，其中至少一個環(huán)是芳族的。芳基基團的連接點可以通過環(huán)體系的任意原子。然而，當芳基基團是雙環(huán)或三環(huán)時，它們通過芳族環(huán)連接至分子的其他部分。C6-14芳基基團包括：苯基、萘基等，例如1,2,3,4-四氫萘基、茚滿基、茚基和芴基?？赡芴峒暗谋景l(fā)明的實施方式包括芳基是苯基的那些。雜環(huán)(Het1至Het9和Heta至Hetc)基團可以是完全飽和的、部分飽和的、完全芳族或部分芳族的?？赡芴峒暗腍et1至Het9和Heta至Hetc基團的例子包括：吖啶基,1-氮雜雙環(huán)[2.2.2]辛烷基,吖丁啶基,苯并咪唑基,苯并異噻唑基,苯并異噁唑基,苯并二噁烷基,苯并二氧雜環(huán)庚烷基,苯并二氧雜環(huán)庚烯基(benzodioxepinyl),苯并間二氧雜環(huán)戊烯基,苯并呋喃基,苯并呋吖基,苯并[c]異噁唑烷基,苯并嗎啉基,2,1,3-苯并噁二唑基,苯并噁嗪基(包括3,4-二氫-2H-1,4-苯并噁嗪基),苯并噁唑烷基,苯并噁唑基,苯并吡唑基,苯并[e]嘧啶,2,1,3-苯并噻二唑基,苯并噻唑基,苯并噻吩基,苯并三唑基,咔唑基,色滿基,色烯基,噌啉基,2,3-二氫苯并咪唑基,2,3-二氫苯并[b]呋喃基,1,3-二氫苯并[c]呋喃基,1,3-二氫-2,1-苯并異噁唑基,2,3-二氫吡咯并[2,3-6]吡啶基,二噁烷基,呋喃基,呋咱基,六氫嘧啶基,乙內酰脲基,咪唑基,咪唑并[1,2-a]吡啶基,咪唑并[2,3-b]噻唑基,吲唑基,吲哚啉基,吲哚基,異苯并呋喃基,異色滿基,異吲哚啉基,異吲哚基,異喹啉基,異噻唑基,異硫代色滿基,異噁唑烷基,異噁唑基,馬來酰亞胺,嗎啉基,萘并[1,2-b]呋喃基,萘啶基(包括1,6-萘啶基，或者尤其是1,5-萘啶基和1,8-萘啶基),噁二唑基,1,2-或1,3-噁嗪烷基,噁唑基,氧雜環(huán)丁基,吩嗪基,吩噻嗪基,酞嗪基,哌嗪基,哌啶基,蝶啶基,嘌呤基,吡喃基,吡嗪基,吡唑基,噠嗪基,吡啶基,嘧啶基,吡咯烷酮基,吡咯烷基,吡咯啉基,吡咯并[2,3-b]吡啶基,吡咯并[5,1-b]吡啶基,吡咯并[2,3-c]吡啶基,吡咯基,喹唑啉基,喹啉基,喹嗪基,喹喔啉基,二氧噻吩烷基,3-二氧噻吩烯基,4,5,6,7-四氫苯并咪唑基,4,5,6,7-四氫苯并吡唑基,5,6,7,8-四氫苯并[e]嘧啶,四氫呋喃基,四氫異喹啉基(包括1,2,3,4-四氫異喹啉基和5,6,7,8-四氫異喹啉基),四氫吡喃基,3,4,5,6-四氫吡啶基,1,2,3,4-四氫嘧啶基,3,4,5,6-四氫嘧啶基,四氫喹啉基(包括1,2,3,4-四氫喹啉基和5,6,7,8-四氫喹啉基),四唑基,噻二唑基,噻唑烷基,噻唑基,噻吩基,噻吩并[5,1-c]吡啶基,硫代色滿基,硫代乙氧苯基(thiophenetyl),三唑基,1,3,4-三唑并[2,3-b]嘧啶基,呫噸基等。雜環(huán)(Het1至Het9和Heta至Hetc)基團上的取代基(合適的話)可以位于環(huán)體系中的任意原子上，包括雜原子。雜環(huán)(Het1至Het9和Heta至Hetc)基團的連接點可以通過包括(合適的話)雜原子(例如氮原子)在內的環(huán)體系中的任意原子，或者作為環(huán)體系的一部分存在的任意稠合碳環(huán)上的原子。雜環(huán)(Het1至Het9和Heta至Hetc)基團也可以是N-或S-氧化形式。為了避免疑問，在式I的化合物中的兩個或更多個取代基的身份相同的情況下，各個取代基的實際身份無論如何不是相互獨立的。為了避免疑問，本文中采用術語如“R19a至R19c”時，本領域技術人員應理解表示R19a,R19b和R19c中的任一種(即適用的話，一些或所有)，包括本數(shù)?？梢圆捎玫谋景l(fā)明的實施方式包括取代基為以下形式的式I化合物：(a)R1至R3獨立地代表H,鹵素,CN,C1-6烷基(后一組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,硝基,CN,C1-4烷基,C2-3烯基,C2-3炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：OH,═O,鹵素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),OR6a和NR6gR6h),Cy1(其中Cy1基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,硝基,CN,C1-4烷基,C2-3烯基,C2-3炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：OH,═O,鹵素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),OR7a和NR7gR7h),Heta(其中Heta基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,硝基,CN,C1-4烷基,C2-3烯基,C2-3炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：OH,═O,鹵素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),OR8a和NR8gR8h),OR9a和NR9gR9h(例如，R1至R3獨立地代表H)；(b)R4和R5獨立地代表H,C1-6烷基,C2-6烯基,C2-6炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,硝基,CN,C1-4烷基,C2-3烯基,C2-3炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：OH,═O,鹵素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),＝O,OR10a,S(O)qR10b,NR10gR10h,芳基和Het4或熒光基團),芳基,Cy2(其中后兩組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,硝基,CN,C1-4烷基,C2-3烯基,C2-3炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：OH,═O,鹵素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),OR11a和NR11gR11h),Hetb(其中Hetb基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,硝基,CN,C1-4烷基,C2-3烯基,C2-3炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：OH,═O,鹵素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),OR12a和NR12gR12h),OR13a和S(O)qR13b,或者R4和R5可以與它們所連接的氮原子一起形成3至10元雜環(huán)，所述雜環(huán)可以是芳族、完全飽和或者部分不飽和并且可以額外地包含一個或多個選自O、S和N的雜原子，所述雜環(huán)任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,硝基,CN,C1-6烷基,C2-6烯基,C2-6炔基(其中后三組基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：OH,═O,鹵素,C1-4烷基和C1-4烷氧基)。例如，R4表示H，R5表示H,C1-6烷基(其中后一組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,硝基,CN,＝O,OR10a和Het4或熒光基團),芳基,Cy2(其中后兩組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,硝基,CN,C1-4烷基(其中后一組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：OH,═O,鹵素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),OR11a和NR11gR11h),Hetb(其中Hetb基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,硝基,CN,C1-4烷基,OR12a和NR12gR12h)和OR13a；(c)Het1至Het6獨立地代表含有一個或多個選自O、S和N的雜原子的6至10元雜環(huán)，所述雜環(huán)可以包含一個、兩個或三個環(huán)，可以被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,C3-5烷基,C3-5烯基(其中后兩組基團未取代或者任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素和Het7),和OR14。例如，Het4表示含有一個或多個選自O、S和N的雜原子的6至10元雜環(huán)，所述雜環(huán)可以包含一個或兩個環(huán)并且可以被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,C3-5烯基(后一組基團被Het7取代基取代),和OR14；(d)Het7獨立地代表含有一個或多個選自O、S和N的雜原子的6至10元雜環(huán)，所述雜環(huán)可包含一個或兩個環(huán)并且可以被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,C1-6烷基,S(O)qR15a和OR15b；(e)Cy1和Cy2每次出現(xiàn)時獨立地表示5至6元芳族、完全飽和或部分不飽和的碳環(huán)；(f)R6a至R6h,R7a至R7h,R8a至R8h,R9a至R9h,R10a至R10h,R11a至R11h,R12a至R12h,R13a至R13h,每次出現(xiàn)時獨立地表示H,C1-4烷基,C2-3烯基,C2-3炔基(其中后三組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,硝基,CN,C1-4烷基(其中后一組基團未取代或者被一種或多種選自以下的取代基取代：OH,═O,鹵素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),OR16a,NR16gR16h,芳基和Het8),或者R10g表示H，R10h表示C(S)NR17aR17b；(g)Heta至Hetc獨立地代表含有一個或多個選自O、S和N的雜原子的6至10元雜環(huán)；和/或Het8獨立地代表含有一個或多個選自O、S和N的雜原子的6至10元雜環(huán),所述雜環(huán)可包含一個或兩個環(huán)并且可以被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,C1-6烷基，后一組基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,OR18a和NR18bR18c；(h)R14,R15a,R15b,R16a至R16h，R18a至R18c每次出現(xiàn)時獨立地代表H,C1-4烷基,C2-4烯基,C2-4炔基其中后三組基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,硝基,CN,C1-4烷基,C2-4烯基,C2-4炔基(其中后三組基團任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：OH,═O,鹵素,C1-4烷基和C1-4烷氧基),C3-6環(huán)烷基,orC4-6環(huán)烯基(其中后兩組基團未取代或者任選地被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,OH,═O,C1-4烷基和C1-4烷氧基)；(i)Het9代表含有一個或多個選自O、S和N的雜原子的10至22元雜環(huán)，所述雜環(huán)可包含三個、四個或五個環(huán)并且可以被一種或多種選自以下的取代基取代：鹵素,C1-6烷基,＝O,OR20a,NR20bR20c。在本發(fā)明的另一些實施方式中，式I的化合物可選自下組：a)b)c)d)e)f)g)h)和i)或者所述化合物藥學上可接受的鹽或溶劑合物，或者藥物功能衍生物?？赡芴峒暗谋景l(fā)明的另一些實施方式包括式I的化合物被同位素標記的那些。然而，其他，尤其是可能提及的本發(fā)明的具體實施方式包括式I的化合物沒有被同位素標記的那些。本文中使用的術語“同位素標記”包括在化合物中的一個或多個位置存在非天然同位素(或者非天然同位素的分布)的式I的化合物。本領域技術人員應理解，“化合物中的一個或多個位置”是指式I的化合物的一個或多個原子。因此，術語“同位素標記”包括在化合物中的一個或多個位置富含同位素的式I的化合物。式I化合物的同位素標記或富含可以用氫、碳、氮、氧、硫、氟、氯、溴和/或碘中的任一種的放射性或非放射性同位素進行。該方面可能涉及的具體同位素包括：2H,3H,11C,13C,14C,13N,15N,15O,17O,18O,35S,18F,37CI,77Br,82Br和125l)。用放射性或非放射性同位素標記或富集的式I化合物時，可能涉及的式I的化合物包括化合物中至少一個原子顯示相關原子的放射性或非放射性同位素的同位素分布水平比放射性或非放射性同位素的天然水平高至少10％(例如，10％至5000％,具體是50％至1000％，更具體是100％至500％)。式I的化合物可以以包含藥學上可接受的劑量形式的化合物的藥物制劑的形式，通過任意合適的途徑給予，但優(yōu)選通過以下途徑給予：口服，靜脈內，肌內，皮膚，皮下，經(jīng)粘膜(如舌下或口頰)，直腸，透皮，鼻，肺(如氣管或支氣管)，局部，通過任意其他胃腸外途徑?？赡苌婕暗木唧w的給藥方式包括口服、靜脈內、皮膚、皮下、鼻、肌內或腹膜內給予。式I的化合物通常以與藥學上可接受的佐劑、稀釋劑或載體混合的藥物制劑的形式給予，可以根據(jù)指定的給藥途徑和標準藥物實踐進行選擇。這些藥學上可接受的載體可以是對活性化合物化學惰性的并且在使用條件下沒有有害的副作用或毒性。合適的藥物制劑參見例如《雷明登藥物科學與實踐》(RemingtonTheScienceandPracticeofPharmacy)，第19版,賓西馬尼亞州伊斯頓的馬克出版公司(MackPrintingCompany,Easton,Pennsylvania)(1995)。對于胃腸外給藥，可采用胃腸外可接受的水性乳液，無熱源并且具有必要的pH、等張性和穩(wěn)定性。合適的溶液是本領域技術人員公知的，文獻中描述了大量方法。藥物遞送方法的簡要綜述也可參見例如Langer,Science(1990)249,1527。否則，合適的制劑的制備可以由本領域技術人員采用常規(guī)技術和/或根據(jù)標準和/或可接受的藥物實踐常規(guī)實現(xiàn)。本發(fā)明中使用的任意藥物制劑中式I的化合物的量將取決于各種因素，例如需要治療的病癥的嚴重性，需要治療的具體患者，以及采用的化合物。在任意情況下，制劑中式I的化合物的量將由本領域技術人員常規(guī)確定。例如，諸如片劑或膠囊的固態(tài)口服組合物可包含1-99％(w/w)活性成分；0-99％(w/w)稀釋劑或填充劑；0-20％(w/w)崩解劑；0-5％(w/w)潤滑劑；0-5％(w/w)流動助劑；0-50％(w/w)造粒劑或粘合劑；0-5％(w/w)抗氧化劑；和0-5％(w/w)色素?？蒯屍瑒┛深~外地包含0-90％(w/w)的控釋聚合物。胃腸外制劑(例如用于注射的溶液或懸浮液或者用于輸注的溶液)可包含1-50％(w/w)活性成分；50-99％(w/w)液體或半固體載體或運載體(例如，諸如水的溶劑)；和0-20％(w/w)的一種或多種其他賦形劑，例如緩沖劑、抗氧化劑、懸浮液穩(wěn)定劑、張力調節(jié)劑和防腐劑。根據(jù)需要治療的病癥和患者以及給藥途徑，式I的化合物可以以各種治療有效劑量給予需要的患者。然而，在本發(fā)明的內容中，給予哺乳動物(尤其是人類)的劑量應足以造成所述哺乳動物中持續(xù)合理時間長度的治療性響應。本領域技術人員將理解，準確劑量和組成以及最合適的遞送方案的選擇也將受到以下因素的影響：制劑的藥理學性質、需要治療的病癥的性質和嚴重性、接受者的身體狀況和精神敏度、具體化合物的效力、需要治療的患者的年齡、體重、性別和響應、疾病的階段/嚴重性等等。給藥可以是連續(xù)或間斷的(例如推注)。劑型可以根據(jù)給藥周期和頻率確定。對于口服或胃腸外給藥來說，劑量可以約為，每天給予0.01-1000毫克式I的化合物。在任意情況下，醫(yī)療實踐者或其他本領域技術人員將能夠常規(guī)確定對于個體患者而言是最合適的實際劑量。上述劑量是平均情況的示例，當然，也存在應使用更高或更低劑量范圍的單獨情況，這類劑量也在本發(fā)明的范圍內。如上所述，式I的化合物可以選擇性結合游離巰基，因而可以用作確定游離巰基(即在半胱氨酸蛋白酶中)的存在和/或位置(體內或體外)的診斷試劑。因此，根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種確定組織樣品中游離巰基的存在和/或位置的方法(例如體內，或者具體是離體方法)，所述方法包括使所述組織樣品與式I的化合物接觸，然后通過視覺化方法檢測樣品中式I的化合物的位置?？赡苌婕暗囊曈X化方法包括分光光度檢測法(例如熒光檢測、磁共振成像等)，或者，當式I的化合物是同位素標記或者富含放射性同位素(例如3H,11C,35S,18F或125I)時，放射性檢測法(例如，通過本領域技術人員已知的標準放射自顯影、磷光體或閃爍方法的α-、β-或γ-檢測，或正電子發(fā)射斷層掃描法(后一種方法可以例如當式I的化合物存在11C或具體是18F同位素標記或富集時采用))。本文所述的本發(fā)明的方面(例如上述化合物、組合、方法和應用)在本文所述病癥的治療中具有優(yōu)勢，與現(xiàn)有技術已知的用于這些疾病或其他的治療的類似化合物、組合、方法(治療)或應用相比，它們對于醫(yī)師和/或患者而言更加方便，更加有效，毒性較小，具有更好的選擇性，具有更寬的活性范圍，效力更高，產(chǎn)生的副作用較少，或者具有其他有用的藥理學性質。式I的化合物可以根據(jù)本領域技術人員已知的技術進行制備，例如如下所述。本發(fā)明的化合物可以采用常規(guī)技術(例如重結晶、柱色譜、制備型HPLC等)從其反應混合物分離。在上述和后文描述的方法中，中間化合物的官能團可能需要由保護基團進行保護。官能團的保護和脫保護可以在上述方案反應之前或之后進行。保護基團可以根據(jù)本領域技術人員公知的技術去除，如下所述。例如，可以采用標準脫保護技術將本文所述保護的化合物/中間體化學轉化為未保護的化合物。涉及的化學類型將指導保護基團的需要和類型以及完成合成的順序。保護基團的使用參見《有機化學中的保護基團》(ProtectiveGroupsinOrganicChemistry),JWFMcOmie編,PlenumPress(1973),和《有機合成中的保護基團(ProtectiveGroupsinOrganicSynthesis),第3版,T.W.Greene&P.G.M.Wutz,Wiley-Interscience(1999)。本文所用術語“官能團”在未保護的官能團的情況下表示羥基、巰基、氨基官能、羧酸，在保護的官能團的情況下表示低級烷氧基、N-、O-、S-乙?；?、羧酸酯。在本發(fā)明的又一方面，提供了式I的化合物作為成像或診斷試劑的應用。例如，式I的化合物可以同位素標記和/或選自下組：i)ii)和iii)或所述化合物藥學上可接受的鹽或溶劑合物，或者藥物功能衍生物。在本發(fā)明的又一方面，提供了包含(任選地通過連接基團的方式)共價連接至具有診斷或成像性質的生物分子或者材料的丙二烯酰胺的化合物，或其藥學上可接受的鹽或溶劑合物或藥物功能衍生物。在本發(fā)明的其他相關方面，本文所述的化合物用作診斷或成像試劑。實施例一般描述所有化學物質購自供應商(SigmaAldrich,Merck,AlfaAesar和TCI)，無需進一步純化。用于肽合成的氨基酸購自GLBiochem公司。NMR譜采用Bruker300或400MHz分光光度計記錄。質譜在ThermoLCQFLEET設備上記錄?；衔?4和15的HPLC純化在反相ShimadzuHPLC系統(tǒng)上進行，采用AlltimaC-18(250X10mm)柱，流速3毫升/分鐘。熒光發(fā)射光譜記錄在TyphoonTRIO可變模式成像儀上。LC-MS/MS譜記錄在具有DionexpepmapC-18柱的DionexUHPLC和LTQ-軌道阱設備上。BSA蛋白的MS/MS之后產(chǎn)生的數(shù)據(jù)通過gpm軟件進行分析。制備制備1:合成3-丁炔酸氧化3-丁炔-1-醇并根據(jù)報道的過程(Schmieder-vandeVondervoort,L.等,P.L.Synlett2002,2002,0243)制備3-丁炔酸。水(45mL)加入配備有磁力攪拌棒的150mL單頸RBF中。相繼加入65％HNO3(0.17mL,5mol％,2.5mmol),Na2Cr2O7(0.15g,1mol％,0.5mmol)和NaIO4(23.53g,2.2當量,110mmol)至RBF中，混合液在冰浴上劇烈攪拌15分鐘。將溶解在45mL的冷水中的3.78mL的3-丁炔-1-醇(1當量,50mmol)緩慢加入該混合液中，反應混合液靜置18-24小時(未除去冰浴以允許冰融化并且反應混合液的溫度緩慢上升至室溫)。然后，產(chǎn)物用乙醚(80mLX6)萃取。合并所有餾分，在無水硫酸鎂上干燥。采用旋轉蒸發(fā)儀除去溶劑，得到橙色/淡黃色的粘稠液體。然后加入二氯甲烷，在旋轉蒸發(fā)儀上除去溶劑(真空下)4-5次，得到3.20g灰白色/淡黃色固體(38mmol,產(chǎn)率76％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ3.38(d,2H,J＝2.7Hz),2,25(t,1H,J＝2.7Hz)；13CNMR(400MHz,CDCl3)δ173.8,74.8,72.4,25.6制備2:合成(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(N-Boc-乙二胺)采用Liu,F.等,BioconjugateChemistry2012,23,1639報道的過程合成標題化合物。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ5.35(s,1H),3.15(t,2H,J＝5.7Hz),2.79(t,2H,J＝5.9Hz),1.45(s,9H)；13CNMR(400MHz,CDCl3)δ156.1,78.7,53.2,43.2,41.6,28.2合成化合物和肽合成丙二烯酰胺的一般過程室溫下，3-丁炔酸用1.5當量的Mukaiyama反應試劑(2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物)在無水二氯甲烷中攪拌1小時，沒有任何堿。1小時之后，將無水二氯甲烷中的所需胺(1.1當量)和三乙胺(1.5當量)的溶液逐滴加入3-丁炔酸混合液中。該步驟期間觀察到少量放熱，然后反應混合液再攪拌半小時。然后，采用旋轉蒸發(fā)儀除去二氯甲烷，將乙酸乙酯加入固體殘留物中，然后轉移至分液漏斗。有機層用水洗滌2次，在無水硫酸鈉上干燥。蒸發(fā)溶劑得到粗產(chǎn)物，然后柱色譜純化。發(fā)現(xiàn)產(chǎn)率對三乙胺的量敏感，過量的TEA導致較低的產(chǎn)率。合成N-芐基丁-2,3-二烯酰胺(1a)3-丁炔酸(制備1,0.23g,1當量,2.76mmol)和1.05g2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(1.5當量,4.13mmol)加入配備有磁力攪拌棒的25mL雙頸烘干RBF中。加入10mL無水二氯甲烷，混合液在氮氣下攪拌1小時。逐滴加入0.33mL芐基胺(1.1當量,3.03mmol)和0.6mL三乙胺(1.5當量,4.55mmol)在5mL無水二氯甲烷中的溶液，然后將反應混合液再攪拌半小時。在上文所述后處理之后，產(chǎn)物通過快速柱色譜純化(20-30％EA在己烷中)，得到0.3212g的1(1.86mmol；產(chǎn)率67％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.34-7.25(m,5H),6.31(s,1H),5.67(t,1H,J＝6.6Hz),5.19(d,2H,J＝6.7Hz),4.46(d,2H,J＝5.9Hz)；13CNMR(400MHz,CDCl3)δ212.0,164.5,138.2,128.7,127.8,127.5,90.8,80.6,43.7；ESI-MSC11H11NO[M+H]+m/z計算值174.09,實際值174.02合成2-(丁-2,3-二烯酰胺)乙酸乙酯(1b)3-丁炔酸(制備1,0.34g,1當量,4.04mmol)和1.55g2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(1.5當量,6.06mmol)加入配備有磁力攪拌棒的25mL雙頸烘干RBF中。加入15mL無水二氯甲烷，混合液在氮氣下攪拌1小時。逐滴加入0.62g甘氨酸乙酯鹽酸鹽(1.1當量,4.45mmol)和1.6mL三乙胺(2.5當量,11.25mmol)在5mL無水二氯甲烷中的溶液，然后將反應混合液再攪拌半小時。在上文所述后處理之后，產(chǎn)物通過快速柱色譜純化(20％EA在己烷中)，得到0.4321g的6(2.56mmol；產(chǎn)率63％)。(收集產(chǎn)物，rf值稍許變化的兩個餾分。第一餾分(0.19g)含有20％同型丙炔基異構體(homopropargylicisomer)，第二餾分(0.24g)含有純的丙二烯異構體(allenicisomer)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.71(s,1H),5.71(t,1H,J＝6.59Hz),5.26(d,2H,J＝6.64Hz),4.21(q,2H,J＝7.16Hz),4.06(d,2H,J＝5.44Hz),1.29(t,3H,J＝7.15)；13CNMR(400MHz,CDCl3)δ212.3,169.9,164.8,90.2,80.6,61.4,41.4,14.1；ESI-MSC8H11NO3[M+H]+m/z計算值169.07,實際值169.09合成N-環(huán)己基丁-2,3-二烯酰胺(1c)3-丁炔酸(制備1,0.10g,1當量,1.21mmol)和0.46g2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(1.5當量,1.82mmol)加入配備有磁力攪拌棒的25mL雙頸烘干RBF中。加入6mL無水二氯甲烷，混合夜在氮氣下攪拌1小時。逐滴加入0.15mL環(huán)己基胺(1.1當量,1.33mmol)和0.28mL三乙胺(1.5當量,2.00mmol)在4mL無水二氯甲烷中的溶液，然后將反應混合液再攪拌半小時。在上文所述后處理之后，產(chǎn)物通過快速柱色譜純化(20％EA在己烷中)，得到0.1143g的7((28％同型丙炔基和72％丙二烯異構體作為單獨餾分)(0.69mmol；產(chǎn)率57％)。同型丙炔基異構體：1HNMR(300MHz,CDCl3)δ6.38(s,1H)3.81-3.72(m,1H)3.19(d,2H,J＝2.68Hz),2.37(t,1H,J＝2.7Hz),1.94-1.89(m,2H),1.72(td,2H,J＝3.7,13.5Hz),1.62(td,1H,J＝3.7,13.0Hz),1.44-1.33(m,2H),1.24-1.15(m,3H)；13CNMR(300MHz,CDCl3)δ165.0,77.7,74.0,48.4,32.8,27.5,25.5,24.7；ESI-MSC10H15NO[M+H]+m/z計算值165.12,實際值165.09丙二烯異構體(1c):1HNMR(300MHz,CDCl3)δ5.74(s,1H),5.61(t,1H,J＝6.7Hz),5.21(d,2H,J＝6.7Hz),3.83-3.75(m,1H),1.95-1.92(m,2H),1.72-1.60(m,3H),1.42-1.33(m,2H),1.22-1.10(m,3H)；13CNMR(300MHz,CDCl3)δ211.5,163.5,91.2,80.3,48.3,33.1,25.5,24.8；ESI-MSC10H15NO[M+H]+m/z計算值165.12,實際值165.10合成N-(萘-1-基)丁-2,3-二烯酰胺(1d)3-丁炔酸(制備1,0.11g,1當量,1.27mmol)和0.48g2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(1.5當量,1.90mmol)加入配備有磁力攪拌棒的15mL雙頸烘干RBF中。加入6mL無水二氯甲烷，混合夜在氮氣下攪拌1小時。逐滴加入0.16g1-萘基胺(0.9當量,1.14mmol)和0.24mL三乙胺(相對于萘基胺1.5當量,1.71mmol)在4mL無水二氯甲烷中的溶液，然后將反應混合液再攪拌半小時。如上所述后處理之后，產(chǎn)物通過快速柱色譜純化(25％EA在己烷中)，得到0.067g淺棕色固體，發(fā)現(xiàn)是8的同型丙炔基異構體。然而，用1eq.三乙胺的無水二氯甲烷(1mL)溶液處理可容易地異構化為8。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ8.01(s,1H),7.87(dd,1H,J＝6.9,2.4Hz),7.80(d,1H,J＝6.8Hz),7.70(d,1H,J＝8.3Hz),7.55-7.46(m,4H),5.89(t,1H),5.45(d,2H,J＝4.8Hz；13CNMR(400MHz,CDCl3)δ211.8,162.8,134.1,132.1,128.9,126.9,126.4,126.0,125.9,120.2,92.0,81.4；ESI-MSC14H11NO[M+H]+m/z計算值209.08,實際值209.06合成N-(2-氧代-4-(三氟甲基)-2H-色烯-7-基)丁-2,3-二烯酰胺(1e)3-丁炔酸(制備1,0.27g,1當量,3.2mmol)和1.22g2-氯-1-甲基吡啶鎓碘化物(1.5當量,4.8mmol)加入配備有磁力攪拌棒的25mL雙頸烘干RBF中。加入10mL無水二氯甲烷，混合液在氮氣下攪拌1小時。0.66g胺(7-氨基-4-(三氟甲基)-2H-色烯-2-酮)分批加入(0.9當量2.9mmol)(固體)，然后加入在5mL無水二氯甲烷中的0.60mL三乙胺(相對于胺1.5當量,4.3mmol)，然后將反應混合液再攪拌半小時。到時間之后，蒸發(fā)二氯甲烷，產(chǎn)物通過快速柱色譜純化(30-40％EA在己烷中)，得到黃色固體。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.84(s,1H),7.81(d,1H,J＝2.1Hz),7.66(dd,1H,J＝1.7,8.9Hz),7.49(dd,1H,J＝2.1,8.8Hz),6.70(s,1H),5.82(t,1H,J＝6.6Hz),5.46(d,2H,J＝6.6Hz)；13CNMR(400MHz,CDCl3)δ212.2,162.6,159.1,155.3,142.1,126.1,126.0,115.9,113.9,113.8,109.5,107.2,91.7,82.1；ESI-MSC14H8F3NO3[M+H]+m/z計算值296.05,實際值296.16合成(2-(丁-2,3-二烯酰胺)乙基)氨基甲酸叔丁酯(1f)采用上文所述的過程，采用0.38g3-丁炔酸(制備1,4.5mmol),1.74gMukaiyama反應試劑(1.5當量,6.8mmol),0.8727gN-Boc-乙二胺(如上所述；1.2當量,5.4mmol)和0.6mL三乙胺。得到0.3833g產(chǎn)物(1.7mmol,產(chǎn)率38％)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ6.79(s,1H),5.64(t,1H,J＝6.6Hz),5.31(s,1H),5.22(d,2H,J＝6.6Hz),3.42-3.38(m,2H),3.29(t,2H,J＝5.5Hz),1.44(s,9H)；13CNMR(400MHz,CDCl3)δ211.9,165.3,156.8,90.5,80.3,79.4,73.9,40.8,40.1,28.2,27.2合成N-(2-氨基乙基)丁-2,3-二烯酰胺(1g)根據(jù)Liu,F.等,BioconjugateChemistry2012,23,1639的方法由1f合成化合物。1HNMR(400MHz,MeOD)δ8.10(s,1H),5.75(t,1H,J＝6.6Hz),5.32(d,2H,J＝6.6Hz),3.55(t,2H,J＝5.8Hz),3.12(t,2H,J＝5.8Hz)；13CNMR(400MHz,MeOD)δ213.0,167.2,89.0,79.2,39.4,37.1；ESI-MSC6H10N2O[M+H]+m/z計算值127.08,實際值126.99表1列舉了由相應的胺合成的C-取代的丙二烯酰胺1a至1fa有時觀察到少量同型丙炔基酰胺，過量TEA可異構化為丙二烯異構體合成具有丙二烯酰胺手柄(6)的熒光異構體在1.5mL玻璃試管中，50mgFITC(異硫氰酸熒光素)異構體I(1當量，0.13mmol)溶解在0.5mLDMF中。加入溶解在0.5mLDMF中的1g(1.5當量,0.19mmol)的24mg，然后是34μLDIPEA(N,N-二異丙基乙基胺)，反應混合液在黑暗中攪拌2小時。2小時后LCMS顯示形成所需的化合物。反應混合液直接加載到硅膠柱上，產(chǎn)物用25％MeOH的二氯甲烷溶液洗脫。1HNMR(400MHz,MeOD)δ8.02(d,2H,J＝1.7Hz),7.70(dd,1H,J＝2.0,8.2Hz),7.24-7.14(m,4H),6.64(m,6H),5.71(t,1H,J＝6.6Hz),5.28(d,2H,J＝6.6Hz),3.81(t,2H,J＝5.7Hz),3.57-3.47(m,4H)；ESI-MSC27H21N3O6S[M+H]+m/z計算值516.12,實際值516.23合成具有丙二烯酰胺手柄(7)的Cy3(花青3)在1.5mL玻璃試管中，5.0mgCy3-NHS酯(1當量,8.5μmol)溶解在250μLDMF中。加入溶解在250μLDMF中的1g(2當量,17μmol)的2.1mg，然后是3μLDIPEA(2當量,17μmol)。反應混合液在黑暗中攪拌2小時，然后LCMS顯示形成所需的產(chǎn)物，產(chǎn)物在反相HPLC上純化，采用C-18制備柱以及含有0.1％TFA的水/ACN溶劑系統(tǒng)。1HNMR(400MHz,MeOD)δ8.58(t,3H,J＝13.6),8.04(s,1H),7.57(d,2H,J＝7.3Hz),7.50-7.46(m,2H),7.39-7.28(m,4H),7.14-7.04(m,1H),6.47(dd,2H,J＝2.9,13.5Hz),5.68(t,1H,J＝6.6Hz),5.26(d,2H,J＝6.6Hz),4.18(t,2H,J＝7.5Hz),3.78(t,1H,J＝7.1),3.71(s,2H),2.24(t,2H,J＝7.2Hz),1.92-1.84(m,2H),1.79(s,6H),1.73(t,2H,J＝7.5),1.60(s,1H),1.54-1.47(m,3H),1.40-1.27(m,6H)；ESI-MSC36H45ClN4O2[M-Cl+H]+m/z計算值565.35,實際值565.62合成具有丙二烯酰胺手柄(8)的磺基-Cy5(花青素5)在1.5mL玻璃試管中，2.5mg磺基-Cy5-NHS酯(1當量,3.8μmol)溶解在200μLDMF中。加入溶解在100μLDMF中的1g(2當量,7.6μmol)的0.9mg，然后是1.3μLDIPEA(2當量,7.6μmol)。反應混合液在黑暗中攪拌2小時。產(chǎn)物在反相HPLC上純化，采用含有0.1％TFA的C-18制備柱和水/ACN溶劑系統(tǒng)。1HNMR(400MHz,D2O)δ7.99(t,2H,J＝13.0Hz),7.80–7.73(m,4H),7.27(dd,2H,J＝8.6,11.4Hz),6.51(t,1H,J＝12.9),6.27–6.19(m,2H),5.58(t,1H,J＝6.6Hz),5.11(d,2H,J＝6.6Hz),4.03(m,4H),3.16–3.11(m,4H),2.15(s,1H),2.13–2.11(m,2H),1.76(m,2H),1.61(s,12H),1.53(m,2H),1.29(t,3H,J＝7.3Hz),1.25(m,2H).ESI-MSC38H45N4NaO8S2[M-Na+2H]+m/z計算值751.28,實際值751.47肽合成采用預先加載的Wang樹脂并根據(jù)標準操作，在配備有UV檢測器的自動化Liberty1CEM微波肽合成儀上合成肽CGKSRF(3),KSCGRF(4)和YDSQCFHRW(5)。肽通過LCMS表征，無需進一步純化即可使用。實施例1采用1a修飾半胱氨酸甲酯得到1aa向丙二烯酰胺1a(0.122mmol；21.2mg在0.4mLTHF中)的溶液中加入半胱氨酸甲酯鹽酸鹽(0.122mmol；21.0mg)和碳酸鉀(0.125mmol；17.3mg)在1.6mL水中的混合液。反應混合物攪拌30分鐘，然后TLC驗證1a完全消耗。在旋轉蒸發(fā)儀上蒸發(fā)THF，產(chǎn)物在二氯甲烷中萃取兩次(每次2.5mL)。蒸發(fā)溶劑，產(chǎn)物通過柱色譜純化(5％MeOH的二氯甲烷溶液)，得到32.8mg(產(chǎn)率76％)白色固體(修飾的半胱氨酸)。1HNMR(400MHz,CDCl3)δ7.35-7.25(m,5H),6.69(s,1H),5.33(s,1H),5.11(s,1H),4.51-4.40(m,2H),3.70(s,3H),3.69(t,1H,J＝4.5Hz),3.23(d,2H,J＝2.5Hz),3.17(dd,1H,J＝4.7,13.7Hz),2.94(dd,1H,J＝7.7,13.8Hz),1.65(s,2H)；13CNMR(400MHz,CDCl3)δ174.13,168.85,138.25,137.83,128.64,127.68,127.43,112.76,53.44,52.40,45.16,43.62,36.12；ESI-MSC15H20N2O3S[M+H]+m/z計算值309.13,實際值309.10芐基丙二烯酰胺1a與含有游離巰基和氨基基團的半胱氨酸甲酯的反應顯示在圖2A中。即使使用過量的1a，沒有觀察到游離氨基的反應。發(fā)現(xiàn)僅游離巰基參與反應，得到產(chǎn)物1aa。同時，在類似的條件下，當1a與賴氨酸、絲氨酸和甲硫氨酸反應時沒有獲得產(chǎn)物，證實在采用的條件下丙二烯酰胺與巰基的反應是選擇性的。實施例2采用丙二烯酰胺1a修飾谷胱甘肽(2)得到2a在4mL玻璃試管中，6.5mg谷胱甘肽(0.021mmol)溶解在0.5mL碳酸銨緩沖液(pH8.0)中。向溶液中加入7.3mg丙二烯酰胺1a(0.042mmol；2當量)在0.5mLTHF中的溶液，所得溶液用移液管充分混合。15分鐘后LCMS顯示谷胱甘肽完全轉化，然后將3mLTHF加入試管中，導致產(chǎn)物2a沉淀。混合液在8000rpm離心5分鐘。小心傾潷掉液體，沉淀的固體用THF洗滌兩次。最終洗滌后的沉淀真空干燥，得到9.9mg(產(chǎn)率97％)白色固體(修飾的谷胱甘肽)。1HNMR(400MHz,D2O)δ7.36-7.27(m,5H),5.36(s,1H),5.19(s,1H),4.57(dd,1H,J＝5.0,8.6),4.35(s,2H),3.70(d,2H,J＝8.0),3.67-3.65(m,1H),3.25(m,3H),3.02(dd,1H,J＝8.7,13.9),2.42(t,2H,J＝8.0),2.06(q,2H,J＝7.6)；13CNMR(400MHz,D2O)δ175.5,174.9,173.9,172.5,171.8,138.0,136.4,128.8,127.5,127.3,115.2,54.2,52.5,44.2,43.2,43.0,32.4,31.5,26.2；ESI-MSC21H28N4O7S[M+H]+m/z計算值481.18,實際值481.23天然產(chǎn)生的三肽谷胱甘肽(GSH；2)與丙二烯酰胺1a的反應顯示在圖2B中。所得產(chǎn)物2a的分離產(chǎn)率為97％，通過NMR和LC-MS/MS表征證實，肽殘基中在半胱氨酸殘基(即巰基)而非氨基的修飾，提示C-取代的末端丙二烯酰胺對特定的半胱氨酸偶聯(lián)具有優(yōu)異的反應選擇性(圖3)。實施例3用丙二烯酰胺1a修飾肽3，4和5的一般過程為了進一步闡述選擇性，還研究了具有末端以及內部半胱氨酸殘基的三種其他肽序列的半胱氨酸修飾，包括Cys-Gly-Lys-Ser-Arg-Phe(3),Lys-Ser-Cys-Gly-Arg-Phe(4)和Tyr-Asp-Ser-Gln-Cys-Phe-His-Arg-Trp(5)。將100μL肽溶液(250μM，在pH8.0的碳酸銨緩沖液中)與等量的1a溶液(2.5mM在含有5％THF的碳酸銨緩沖液中)混合。移液管混合之后，反應混合液于室溫靜置10-20分鐘。進行LCMS以確保完全轉化。位點選擇性通過LC-MS/MS建立。在所有情況下，在如上所述孵育肽上獲得定量轉化。LCMS和LC-MS/MS分析(圖4-6)證實，修飾在半胱氨酸處選擇性發(fā)生。應理解，其他氨基酸殘基，包括組氨酸，賴氨酸，酪氨酸和其他反應性側鏈不會與1a發(fā)生反應，即使靜置過夜。偶聯(lián)產(chǎn)物的不可逆性用肽5和GSH(2)測試。當5和1a的偶聯(lián)產(chǎn)物與過量(100當量)谷胱甘肽37℃孵育過夜時，沒有觀察到轉化為起始材料5。類似地，用過量(100當量)DTT處理2a不會產(chǎn)生2(LCMS)，清楚提示偶聯(lián)產(chǎn)物的穩(wěn)定性。因此，特定半胱氨酸標記的不可逆性使得細胞內環(huán)境中的蛋白質修飾成為可能。實施例4用化合物1b-1d修飾肽5用1b-d修飾肽5，在每種情況下得到定量轉化和優(yōu)異的選擇性(參見表2和圖7-9)。表2：用丙二烯酰胺1b-d修飾肽5中的半胱氨酸。編號丙二烯酰胺肽序列轉化a11bYDSQCFHRW定量21cYDSQCFHRW定量31dYDSQCFHRW定量aLCMS測定實施例5用1a修飾胰島素在簡單肽中獲得有前景的結果之后，在更加復雜的肽序列中檢測半胱氨酸殘基的類似修飾。檢測了由DTT處理的牛胰島素產(chǎn)生的更加復雜的肽對(圖10)。將10當量的固體DTT加入2ml10mM牛胰島素在50mMpH8的碳酸銨緩沖液的溶液中?；旌弦河靡埔汗芑旌现?，在氮氣氣氛下70℃靜置10分鐘。到時間之后進行LCMS，冷卻至室溫以證實二硫鍵完全還原。在對應于還原的鏈B和鏈A的色譜圖中觀察到兩個獨立的峰。對應于鏈B的m/z值為680,850,1133和1700，對應于鏈B上的+5,+4,+3和+2電荷(分子量3397.67)。類似地，對應于鏈A的m/z值為779,1169和2338，對應于鏈A上的+3,+2和+1電荷(分子量2337.97)。1ml還原的胰島素化合物加入25當量溶解在500μLTHF中的1a，移液管混合之后，反應混合液室溫靜置30分鐘。30分鐘后LCMS證實如預期修飾，顯示具有不同rf值的兩個峰，對應于修飾的鏈B和鏈A。m/z值與鏈B分子量的預期增量346相一致(173*2＝346,顯示包含兩個分子量為173的分子1)，鏈A分子量的預期增量692相一致((173*4＝692,顯示包含四個分子1)，這與每條鏈中半胱氨酸殘基的數(shù)量相一致。因此，修飾的鏈B的預期分子量為3743.67(3397.67+346)，鏈A為3029.97(2337.97+692)，修飾的鏈B的m/z值為750,937,1249和1873，對應于+5,+4,+3和+2電荷，修飾的鏈A的m/z值為1011和1515，對應于鏈上+3和+2電荷。位點選擇性通過MS/MS進一步驗證(分別是圖11和12)。實施例6用化合物1a修飾(烷基化)BSA6.6mgBSA(0.1μmol)溶解在1ml碳酸銨緩沖液中(pH8.0)。加入2.3mg固體DTT(15μmol)，移液管混合之后，所得混合物在37℃孵育過夜。然后加入溶解在1ml碳酸銨緩沖液(5％THF)中的3.7mg1a(21μmol)，37℃再次孵育30分鐘。到時間之后，蛋白質通過納米級分離過濾進行純化。純化的蛋白質進行胰蛋白酶消化和采用標準過程的LC-MS/MS(圖13)。發(fā)現(xiàn)檢測的肽中的所有半胱氨酸殘基被對應于1a的分子量(173.0841)修飾。實施例7用6-8標記BSA的過程在1ml的離心管中將0.1μmol/mLBSA的H2O(10μL,1nmol)溶液,1.0μmol/mL6,7和8的H2O(10μLeach,10nmol)溶液以及80μLTris-HCl緩沖液(pH7.4)混合，37℃孵育30分鐘。然后，所得溶液進行SDS-PAGE分析，驗證所需的標記是否成功發(fā)生(圖14A)。實施例8用7標記β-內酰胺酶的過程對于TEM1β-內酰胺酶,在1ml離心管中將0.1μmol/mLβ-內酰胺酶的H2O(10μL,1nmol)溶液,1.0μmol/mL7的H2O(10μL,10nmol)溶液以及80μLTris-HCl緩沖液(pH7.4)混合，37℃孵育30分鐘。到時間之后，反應混合液進行SDS-PAGE分析以驗證無標記。在本實驗的第二部分，0.1μmol/mLβ-內酰胺酶(1mL)與1.0μmol/mLDTT(1mL)溶液于80℃加熱10分鐘。冷卻至室溫之后，10μL等分試樣的混合物與10μL7(2.0μmol/mL在H2O中)以及80μLTris-HCl緩沖液(pH7.4)混合，37℃孵育30分鐘。所得混合物的SDS-PAGE分析揭示成功標記。為了顯示標記是對巰基特異性的，選擇僅具有二硫鍵合半胱氨酸(無游離半胱氨酸)的已建立的抗生素耐受性細菌酶TEM1β-內酰胺酶(B1a)?；衔?與Bla混合而沒有DTT處理，沒有觀察到標記(道5,圖14B)，當Bla用DTT處理然后與7混合則觀察到成功標記(道3，圖14B)。這些結果表明，丙二烯酰胺能夠作為在蛋白質環(huán)境的復雜情況下選擇性靶向半胱氨酸殘基的有效手柄，成為成像應用的可選擇的手段。當前第1頁1 2 3