本發(fā)明提供了一種新型p38和JNK絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)變構(gòu)抑制劑，其可用于治療和預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病。此種疾病的實例包括帕金森氏癥、阿爾茨海默癥、色素性視網(wǎng)膜炎、年齡相關(guān)性黃斑變性和癡呆。
背景技術(shù)：
：p38αMAP激酶(MAPK)是炎癥細(xì)胞信號調(diào)節(jié)中涉及的細(xì)胞內(nèi)絲氨酸/蘇氨酸激酶，并在促炎癥細(xì)胞因子生產(chǎn)的調(diào)節(jié)中起到核心作用。p38α的激活由上游激酶MKK6和MKK3引發(fā)。在分子水平上，與其他蛋白激酶相似，p38α負(fù)責(zé)將γ-磷酸鹽形式ATP轉(zhuǎn)移到包括轉(zhuǎn)錄因子ATF2、Elk-l和MEF2A和下游激酶(如MK2、MK3、PRAK、MNK1/2和MSK1)在內(nèi)的多種底物蛋白上，并調(diào)制其功能(Stokoe等,1992,EMBOJ.11,3985-3994)。已經(jīng)確定p38α是抗炎癥藥物的潛在靶標(biāo)，并且已經(jīng)確認(rèn)了對于這些藥物的不同結(jié)合位點(Akella等,2008年1月,BiochimBiophysActa；1784(1):48-55)。Yong等綜述了正在開發(fā)中的作為治療炎癥疾病和癌癥的潛在藥物的不同p38MAPK抑制劑(Yong等,2009,ExpertOpin.Investig.Drugs；18(12))。已經(jīng)證明，大多數(shù)藥物候選物可與ATP競爭，結(jié)合至活性位點。還已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，少數(shù)抑制劑結(jié)合至與活性位點相鄰的位點上。Akella等討論了其他結(jié)合位點如D-motifs、FXFP的結(jié)合位點與背側(cè)位點的潛在相關(guān)性。近來，臨床研究和臨床前動物模型的證據(jù)暗示，促炎癥細(xì)胞因子的過度生產(chǎn)對慢性神經(jīng)退行性紊亂如阿爾茨海默癥、帕金森氏癥和多種硬化的病理發(fā)展有促進(jìn)(如A.D,Bachstetter等,AgeingandDisease2010,Vol.1,No.3,pp.139-211)。這表明了p38MAPK信號通路可能是用于調(diào)制神經(jīng)疾病中炎癥反應(yīng)的可能靶標(biāo)。在神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病中也是重要的藥物目標(biāo)的另一種MAP激酶為JNKMAP激酶。JNKMAP激酶對于神經(jīng)元細(xì)胞凋亡和APP的淀粉樣變性處理(兩種最重要的阿爾茨海默癥的特征)而言提供了大腦中的關(guān)鍵信號。盡管已經(jīng)報道了數(shù)種p38MAPK抑制劑，但是當(dāng)前還沒有關(guān)于使用p38和JNKMAPK抑制劑來治療神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病的研究，甚至沒有關(guān)于任何此種化合物是否能夠穿過血腦障壁的可利用的信息。技術(shù)實現(xiàn)要素：因此，本發(fā)明的目的在于提供可用于治療和/或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病的化合物(特別是p38和JNKMAPK抑制劑)以及其組合物和制劑。本文使用的術(shù)語“神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病”是指以下一組紊亂，其中，神經(jīng)元存在漸變的、一般為對稱的、持續(xù)進(jìn)行的衰弱。通常，神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病隱匿地開始，并且是可能延續(xù)多年的逐漸發(fā)展的過程。這些疾病的共同特征為解剖學(xué)或生理學(xué)相關(guān)的神經(jīng)元系統(tǒng)的接近選擇性的損害。神經(jīng)系統(tǒng)的各種退行性疾病的常用分類方式基于根據(jù)真實病例中可見的臨床特征對其劃分。因此，一類所述疾病包括：在沒有其他顯著的神經(jīng)病學(xué)征兆的情況下以進(jìn)行性癡呆為明顯特征的綜合征。該類退行性疾病包括老年癡呆和阿爾茨海默癥等，其均涉及彌漫性腦萎縮。該類中另一實例為涉及局限性腦萎縮的皮克氏病。另一重要類別的神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病是進(jìn)行性癡呆與其他神經(jīng)病學(xué)征兆組合的綜合征。此種紊亂的實例例如為亨廷頓舞蹈癥和主要在成年人中發(fā)病的腦小腦退變(cerebrocerebellardegeneration)。所述紊亂的另一亞類的實例在兒童和成年人中發(fā)病，并包括家族性黑朦性癡呆(神經(jīng)元脂質(zhì)沉積)、腦白質(zhì)病變、家族性肌陣攣性癲癇、蒼白球黑質(zhì)色素變性病和威爾遜氏病(肝豆?fàn)詈俗冃浴⑹?韋二氏假性硬化)等。另一重要類別的神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病是主要表現(xiàn)為不自主運動姿勢的異常的漸變式發(fā)展的綜合征。該類紊亂包括震顫性麻痹(帕金森氏癥)、變形性肌張力障礙(扭轉(zhuǎn)痙攣)、蒼白球黑質(zhì)色素變性病和其他受限的運動障礙、家族性震顫和痙攣性斜頸。另一重要類別的神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病是主要表現(xiàn)為慢性發(fā)展的共濟(jì)失調(diào)的綜合征。這些紊亂包括但不限于，小腦退變和脊髓小腦退變(弗里德利希共濟(jì)失調(diào)、馬里氏遺傳性共濟(jì)失調(diào))。另一類別的神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病包括具有慢性發(fā)展的肌無力和衰弱的綜合征。相應(yīng)的紊亂可以在沒有感知變化的情況下發(fā)展，例如，肌萎縮性側(cè)索硬化癥(ALS)、進(jìn)行性肌萎縮、惡質(zhì)病、肌肉減少癥、進(jìn)行性延髓麻痹或成年人中的原發(fā)性側(cè)索硬化，或以下紊亂，如小兒肌萎縮(Werdnig-Hoffmann病)、多種形式的家族性進(jìn)行性肌萎縮(包括Wohlfart-Kugelberg-Welander綜合征)或在兒童或年輕人中的遺傳性痙攣性截癱。所述類別的疾病還包括具有感知變化的那些，如進(jìn)行性神經(jīng)性肌萎縮、如腓骨肌萎縮(Charcot-Marie-Tooth)和肥大性間質(zhì)性神經(jīng)病(Dejerine-Sottas)或慢性進(jìn)行性神經(jīng)病的雜癥形式。最后，另一類別的神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病是主要表現(xiàn)為進(jìn)行性視力喪失的綜合征。這些紊亂包括遺傳性視神經(jīng)萎縮(利伯氏病)、與年齡相關(guān)的黃斑變性和視網(wǎng)膜的色素變性(色素性視網(wǎng)膜炎)等。本發(fā)明還提供了用于治療和/或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病以及相關(guān)疾病的方法中使用的化合物。優(yōu)選的是，本發(fā)明的化合物能夠結(jié)合由絲裂原活化蛋白激酶14(Uniprot登錄號Q16539或SEQIDNo.1)和/或絲裂原活化蛋白激酶11(Uniprot登錄號Q15759或SEQIDNo.2)的170～199位氨基酸構(gòu)成的區(qū)域，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2分別為MAPK14(p38α)和MAPK11(p38β)的氨基酸序列。由170～199位氨基酸構(gòu)成的特定區(qū)域在本文中公開為SEQIDNO.4(對于絲裂原活化蛋白激酶14)和或SEQIDNO.5(對于絲裂原活化蛋白激酶11)，并且認(rèn)為其是新的抑制性結(jié)合位點。其三維結(jié)構(gòu)可從蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(PDB登記號20ZA)獲得。重要的是，本發(fā)明的化合物不僅充當(dāng)有效的p38和JNKMAPK抑制劑，還具備優(yōu)異的血腦障壁穿透性。因此，對患者施用本發(fā)明的化合物可使得所述化合物在患者的大腦和神經(jīng)系統(tǒng)組織中大量積聚。這使得所述化合物能夠與相應(yīng)組織中的p38和JNKMAPK相互作用，并能夠有效地治療和/或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病。具體而言，本發(fā)明提供了通式(I)的化合物或其鹽：其中：A是多環(huán)芳香族、雜芳族、脂環(huán)族、雜脂環(huán)族取代基，或由以下結(jié)構(gòu)表示：R1為氫原子、鹵原子或可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-6烷基，R2為可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-6脂肪族基團(tuán)，X表示-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NH-、-C(O)-或-CH2-，Y1、Z1、Y2、Z2和Y3獨立地表示-CH-或-N-，且W表示-O-、-S-、-NH-或-C(O)-；并且其中，該多環(huán)芳香族、雜芳族、脂環(huán)族、雜脂環(huán)族取代基可以可選地取代有-W-R2。本發(fā)明還提供了使用本文描述的p38和JNKMAPK抑制劑治療和/或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病的治療和/或預(yù)防方法。在另一方面中，本發(fā)明涉及一種藥物組合物，其包含治療有效量的通式(I)的化合物或其鹽作為活性成分。本發(fā)明的藥物組合物優(yōu)選被配制為口服劑型，從而能夠方便地施用給患者。本發(fā)明的另一方面是用于治療人體或動物體、特別是用于治療和/或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病的通式(I)的化合物。換言之，本發(fā)明提供了使用本文描述的p38和JNKMAPK抑制劑治療人體或動物體的方法、特別是治療神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病的方法。附圖說明圖1：使用化合物1減緩由急性腦血管內(nèi)注射寡聚Αβ25-35肽制劑而在大鼠中產(chǎn)生的病理。圖2：由于施用化合物1而減少大鼠體內(nèi)的Αβ1-42水平增加。具體實施方式本發(fā)明提供了用于治療和/或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病、特別是p38和JNK介導(dǎo)的神經(jīng)退行性疾病的化合物。本發(fā)明的化合物能夠穿過血腦障壁，并結(jié)合由SEQIDNo.1和/或SEQIDNo.2的170～199位氨基酸構(gòu)成的區(qū)域，SEQIDNO.1和SEQIDNO.2分別為MAPK14(p38α)和MAPK11(p38β)的氨基酸序列。本發(fā)明的化合物優(yōu)選對SEQIDNo.1和/或SEQIDNo.2的蛋白有抑制作用，而對SEQIDNo.1和/或SEQIDNo.2蛋白的突變體R186A或R189A沒有抑制作用。本發(fā)明的一個方面涉及通式(I)的化合物或其鹽：其中：A是多環(huán)芳香族、雜芳族、脂環(huán)族、雜脂環(huán)族取代基，或由以下結(jié)構(gòu)表示：R1為氫原子、鹵原子或可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-6烷基，R2為可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-6脂肪族基團(tuán)，X表示-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NH-、-C(O)-或-CH2-，Y1、Z1、Y2、Z2和Y3獨立地表示-CH-或-N-，且W表示-O-、-S-、-NH-或-C(O)-；并且其中，該多環(huán)芳香族、雜芳族、脂環(huán)族、雜脂環(huán)族取代基可以可選地取代有-W-R2。優(yōu)選地，多環(huán)芳香族、雜芳族、脂環(huán)族、雜脂環(huán)族取代基是稠合雙環(huán)芳香族、雜芳族、脂環(huán)族、雜脂環(huán)族取代基。如本文所用，術(shù)語“多環(huán)芳香族取代基”可以指代選自萘基、蒽基、菲基和四氫化萘基的基團(tuán)。術(shù)語“多環(huán)雜芳族取代基”可以指代選自茚滿基、茚基、喹啉基、異喹啉基、1,2,3,4-四氫喹啉基、1,2,3,4-四氫異喹啉基、苯并咪唑基、苯并呋喃基、苯并噻吩基、二氫苯并呋喃基、二氫苯并噻吩基和苯并異噁唑基的基團(tuán)。根據(jù)本發(fā)明，術(shù)語“多環(huán)脂環(huán)族取代基”可以指代諸如降莰烷基、1-金剛烷基、2-金剛烷基、異莰烷基或十氫化萘基等基團(tuán)。最后，術(shù)語“多環(huán)雜環(huán)取代基”可以指代十氫喹啉基、十氫異喹啉基、八氫喹啉基、八氫異喹啉基或奎寧環(huán)基。在本發(fā)明的一些優(yōu)選實施方式中，取代基A由以下結(jié)構(gòu)之一表示：在又一優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明涉及由通式(II)表示的化合物或其鹽：其中：R1為氫原子、鹵原子或可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-6烷基，R2為可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-6脂肪族基團(tuán)，X表示-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NH-、-C(O)-或-CH2-，Y1、Z1、Y2、Z2和Y3獨立地表示-CH-或-N-，和W表示-O-、-S-、-NH-或-C(O)-。在本申請中，術(shù)語“鹵原子”可以指代氟原子、氯原子、溴原子或碘原子，特別優(yōu)選的是氟原子或氯原子。在特別優(yōu)選的實施方式中，術(shù)語“鹵原子”指代氟原子。本文所用的術(shù)語“脂肪族基團(tuán)”可以指代直鏈或支化的烷基、環(huán)烷基、烷基-環(huán)烷基、環(huán)烷基-烷基、烯基、炔基、二烯基或炔烯基。脂肪族基團(tuán)可以是飽和的，或者包含一個或多個碳碳雙鍵和/或三鍵。因此，術(shù)語“C1-6脂肪族基團(tuán)”涵蓋了C1-6烷基、C3-6環(huán)烷基、C4-6烷基-環(huán)烷基、C4-6環(huán)烷基-烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C4-6二烯基和C4-6炔烯基。優(yōu)選的是，術(shù)語“C1-6脂肪族基團(tuán)”指代C1-6烷基。術(shù)語“烷基”指代直鏈或支化烷基。因此，術(shù)語“C1-6烷基”指代具有1～6個碳原子的直鏈或支化烷基。C1-6烷基的實例包括但不限于：甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、異丁基、叔丁基、正戊基和正己基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，“C1-6烷基”是具有1～4個碳原子的直鏈或支化烷基。在特別優(yōu)選的實施方式中，“C1-6烷基”是甲基、乙基或正丙基。術(shù)語“C3-6環(huán)烷基”可以指代環(huán)丙基、環(huán)丁基、環(huán)戊基或環(huán)己基。術(shù)語“C4-6烷基-環(huán)烷基”可以例如指代環(huán)丙基甲基、1-環(huán)丙基乙基、2-環(huán)丙基乙基或環(huán)戊基甲基。通式(I)中的“C4-6環(huán)烷基-烷基”可以表示甲基環(huán)丙基、甲基環(huán)丁基或甲基環(huán)戊基等，其可以是(E)-或(Z)-異構(gòu)體。術(shù)語“烯基”是指包含碳碳雙鍵的直鏈或支化脂肪族基團(tuán)。因此，術(shù)語“C2-6烯基”指代具有2～6個碳原子的直鏈或支化烯基。C2-6烯基的實例包括但不限于：乙烯基、烯丙基、甲代烯丙基、1-丙烯基和5-己烯基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，“C2-6烯基”是乙烯基或烯丙基。術(shù)語“炔基”指代包含碳碳三鍵的直鏈或支化脂肪族基團(tuán)。因此，術(shù)語“C2-6炔基”指代具有2～6個碳原子的直鏈或支化炔基。C2-6炔基的實例包括但不限于：乙炔基、1-丙炔基、2-丙炔基、1-丁炔基、2-丁炔基、3-丁炔基、1-戊炔基、2-戊炔基、3-戊炔基、4-戊炔基和1-己炔基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選實施方式中，“C2-6炔基”是乙炔基、1-丙炔基或2-丙炔基。術(shù)語“二烯基”指代包含兩個碳碳雙鍵的直鏈或支化脂肪族基團(tuán)。因此，術(shù)語“C4-6二烯基”指代具有4～6個碳原子的直鏈或支化二烯基。C4-6二烯基的實例包括但不限于1,3-丁二烯基、1,3-戊二烯基或2,4-戊二烯基。術(shù)語“炔烯基”指代包含兩個碳碳雙鍵的直鏈或支化脂肪族基團(tuán)。因此，術(shù)語“C4-6炔烯基”指代具有4～6個碳原子的直鏈或支化炔烯基。C4-6炔烯基的實例包括但不限于：丁-1-烯-3炔基、戊-1-烯-3-炔基或己-1-烯-3-炔基。烷基等脂肪族基團(tuán)(如C1-6烷基)可以可選地取代有一個或多個鹵原子。因此，例如，相對應(yīng)的取代基可以是全氟烷基，例如，三氟甲基、五氟乙基或正七氟丙基。在本發(fā)明的特別優(yōu)選的實施方式中，“可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-6脂肪族基團(tuán)”指代三氟甲基。在一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供了通式(I)的化合物或其鹽，其中：R1為鹵原子或可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-6烷基，R2為可選地取代有一個或多個鹵原子的C2-6烷基，Y2、Z1和Z2表示＝CH-且Y2表示＝N-，和W表示-O-。在另一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明提供了通式(I)的化合物或其鹽，其中：R1為鹵原子或可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-6烷基，R2為可選地取代有一個或多個鹵原子的C2-6烷基，Y2、Z1和Y2表示＝CH-且Z2表示＝N-，和W表示-O-。在另一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的化合物由通式(I)表示，其中：R1為鹵原子或可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-6烷基，R2為可選地取代有一個或多個鹵原子的C2-6烷基，Y1、Z1、Y2和Z2表示＝CH-，和W表示-O-。在又一個優(yōu)選實施方式中，本發(fā)明的化合物由通式(I)表示，其中：R1為氯原子或可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-3烷基，R2為可選地取代有一個或多個鹵原子的C2-4烷基，Y3表示-CH-，和W表示-O-。在特別優(yōu)選的實施方式中，本發(fā)明的化合物由通式(I)表示，其中：R1為氟原子、氯原子或甲基，R2為乙基或正丙基，X表示-O-、-S-或-CH2-，Y1、Z1、Y2、Z2和Y3表示-CH-，和W表示-O-。如本領(lǐng)域技術(shù)人員可理解的是，通式(I)中的結(jié)構(gòu)部分可以具有1,4-取代模式、1,3-取代模式或1,2-取代模式。在本發(fā)明的一個實施方式中，所述部分具有1,3-取代模式。因此，本發(fā)明的化合物由式(Ia)表示：在本發(fā)明的又一實施方式中，相應(yīng)的結(jié)構(gòu)部分具有1,4-取代模式。因此，本發(fā)明的化合物由式(Ib)表示：在本發(fā)明的特別優(yōu)選實施方式中，通式(I)中的結(jié)構(gòu)片段可以選自包含以下取代基的組：優(yōu)選的是，通式(I)中的結(jié)構(gòu)部分由選自包含以下結(jié)構(gòu)單元的組中的結(jié)構(gòu)表示：本發(fā)明的特別優(yōu)選的化合物的實例包括但不限于下述化合物：本發(fā)明的另一方面涉及式(I)的化合物用于制造和/或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病的應(yīng)用。相應(yīng)的神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病可以選自由老年癡呆、阿爾茨海默癥、皮克氏病、亨廷頓舞蹈癥、腦小腦退變、家族性黑朦性癡呆(神經(jīng)元脂質(zhì)沉積)、腦白質(zhì)病變、家族性肌陣攣性癲癇和威爾遜氏病(肝豆?fàn)詈俗冃?、?韋二氏假性硬化)組成的組。在另一實施方式中，神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病可以選自由下述疾病組成的組：震顫性麻痹(帕金森氏癥)、變形性肌張力障礙(扭轉(zhuǎn)痙攣)、蒼白球黑質(zhì)色素變性病和其他受限的運動障礙、家族性震顫和痙攣性斜頸、小腦退變和脊髓小腦退變(弗里德利希共濟(jì)失調(diào)、馬里氏遺傳性共濟(jì)失調(diào))、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、進(jìn)行性肌萎縮、進(jìn)行性延髓麻痹、原發(fā)性側(cè)索硬化，小兒肌萎縮(Werdnig-Hoffmann病)、家族性進(jìn)行性肌萎縮的其他形式(包括Wohlfart-Kugelberg-Welander綜合征)、惡質(zhì)病和肌肉減少癥、遺傳性痙攣性截癱、進(jìn)行性神經(jīng)性肌萎縮、腓骨肌萎縮(Charcot-Marie-Tooth)和肥大性間質(zhì)性神經(jīng)病(Dejerine-Sottas)、慢性進(jìn)行性神經(jīng)病的雜癥形式、遺傳性視神經(jīng)萎縮(利伯氏病)、與年齡相關(guān)的黃斑變性和視網(wǎng)膜的色素變性(色素性視網(wǎng)膜炎)。不過，在另一實施方式中，神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病選自由抑郁癥和精神分裂癥組成的組。在本發(fā)明的特別優(yōu)選實施方式中，通式(I)的化合物用于治療和/或預(yù)防阿爾茨海默癥。式(I)的化合物可以基本上如下述文獻(xiàn)所述制備：Fernandez等,2002,TetrahedronLetters43,4741-4745；Starchenkov等,ChemistryofHeterocyclicCompounds1997,33(19),1219-1233；和Khim.Geterotskil.Soedin.,1997,1402-1416。本發(fā)明的化合物包括其藥學(xué)上可接受的鹽、酰胺化物和前藥，包括但不限于本發(fā)明的化合物的羧酸鹽、氨基酸加成鹽、酰胺和前藥，其在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適用于接觸患者的組織，而沒有不當(dāng)?shù)亩拘浴⒋碳?、過敏反應(yīng)等，具有合理的益處/風(fēng)險比例，并有效用于其預(yù)定用途；還包括本發(fā)明的化合物的可能的兩性離子形式。術(shù)語“鹽”是指本發(fā)明的化合物的相對無毒性的無機(jī)和有機(jī)酸加成鹽。這些鹽可以在化合物的最終分離純化過程中原位制備，或通過使游離堿形式的純化化合物與合適的有機(jī)或無機(jī)酸反應(yīng)并分離由此形成的鹽而制備。代表性鹽包括：氫溴酸鹽、鹽酸鹽、硫酸鹽、硫酸氫鹽、硝酸鹽、乙酸鹽、草酸鹽、戊酸鹽、油酸鹽、棕櫚酸鹽、硬脂酸鹽、月桂酸鹽、硼酸鹽、苯甲酸鹽、乳酸鹽、磷酸鹽、甲苯磺酸鹽、檸檬酸鹽、馬來酸鹽、富馬酸鹽、琥珀酸鹽、酒石酸鹽、甲磺酰萘酸鹽(naphthylatemesylate)、葡庚糖酸鹽、乳糖酸鹽(lactobsonate)和月桂基硫酸鹽等。這些鹽可以包括：基于堿金屬或堿土金屬的陽離子，例如鈉、鋰、鉀、鈣、鎂等，以及無毒性的銨、季銨和胺陽離子，包括但不限于銨、四甲基銨、四乙基銨、甲胺、二甲胺、三甲胺、三乙胺、乙胺等(參見例如S.M.Berg等,“PharmaceuticalSalts”,J.Pharm.Sci.,1977,66:1-19，此處通過援引并入本文)。本發(fā)明的另一方面包括一種藥物組合物，其包含治療有效量的本發(fā)明的一種或多種上述化合物與藥學(xué)上可接受的載質(zhì)。關(guān)于施用，上述化合物通常與適于指定施用途徑的一種或多種助劑組合。所述化合物可以與乳糖、蔗糖、淀粉粉末、烷酸的纖維素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸鎂、氧化鎂、磷酸和硫酸的鈉鹽和鈣鹽、阿拉伯樹膠、明膠、海藻酸鈉、聚乙烯基吡咯烷酮和/或聚乙烯醇混合，并進(jìn)行壓片或膠囊化，從而進(jìn)行常規(guī)施用。作為另選，本發(fā)明的化合物可以溶于鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纖維素膠體溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉花籽油、芝麻油、黃蓍膠和/或各種緩沖液中。其他助劑和施用模式是藥物領(lǐng)域中公知的。載質(zhì)或稀釋劑可以包括時延材料，如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯(獨用或與蠟混合)，或本領(lǐng)域公知的其他材料。本發(fā)明的化合物的藥學(xué)上可接受的無毒性的酰胺化物的實例包括衍生自仲胺的酰胺化物。本發(fā)明的化合物的酰胺化物可以根據(jù)常規(guī)方法制備。術(shù)語“前藥”是指在體內(nèi)快速轉(zhuǎn)化(例如通過在血液中水解轉(zhuǎn)化)產(chǎn)生上式母體化合物的化合物。前藥的全面介紹提供于T.Higuchi和V.Stella,"Pro-drugsasNovelDeliverySystems",A.C.S.SymposiumSeries第14卷,以及BioreversibleCarriersinDrugDesign,EdwardB.Roche編,美國醫(yī)藥協(xié)會和帕加馬出版社,1987中，在此通過援引將其并入。本發(fā)明的化合物可以單獨施用，或者通常以藥物組合物的形式組合施用。此種組合物以藥物領(lǐng)域公知的方式制備，并包含至少一種活性化合物。因此，本發(fā)明的一個方面包括一種藥物組合物，其包含本發(fā)明的一種或多種上述化合物與藥學(xué)上可接受的載質(zhì)。關(guān)于施用，上述化合物通常與適于指定施用途徑的一種或多種助劑組合。上述化合物可以與乳糖、蔗糖、淀粉粉末、烷酸的纖維素酯、硬脂酸、滑石、硬脂酸鎂、氧化鎂、海藻酸鈉、聚乙烯基吡咯烷酮和/或聚乙烯醇混合，并進(jìn)行壓片或膠囊化，從而進(jìn)行常規(guī)施用。作為另選，本發(fā)明的化合物可以溶于鹽水、水、聚乙二醇、丙二醇、羧甲基纖維素膠體溶液、乙醇、玉米油、花生油、棉花籽油、芝麻油、黃蓍膠和/或各種緩沖液中。其他助劑和施用模式是藥物領(lǐng)域中公知的。載質(zhì)或稀釋劑可以包括時延材料，如單硬脂酸甘油酯或二硬脂酸甘油酯(獨用或與蠟混合)，或本領(lǐng)域公知的其他材料。本發(fā)明的優(yōu)選實施方式包括以下(1)～(15)方面：(1)通式(II)的化合物或其鹽，其中：R1為氫原子、鹵原子或可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-6烷基，R2為可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-6脂肪族基團(tuán)，X表示-O-、-S-、-S(O)-、-S(O)2-、-NH-、-C(O)-或-CH2-，Y1、Z1、Y2、Z2和Y3獨立地表示-CH-或-N-，和W表示-O-、-S-、-NH-或-C(O)-。(2)如第(1)方面所述的通式(II)的化合物或其鹽，其中：R1為鹵原子或可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-6烷基，R2為可選地取代有一個或多個鹵原子的C2-6烷基，Y2、Z1和Z2表示＝CH-，且Y2表示＝N-，和W表示-O-。(3)如第(1)方面所述的通式(II)的化合物或其鹽，其中：R1為鹵原子或可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-6烷基，R2為可選地取代有一個或多個鹵原子的C2-6烷基，Y2、Z1和Y2表示＝CH-，且Z2表示＝N-，和W表示-O-。(4)如第(1)方面所述的通式(II)的化合物或其鹽，其中：R1為鹵原子或可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-6烷基，R2為可選地取代有一個或多個鹵原子的C2-6烷基，Y1、Z1、Y2和Z2表示＝CH-，和W表示-O-。(5)如第(1)～(4)方面中任一方面所述的通式(II)的化合物或其鹽，其中：R1為氯原子或可選地取代有一個或多個鹵原子的C1-3烷基，R2為可選地取代有一個或多個鹵原子的C2-4烷基，Y3表示-CH-，和W表示-O-。(6)如第(1)～(5)方面中任一方面所述的通式(II)的化合物或其鹽，其中，所述化合物由式(IIa)表示：(7)如第(1)～(5)方面中任一方面所述的通式(II)的化合物或其鹽，其中，所述化合物由式(IIb)表示：(8)如第(6)或(7)方面所述的通式(II)的化合物或其鹽，其中：R1為氟原子、氯原子或甲基，R2為乙基或正丙基，X表示-O-、-S-或-CH2-，Y1、Z1、Y2、Z2和Y3表示-CH-，和W表示-O-。(9)如第(1)～(8)方面中任一方面所述的通式(II)的化合物或其鹽，其用于治療人或動物體。(10)如第(1)～(8)方面中任一方面所述的通式(II)的化合物或其鹽，其用于治療或預(yù)防神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病。(11)如第(1)～(8)方面中任一方面所述的通式(II)的化合物或其鹽在第(10)方面中的應(yīng)用，其中，神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病選自由老年癡呆、阿爾茨海默癥、皮克氏病、亨廷頓舞蹈癥、腦小腦退變、家族性黑朦性癡呆(神經(jīng)元脂質(zhì)沉積)、腦白質(zhì)病變、家族性肌陣攣性癲癇和威爾遜氏病(肝豆?fàn)詈俗冃浴⑹?韋二氏假性硬化)組成的組。(12)如第(1)～(8)方面中任一方面所述的通式(II)的化合物或其鹽在第(10)方面中的應(yīng)用，其中，神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病選自由下述疾病組成的組：震顫性麻痹(帕金森氏癥)、變形性肌張力障礙(扭轉(zhuǎn)痙攣)、蒼白球黑質(zhì)色素變性病和其他受限的運動障礙、家族性震顫和痙攣性斜頸、腦小腦退變和脊髓小腦退變(弗里德利希共濟(jì)失調(diào)、馬里氏遺傳性共濟(jì)失調(diào))、肌萎縮性側(cè)索硬化癥、進(jìn)行性腓骨肌萎縮、惡質(zhì)病和肌肉減少癥、進(jìn)行性延髓麻痹、原發(fā)性側(cè)索硬化、小兒肌萎縮(Werdnig-Hoffmann病)、家族性進(jìn)行性肌萎縮的其他形式(包括Wohlfart-Kugelberg-Welander綜合征)、遺傳性痙攣性截癱、進(jìn)行性神經(jīng)性肌萎縮、腓骨肌萎縮(Charcot-Marie-Tooth)和肥大性間質(zhì)性神經(jīng)病(Dejerine-Sottas)、慢性進(jìn)行性神經(jīng)病的雜癥形式、遺傳性視神經(jīng)萎縮(利伯氏病)、與年齡相關(guān)的黃斑變性和視網(wǎng)膜的色素變性(色素性視網(wǎng)膜炎)。(13)如第(1)～(8)方面中任一方面所述的通式(II)的化合物或其鹽，其用于第(10)方面所述的應(yīng)用，其中，神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病選自由抑郁癥和精神分裂癥組成的組。(14)一種藥物組合物，其包含治療有效量的第(1)～(8)方面中任一方面所述的通式(II)的化合物或其鹽作為活性成分。(15)如第(14)方面所述的藥物組合物，其中，所述藥物組合物為口服劑型。以下實施例僅僅為了描述本發(fā)明。實施例實施例1：結(jié)合測定1.1.材料和方法p38為了檢驗化合物1～12的抑制性，進(jìn)行了體外激酶測定。在最終體積為30μl的激酶緩沖液(Hepes60mMpH7.5、MgCl23mM、MnCl23mM、原釩酸鈉3μΜ、DTT1.2mM)中，將純化的重組激活p38α(10nM)(ProQinase)與濃度為1μΜ～100μΜ的所研究的化合物在30℃一式兩份預(yù)溫育10分鐘。預(yù)溫育后，添加肽底物(SignalChem#PQ3-58)和ATP至最終濃度分別為10μΜ和100μΜ，然后在30℃溫育40分鐘以進(jìn)行激酶反應(yīng)。使用ADP-GloTM(Promega#V9101)分析磷酸化作用，并使用BMGFluostar酶標(biāo)儀測量發(fā)出的光。JNK為了檢驗化合物1～12的抑制性，進(jìn)行了體外激酶測定。在最終體積為30μl的激酶緩沖液(Hepes60mMpH7.5、MgCl23mM、MnCl23mM、原釩酸鈉3μΜ、DTT1.2mM)中，將純化的重組激活JNK(10nM)(ProQinase)與濃度為1μΜ～100μΜ的所研究的化合物在30℃一式兩份預(yù)溫育10分鐘。預(yù)溫育后，添加肽底物(SignalChem#PQ3-58)和ATP至最終濃度分別為10μΜ和100μΜ，然后在30℃溫育40分鐘以進(jìn)行激酶反應(yīng)。使用ADP-GloTM(Promega#V9101)分析磷酸化作用，并使用BMGFluostar酶標(biāo)儀測量發(fā)出的光。Thp1：TNF-α分泌受人單核細(xì)胞系THP-1的抑制以對數(shù)期生長的THP-1細(xì)胞通過離心收集，并再懸浮于RPMI1640(SigmaAldrich)中至最終細(xì)胞濃度為2×106個細(xì)胞/ml。將細(xì)胞在24孔板(BDBiosciences)中鋪板。向培養(yǎng)基中添加化合物的二甲亞砜(DMSO)稀釋液至最終的濃度M。最終的DMSO濃度為0.5％。將0.1～50懸浮液的細(xì)胞在5％CO2潮濕氣氛中用化合物在37℃預(yù)溫育1小時，然后添加LPS(SigmaAldrich,L2654)至ag/ml。然后，將細(xì)胞溫育3小時，隨后在2℃通過離心將細(xì)胞沉淀進(jìn)行最終濃縮。將細(xì)胞上清液儲存在4℃直至分析人TNF-α含量。利用ELISA(TNFBiotrak,GEHealthcare)按照制造商的說明來確定TNF-α水平。對于各個測試的化合物濃度計算抑制百分率，并計算各個化合物的IC50。p38/JHK抑制劑保護(hù)SHSY5Y細(xì)胞免受活化THP-1毒性上清液的影響將SH-SY5Y細(xì)胞系擴(kuò)展并保持在具有10％FBS、2mM谷氨酰胺和抗生素的DMEM中。如先前公開的那樣(Gimenez-Cassina等,·J.Neurosci.Res；2006)，將細(xì)胞分化。簡言之，將7×103個細(xì)胞/cm2播種在涂布有MatrigelBasement的培養(yǎng)24孔板上，并使其附著過夜。然后使細(xì)胞接觸10μM視黃酸5天。然后，將細(xì)胞在具有B27、2mMGlutamaxI、2mMdbAMPc、20mMKCl,50ng/mlhBDNF和抗生素的Neurobasal培養(yǎng)基中培養(yǎng)另外5天。同時，將人單核細(xì)胞THP-1細(xì)胞播種在24孔板(2×106個細(xì)胞/ml)的Neurobasal培養(yǎng)基(不具有血清)中，并在有或無刺激劑LPS(1gml)和IFNα(333U/ml)下溫育24小時。溫育后，對培養(yǎng)物進(jìn)行離心，并將上清液轉(zhuǎn)移到分化的SH-SY5Y細(xì)胞中。隨后將細(xì)胞在有或無抑制劑下溫育另外的72小時。處理后，用CellTiterGlo試劑盒(Promega)評價細(xì)胞的活力，并用BMGFluostar酶標(biāo)儀測量發(fā)光。使用來自非受激THP-1細(xì)胞的上清液作為高對照。1.2結(jié)果測定在10μM和1μΜ下進(jìn)行。將收集的結(jié)果匯總在下表1和2中。因此，所有測試的化合物1～12均是p38和JNKMAP激酶的有效抑制劑。實施例2：在雄性SpragueDawley大鼠中的單劑量腹膜內(nèi)和靜脈內(nèi)血腦障壁穿透性研究這些測試的目的是確定在單劑量腹腔(i.p.)和靜脈(i.v.)施用后化合物1在雄性SpragueDawley大鼠中的血漿和腦濃度。2.1實驗程序?qū)嶒炘O(shè)計匯總于下表3中。表3：實驗設(shè)計2.2測試化合物施用化合物1經(jīng)尾靜脈進(jìn)行靜脈施用(i.v.)，在腹腔內(nèi)進(jìn)行腹腔施用(i.p.)。在對各個動物給藥后，記錄時間。在整個研究期間內(nèi)觀察所有動物在藥物施用后表現(xiàn)出的任何異常行為信號。制劑詳情化合物1的重量：30.14mg制劑載質(zhì)：20體積％Cremophore、10體積％乙醇、70體積％生理鹽水制劑載質(zhì)的體積：6.028ml2.3生物分析研究設(shè)計使用符合目的的LC-MS/MS法進(jìn)行生物分析，對血漿樣品和大腦均漿中的測試化合物進(jìn)行定量。該方法經(jīng)由9個非零校準(zhǔn)標(biāo)樣與雙空白和零標(biāo)樣組成的校準(zhǔn)曲線驗證是有效的。研究樣品與兩套質(zhì)量控制樣品(6個QC樣品；低、中等和高QC樣品)一起分析。2.4樣品采集詳情—血液抗凝劑：肝素鋰管采集部位：血液：頸靜脈插管樣品大?。杭s0.25ml～0.30ml血液樣品處理：將血液樣品在離心之前置于冰上，并在15分鐘內(nèi)于4℃以5000rpm離心10分鐘樣品儲存：CondPlasma樣品立即儲存在-80±10℃直至進(jìn)行生物分析2.5樣品采集詳情——大腦樣品采集過程在采血后，立即使用冷鹽水原位進(jìn)行腦灌注。將大鼠的胸部暴露，將腹主動脈夾緊，并切斷兩個頸靜脈。通過插入左心室而進(jìn)行心臟內(nèi)灌注。各個大鼠的灌注后進(jìn)行放血，以便于采集大腦。切開顱骨上的皮膚并使之彎轉(zhuǎn)。將頭部彎曲，并在枕骨大孔和環(huán)椎的接點處切穿肌肉和脊髓。使用剔骨刀在顱骨中小心作出圓周切口。升起顱骨頂以露出腦膜和大腦。小心地移除腦膜。然后降頭部保持為鼻子向上，提起大腦前部以分離大腦。分離出的大腦即刻進(jìn)行稱重，并在-80±10℃冷凍直至均質(zhì)化。樣品儲存條件將大腦樣品立即適當(dāng)在-80±10℃直至生物分析。大腦均質(zhì)化將大腦樣品在冰上解凍。添加適當(dāng)體積的冰冷均質(zhì)化介質(zhì)(生理鹽水)。使用均質(zhì)器在冰上對大腦樣品均質(zhì)化，并用均質(zhì)化介質(zhì)調(diào)節(jié)體積以實現(xiàn)1g大腦/5ml均漿。均質(zhì)化后，將大腦均漿即刻冷凍在-80℃直至分析。2.6結(jié)果分析結(jié)果匯總在下表4和5中：表4：大鼠血漿和大腦均漿(i.v.)中2h時的濃度表5：大鼠血漿和大腦均漿(i.p.)中2h時的濃度因此，上述結(jié)果顯示了化合物1具有優(yōu)異的血腦穿透性。由此，此化合物以及本發(fā)明的其他結(jié)構(gòu)相關(guān)化合物能夠使p38α和JNKMAP激酶到達(dá)腦和神經(jīng)組織中。實施例3：測試化合物1對抗大鼠體內(nèi)Aβ25-35淀粉樣肽誘發(fā)的毒性的保護(hù)性質(zhì)的分析本研究的目的是為了確定測試化合物1是否能夠減輕大鼠中因急性腦室內(nèi)(i.c.v)注射Aβ25-35寡聚肽制劑而產(chǎn)生的病理學(xué)。化合物功效在施用肽后7天進(jìn)行評價：-Aβ25-35誘發(fā)的學(xué)習(xí)缺陷的減弱(認(rèn)知長期記憶:新物體認(rèn)知)；-Aβ25-35誘發(fā)的大鼠海馬體中的Aβ1-42積聚的減弱。檢驗了一種施用程序：在9天中每天經(jīng)靜脈(i.v.)施用化合物1(10mg/kg)一次。3.2過程和材料動物和治療組使用36只雄性SpragueDawleyRjHan:SD大鼠(230～260g)。以下述方式構(gòu)成3個動物組，每組n＝12：數(shù)量1.Sc.Aβ+載質(zhì)(i.v.)122.Aβ25-35+載質(zhì)(i.v.)123.Aβ25-35+化合物1(10mg/kg，i.v.)12總計36第0天，于上午9:00i.c.v.施用Aβ25-35(寡聚，9nmol)或亂序Aβ25-35肽對照(Sc.Αβ,9nmol)。第0天至第9天，于上午9:30i.v.施用化合物1或載質(zhì)，每天1次。第8天和第9天，使用新物體認(rèn)知(NOR)程序評價動物的認(rèn)知長期記憶。在第7天進(jìn)行馴化(無物體階段)。第10天，殺死所有動物，并剖出額葉皮質(zhì)和海馬體。使用一個海馬體進(jìn)行Aβ1-42含量的ELISA分析。制劑所有溶液均是各次施用前新鮮制備的。載質(zhì)是5％乙醇(Fluka)、20％Cremophor(參考號C-5135，批次32H0925，Sigma-Aldrich)的生理鹽水溶液，并且以2.5mg/ml施用。處理組的制備如下：組1、2：載質(zhì)溶液(蒸餾水)組3：化合物1，2.5mg/ml。淀粉樣β肽Aβ25-35■命名：淀粉樣-β蛋白(25-35)，人、小鼠、大鼠■CAS:131602-53-4■提供商：Polypeptides(法國)■參考號：SC489■批次：AW13285A■分子量：1060.28■儲存溫度：-20℃■外觀：白色粉末Sc.Aβ■命名：亂序淀粉樣-β蛋白(25-35)，人、小鼠、大鼠■CAS:NA■提供商：Polypeptides(法國)■參考號：SC942■批次：AW13157A■分子量：1060.26■儲存溫度：-20℃■外觀：白色粉末肽制備和注射使用立體定向法，使大鼠接受Aβ25-35肽的雙側(cè)i.c.v注射(2×5nmol/側(cè))，或Sc.Aβ的雙側(cè)i.c.v注射(2×5nmol/側(cè))。通過肌肉內(nèi)注射0.2ml鹽酸氯胺酮(80mg/kg體重)和甲苯噻嗪(10mg/kg體重)的混合物，使動物麻醉。然后將其固定在立體定向架(David.Kopf)上，露出其頭骨，用H2O2清潔，并在立體定向坐標(biāo)AP:-1mm和L:±1.5mm處鉆孔。然后在V:-3.5mm處進(jìn)行雙側(cè)注射(2×5μl)至側(cè)腦室。然后將皮膚縫合，并用10％碘伏溶液(AstaMedica)清潔。Aβ25-35肽的均質(zhì)化寡聚制備根據(jù)AMYLGEN自有的程序進(jìn)行。測試化合物和/或載質(zhì)溶液的施用■途徑：i.v.，至尾靜脈中■頻率：每天一次，上午10:00■治療時長：9天，從第0天(注射肽后即刻開始)至第8天(NOR階段2前兩小時)動物將來自Janvier(SaintBerthevin,法國)的體重230～260g的雄性SpragueDawley大鼠裝籠喂養(yǎng)，并且在蒙彼利埃大學(xué)動物設(shè)施樓2中進(jìn)行實驗(CECEMA,獸醫(yī)局協(xié)議#B-34-172-23)。將動物分組裝籠，每組3只，除了在行為實驗中，使其隨意接觸水和食物。將其在溫度和濕度受控的動物設(shè)施中喂養(yǎng)，光/暗周期為12h/12h(下午7:00熄燈)。通過使用永久性標(biāo)識標(biāo)記其尾部，來對大鼠進(jìn)行編號。所有動物程序在嚴(yán)格遵守EUDirective86/609(根據(jù)判決87-848和2001-464修改)下進(jìn)行。治療和動物的隨機(jī)化動物治療進(jìn)行隨機(jī)化。所有藥物注射每天一次，由未參與行為實驗的人員進(jìn)行。死亡率急性和延遲死亡率每天進(jìn)行檢查。一個動物在立體定向手術(shù)后死亡。沒有動物在i.v.治療期內(nèi)死亡。3.3行為和生化分析新物體認(rèn)知階段1：在注射肽后的第7天，將大鼠分別置于正方形開放場(100cmx100cmx50cm高)中，該開放場由白色樹脂玻璃制成，地板裝備有紅外光發(fā)射二極管。在10分鐘階段內(nèi)使大鼠習(xí)慣該開放場。階段2：在注射肽后的第8天，將兩個相同的物體(50ml的帶蓋塑料瓶)放在指定的位置(開放場的一條對角線的1/4和3/4處)。將各個大鼠放入開放場中，并在10分鐘階段內(nèi)記錄探索性活動。使用程序(觀點)分析在與物體接觸的次數(shù)和接觸時長方面的活動。開放場和物體在兩次實驗之間使用50％乙醇溶液清潔。階段3：在第9天，將位置1處的物體更換為新物體(軟塑料椅腳保護(hù)墊)，其顏色、形狀和質(zhì)地與已熟悉的物體不同。將各個大鼠再次放入開放場中，并在10分鐘階段內(nèi)記錄探索性活動。以相似方式分析活動。計算與位置1的物體接觸的次數(shù)(或時長)/與兩個物體接觸的總次數(shù)(或時長)的比例，作為偏愛探索指數(shù)。認(rèn)為在階段2中表現(xiàn)出不與一個物體接觸或與一個物體接觸小于10次的動物是未令人滿意地探索各個相同的物體，并將其排除在計算之外。由此，排除了5個動物。因此，損耗率為11.1％，這在該程序中保持為中等。動物的殺死和大腦采樣在行為實驗結(jié)束時，通過斬首殺死所有大鼠，并快速取出額葉皮質(zhì)和兩個海馬體，稱重并保持在液氮中直至測定。ELISA測定由每組中各個大鼠的一個海馬體組織制備樣品，并在對市售ELISA測定試劑盒有特異性的提取緩沖液中均質(zhì)化。所用的試劑盒：Αβ1-42：提供商USCN，參考號：SEA946Ra，批次號：L140311213。解凍后，將海馬體在50mMTris-150mMNaCl緩沖液(pH7.5)中均質(zhì)化，并進(jìn)行超聲處理20s。離心(16.100g，15分鐘，4℃)后，使用上清液，根據(jù)制造商的說明進(jìn)行Αβ1-42ELISA測定。讀取450nm的吸光度，并使用標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣品濃度。將結(jié)果表達(dá)為Αβ1-42(pg)/mg組織。所有樣品一式兩份進(jìn)行測定。蛋白質(zhì)濃度的測量使用PierceBCA(二喹啉甲酸)蛋白質(zhì)測定試劑盒(Pierce，參考號23227)進(jìn)行蛋白質(zhì)的定量化，從而評價提取性能并進(jìn)行歸一化。通過在0.9％NaCl(具有疊氮化鈉)的溶液(參考號：23209,Pierce)中如下的系列稀釋，從2mg/ml的牛血清白蛋白原液制得標(biāo)準(zhǔn)溶液：溶液A：2mg/ml，75μl原液溶液B：1mg/ml，50μl溶液A+50μlPBS溶液C：0.5mg/ml，50μl溶液B+50μlPBS溶液D：0.25mg/ml，50μl溶液C+50μlPBS溶液E：0.125mg/ml，50μl溶液D+50μlPBS溶液F：0.05mg/ml，10μl溶液C+90μlPB溶液G：0.025mg/ml，50μl溶液F+50μlPBS溶液H：100μlPBS(0mg/ml)將10μl的標(biāo)樣和樣品一式兩份添加到96孔板中(樣品將在PBS中稀釋5倍)。添加工作試劑，200μl/孔(試劑A+試劑B，比例50/1)，然后混合30s，隨后將板在37℃溫育30分鐘。測量562nm的吸光度。然后從標(biāo)準(zhǔn)曲線稀釋液計算出總蛋白質(zhì)濃度，并用于歸一化Elisa。統(tǒng)計分析將所有值表達(dá)為平均值±S.E.M。使用單向方差分析(F值)在不同條件下進(jìn)行統(tǒng)計分析，然后進(jìn)行Dunnett事后多項比較檢驗，并認(rèn)為p<0.05為統(tǒng)計學(xué)顯著的。將新物體數(shù)據(jù)(與2號物體或新物體的偏愛接觸，以接觸次數(shù)或時長計算)表達(dá)為平均值±S.E.M，并對于各個治療組使用單向方差分析和單樣本t檢驗(相對于“無偏愛”級別，50％)進(jìn)行分析。3.4結(jié)果和討論新物體認(rèn)知該程序通常是高損耗程序，因為動物必須在兩個階段中與兩個物體均有互動才能囊括在計算中。在階段2中，在探索兩個相同物體時表現(xiàn)出極度的位置偏好的動物(Pref>90％或<10％)將排除在外。在該研究中，4只動物由此被排除，這表示損耗率為11％。它們分布在三個實驗組的兩個中，表明與特定的治療沒有關(guān)聯(lián)。收集的實驗結(jié)果匯總于圖1a～1d的圖示中。這些圖示描繪了化合物1在用于新物體認(rèn)知測試的大鼠中于Αβ25-35注射后8～9天的效果：在(a)中以在閉合臂花費的時間/在開放臂花費的時間表示位置偏愛；在(b)中以進(jìn)入閉合臂的次數(shù)/進(jìn)入開放臂的次數(shù)表示位置偏愛。*p<0.05，***p<0.001，相對于無偏愛級別(50％)；單樣本t檢驗；Alk3a12代表用化合物1治療的組。使用與物體的接觸次數(shù)(圖1a)或接觸時長(圖1b)計算出的階段2的物體偏愛對于所有組而言均為約50％，明顯的例外是經(jīng)Αβ25-35/化合物1處理的組，其顯著高于50％。事實上，兩只動物顯示出對于2號物體的非常高(>65％)的偏愛。階段3中的新物體偏愛顯示出，經(jīng)Sc.Αβ/Veh處理的動物表現(xiàn)了對新物體的顯著偏愛，無論是接觸次數(shù)(圖1c)還是接觸時長(圖1d)均是如此。經(jīng)Αβ25-35/Veh處理的動物未能顯示出對于新物體的任何偏愛(圖1c、1d)?；衔?的治療減輕了損傷，因為兩種參數(shù)均表現(xiàn)為與50％水平非常顯著不同(圖1c、1d)。Αβ1-42水平的ELISA測量經(jīng)Sc.Αβ/Veh處理的對照大鼠的海馬體中的Αβ1-42水平據(jù)估算為約1.2pg/mg組織。Αβ25-35誘發(fā)的毒性誘發(fā)了+158％的Αβ1-42組織含量的顯著增大(圖2)。圖2顯示了在Αβ25-35注射后9天，在用化合物1治療的大鼠海馬體中的Αβ1-42含量。Veh：載質(zhì)溶液；**p<0.01，相對于Sc.Αβ/Veh，Dunnett檢驗；Alk3a12代表用化合物1治療的組。用化合物1治療動物降低了Αβ1-42水平的增大，因為數(shù)據(jù)并沒有與Sc.Αβ/Veh處理組的值顯著不同(圖2)。注意到較高的測試內(nèi)差異，導(dǎo)致數(shù)據(jù)的明顯分散。當(dāng)前第1頁1 2 3