国产精品1024永久观看,大尺度欧美暖暖视频在线观看,亚洲宅男精品一区在线观看,欧美日韩一区二区三区视频,2021中文字幕在线观看

  • <option id="fbvk0"></option>
    1. <rt id="fbvk0"><tr id="fbvk0"></tr></rt>
      <center id="fbvk0"><optgroup id="fbvk0"></optgroup></center>
      <center id="fbvk0"></center>

      <li id="fbvk0"><abbr id="fbvk0"><dl id="fbvk0"></dl></abbr></li>

      微生物麥角硫因生物合成的制作方法

      文檔序號:11109522閱讀:882來源:國知局
      序列表的紙質(zhì)拷貝和含有名為"32559-12_ST25.txt"且大小為19,443字節(jié)(如MICROSOFTWINDOWS?EXPLORER中測量)的文件的序列表的計算機可讀形式在本文中提供并通過引用并入本文。該序列表由SEQIDNO:l-16組成。公開背景本公開總體涉及用于麥角硫因生物合成的方法。更具體地,本公開涉及用于微生物麥角硫因生物合成的方法。麥角硫因(ET)是具有連接至咪唑環(huán)的C2原子的巰基的組氨酸甜菜堿衍生物。作為硫酮互變異構(gòu)體,ET是具有獨特性質(zhì)的非常穩(wěn)定的抗氧化劑。不同于谷胱甘肽和抗壞血酸,ET可以清除不是自由基的氧化物質(zhì)。ET是放線菌諸如恥垢分枝桿菌(Mycobacteriumsmegmatis)和絲狀真菌諸如粗糙脈孢菌(Neurosporacrassa)中產(chǎn)生的天然化合物。其他細菌物種,諸如枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、普通變形桿菌(Proteusvulgaris)和鏈球菌(Streptococcus),以及屬于子囊菌綱(Ascomycetes)和半知菌綱(Deuteromycetes)的真菌不能產(chǎn)生麥角硫因。動物和植物也不能產(chǎn)生麥角硫因,并且必須從膳食來源或在植物的情況下從它們的環(huán)境中獲得麥角硫因。盡管ET在微生物細胞中的功能尚未充分理解,但其據(jù)信在人生理學中是至關(guān)重要的。人從膳食來源吸收ET,并且ET在特定組織和細胞諸如肝、腎、中樞神經(jīng)系統(tǒng)和紅細胞中積累。證明特異性陽離子轉(zhuǎn)運蛋白(OCTN1)對人體中的ET具有高親和力,并且所述轉(zhuǎn)運蛋白的過度活性和缺乏對人細胞發(fā)揮負面作用。在某些分枝桿菌真菌中已經(jīng)檢測到ET的生物合成,然而,確切的代謝途徑?jīng)]有完成或僅部分證實。Seebeck使用大腸桿菌在體外重構(gòu)了分枝桿菌麥角硫因生物合成,以分別表達甲酰甘氨酸生成酶樣蛋白(EgtB)、谷氨酰胺轉(zhuǎn)酰胺酶(EgtC)、組氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶(EgtD)和替代5-磷酸吡哆醛結(jié)合蛋白(EgtE)的來自Erwiniatasmaniensis的無關(guān)的β-裂合酶(因為可溶性EgtE蛋白的重組產(chǎn)生失敗)(參見,J.Am.Chem.Soc.2010,132:6632-6633)。迄今為止,僅編碼EgtB、EgtC和EgtD的3種基因已被鑒定用于體外生產(chǎn)麥角硫因。EgtE的推定基因仍未在體外或體內(nèi)表征。到目前為止,盡管有各種生物轉(zhuǎn)化的嘗試,但尚未報道使用上述基因以在大腸桿菌中工程改造分枝桿菌麥角硫因代謝途徑的微生物生產(chǎn)。此外,盡管各種真菌和分枝桿菌來源可用于麥角硫因提取,但產(chǎn)量太低,以致于不能商業(yè)用于麥角硫因的工業(yè)生產(chǎn)。因此,存在生產(chǎn)麥角硫因的需求。公開概述本公開總體涉及用于生產(chǎn)麥角硫因的工程改造的宿主細胞和方法。更具體地,本公開涉及工程改造的宿主細胞和用于使用所述工程改造的宿主細胞微生物麥角硫因生物合成的方法。在一個方面,本公開涉及用于生產(chǎn)麥角硫因的轉(zhuǎn)化的宿主細胞,其包含編碼EgtB的核酸序列、編碼EgtC的核酸序列、編碼EgtD的核酸序列和編碼EgtE的核酸序列。在另一個方面,本公開涉及用于生產(chǎn)麥角硫因的方法。所述方法包括培養(yǎng)宿主細胞,其中所述宿主細胞用編碼EgtB的核酸序列、編碼EgtC的核酸序列、編碼EgtD的核酸序列和編碼EgtE的核酸序列轉(zhuǎn)化;誘導(dǎo)所述宿主細胞以表達編碼EgtB的核酸序列、編碼EgtC的核酸序列、編碼EgtD的核酸序列和編碼EgtE的核酸序列;和收集麥角硫因。在另一個方面,本公開涉及用于生產(chǎn)麥角硫因的表達載體,其包含編碼選自EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的氨基酸序列的核酸序列。附圖簡述當考慮其以下詳述時,將更好地理解本公開,并且除了上述那些之外的特征、方面和優(yōu)點將變得顯而易見。此類詳述參考以下附圖,其中:圖1A是含有EgtD和EgtB基因的載體圖譜,如實施例1中所討論。圖1B是含有EgtC和EgtE基因的載體圖譜,如實施例1中所討論。圖2是說明僅在含有所有四種基因的菌株中生產(chǎn)ET的圖,如實施例2中所討論。EI,用IPTG誘導(dǎo)的空載體細胞;SI,用IPTG誘導(dǎo)的含有四個基因的菌株;Ck+,添加20mg/L麥角硫因的樣品。圖3A和3B是顯示100mg/L麥角硫因標準品的HPLC保留時間和UV光譜的圖,如實施例2中所討論。圖4A和4B是顯示用編碼EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的核酸序列轉(zhuǎn)化的大腸桿菌中生產(chǎn)的麥角硫因的HPLC保留時間和UV光譜的圖,如實施例2中所討論。圖5是顯示工程改造的大腸桿菌細胞和空載體對照細胞中麥角硫因生產(chǎn)的時間過程的圖,如實施例3中所討論。EI,用IPTG誘導(dǎo)的空載體對照;SI,用IPTG誘導(dǎo)的含有EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的菌株。圖6是顯示用各種底物和輔因子進料的轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株的圖。無,未添加底物或輔因子;His,組氨酸;Met,甲硫氨酸;Cys,半胱氨酸;Fe,鐵Fe++。盡管本公開易于呈現(xiàn)各種改變和替代形式,但其具體實施方案已經(jīng)通過實例的方式在附圖中顯示,并且在本文下面詳細描述。然而,應(yīng)當理解,具體實施方案的描述并不意在將本公開限制為涵蓋落入由所附權(quán)利要求限定的本公開的精神和范圍內(nèi)的所有改變、等同方案和替代方案。詳述術(shù)語“互補”根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的其普通和常規(guī)含義使用,并且在沒有限制的情況下用于描述能夠與彼此雜交的核苷酸堿基之間的關(guān)系。例如,關(guān)于DNA,腺苷與胸腺嘧啶互補,且胞嘧啶與鳥嘌呤互補。因此,本技術(shù)還包括與所附序列表中報道的完整序列以及那些基本上相似的核酸序列互補的分離的核酸片段。術(shù)語“核酸”和“核苷酸”根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的其各自普通和常規(guī)含義使用,并且在沒有限制的情況下用于指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核苷酸或核糖核苷酸及其聚合物。除非特別限制,該術(shù)語涵蓋含有與參考核酸具有相似結(jié)合特性且以與天然存在的核苷酸類似的方式代謝的天然核苷酸的已知類似物的核酸。除非另有指明,特定核酸序列還隱含地涵蓋其保守修飾或簡并的變體(例如,簡并密碼子取代)和互補序列,以及明確指明的序列。術(shù)語“分離的”根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的其普通和常規(guī)含義使用,并且當在分離的核酸或分離的多肽的上下文中使用時,在沒有限制的情況下用于指通過人工,遠離其天然環(huán)境存在并且因此不是天然產(chǎn)物的核酸或多肽。分離的核酸或多肽可以以純化形式存在或可以存在于非天然環(huán)境中,諸如例如在轉(zhuǎn)基因宿主細胞中。如本文所使用的術(shù)語“孵育(incubating)”和“孵育(incubation)”是指將兩種或更多種化學或生物實體(諸如化合物和酶)混合并允許它們在有利于產(chǎn)生甜菊糖苷組合物的條件下相互作用的過程。術(shù)語“簡并變體”是指具有通過一個或多個簡并密碼子取代而不同于參考核酸序列的殘基序列的核酸序列。簡并密碼子取代可以通過產(chǎn)生其中一個或多個選擇的(或所有)密碼子的第三個位置被混合的堿基和/或脫氧肌苷殘基取代的序列來實現(xiàn)。核酸序列和所有其簡并變體將表達相同的氨基酸或多肽。術(shù)語“多肽”、“蛋白”和“肽”根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的其各自普通和常規(guī)含義使用;三個術(shù)語有時可互換使用,并且在沒有限制的情況下用于指氨基酸或氨基酸類似物的聚合物,而無論其大小或功能。盡管“蛋白”經(jīng)常被用來指相對大的多肽且“肽”經(jīng)常被用來指小的多肽,但本領(lǐng)域中的這些術(shù)語的使用重疊且變化。如本文所使用,術(shù)語“多肽”是指肽、多肽和蛋白,除非另有說明。當是指多核苷酸產(chǎn)物時,術(shù)語“蛋白”、“多肽”和“肽”在本文中可互換使用。因此,示例性多肽包括多核苷酸產(chǎn)物,天然存在的蛋白,同源物,直向同源物,旁系同源物,片段,和前述的其他等同物、變體和類似物。當關(guān)于參考多肽使用時,術(shù)語“多肽片段”和“片段”根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員的其普通和常規(guī)含義使用,并且在沒有限制的情況下用于指這樣的多肽,其中與參考多肽本身相比氨基酸殘基缺失,但其中剩余的氨基酸序列通常與參考多肽中的相應(yīng)位置相同。此類缺失可以發(fā)生在參考多肽的氨基末端或羧基末端,或者兩者。多肽或蛋白的術(shù)語“功能片段”是指這樣的肽片段,其為全長多肽或蛋白的一部分,并且具有與全長多肽或蛋白基本上相同的生物活性,或?qū)嵤┡c全長多肽或蛋白基本上相同的功能(例如,實施相同的酶促反應(yīng))??苫Q使用的術(shù)語“變體多肽”、“修飾的氨基酸序列”或“修飾的多肽”是指與參考多肽有一個或多個氨基酸不同(例如,通過一個或多個氨基酸取代、缺失和/或添加)的氨基酸序列。在一個方面,變體是保留參考多肽的一些或所有能力的“功能變體”。術(shù)語“功能變體”還包括保守取代的變體。術(shù)語“保守取代的變體”是指具有這樣的氨基酸序列的肽,所述氨基酸序列通過一個或多個保守氨基酸取代而不同于參考肽,并且維持參考肽的一些或所有活性?!氨J氐陌被崛〈笔怯霉δ芟嗨频臍埢〈被釟埢1J厝〈膶嵗ㄒ粋€非極性(疏水性)殘基諸如異亮氨酸、纈氨酸、亮氨酸或甲硫氨酸取代另一個非極性(疏水性)殘基;一個帶電荷或極性(親水性)殘基取代另一個帶電荷或極性(親水性)殘基,諸如在精氨酸和賴氨酸之間,在谷氨酰胺和天冬酰胺之間,在蘇氨酸和絲氨酸之間;一個堿性殘基諸如賴氨酸或精氨酸取代另一個堿性殘基;或一個酸性殘基諸如天冬氨酸或谷氨酸取代另一個酸性殘基;或一個芳族殘基(諸如苯丙氨酸、酪氨酸或色氨酸)取代另一個芳族殘基。預(yù)期此類取代對蛋白或多肽的表觀分子量或等電點影響很少或沒有影響。短語“保守取代的變體”還包括其中殘基被化學衍生的殘基取代的肽,條件是所得肽維持如本文所述的參考肽的一些或所有活性。與本技術(shù)的多肽相關(guān)的術(shù)語“變體”還包括具有這樣的氨基酸序列的功能活性多肽,所述氨基酸序列與參考多肽的氨基酸序列至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%且甚至100%相同。以所有其語法形式和拼寫變化的術(shù)語“同源的”是指具有“共同進化起源”的多核苷酸或多肽之間的關(guān)系,包括來自超家族的多核苷酸或多肽和來自不同物種的同源多核苷酸或蛋白(Reeck等人,Cell50:667,1987)。此類多核苷酸或多肽具有序列同源性,如由它們的序列相似性所反映,無論是百分比同一性還是在保守位置存在特定氨基酸或基序的方面。例如,兩個同源多肽可以具有至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%且甚至100%相同的氨基酸序列。關(guān)于本技術(shù)的變體多肽序列的“百分比(%)氨基酸序列同一性”是指候選序列中與參考多肽(諸如,例如SEQIDNO:6)的氨基酸殘基在比對序列并引入空位(如果必要)以實現(xiàn)最大百分比序列同一性(并且不考慮任何保守取代作為序列同一性的一部分)之后相同的氨基酸殘基的百分比。用于確定百分比氨基酸序列同一性的目的的比對可以以本領(lǐng)域技術(shù)內(nèi)的各種方式,例如,使用公開可得的計算機軟件諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN、ALIGN-2或Megalign(DNASTAR)軟件來實現(xiàn)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定用于測量比對的適當參數(shù),包括實現(xiàn)所比較序列全長內(nèi)的最大比對所需的任何算法。例如,%氨基酸序列同一性可以使用序列比較程序NCBI-BLAST2來確定。NCBI-BLAST2序列比較程序可以從ncbi.nlm.nih.gov下載。NCBIBLAST2使用幾個搜索參數(shù),其中所有那些搜索參數(shù)被設(shè)置為默認值,包括例如不屏蔽:是(unmaskyes);鏈=所有;預(yù)期發(fā)生數(shù):10;最小低復(fù)雜度長度=15/5;多通道e-值=0.01;多通道的常數(shù)=25;最終空位比對的下降(dropoff)=25;和評分矩陣=BLOSUM62。在NCBI-BLAST2用于氨基酸序列比較的情況下,給定氨基酸序列A對于、與或針對給定氨基酸序列B的%氨基酸序列同一性(其可以替代地表述為對于、與或針對給定氨基酸序列B具有或包含特定%氨基酸序列同一性的給定氨基酸序列A)如下計算:分數(shù)X/Y乘以100,其中X是在A和B的該程序比對中通過序列比對程序NCBI-BLAST2評分為相同匹配的氨基酸殘基的數(shù)目,且其中Y是B中的氨基酸殘基的總數(shù)。應(yīng)當理解,當氨基酸序列A的長度不等于氨基酸序列B的長度時,A對于B的%氨基酸序列同一性將不等于B對于A的%氨基酸序列同一性。在該意義上,用于確定氨基酸序列“相似性”的技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的。通常,“相似性”是指在適當位置處的兩個或更多個多肽的確切的氨基酸與氨基酸比較,其中氨基酸是相同的或具有相似的化學和/或物理性質(zhì),諸如電荷或疏水性。然后可以在比較的多肽序列之間確定所謂的“百分比相似性”。用于確定核酸和氨基酸序列同一性的技術(shù)也是本領(lǐng)域眾所周知的,并且包括確定該基因的mRNA的核苷酸序列(通常經(jīng)由cDNA中間體),并確定其中編碼的氨基酸序列,并將其與第二氨基酸序列比較。通常,“同一性”分別是指兩個多核苷酸或多肽序列的確切的核苷酸與核苷酸或氨基酸與氨基酸的對應(yīng)性。可以通過確定它們的“百分比同一性”來比較兩個或更多個多核苷酸序列,如同兩個或更多個氨基酸序列一樣。WisconsinSequenceAnalysisPackage,版本8(可得自GeneticsComputerGroup,Madison,Wis.)中可得的程序,例如GAP程序,能夠分別計算兩個多核苷酸之間的同一性和兩個多肽序列之間的同一性和相似性。用于計算序列之間的同一性或相似性的其他程序是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的。“對應(yīng)于”參考位置的氨基酸位置是指與參考序列比對的位置,如通過比對氨基酸序列所鑒定。此類比對可以通過手動或通過使用眾所周知的序列比對程序諸如ClustalW2、Blast2等來進行。除非另有指明,兩個多肽或多核苷酸序列的百分比同一性是指在兩個序列中的較短者的整個長度的相同氨基酸殘基或核苷酸的百分比。“編碼序列”根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的其普通和常規(guī)含義使用,并且在沒有限制的情況下用于指編碼特定氨基酸序列的DNA序列?!昂线m的調(diào)節(jié)序列”根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的其普通和常規(guī)含義使用,并且在沒有限制的情況下用于指位于編碼序列的上游(5'非編碼序列)、內(nèi)部或下游(3'非編碼序列)并影響相關(guān)編碼序列的轉(zhuǎn)錄、RNA加工或穩(wěn)定性或翻譯的核苷酸序列。調(diào)節(jié)序列可以包括啟動子、翻譯前導(dǎo)序列、內(nèi)含子和多腺苷酸化識別序列?!皢幼印备鶕?jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的其普通和常規(guī)含義使用,并且在沒有限制的情況下用于指能夠控制編碼序列或功能性RNA的表達的DNA序列。通常,編碼序列位于啟動子序列的3'端。啟動子可以整體源自天然基因,或由源自自然界中發(fā)現(xiàn)的不同啟動子的不同元件構(gòu)成,或甚至包含合成的DNA區(qū)段。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當理解,不同的啟動子可以指導(dǎo)基因在不同細胞類型中或在不同的發(fā)育階段或響應(yīng)于不同的環(huán)境條件的表達。引起基因在大多數(shù)時間在大多數(shù)細胞類型中表達的啟動子通常稱為“組成型啟動子”。進一步認識到,由于在大多數(shù)情況下,調(diào)節(jié)序列的確切邊界尚未完全確定,所以不同長度的DNA片段可具有相同的啟動子活性。術(shù)語“可操作連接”是指核酸序列在單個核酸片段上的締合,使得一個核酸序列的功能受另一個核酸序列的影響。例如,當啟動子能夠影響編碼序列的表達(即,編碼序列在啟動子的轉(zhuǎn)錄控制下)時,啟動子與該編碼序列可操作連接。編碼序列可以與調(diào)節(jié)序列以有義或反義取向可操作連接。如本文所使用的術(shù)語“表達”根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的其普通和常規(guī)含義使用,并且在沒有限制的情況下用于指源自本技術(shù)的核酸片段的有義(mRNA)或反義RNA的轉(zhuǎn)錄和穩(wěn)定積累?!斑^表達”是指在轉(zhuǎn)基因或重組生物體中產(chǎn)生基因產(chǎn)物,其超過正?;蚍寝D(zhuǎn)化生物體中的產(chǎn)生水平?!稗D(zhuǎn)化”根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的其普通和常規(guī)含義使用,并且在沒有限制的情況下用于指多核苷酸轉(zhuǎn)移至靶細胞中。轉(zhuǎn)移的多核苷酸可以并入靶細胞的基因組或染色體DNA中,導(dǎo)致基因上穩(wěn)定的遺傳(geneticallystableinheritance),或者其可以獨立于宿主染色體復(fù)制。含有轉(zhuǎn)化的核酸片段的宿主生物體被稱為“轉(zhuǎn)基因的”或“重組的”或“轉(zhuǎn)化的”生物體。當在本文中與宿主細胞結(jié)合使用時,術(shù)語“轉(zhuǎn)化的”、“轉(zhuǎn)基因的”和“重組的”根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的其普通和常規(guī)含義使用,并且在沒有限制的情況下用于指其中已經(jīng)引入異源核酸分子的宿主生物體的細胞,諸如植物或微生物細胞。核酸分子可以穩(wěn)定地整合入宿主細胞的基因組中,或者核酸分子可以作為染色體外分子存在。此類染色體外分子可以自主復(fù)制。轉(zhuǎn)化的細胞、組織或主體應(yīng)理解為不僅涵蓋轉(zhuǎn)化過程的最終產(chǎn)物,而且涵蓋其轉(zhuǎn)基因子代。當在本文中與多核苷酸結(jié)合使用時,術(shù)語“重組的”、“異源的”和“外源的”根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的其普通和常規(guī)含義使用,并且在沒有限制的情況下用于指源自對于特定宿主細胞而言外源的來源、或者如果源自相同來源則從其原始形式修飾的多核苷酸(例如,DNA序列或基因)。因此,宿主細胞中的異源基因包括對于特定宿主細胞是內(nèi)源的、但已經(jīng)通過例如使用定點誘變或其他重組技術(shù)進行修飾的基因。所述術(shù)語還包括非天然存在的多個拷貝的天然存在的DNA序列。因此,所述術(shù)語是指這樣的DNA區(qū)段,其對于細胞是外來或異源的,或者與細胞同源、但在宿主細胞內(nèi)通常不存在所述元件的位置處或者以宿主細胞內(nèi)通常不存在所述元件的形式。類似地,當在本文中與多肽或氨基酸序列結(jié)合使用時,術(shù)語“重組的”、“異源的”和“外源的”意指源自對于特定宿主細胞而言外來的來源、或者如果源自相同來源則從其原始形式修飾的多肽或氨基酸序列。因此,重組DNA區(qū)段可以在宿主細胞中表達以產(chǎn)生重組多肽。術(shù)語“質(zhì)?!?、“載體”和“盒”根據(jù)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所理解的其普通和常規(guī)含義使用,并且在沒有限制的情況下用于指這樣的染色體外元件,所述染色體外元件經(jīng)常攜帶不是細胞的中央代謝的一部分的基因且通常為環(huán)狀雙鏈DNA分子的形式。此類元件可以是源自任何來源的單鏈或雙鏈DNA或RNA的線性或環(huán)狀的自主復(fù)制序列、基因組整合序列、噬菌體或核苷酸序列,其中多個核苷酸序列已經(jīng)接合或重組成能夠?qū)幼悠魏退x基因產(chǎn)物的DNA序列連同適當?shù)?'非翻譯序列引入細胞的獨特構(gòu)建體?!稗D(zhuǎn)化盒”是指含有外來基因并且除了外來基因外還具有促進特定宿主細胞的轉(zhuǎn)化的元件的特定載體?!氨磉_盒”是指含有外來基因并且除了外來基因外還具有允許該基因在外來宿主中的增強表達的元件的特定載體。本文所使用的標準重組DNA和分子克隆技術(shù)是本領(lǐng)域眾所周知的,并且描述于例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.和Maniatis,T.MolecularCloning:ALaboratoryManual,第2版;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,N.Y.,1989(以下稱為"Maniatis");和Silhavy,T.J.,Bennan,M.L.和Enquist,L.W.ExperimentswithGeneFusions;ColdSpringHarborLaboratory:ColdSpringHarbor,N.Y.,1984;和Ausubel,F.M.等人,InCurrentProtocolsinMolecularBiology,由GreenePublishingandWiley-Interscience出版,1987;其各自整體由此在它們與之一致的程度上通過引用并入本文。除非另有定義,本文所使用的所有技術(shù)和科學術(shù)語具有與本公開所屬領(lǐng)域普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。盡管類似于或等同于本文所述的那些方法和材料的任何方法和材料可以用于本公開的實踐或測試中,但下面描述了優(yōu)選的材料和方法。根據(jù)本公開,已經(jīng)開發(fā)了用于生產(chǎn)麥角硫因和具有編碼可用于生產(chǎn)麥角硫因的EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的基因的宿主細胞的方法。令人驚訝且出人意料地,已經(jīng)在體外微生物生產(chǎn)系統(tǒng)中重現(xiàn)了麥角硫因生產(chǎn)途徑。用于生產(chǎn)麥角硫因的工程改造的宿主細胞在一個方面,本公開涉及工程改造的宿主細胞。工程改造的宿主細胞包括編碼EgtB的核酸序列、編碼EgtC的核酸序列、編碼EgtD的核酸序列和編碼EgtE的核酸序列。EgtB(或鐵(II)-依賴性氧化還原酶EgtB)經(jīng)由在組氨酸三甲基內(nèi)鹽(N-α,N-α,N-α-三甲基-L-組氨酸)上添加氧和γ-谷氨酰-半胱氨酸而催化組氨酸三甲基內(nèi)鹽的氧化硫化作用。合適的EgtB可以是,例如,分枝桿菌EgtB。特別合適的EgtB可以是,例如,編碼與SEQIDNO:2中提供的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的EgtB核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtB可以是,例如,編碼與SEQIDNO:2中提供的氨基酸序列至少96%相同的氨基酸序列的EgtB核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtB可以是,例如,編碼與SEQIDNO:2中提供的氨基酸序列至少97%相同的氨基酸序列的EgtB核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtB可以是,例如,編碼與SEQIDNO:2中提供的氨基酸序列至少98%相同的氨基酸序列的EgtB核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtB可以是,例如,編碼與SEQIDNO:2中提供的氨基酸序列至少99%相同的氨基酸序列的EgtB核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtB可以是,例如,編碼與SEQIDNO:2中提供的氨基酸序列100%相同的氨基酸序列的EgtB核酸序列。EgtC(或酰胺水解酶EgtC)催化從N-(γ-谷氨酰)-[N(α),N(α),N(α)-三甲基-L-組氨酰]-半胱氨酸亞砜水解γ-谷氨酰胺鍵(gamma-glutamylamidebond)以產(chǎn)生組氨酸三甲基半胱氨酸(hercynylcysteine)亞砜。合適的EgtC可以是,例如,分枝桿菌EgtC。特別合適的EgtC可以是,例如,編碼與SEQIDNO:4中提供的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的EgtC核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtC可以是,例如,編碼與SEQIDNO:4中提供的氨基酸序列至少96%相同的氨基酸序列的EgtC核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtC可以是,例如,編碼與SEQIDNO:4中提供的氨基酸序列至少97%相同的氨基酸序列的EgtC核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtC可以是,例如,編碼與SEQIDNO:4中提供的氨基酸序列至少98%相同的氨基酸序列的EgtC核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtC可以是,例如,編碼與SEQIDNO:4中提供的氨基酸序列至少99%相同的氨基酸序列的EgtC核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtC可以是,例如,編碼與SEQIDNO:4中提供的氨基酸序列100%相同的氨基酸序列的EgtC核酸序列。EgtD(或組氨酸特異性甲基轉(zhuǎn)移酶EgtD)催化組氨酸的甲基化以形成N-α,N-α,N-α-三甲基-L-組氨酸(也稱為組氨酸三甲基內(nèi)鹽(hercynine))。組氨酸和α-N,N-二甲基組氨酸是優(yōu)選的底物。合適的EgtD可以是,例如,分枝桿菌EgtD。特別合適的EgtD可以是,例如,編碼與SEQIDNO:6中提供的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的EgtD核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtD可以是,例如,編碼與SEQIDNO:6中提供的氨基酸序列至少96%相同的氨基酸序列的EgtD核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtD可以是,例如,編碼與SEQIDNO:6中提供的氨基酸序列至少97%相同的氨基酸序列的EgtD核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtD可以是,例如,編碼與SEQIDNO:6中提供的氨基酸序列至少98%相同的氨基酸序列的EgtD核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtD可以是,例如,編碼與SEQIDNO:6中提供的氨基酸序列至少99%相同的氨基酸序列的EgtD核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtD可以是,例如,編碼與SEQIDNO:6中提供的氨基酸序列100%相同的氨基酸序列的EgtD核酸序列。EgtE(或磷酸吡哆醛-依賴性蛋白EgtE)據(jù)信催化去除丙酮酸、氨和氧以產(chǎn)生麥角硫因。合適的EgtE可以是,例如,分枝桿菌EgtE。特別合適的EgtE可以是,例如,編碼與SEQIDNO:8中提供的氨基酸序列至少95%相同的氨基酸序列的EgtE核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtE可以是,例如,編碼與SEQIDNO:8中提供的氨基酸序列至少96%相同的氨基酸序列的EgtE核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtE可以是,例如,編碼與SEQIDNO:8中提供的氨基酸序列至少97%相同的氨基酸序列的EgtE核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtE可以是,例如,編碼與SEQIDNO:8中提供的氨基酸序列至少98%相同的氨基酸序列的EgtE核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtE可以是,例如,編碼與SEQIDNO:8中提供的氨基酸序列至少99%相同的氨基酸序列的EgtE核酸序列。在另一個方面,特別合適的EgtE可以是,例如,編碼與SEQIDNO:8中提供的氨基酸序列100%相同的氨基酸序列的EgtE核酸序列。合適的宿主細胞可以是,例如,細菌細胞和酵母細胞。合適的細菌細胞可以是,例如,大腸桿菌。合適的酵母細胞可以是,例如,酵母(Saccharomyces)和畢赤酵母(Pichia)。特別合適的酵母可以是,例如,釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。特別合適的畢赤酵母可以是,例如,巴斯德畢赤酵母。將編碼EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的核酸序列克隆至表達載體中在本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的啟動子控制下。合適的啟動子可以是,例如,本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的組成型活性啟動子和誘導(dǎo)型啟動子。合適的誘導(dǎo)型啟動子是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,并且可以是,例如,化學誘導(dǎo)物,營養(yǎng)物添加,營養(yǎng)物耗竭和物理或生理化學因素改變,諸如例如pH改變和溫度誘導(dǎo)。合適的化學誘導(dǎo)物可以是,例如,本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)型啟動子和抗生素誘導(dǎo)型啟動子。特別合適的化學誘導(dǎo)型啟動子可以是,例如,本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)誘導(dǎo)型啟動子。其他合適的誘導(dǎo)型啟動子可以是,例如,本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的溫度誘導(dǎo)型啟動子,諸如例如,pL和pRλ噬菌體啟動子。特別合適的表達載體示于圖1A和1B中。其他合適的表達載體是本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的,并且可以是,例如,pET載體、pCDF載體、pRSF載體和Duet載體。用于生產(chǎn)麥角硫因的方法在另一個方面,本公開涉及用于生產(chǎn)麥角硫因的方法。所述方法包括培養(yǎng)宿主細胞,其中所述宿主細胞用編碼EgtB的核酸序列、編碼EgtC的核酸序列、編碼EgtD的核酸序列和編碼EgtE的核酸序列轉(zhuǎn)化;誘導(dǎo)所述宿主細胞以表達編碼EgtB的核酸序列、編碼EgtC的核酸序列、編碼EgtD的核酸序列和編碼EgtE的核酸序列;和收集麥角硫因。所述方法還可以包括向培養(yǎng)物添加底物。底物的合適量可以是,例如,約1mM至約20mM。特別合適的底物可以是,例如,組氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、γ-谷氨酰半胱氨酸及其組合。在另一個實施方案中,所述方法可以包括向培養(yǎng)物添加輔因子。輔因子的合適量可以是,例如,約0.05mM至約0.4mM。特別合適的輔因子可以是,例如,鐵(II)(Fe++)。合適的宿主細胞可以是,例如,細菌細胞和酵母細胞。合適的細菌細胞可以是,例如,大腸桿菌。合適的酵母細胞可以是,例如,酵母(Saccharomyces)和畢赤酵母(Pichia)。特別合適的酵母可以是,例如,釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)。特別合適的畢赤酵母可以是,例如,巴斯德畢赤酵母。在一個實施方案中,所述宿主細胞可以生產(chǎn)約10毫克至約30毫克的麥角硫因/升??紤]以下非限制性實施例后將更充分理解本公開。實施例實施例1在本實施例中,將EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的核酸序列克隆至大腸桿菌中。具體地,從GenBank(登錄號NC008596)獲得以下序列:EgtB:MSMEG_6249(SEQIDNO:1);EgtC:MSMEG_6248(SEQIDNO:3);EgtD:MSMEG_6247(SEQIDNO:5);和EgtE:MSMEG_6246(SEQIDNO:7)。將基因引入在IPTG誘導(dǎo)型啟動子控制下的載體中。為了在大腸桿菌中構(gòu)建ET途徑,使用表1中概述的引物對從恥垢分枝桿菌的基因組序列中PCR擴增EgtB、C、D、E核酸序列。用于克隆的所有5'-引物包括EcoRI和BglI限制性位點和核糖體結(jié)合位點(RBS),并且所有3'-引物都包括BamHI-XhoI位點。將EgtD和EgtB序列克隆至pConB7A載體(圖1A)中,并將EgtC和EgtE序列克隆至pConA5K載體(圖1B)中。在克隆的序列中沒有鑒定到序列錯誤。以相同的方式制備空載體。然后將構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化至大腸桿菌菌株BL21(DE3)中。表1.用于基因克隆的引物。實施例2在本實施例中,在工程改造的微生物系統(tǒng)中生產(chǎn)麥角硫因。具體地,用如實施例1中所述的編碼EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的pConB7A載體和pConA5K載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。為了在大腸桿菌系統(tǒng)中共表達四種基因(EgtB、C、D、E),使轉(zhuǎn)化體在含有100mg/L氨芐青霉素和50mg/L卡那霉素的LB培養(yǎng)基中在37℃下生長,直至達到OD600~0.6。通過添加0.2-0.5mM異丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG)而誘導(dǎo)表達,并將培養(yǎng)物在30℃或37℃下進一步生長16-24小時。通過離心收獲細胞,并分別收集上清液和細胞沉淀。將上清液以16,000xg離心5分鐘用于HPLC分析。將沉淀重懸于1ml50%甲醇中并超聲處理1分鐘(3x20秒)。以16,000×g離心5分鐘之后,通過HPLC分析5μl樣品,如下所述。將用空載體轉(zhuǎn)化的大腸桿菌以相同的方式處理并通過HPLC分析。將獲得自IPTG誘導(dǎo)的含有EgtB、EgtC、EgtD、EgtE基因的大腸桿菌的樣品摻入20mg/L麥角硫因并通過HPLC分析。使用DionexUPLCUltimate3000(Sunnyvale,CA)分析樣品。在AtlantisHILIC硅膠柱(粒徑3.0μm,直徑×長度=2.1×100mm;Waters)上分離化合物,并在264nm檢測。流動相由0.1%甲酸/水(A)和0.1%甲酸/乙腈(B)組成。梯度程序為在1分鐘的95%B,在8分鐘的40%B,在8.1分鐘的95%B,在11分鐘時終止。流速為0.6ml/分鐘,且注射體積為5μl。如圖2中所示,ET令人驚訝地僅在IPTG誘導(dǎo)的含有EgtB、EgtC、EgtD、EgtE序列的大腸桿菌菌株(“SI”)中積累,成功地表明在工程改造的大腸桿菌中ET的生物合成。相反,IPTG誘導(dǎo)的含有空載體的大腸桿菌不生產(chǎn)任何ET(“EI”)。在ET-摻入樣品中,來自IPTG誘導(dǎo)的含有EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的大腸桿菌菌株的ET峰與添加的麥角硫因重疊,并且表明增加的水平以解釋添加的ET(“Ck+”)。圖3A和3B說明100mg/L麥角硫因標準品的HPLC分析。如圖4A中所示,來自含有EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的大腸桿菌菌株的ET的保留時間與麥角硫因標準品的保留時間重疊(參見圖3A)。除了保留時間以外,ET峰的UV光譜(參見圖4B)也與麥角硫因標準品(參見圖3B)匹配。這些結(jié)果表明,來自表達EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的工程改造的大腸桿菌菌株的峰對應(yīng)于ET。實施例3在本實施例中,進行工程改造的微生物系統(tǒng)中麥角硫因生產(chǎn)的時間過程。具體地,用如實施例1中所述的含有EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的基因的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌。對照大腸桿菌細胞包括具有空載體(無Egt基因)的細胞和含有Egt載體、但未被誘導(dǎo)的未誘導(dǎo)菌株。使細胞在30℃或37℃下生長,如實施例2所述。在0小時至20小時的不同時間點取樣。超聲處理1分鐘(3x20秒)之后,將樣品以16,000xg離心5分鐘,并通過HPLC分析5μl樣品,如實施例2中所討論。如圖5中所示,HPLC分析揭示,到IPTG誘導(dǎo)后約1小時,細胞開始生產(chǎn)ET。從IPTG誘導(dǎo)后約3小時直至約10小時觀察到ET生產(chǎn)的最快增加。ET生產(chǎn)在10小時后減慢,但繼續(xù)生產(chǎn)至少直到20小時。同時,在整個時間過程中在空載體對照中完全沒有檢測到ET。這些結(jié)果進一步表明,ET專門在工程改造用于表達EgtB、EgtC、EgtD和EgtE的大腸桿菌菌株中生產(chǎn)。實施例4在本實施例中,進行進料實驗以確定對工程改造的微生物系統(tǒng)中的麥角硫因生產(chǎn)的影響。不受理論束縛,據(jù)信ET由氨基酸諸如組氨酸(His)、甲硫氨酸(Met)和半胱氨酸(Cys)合成。ET的咪唑環(huán)由His提供,然后將其甲基化以產(chǎn)生組氨酸甜菜堿。Met是充當甲基供體的S-腺苷基甲硫氨酸(SAM)的構(gòu)件(buildingblock)。硫原子從Cys引入。為了測定對工程改造的大腸桿菌中的麥角硫因生產(chǎn)的影響,通過培養(yǎng)基將幾種底物和輔因子諸如Fe++進料給轉(zhuǎn)基因大腸桿菌細胞。誘導(dǎo)3小時后,將2mMHis、4mMMet、4mMCys和0.2mMFe++添加至培養(yǎng)基,并將細胞進一步培養(yǎng)16小時、24小時和42小時。用相同的底物或輔因子進料對照大腸桿菌培養(yǎng)物(攜帶空載體)。通過HPLC分析樣品,如實施例2所述。如圖6中所示,進料實驗揭示,Cys的添加在三個時間點內(nèi)使ET產(chǎn)量增加17.3-44.4%。該結(jié)果表明Cys及其衍生物γ-谷氨酰半胱氨酸在ET的生物合成中發(fā)揮重要作用。對照培養(yǎng)物不產(chǎn)生任何ET。實施例5在本實施例中,將在工程改造的釀酒酵母系統(tǒng)中生產(chǎn)麥角硫因。為了在釀酒酵母中生產(chǎn)ET,將EgtB、C、D、E基因克隆至可商購的pESC載體中,諸如pESC-His和pESC-Leu(AgilentTechnologies)。這些載體含有相反取向的GAL1和GAL10酵母啟動子,其允許將兩個基因引入酵母菌株中分別在兩個阻抑型啟動子的控制下。然后將所得兩種構(gòu)建體共轉(zhuǎn)化至釀酒酵母中。為了在酵母中共表達四種基因(EgtB、C、D、E),將轉(zhuǎn)化體在不含兩種氨基酸組氨酸和亮氨酸的培養(yǎng)基中生長,直到達到OD600~0.4。通過添加2%半乳糖誘導(dǎo)表達,并且使培養(yǎng)物在28℃或30℃下進一步生長24-48小時。通過離心收獲細胞,并分別收集上清液和細胞沉淀。將上清液以12,000xg離心5分鐘,并通過HPLC分析。將沉淀重懸于1ml50%甲醇中并超聲處理1分鐘(3x20秒)。以12,000xg離心5分鐘之后,將5μl樣品注入HPLC中。攜帶空載體的酵母以相同的方式進行轉(zhuǎn)化和分析??梢詫⑸鲜鰳?gòu)建體最終整合入酵母基因組中并在組成型啟動子諸如GPD啟動子或GAP啟動子的控制下表達。實施例6在本實施例中,在工程改造的巴斯德畢赤酵母系統(tǒng)中生產(chǎn)麥角硫因。為了在巴斯德畢赤酵母中生產(chǎn)ET,將EgtB、C、D、E基因克隆至可商購的pPICZ或pGAPZ載體(Invitrogen,LifeTechnologies)中。pPICZ載體含有甲醇調(diào)節(jié)的AOX1啟動子,而pGAPZ載體具有組成型甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAP)啟動子。pPICZ載體中的四種基因(EgtB、C、D、E)的共表達將由0.5-5%甲醇誘導(dǎo)。ET的生產(chǎn)將使用上述相同方法通過HPLC分析來分析。鑒于上述內(nèi)容,將看到,實現(xiàn)了本公開的幾個優(yōu)點并且獲得了其他有利的結(jié)果。因為在不背離本公開范圍的情況下可以在上述方法和系統(tǒng)中進行各種改變,所以意欲上文描述中含有和附圖中顯示的所有內(nèi)容均應(yīng)被解釋為說明性而非限制性意義。當介紹本公開的要素或其各種版本、實施方案或方面時,冠詞“一個/種(a)”,“一個/種(an)”,“該(the)”和“所述(said)”意指存在一個或多個要素。術(shù)語“包含”、“包括”和“具有”意欲為包括性的,并且意味著可以存在除了所列要素之外的額外要素。序列表<110>ConagenInc.Han,JixiangChen,HuiYu,Oliver<120>微生物麥角硫因生物合成<130>C1497.70015<140>尚未指定<141>隨此同時地<150>PCT/US2015/027977<151>2015-04-28<160>16<170>PatentIn版本3.5<210>1<211>1287<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的<400>1atgatcgcacgcgagacactggccgacgagctggccctggcccgcgaacgcacgttgcgg60ctcgtggagttcgacgacgcggaactgcatcgccagtacaacccgctgatgagcccgctc120gtgtgggacctcgcgcacatcgggcagcaggaagaactgtggctgctgcgcgacggcaac180cccgaccgccccggcatgctcgcacccgaggtggaccggctttacgacgcgttcgagcac240tcacgcgccagccgggtcaacctcccgttgctgccgccttcggatgcgcgcgcctactgc300gcgacggtgcgggccaaggcgctcgacaccctcgacacgctgcccgaggacgatccgggc360ttccggttcgcgctggtgatcagccacgagaaccagcacgacgagaccatgctgcaggca420ctcaacctgcgcgagggcccacccctgctcgacaccggaattcccctgcccgcgggcagg480ccaggcgtggcaggcacgtcggtgctggtgccgggcggcccgttcgtgctcggggtcgac540gcgctgaccgaaccgcactcactggacaacgaacggcccgcccacgtcgtggacatcccg600tcgttccggatcggccgcgtgccggtcaccaacgccgaatggcgcgagttcatcgacgac660ggtggctacgaccaaccgcgctggtggtcgccacgcggctgggcgcaccgccaggaggcg720ggcctggtggccccgcagttctggaaccccgacggcacccgcacccggttcgggcacatc780gaggagatcccgggtgacgaacccgtgcagcacgtgacgttcttcgaagccgaggcctac840gcggcgtgggccggtgctcggttgcccaccgagatcgaatgggagaaggcctgcgcgtgg900gatccggtcgccggtgctcggcgccggttcccctggggctcagcacaacccagcgcggcg960ctggccaacctcggcggtgacgcacgccgcccggcgccggtcggggcctacccggcgggg1020gcgtcggcctatggcgccgagcagatgctgggcgacgtgtgggagtggacctcctcgccg1080ctgcggccgtggcccggtttcacgccgatgatctacgagcgctacagcacgccgttcttc1140gagggcaccacatccggtgactaccgcgtgctgcgcggcgggtcatgggccgttgcaccg1200ggaatcctgcggcccagcttccgcaactgggaccacccgatccggcggcagatattctcg1260ggtgtccgcctggcctgggacgtctga1287<210>2<211>428<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>2MetIleAlaArgGluThrLeuAlaAspGluLeuAlaLeuAlaArgGlu151015ArgThrLeuArgLeuValGluPheAspAspAlaGluLeuHisArgGln202530TyrAsnProLeuMetSerProLeuValTrpAspLeuAlaHisIleGly354045GlnGlnGluGluLeuTrpLeuLeuArgAspGlyAsnProAspArgPro505560GlyMetLeuAlaProGluValAspArgLeuTyrAspAlaPheGluHis65707580SerArgAlaSerArgValAsnLeuProLeuLeuProProSerAspAla859095ArgAlaTyrCysAlaThrValArgAlaLysAlaLeuAspThrLeuAsp100105110ThrLeuProGluAspAspProGlyPheArgPheAlaLeuValIleSer115120125HisGluAsnGlnHisAspGluThrMetLeuGlnAlaLeuAsnLeuArg130135140GluGlyProProLeuLeuAspThrGlyIleProLeuProAlaGlyArg145150155160ProGlyValAlaGlyThrSerValLeuValProGlyGlyProPheVal165170175LeuGlyValAspAlaLeuThrGluProHisSerLeuAspAsnGluArg180185190ProAlaHisValValAspIleProSerPheArgIleGlyArgValPro195200205ValThrAsnAlaGluTrpArgGluPheIleAspAspGlyGlyTyrAsp210215220GlnProArgTrpTrpSerProArgGlyTrpAlaHisArgGlnGluAla225230235240GlyLeuValAlaProGlnPheTrpAsnProAspGlyThrArgThrArg245250255PheGlyHisIleGluGluIleProGlyAspGluProValGlnHisVal260265270ThrPhePheGluAlaGluAlaTyrAlaAlaTrpAlaGlyAlaArgLeu275280285ProThrGluIleGluTrpGluLysAlaCysAlaTrpAspProValAla290295300GlyAlaArgArgArgPheProTrpGlySerAlaGlnProSerAlaAla305310315320LeuAlaAsnLeuGlyGlyAspAlaArgArgProAlaProValGlyAla325330335TyrProAlaGlyAlaSerAlaTyrGlyAlaGluGlnMetLeuGlyAsp340345350ValTrpGluTrpThrSerSerProLeuArgProTrpProGlyPheThr355360365ProMetIleTyrGluArgTyrSerThrProPhePheGluGlyThrThr370375380SerGlyAspTyrArgValLeuArgGlyGlySerTrpAlaValAlaPro385390395400GlyIleLeuArgProSerPheArgAsnTrpAspHisProIleArgArg405410415GlnIlePheSerGlyValArgLeuAlaTrpAspVal420425<210>3<211>684<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的<400>3atgtgccggcatgtggcgtggctgggcgcgccgcggtcgttggccgacctggtgctcgac60ccgccgcagggactgctggtgcagtcctacgcaccgcgacgacagaagcacggtctgatg120aacgccgacggttggggcgcagggtttttcgacgacgagggagtggcccgccgctggcgc180agcgacaaaccgctgtggggtgatgcgtcgttcgcgtcggtggcacccgcactacgcagt240cgttgcgtgctggccgcggtgcgctcggccaccatcggcatgcccatcgaaccgtcggcg300tcggcgccgttcagcgacgggcagtggctgctgtcgcacaacggcctggtcgaccgcggg360gtgctcccgttgaccggtgccgccgagtccacggtggacagcgcgatcgtcgcggcgctc420atcttctcccgtggcctcgacgcgctcggcgccaccatcgccgaggtcggcgaactcgac480ccgaacgcgcggttgaacatcctggccgccaacggttcccggctgctcgccaccacctgg540ggggacacgctgtcggtcctgcaccgccccgacggcgtcgtcctcgcgagcgaaccctac600gacgacgatcccggctggtcggacatcccggaccggcacctcgtcgacgtccgcgacgcc660cacgtcgtcgtgacacccctgtga684<210>4<211>227<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>4MetCysArgHisValAlaTrpLeuGlyAlaProArgSerLeuAlaAsp151015LeuValLeuAspProProGlnGlyLeuLeuValGlnSerTyrAlaPro202530ArgArgGlnLysHisGlyLeuMetAsnAlaAspGlyTrpGlyAlaGly354045PhePheAspAspGluGlyValAlaArgArgTrpArgSerAspLysPro505560LeuTrpGlyAspAlaSerPheAlaSerValAlaProAlaLeuArgSer65707580ArgCysValLeuAlaAlaValArgSerAlaThrIleGlyMetProIle859095GluProSerAlaSerAlaProPheSerAspGlyGlnTrpLeuLeuSer100105110HisAsnGlyLeuValAspArgGlyValLeuProLeuThrGlyAlaAla115120125GluSerThrValAspSerAlaIleValAlaAlaLeuIlePheSerArg130135140GlyLeuAspAlaLeuGlyAlaThrIleAlaGluValGlyGluLeuAsp145150155160ProAsnAlaArgLeuAsnIleLeuAlaAlaAsnGlySerArgLeuLeu165170175AlaThrThrTrpGlyAspThrLeuSerValLeuHisArgProAspGly180185190ValValLeuAlaSerGluProTyrAspAspAspProGlyTrpSerAsp195200205IleProAspArgHisLeuValAspValArgAspAlaHisValValVal210215220ThrProLeu225<210>5<211>966<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的<400>5atgacgctctcactggccaactacctggcagccgactcggccgccgaagcactgcgccgt60gacgtccgcgcgggcctcaccgcggcaccgaagagtctgccgcccaagtggttctacgac120gccgtcggcagtgatctgttcgaccagatcacccggctccccgagtattaccccacccgc180accgaggcgcagatcctgcggacccggtcggcggagatcatcgcggccgcgggtgccgac240accctggtggaactgggcagtggtacgtcggagaaaacccgcatgctgctcgacgccatg300cgcgacgccgagttgctgcgccgcttcatcccgttcgacgtcgacgcgggcgtgctgcgc360tcggccggggcggcaatcggcgcggagtaccccggtatcgagatcgacgcggtatgtggc420gatttcgaggaacatctgggcaagatcccgcatgtcggacggcggctcgtggtgttcctg480gggtcgaccatcggcaacctgacacccgcgccccgcgcggagttcctcagtactctcgcg540gacacgctgcagccgggcgacagcctgctgctgggcaccgatctggtgaaggacaccggc600cggttggtgcgcgcgtacgacgacgcggccggcgtcaccgcggcgttcaaccgcaacgtg660ctggccgtggtgaaccgcgaactgtccgccgatttcgacctcgacgcgttcgagcatgtc720gcgaagtggaactccgacgaggaacgcatcgagatgtggttgcgtgcccgcaccgcacag780catgtccgcgtcgcggcactggacctggaggtcgacttcgccgcgggtgaggagatgctc840accgaggtgtcctgcaagttccgtcccgagaacgtcgtcgccgagctggcggaagccggt900ctgcggcagacgcattggtggaccgatccggccggggatttcgggttgtcgctggcggtg960cggtga966<210>6<211>321<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>6MetThrLeuSerLeuAlaAsnTyrLeuAlaAlaAspSerAlaAlaGlu151015AlaLeuArgArgAspValArgAlaGlyLeuThrAlaAlaProLysSer202530LeuProProLysTrpPheTyrAspAlaValGlySerAspLeuPheAsp354045GlnIleThrArgLeuProGluTyrTyrProThrArgThrGluAlaGln505560IleLeuArgThrArgSerAlaGluIleIleAlaAlaAlaGlyAlaAsp65707580ThrLeuValGluLeuGlySerGlyThrSerGluLysThrArgMetLeu859095LeuAspAlaMetArgAspAlaGluLeuLeuArgArgPheIleProPhe100105110AspValAspAlaGlyValLeuArgSerAlaGlyAlaAlaIleGlyAla115120125GluTyrProGlyIleGluIleAspAlaValCysGlyAspPheGluGlu130135140HisLeuGlyLysIleProHisValGlyArgArgLeuValValPheLeu145150155160GlySerThrIleGlyAsnLeuThrProAlaProArgAlaGluPheLeu165170175SerThrLeuAlaAspThrLeuGlnProGlyAspSerLeuLeuLeuGly180185190ThrAspLeuValLysAspThrGlyArgLeuValArgAlaTyrAspAsp195200205AlaAlaGlyValThrAlaAlaPheAsnArgAsnValLeuAlaValVal210215220AsnArgGluLeuSerAlaAspPheAspLeuAspAlaPheGluHisVal225230235240AlaLysTrpAsnSerAspGluGluArgIleGluMetTrpLeuArgAla245250255ArgThrAlaGlnHisValArgValAlaAlaLeuAspLeuGluValAsp260265270PheAlaAlaGlyGluGluMetLeuThrGluValSerCysLysPheArg275280285ProGluAsnValValAlaGluLeuAlaGluAlaGlyLeuArgGlnThr290295300HisTrpTrpThrAspProAlaGlyAspPheGlyLeuSerLeuAlaVal305310315320Arg<210>7<211>1113<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的<400>7atgctcgcgcagcagtggcgtgacgcccgtcccaaggttgccgggttgcacctggacagc60ggggcatgttcgcggcagagcttcgcggtgatcgacgcgaccaccgcacacgcacgccac120gaggccgaggtgggtggttatgtggcggccgaggctgcgacgccggcgctcgacgccggg180cgggccgcggtcgcgtcgctcatcggttttgcggcgtcggacgtggtgtacaccagcgga240tccaaccacgccatcgacctgttgctgtcgagctggccggggaagcgcacgctggcctgc300ctgcccggcgagtacgggccgaatctgtctgccatggcggccaacggtttccaggtgcgt360gcgctaccggtcgacgacgacgggcgggtgctggtcgacgaggcgtcgcacgaactgtcg420gcccatcccgtcgcgctcgtacacctcaccgcattggcaagccatcgcgggatcgcgcaa480cccgcggcagaactcgtcgaggcctgccacaatgcggggatccccgtggtgatcgacgcc540gcgcaggcgctggggcatctggactgcaatgtcggggccgacgcggtgtactcatcgtcg600cgcaagtggctcgccggcccgcgtggtgtcggggtgctcgcggtgcggcccgaactcgcc660gagcgtctgcaaccgcggatccccccgtccgactggccaattccgatgagcgtcttggag720aagctcgaactaggtgagcacaacgcggcggcgcgtgtgggattctccgtcgcggttggt780gagcatctcgcagcagggcccacggcggtgcgcgaacgactcgccgaggtggggcgtctc840tctcggcaggtgctggcagaggtcgacgggtggcgcgtcgtcgaacccgtcgaccaaccc900accgcgatcaccacccttgagtccaccgatggtgccgatcccgcgtcggtgcgctcgtgg960ctgatcgcggagcgtggcatcgtgaccaccgcgtgtgaactcgcgcgggcaccgttcgag1020atgcgcacgccggtgctgcgaatctcgccgcacgtcgacgtgacggtcgacgaactggag1080cagttcgccgcagcgttgcgtgaggcgccctga1113<210>8<211>370<212>PRT<213>人工序列<220><223>合成的<400>8MetLeuAlaGlnGlnTrpArgAspAlaArgProLysValAlaGlyLeu151015HisLeuAspSerGlyAlaCysSerArgGlnSerPheAlaValIleAsp202530AlaThrThrAlaHisAlaArgHisGluAlaGluValGlyGlyTyrVal354045AlaAlaGluAlaAlaThrProAlaLeuAspAlaGlyArgAlaAlaVal505560AlaSerLeuIleGlyPheAlaAlaSerAspValValTyrThrSerGly65707580SerAsnHisAlaIleAspLeuLeuLeuSerSerTrpProGlyLysArg859095ThrLeuAlaCysLeuProGlyGluTyrGlyProAsnLeuSerAlaMet100105110AlaAlaAsnGlyPheGlnValArgAlaLeuProValAspAspAspGly115120125ArgValLeuValAspGluAlaSerHisGluLeuSerAlaHisProVal130135140AlaLeuValHisLeuThrAlaLeuAlaSerHisArgGlyIleAlaGln145150155160ProAlaAlaGluLeuValGluAlaCysHisAsnAlaGlyIleProVal165170175ValIleAspAlaAlaGlnAlaLeuGlyHisLeuAspCysAsnValGly180185190AlaAspAlaValTyrSerSerSerArgLysTrpLeuAlaGlyProArg195200205GlyValGlyValLeuAlaValArgProGluLeuAlaGluArgLeuGln210215220ProArgIleProProSerAspTrpProIleProMetSerValLeuGlu225230235240LysLeuGluLeuGlyGluHisAsnAlaAlaAlaArgValGlyPheSer245250255ValAlaValGlyGluHisLeuAlaAlaGlyProThrAlaValArgGlu260265270ArgLeuAlaGluValGlyArgLeuSerArgGlnValLeuAlaGluVal275280285AspGlyTrpArgValValGluProValAspGlnProThrAlaIleThr290295300ThrLeuGluSerThrAspGlyAlaAspProAlaSerValArgSerTrp305310315320LeuIleAlaGluArgGlyIleValThrThrAlaCysGluLeuAlaArg325330335AlaProPheGluMetArgThrProValLeuArgIleSerProHisVal340345350AspValThrValAspGluLeuGluGlnPheAlaAlaAlaLeuArgGlu355360365AlaPro370<210>9<211>49<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的<400>9agaattcaaaagatctaaaggaggccatccatgatcgcacgcgagacac49<210>10<211>53<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的<400>10actcgagtttggatcctcagacgtcccaggccaggcggacacccgagaatatc53<210>11<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的<400>11agaattcaaaagatctaaaggaggccatccatgtgccggcatgtggcgtg50<210>12<211>34<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的<400>12actcgagtttggatcctcacaggggtgtcacgac34<210>13<211>51<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的<400>13agaattcaaaagatctaaaggaggccatccatgacgctctcactggccaac51<210>14<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的<400>14actcgagtttggatcctcaccgcaccgccagcgac35<210>15<211>47<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的<400>15agaattcaaaagatctaaaggaggccatccatgctcgcgcagcagtg47<210>16<211>35<212>DNA<213>人工序列<220><223>合成的<400>16actcgagtttggatcctcagggcgcctcacgcaac35當前第1頁1 2 3 當前第1頁1 2 3 
      當前第1頁1 2 3 
      網(wǎng)友詢問留言 已有0條留言
      • 還沒有人留言評論。精彩留言會獲得點贊!
      1