本發(fā)明涉及用于保護(hù)免于腸細(xì)菌感染的活疫苗。

發(fā)明背景

說明書中對任何現(xiàn)有技術(shù)的引用并非是承認(rèn)或表明了本技術(shù)形成任何管轄區(qū)中公知常識的一部分或本技術(shù)可合理地預(yù)期被本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解、被認(rèn)為是相關(guān)的，和/或與現(xiàn)有技術(shù)的其他部分進(jìn)行組合。

非傷寒沙門氏菌(Nontyphoidal Salmonella)是美國最大的食源性疾病負(fù)擔(dān)，其導(dǎo)致最多的感染、住院和死亡，具有每年報告的103萬例疾病。與疾病相關(guān)的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)是驚人的，而僅醫(yī)療開銷就達(dá)到每年110億美元，且通過食品工業(yè)(召回、訴訟、降低消費者信心)和通過州、地方和聯(lián)邦公共衛(wèi)生機(jī)構(gòu)響應(yīng)NTS爆發(fā)產(chǎn)生大量額外費用。在全球范圍，非傷寒沙門氏菌估計為9,380萬例且每年死亡15.5萬，并已經(jīng)成為撒哈拉以南的非洲(sub-Saharan Africa)中菌血癥的主要原因，其中其致死率達(dá)到多至25％。

隨著抗生素的長期施用已經(jīng)導(dǎo)致在世界范圍內(nèi)傳播的多藥抗性菌株的出現(xiàn)，與沙門氏菌相關(guān)的健康和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)可能會惡化；例如，鼠傷寒沙門氏菌DT104在過去二十年已引起了數(shù)起食源性疾病爆發(fā)，并且對獸藥中五種最常用的抗生素中的四種(四環(huán)素、β-內(nèi)酰胺、氨基糖苷和磺酰胺)有抗性。這些多藥抗性菌株常常與更多的住院和菌血癥相關(guān)，并且它們在自然中的維持可以通常在包括地下水的環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的非常低的抗生素濃度發(fā)生。此外，在2009年從患者中分離出了一種新類型的碳青霉烯抗性腸桿菌科，其對于β-內(nèi)酰胺、氟喹諾酮類和氨基糖苷類有抗性，并且這種抗性現(xiàn)在表現(xiàn)出在革蘭氏陰性病原體(包括沙門氏菌)中的廣泛分布。此外，最近(2012)從源自牲畜的天然微生物群體中已分離出“超毒力(hypervirulent)”沙門氏菌。這些超毒力菌株的毒力是大多數(shù)臨床分離株的100倍，更易殺死免疫接種的動物，且由于離體快速轉(zhuǎn)變?yōu)檩^低毒力狀態(tài)以致在標(biāo)準(zhǔn)實驗室測試條件下檢測不到?？傊@些發(fā)現(xiàn)支持這樣的觀點，即沙門氏菌疾病負(fù)擔(dān)隨著更具毒力的多藥抗性菌株的潛在出現(xiàn)而將惡化，所述菌株難以使用目前可獲得的抗生素加以控制。

腸沙門氏菌(Salmonella enterica)經(jīng)由糞-口途徑獲得且包含6個亞種，其基于糖、脂多糖(LPS)和鞭毛組成細(xì)分為超過2500個血清型(血清學(xué)變體)，其中腸亞種包含超過99％的人致病性分離株。腸沙門氏菌感染可導(dǎo)致任何下述四種不同的疾病綜合征：小腸結(jié)腸炎/腹瀉、菌血癥、腸(傷寒)發(fā)熱和慢性無癥狀攜帶。多種血清型感染人和動物兩者，且疾病的嚴(yán)重性是血清型、菌株毒力和宿主易感性的函數(shù)。

對牲畜中的沙門氏菌屬控制的努力由于下述原因持續(xù)性存在問題：1)大多數(shù)牲畜感染是亞臨床的；2)疾病爆發(fā)是零星的且經(jīng)常由特定血清型引起，盡管許多血清型是牲畜生產(chǎn)系統(tǒng)特有的；3)環(huán)境持續(xù)性為牲畜感染提供了持續(xù)性的儲存；4)最近出現(xiàn)了更具毒力和可以殺死接種動物的菌株變體；5)一些源自人沙門氏菌病患者的菌株與動物來源的那些不同；和6)管理和環(huán)境事件可增加病原體暴露和/或損害宿主免疫力。

接種代表任何食品安全計劃的可持續(xù)性方法，其在食品生產(chǎn)鏈的開始減少病原體暴露[1]。然而，由常規(guī)疫苗賦予的免疫力受限于狹窄范圍的密切相關(guān)菌株，并且農(nóng)場上(on-farm)的控制需要開發(fā)引發(fā)針對多種病原性血清型的保護(hù)的疫苗[1]。最近的進(jìn)展已經(jīng)導(dǎo)致修飾的活沙門氏菌屬交叉保護(hù)疫苗的開發(fā)，其中許多包含有利于抗原生產(chǎn)的全球調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中的突變；并且也適合于異源抗原的表達(dá)[2-6]。交叉保護(hù)疫苗效力的分子基礎(chǔ)尚未完全清楚。相關(guān)參數(shù)可包括：病原性血清型中共享的多個抗原的表達(dá)；減少的疫苗誘導(dǎo)的免疫抑制；靶向去除免疫顯性抗原以暴露交叉保護(hù)表位；重組抗原的III型分泌；和/或用于免疫響應(yīng)的增強(qiáng)刺激的延遲疫苗減毒([1,3,7,8]中進(jìn)行了綜述)。

在基因中攜帶功能缺失突變的修飾的活減毒腸沙門氏菌鼠傷寒血清型可用于提供針對沙門氏菌的多樣性的保護(hù)?？煽紤]用于提供可應(yīng)用的功能缺失突變的基因座的數(shù)目是龐大的，如在每個基因座可應(yīng)用的突變數(shù)目般。用于提供功能缺失的基因座的一些實例包括涉及細(xì)菌的粘附、侵入和細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外存活的基因座(包括編碼參與代謝過程的蛋白的多種基因)。編碼DNA腺嘌呤甲基化酶(dam)的基因的一些突變能夠引起針對沙門氏菌的多樣性的保護(hù)。當(dāng)作為修飾的活疫苗在小鼠[2,9]、家禽[10,11]、綿羊[12]和小牛[13-15]中應(yīng)用時，這些看起來被充分耐受。免疫力的誘導(dǎo)是快速的，且疫苗可以低成本和牲畜群體的低應(yīng)激免疫以經(jīng)由飲用水的遞送施用[12,16]。

任何疫苗的商業(yè)成功取決于治療指數(shù)、安全性/毒力的比率，且安全性對于具有回復(fù)至升高毒力的潛力的修飾的活疫苗是特別關(guān)注的。一般而言，疫苗應(yīng)滿足4個安全類別才能被考慮作為牲畜生產(chǎn)系統(tǒng)中商業(yè)用途的候選。相關(guān)的安全性表型如下：減少的i)疫苗脫落；ii)激發(fā)株脫落；iii)在全身組織(肝/脾)中的持續(xù)性；和iv)在環(huán)境中的持續(xù)性。

理解的是在提供包含功能缺失突變的減毒株中，重要的是由相關(guān)突變產(chǎn)生的改進(jìn)的安全性概貌就其提供的保護(hù)而言不減少疫苗效力。最終，尋找的是其不減少免疫的個體中低水平感染的持續(xù)性且當(dāng)病原體從免疫動物脫落并釋放到環(huán)境中時不增加免疫原在環(huán)境中的持續(xù)性的突變。

難以預(yù)測哪些功能缺失突變在減毒中比其他更有效，特別是考慮到與每個基因座和突變相關(guān)的效力和回復(fù)到病原性的數(shù)據(jù)產(chǎn)生自不同的實驗室系統(tǒng)。

另一復(fù)雜性是希望選擇多于一個基因座用于突變，使得在至少一種功能缺失突變丟失時防止回復(fù)到病原性表型。這樣的方法需要組合來自大量候選基因座的至少2個基因座，然而對于特定組合是否可能增加或減少回復(fù)的可能性或可能增加或降低所得的減毒疫苗的效力仍僅有有限指導(dǎo)。

對于用于保護(hù)針對沙門氏菌屬感染的減毒活疫苗存在需要。

對于具有改進(jìn)的安全性表型的用于保護(hù)針對沙門氏菌屬感染的減毒活疫苗也存在需求。

對于具有有限的或沒有從動物脫落的傾向、當(dāng)從動物脫落時在環(huán)境中具有最小持續(xù)性，且在動物中保持可接受水平的持續(xù)性以引起免疫力的減毒活疫苗存在需求。

發(fā)明概述

本發(fā)明尋求改善或解決上述一個或多個問題、限制或需要，且在一個實施方案中提供了腸細(xì)菌，其包含：

-編碼DNA腺嘌呤甲基化酶的基因(本文稱為dam)中的第一功能缺失突變和

-選自下組的基因中的第二功能缺失突變：sifA、spvB和mgtC。

在另一實施方案中提供了疫苗，其包含：

-如上文所述的腸細(xì)菌；和

-載劑、稀釋劑、賦形劑或佐劑。

在另一實施方案中提供了預(yù)防或治療細(xì)菌性腸疾病或病況的方法，其包括下述步驟：將如上文所述的疫苗提供給其待預(yù)防或治療細(xì)菌性腸疾病或病況的個體。

在另一實施方案中提供了用于產(chǎn)生適用于預(yù)防或治療細(xì)菌性腸疾病或病況的疫苗的免疫原集合的方法，其包括：

-提供具有dam中的功能缺失突變的腸細(xì)菌，

-將功能缺失突變引入選自下組的細(xì)菌基因：sifA、spvB和mgtC。

在另一實施方案中提供了用于產(chǎn)生適用于預(yù)防或治療細(xì)菌性腸疾病或病況的疫苗的免疫原集合的方法，其包括：

-提供具有選自下組的功能缺失突變的腸細(xì)菌：sifA、spvB和mgtC，

-將功能缺失突變引入所述細(xì)菌的dam基因。

附圖簡述

圖1.評估用于菌落化的沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物和在粘膜和全身組織中的持續(xù)性。用鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232雙突變疫苗候選物(dam aroA[MT3138],dam htrA[MT3142],dam mgtC[MT3146],dam sifA[MT3150],dam spiC[MT3154],dam spvB[MT3158],dam ssaV[MT3162])或親本UK-1damΔ232疫苗株(MT3134)(10⁹CFU)口服免疫BALB/c小鼠。在口服免疫后第2周(A)和第4周(B)，評估了從派爾集合淋巴結(jié)(Peyer’s patches，PP)、腸系膜淋巴結(jié)(mesenteric lymph nodes，MLN)、肝(L)和脾(S)回收的細(xì)菌在LB培養(yǎng)基上的集落形成單位(CFU)。檢測限制：PP、MLN、脾<100CFU；肝<50CFU。

圖2.沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物的同源菌株效力評估。用鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232雙突變疫苗候選物(dam aroA[MT3138],dam htrA[MT3142],dam mgtC[MT3146],dam sifA[MT3150],dam spiC[MT3154],dam spvB[MT3158],dam ssaV[MT3162])或親本UK-1 damΔ232疫苗株(MT3134)(10⁹CFU)口服免疫BALB/c小鼠。免疫后11周，用200LD₅₀口服劑量的同源菌株、野生型鼠傷寒沙門氏菌UK-1(χ3761)激發(fā)接種的小鼠。未免疫的對照小鼠在感染后第21天全部死亡。毒力激發(fā)存活的小鼠比例的差異使用邏輯回歸分析(Genstat第15版[34])。接種提供顯著的保護(hù)(P<0.01)。相比親本dam疫苗，通過將并入次級缺失mgtC、sifA和spvB的dam疫苗提供了相似的保護(hù)。引入次級缺失aroA、htrA、spiC和ssaV后觀察到dam疫苗效力的顯著減少(**P<0.01；***P<0.001)。

圖3.沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物的異源交叉保護(hù)效力評估。用鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232雙突變疫苗候選物(dam mgtC[MT3146],dam sifA[MT3150],dam spvB[MT3158]；10⁹CFU)口服免疫BALB/c小鼠(16-25只每窩)。免疫后11周，用100LD₅₀口服劑量的與畜牧業(yè)臨床相關(guān)的異源沙門氏菌屬血清型(都柏林沙門氏菌8895[牛]、病牛沙門氏菌225[羊]、鼠傷寒沙門氏菌131[羊])激發(fā)接種的小鼠。未免疫的對照小鼠在感染后第21天全部死亡。毒力激發(fā)存活的小鼠比例的差異使用邏輯回歸分析(Genstat第15版[34])。用并入了次級缺失mgtC、sifA和spvB的每種dam疫苗的接種提供了針對所評估的同源和異源激發(fā)株的顯著保護(hù)(***P<0.001)。

圖4.沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物中疫苗安全性評估(回復(fù)至2-AP抗性)。用10⁵CFU的鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232雙突變疫苗候選物(dam mgtC[MT3146],dam sifA[MT3150],dam spvB[MT3158])或dam UK-1親本疫苗株[MT3134]腹膜內(nèi)感染BALB/c小鼠。在感染后第5天計數(shù)了脾(A)或肝(B)中2-AP敏感(開放框)或2-AP抗性(封閉框)沙門氏菌屬生物的數(shù)目。0CFU值表示其中脾和肝中的細(xì)菌載荷低于檢測限(<25CFU)的小鼠數(shù)目。鼠傷寒沙門氏菌UK-1 dam雙突變疫苗的持續(xù)性(2-AP^s)和回復(fù)至提高毒力(2-AP^r)相比親本沙門氏菌屬damΔ232疫苗株的統(tǒng)計學(xué)顯著性使用方差分析確定(*P<0.05)。

圖5.沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物的疫苗糞便脫落評估。

將鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232雙突變疫苗候選物dam mgtC(MT3183)、dam sifA(MT3184)、dam spvB(MT3186)和dam UK-1親本株(MT3180)的卡那霉素抗性衍生物用于通過口服途徑接種BALB/c小鼠(10⁹CFU)。在免疫后第2、4、7、11、14和21天從個體小鼠收集糞便并鋪板用于在卡那霉素50μg/ml LB平板上的CFU/g。使用REML重復(fù)測量分析對沙門氏菌屬dam雙缺失疫苗候選物對親本沙門氏菌屬damΔ232疫苗株的糞便脫落進(jìn)行了分析。免疫后疫苗和時間都是顯著的(*P<0.05)。不同雙缺失dam疫苗之間未觀察到糞便脫落的顯著差異。給出的值是接種后小鼠糞便中CFU/g的模型預(yù)測平均數(shù)。檢測的極限是60CFU。

圖6.使用沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物免疫的小鼠中激發(fā)株的糞便脫落。將鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232雙突變疫苗候選物dam mgtC(MT3183)、dam sifA(MT3184)、dam spvB(MT3186)和dam UK-1親本株(MT3180)的卡那霉素抗性衍生物用于通過口服途徑免疫BALB/c小鼠(10⁹CFU)。免疫后四周實現(xiàn)疫苗菌株糞便清除。免疫后11周，使用100LD₅₀劑量的野生型鼠傷寒沙門氏菌UK-1(MT2315；10⁷CFU)的卡那霉素抗性衍生物激發(fā)接種的小鼠。在免疫后第2、4、7、11、14和21天從個體小鼠收集糞便并鋪板用于在卡那霉素50μg/ml LB平板上的CFU/g。使用REML重復(fù)測量分析對激發(fā)免疫小鼠后野生型激發(fā)株的糞便脫落進(jìn)行了分析。免疫后疫苗和時間都是顯著的(*P<0.05)且存在時間和疫苗之間顯著相互作用的趨勢(P＝0.075)。逐對比較揭示了毒力激發(fā)后在不同時間組間的顯著差異；a＝雙缺失疫苗的脫落顯著小于親本dam疫苗的脫落；b＝dam sifA和dam spvB疫苗的脫落小于親本dam疫苗的脫落且dam sifA脫落顯著少于dam mgtC和dam spvB疫苗的脫落；c＝dam sifA和dam spvB疫苗的脫落顯著少于dam mgtC和dam spvB疫苗的脫落且dam spvB疫苗的脫落顯著少于dam mgtC疫苗的脫落；d＝dam sifA、dam spvB和dam mgtC疫苗的脫落顯著少于dam spvB疫苗的脫落。給出的值是激發(fā)后糞便中野生型激發(fā)株的模型預(yù)測的平均CFU。檢測限是60CFU。

圖7.沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物的環(huán)境疫苗持續(xù)性(去離子水)評估。

將鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232雙突變疫苗候選物dam mgtC(MT3183)、dam sifA(MT3184)、dam spvB(MT3186)和dam UK-1親本株(MT3180)的卡那霉素抗性衍生物用于接種20ml的去離子水(10⁴CFU/ml)。在具有松頂帽的50ml錐形管中在室溫實施一式三份測定。將樣品渦旋并在兩周期間在所示時間點鋪板用于CFU/ml。給出的值是具有誤差棒的平均CFU/ml，指示±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。使用REML重復(fù)測量分析對隨時間水中存在的CFU/ml數(shù)目進(jìn)行了分析。觀察到疫苗組和時間之間顯著的相互作用(P<0.001)。逐對比較揭示了在不同時間組之間的顯著差異(P<0.05)。a＝全部疫苗具有比親本UK-1野生型株低的CFU/ml；b＝damΔ232株的CFU/ml顯著少于dam mgtC、dam sifA和dam spvB株的CFU/ml；c＝damΔ232和dam spvB株的CFU/ml顯著少于dam sifA和dam mgtC株。

圖8.沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物的環(huán)境疫苗持續(xù)性(綿羊糞便)評估。通過添加20ml的去離子水至5g干綿羊糞便(來自Barbara Byrne,University of California,Davis的禮物；[32,33])生成20％的糞便干物質(zhì)。使用鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232雙突變疫苗候選物dam mgtC(MT3183)、dam sifA(MT3184)、dam spvB(MT3186)或dam UK-1親本株(MT3180)的卡那霉素抗性衍生物接種20％糞便干物質(zhì)(10⁴CFU/ml)。在具有松頂帽的50ml錐形管中在室溫實施一式三份測定。渦旋樣品并在兩周期間在所示時間點鋪板用于CFU/ml。給出的值是具有誤差棒的平均CFU/ml，表明±平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤(SEM)。使用REML重復(fù)測量分析對隨時間糞便中存在的CFU/ml數(shù)目進(jìn)行了分析。觀察到疫苗組和時間之間顯著的相互作用(P<0.001)。逐對比較揭示了在不同時間組之間的顯著差異(P<0.05)。除第1天和第6天在全部時間點全部疫苗株的CFU/ml小于親本UK-1野生型。a＝dam sifA顯著少于dam、dam mgtC和dam spvB；b＝dam sifA顯著少于dam和dam mgtC；c＝dam sifA顯著少于dam mgtC；d＝dam spvB顯著少于dam mgtC；e＝dam spvB顯著少于dam；f＝dam mgtC顯著少于dam。

實施方案的詳述

如上文所述，腸細(xì)菌疾病例如胃腸炎和以腹瀉、發(fā)熱和脫水為特征的其它病況仍為畜牧生產(chǎn)中的主要問題。沙門氏菌屬感染和沙門氏菌病為核心問題。至今，牲畜動物中預(yù)防或治療這些病況的所有嘗試僅獲得了有限的成功，這是由于疫苗的所包含的/受損的或有限的效價或包含的/受損的安全性概貌。特別引起關(guān)注的是從動物脫落并保持在環(huán)境中的疫苗。

激發(fā)已提供足夠穩(wěn)固的減毒細(xì)菌以便能夠在牲畜動物中保持，由此提供免疫性，并在糞便和更一般的環(huán)境(如飼養(yǎng)場或畜牧生產(chǎn)鏈的其他部分)中具有有限的脫落和持續(xù)的潛力。提供雙突變以預(yù)防回復(fù)至病原性表型的需要是額外的復(fù)雜性水平，特別是在已知非常大量的用于失活的候選基因的情況下。

本發(fā)明的發(fā)明人有興趣提供作為活免疫原有用的具有改進(jìn)的安全性概貌或表型的腸細(xì)菌(例如在減毒活疫苗中)，只要其具有更少回復(fù)至致病性表型的可能性、更少脫落的可能性和更少在環(huán)境中保持的可能性。從廣泛的潛在候選基因座列表中，本發(fā)明的發(fā)明人已鑒定了3個基因座，其可用于在dam失活菌株中引入功能缺失突變以提供具有合意的安全性概貌的減毒微生物，同時保持治療或保護(hù)免于寬范圍的腸細(xì)菌且特別是廣泛的沙門氏菌屬的效力。

A.定義

‘功能缺失突變’一般指完全或部分失活基因在給定生物過程中的相關(guān)功能的基因突變。感興趣的具體功能缺失突變是中斷宿主中腸細(xì)菌生命周期，同時不中斷細(xì)菌的免疫原性概貌的那些。

‘腸細(xì)菌’一般指腸或腸道的細(xì)菌。特別感興趣的是‘腸桿菌科(Enterobacteriaceae)’，其為包括病原體如沙門氏菌屬(Salmonella)、大腸桿菌(Escherichia coli)，鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis)，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)和志賀氏菌屬(Shigella)的革蘭氏陰性腸細(xì)菌的大家族。此家族中其他導(dǎo)致疾病的細(xì)菌包括變形菌屬(Proteus)、腸桿菌屬(Enterobacter)、沙雷氏菌屬(Serratia)和檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)。

‘沙門氏菌屬’是腸桿菌科的腸細(xì)菌。

‘dam’指編碼DNA腺嘌呤甲基化酶的基因，也稱為脫氧腺苷甲基化酶，DNA腺嘌呤甲基轉(zhuǎn)移酶或脫氧腺苷甲基轉(zhuǎn)移酶。鼠傷寒沙門氏菌dam基因登錄號的實例為NCBI登錄號：1255007。該基因的基因座標(biāo)簽是STM3484。

‘sifA’指編碼分泌的效應(yīng)蛋白SifA的基因。鼠傷寒沙門氏菌sifA基因的登錄號的實例為NCBI登錄號1252742。該基因的基因座標(biāo)簽是STM 1224。

‘spvB’指編碼沙門氏菌屬質(zhì)粒毒力蛋白B(SpvB)的基因。鼠傷寒沙門氏菌spvB基因登錄號的實例為NCBI登錄號1256199。該基因的基因座標(biāo)簽為PSLT039。

‘mgtC’指編碼Mg(2+)轉(zhuǎn)運ATP酶蛋白C，MgtC的基因。鼠傷寒沙門氏菌mgtC基因登錄號的實例為NCBI登錄號1255288。該基因的基因座標(biāo)簽為STM3764。

‘減毒的’例如在‘減毒細(xì)菌’中一般指減少細(xì)菌毒力但仍使其保持活力(或"活著")使得其能夠復(fù)制的細(xì)菌的修飾(盡管以較慢的速率或在不同的條件下)。減毒需要感染劑并將其改變使得其變?yōu)闊o害或較少毒力。通常，減毒基本上不減少相關(guān)細(xì)菌的免疫原性。

‘疫苗’一般指包含免疫原(即能夠引起免疫響應(yīng)的物質(zhì))的組合物。通常疫苗暴露至病原體時可用于免疫、預(yù)防或提供保護(hù)免于感染或表現(xiàn)相關(guān)癥狀，特別是其中暴露為激發(fā)形式的情況中。疫苗可用于預(yù)防或治療病況。疫苗可用于最小化以病原體感染的可能性。

‘細(xì)菌腸疾病或病況’一般指由以腸細(xì)菌感染個體產(chǎn)生的病況。這樣的病況可包括下述癥狀：胃炎、脫水、腹瀉、發(fā)熱。沙門氏菌病是細(xì)菌腸疾病或病況的一個實例。

如本文使用的‘免疫’一般指通過其受試者的免疫系統(tǒng)針對免疫原被強(qiáng)化的過程。本發(fā)明減毒的沙門氏菌屬微生物可用于免疫受試者抵抗沙門氏菌屬并由此預(yù)防其他以更具毒力的沙門氏菌屬血清型的感染。

如本文使用的‘基因’指編碼序列和其調(diào)節(jié)序列如啟動子和終止信號。

‘包含(comprise)’和該術(shù)語的變型如‘包含(comprising)’、‘包含(comprises)’和‘包含(comprised)’并非意在排除其他添加劑、組分、整數(shù)或步驟。

本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)沙門氏菌屬基因中功能缺失突變的特定組合在沙門氏菌屬的活的減毒株的產(chǎn)生中提供特別的優(yōu)勢，其作為活疫苗可用于賦予對于以沙門氏菌屬的毒力或致病性血清型的感染的免疫力。

具體而言，本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)在還具有dam基因中的功能缺失突變的沙門氏菌屬菌株中的sifA、spvB或mgtC基因中引入突變導(dǎo)致可安全施用至受試者的微生物的生成，其在環(huán)境中安全并維持賦予對沙門氏菌屬的異源致病性血清型的保護(hù)的能力。

本發(fā)明因此提供活的減毒沙門氏菌屬微生物，其中所述微生物在dam基因中包含功能缺失突變和在選自下組的基因中的至少一個其他功能缺失突變：sifA、spvB和mgtC。

在特別優(yōu)選的實施方案中，根據(jù)本發(fā)明的微生物具有dam中的功能缺失突變和sifA中的另一功能缺失突變。在該實施方案中，微生物或腸細(xì)菌可不具有spvB或mgtC中的功能缺失突變。

本發(fā)明的減毒沙門氏菌屬微生物可通過已知技術(shù)制備，例如通過缺失誘變、插入失活或靶基因中一個或多個核苷酸的取代。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解的是假如天然基因產(chǎn)物的表達(dá)以某些方式被破壞，則靶基因不必需是突變的。例如，突變可在靶基因上游進(jìn)行，例如在啟動子或調(diào)節(jié)區(qū)中。

在一個實施方案中，工程化入dam、sifA、mgtC和spvB基因中的功能缺失突變是框內(nèi)缺失。使用框內(nèi)缺失以維持下游基因的轉(zhuǎn)錄。

其他合適的技術(shù)包括自殺載體的使用，其包含突變的基因和選擇性標(biāo)記。將自殺載體通過偶聯(lián)引入攜帶野生型基因序列(盡管如本領(lǐng)域的技術(shù)人員所理解，在可選的基因座可包含一個或多個突變)的沙門氏菌屬微生物。用突變的基因經(jīng)由同源重組替換野生型基因，并使用選擇性標(biāo)記鑒定突變的微生物。其他合適的技術(shù)描述于例如WO 1996/17951中。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員還會容易地確定引入的突變是否已導(dǎo)致功能缺失或基因功能是否受損。例如，mgtC基因?qū)τ诰哂械玩V濃度的環(huán)境中的沙門氏菌屬的存活是必須的。

引入dam基因和sifA、spvB或mgtC基因任一者中的功能缺失突變可有效產(chǎn)生微生物的減毒。

優(yōu)選地，微生物是腸細(xì)菌，且特別是致病性腸細(xì)菌，如腸桿菌科的成員。

最優(yōu)選地，微生物是沙門氏菌屬。本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解的是，通常為毒力或致病性的任何數(shù)目的沙門氏菌屬血清型可使用上述技術(shù)處理以生成活的減毒株。例如，沙門氏菌屬微生物可來自多種腸沙門氏菌腸亞種血清型，包括但不限于血清型鼠傷寒沙門氏菌(S.Typhimurium)、腸炎沙門氏菌(S.Enteritidis)、都柏林沙門氏菌(S.Dublin)、紐波特沙門氏菌(S.Newport)、豬霍亂沙門氏菌(S.Choleraesuis)或病牛沙門氏菌(S.Bovismorbificans)。在一個特別優(yōu)選的實施方案中，將功能缺失突變引入鼠傷寒沙門氏菌微生物。

在另一優(yōu)選的實施方案中，減毒的活微生物是在dam和sifA基因中都具有功能缺失突變的鼠傷寒沙門氏菌。

本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)本發(fā)明的微生物特別適于用作用于免疫受試者抵抗沙門氏菌屬的毒力血清型并最小化以毒力血清型感染的可能性的疫苗。具體而言，本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)相比在其他基因組合中具有功能缺失突變的沙門氏菌屬，在dam基因中以及在sifA、spvB或mgtC基因的任一者中具有突變的沙門氏菌屬在要免疫的受試者中和在環(huán)境中呈現(xiàn)改進(jìn)的疫苗安全性。

因此，另一方面，本發(fā)明提供用于在受試者中誘導(dǎo)對腸細(xì)菌(優(yōu)選致病性細(xì)菌如沙門氏菌屬)的免疫響應(yīng)的疫苗組合物。疫苗組合物包含足以在受試者中引起免疫響應(yīng)的量的活的減毒沙門氏菌屬微生物和適當(dāng)?shù)妮d劑或稀釋劑，其中所述活的減毒微生物包含在dam基因中的功能缺失突變和在選自下組的基因中的至少一個其他功能缺失突變：sifA、spvB和mgtC。

在一個特別優(yōu)選的實施方案中，疫苗組合物包含一定量的活的減毒沙門氏菌屬，其在dam和sifA基因中都包含功能缺失突變。

為配制疫苗組合物，減毒的微生物可在組合物中與任何適當(dāng)?shù)馁x形劑一起存在。例如，組合物可包含任何適當(dāng)?shù)淖魟?。此外，組合物可適應(yīng)多種施用方式。優(yōu)選的施用途徑包括口服、粘膜(例如鼻)或全身途徑(例如胃腸外注射)且所述疫苗為活的減毒沙門氏菌屬微生物。在一個特定的實施方案中，可提供疫苗組合物用于包含在將被遞送于受試者的飲用水或食物或飼養(yǎng)場中。

存在于疫苗組合物中的減毒微生物的數(shù)目可取決于疫苗組合物的預(yù)期施用途徑和最終其將被遞送的受試者由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。

在疫苗組合物中采用的特別合適的載劑或稀釋劑對本發(fā)明并非是關(guān)鍵的且為本領(lǐng)域常規(guī)的那些。稀釋劑的實例包括：用于緩沖抵抗胃中的胃酸的緩沖液，如包含蔗糖的檸檬酸鹽緩沖液(pH 7.0)、僅有碳酸氫鹽的緩沖液(pH 7.0)或包含抗壞血酸、乳糖和任選的阿斯巴甜的碳酸氫鹽緩沖液(pH 7.0)。載劑的實例包括：蛋白，例如，如在脫脂乳中發(fā)現(xiàn)的；糖，例如蔗糖；或聚乙烯吡咯烷酮。

本發(fā)明的發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)將本發(fā)明減毒微生物或包含該微生物的疫苗組合物施用至受試者賦予受試者對于以野生型或致病性血清型后續(xù)感染的抗性。

因此，另一方面，本發(fā)明提供預(yù)防以沙門氏菌屬的毒力株感染的方法，所述方法包括：

-向?qū)ζ溆行枰氖茉囌呤┯茫?/p>

-一定量的活的減毒沙門氏菌屬微生物，其中所述微生物包含dam基因中的功能缺失突變和選自下組的基因中的至少一個其他功能缺失突變：sifA、spvB和mgtC，或

-疫苗組合物，其包含活的減毒沙門氏菌屬微生物和合適的載劑或稀釋劑，其中所述活的減毒微生物包含dam基因中的功能缺失突變和選自下組的基因中的至少一個其他功能缺失突變：sifA、spvB和mgtC。

-其中施用的微生物或疫苗的量足以在受試者中引起免疫響應(yīng)。

可以理解的是在以沙門氏菌屬的毒力株感染的預(yù)防中，本發(fā)明還提供免疫受試者抵抗沙門氏菌屬的毒力血清型的感染的方法。

本發(fā)明的減毒微生物和包含該微生物的疫苗組合物適于免疫受試者抵抗通常導(dǎo)致沙門氏菌病的沙門氏菌屬的毒力和致病性血清型的感染。本發(fā)明的減毒微生物和包含所述微生物的疫苗組合物特別適于免疫任何對沙門氏菌屬微生物感染易感的動物。例如，在一些實施方案中，可被免疫的受試者可為人?？商鎿Q地，待免疫的受試者可為獸醫(yī)種類和牲畜。依據(jù)本發(fā)明的待免疫的受試者的實例包括豬、綿羊、小牛、牛、鹿、山羊、駱駝、馬、雞、火雞、鴨、鵪鶉等。

減毒的沙門氏菌屬微生物或疫苗的量或數(shù)目可由本領(lǐng)域的技術(shù)人員容易地確定。一般而言，施用約10²cfu至約10¹⁰cfu，優(yōu)選約10⁵至約10¹⁰cfu的微生物。免疫劑量根據(jù)施用途徑變化。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將理解的是胃腸外施用的疫苗的有效劑量(例如通過靜脈內(nèi)、腹膜內(nèi)或皮下注射)可能小于口服施用(例如在飲用水中或在食物中)的相似疫苗。

如本文使用的‘免疫的量’意為能夠在接受減毒微生物或包含所述微生物的疫苗的受試者中誘導(dǎo)保護(hù)性免疫響應(yīng)的量。免疫響應(yīng)可為體液的、粘膜的、局部的和/或細(xì)胞的免疫響應(yīng)。此外，如本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解的，所需減毒微生物或疫苗的量還會取決于與待免疫的受試者相關(guān)的年齡、體重和其他因素。

本領(lǐng)域的技術(shù)人員會理解的是為產(chǎn)生足夠數(shù)目的本文所述的活減毒微生物，在適當(dāng)?shù)沫h(huán)境中培養(yǎng)所述微生物可為必需的。例如，取決于微生物的意欲施用途徑，在需氧或厭氧條件下培養(yǎng)所述微生物可為必需的。本領(lǐng)域的技術(shù)人員將容易地能夠確定相關(guān)的培養(yǎng)條件。此外，一旦培養(yǎng)物中已產(chǎn)生足夠數(shù)目的微生物(例如，一旦微生物已達(dá)到對數(shù)期生長)，理想的是純化培養(yǎng)物以去除并非意欲包含于微生物下游使用的生長培養(yǎng)基的任何元素。

因此，在一個實施方案中，本發(fā)明提供如上文所述的活的減毒沙門氏菌屬微生物的純化的培養(yǎng)物。

可純化包含活的減毒沙門氏菌屬微生物的培養(yǎng)物從而其可在下游應(yīng)用中使用，包括用作疫苗或用于制造疫苗組合物以在受試者中誘導(dǎo)對沙門氏菌屬微生物的免疫響應(yīng)。

可以理解的是取決于培養(yǎng)物的意欲下游應(yīng)用，可冷凍干燥、冷凍或重構(gòu)純化的培養(yǎng)物。

之前段落中所述的本發(fā)明的另外的方面和所述方面的另外的實施方案將從通過實施例方式給出的下述說明并參照附圖而變得顯而易見。

可理解的是，在本說明書中公開和定義的本發(fā)明延伸到從文本或附圖提及或顯而易見的兩個或多個單獨特征的所有可替換的組合。所有這些不同的組合構(gòu)成本發(fā)明多種可替換的方面。此說明書中引用的全部的專利、專利申請和出版物通過提述以其整體并入本文，其程度如同具體而單獨地指示各獨立的專利申請或出版物以通過提述并入。

實施例

1.材料和方法

1.1.細(xì)菌菌株和生長條件

沙門氏菌屬動物分離株源自不同疫情、個體病例或至診斷實驗室的監(jiān)督提交[31]。毒力鼠傷寒沙門氏菌UK-1在全部用于比較的研究中使用[17]。除非另外詳明，細(xì)菌源自含有Luria-Bertani(LB)培養(yǎng)基的37℃通氣的固定相(stationary phase)培養(yǎng)物[18]。以下述濃度使用抗生素：卡那霉素(Kn)，50μg/ml，氨芐青霉素(Ap)，50μg/ml。

1.2.包含額外減毒突變的鼠傷寒沙門氏菌dam疫苗候選物的構(gòu)建

使用標(biāo)準(zhǔn)遺傳方案[20]通過引入定義的dam序列的框內(nèi)300bp缺失(稱為damΔ232[19])構(gòu)建了鼠傷寒沙門氏菌UK-1Δdam。獲得的鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232株(MT3134)顯示對嘌呤類似物2-氨基嘌呤(2-AP)敏感，其對于缺少非功能性DNA腺嘌呤甲基化酶的菌株是毒性的[21,22]，且對于全部研究將其用作親本沙門氏菌屬dam疫苗株。如所述[20]利用自殺載體pCVD442將次級毒力減毒缺失突變引入親本鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232株，在下述靶向基因中獲得定義編碼序列的框內(nèi)缺失的構(gòu)建：dam aroA(MT3138；1056bp缺失)；dam htrA(MT3142；1341bp缺失)；dam mgtC(MT3146；606bp缺失)；dam sifA(MT3150；807bp缺失)；dam spiC(MT3154；306bp缺失)；dam spvB(MT3158；1563bp缺失)；和dam ssaV(MT3162；1959bp缺失)。所得的基因構(gòu)建體使用缺失序列側(cè)翼的引物通過PCR確認(rèn)。

1.3.毒力和保護(hù)測定

口服和腹膜內(nèi)致死劑量₅₀(LD₅₀)：殺死50％的感染動物所需的劑量經(jīng)由口服(經(jīng)由胃插管)和腹膜內(nèi)(i.p.)途徑通過感染至少10只小鼠確定[30,19]。沙門氏菌屬測試株和野生型鼠傷寒沙門氏菌參照株14028在LB培養(yǎng)基中生長過夜。將在0.2ml的0.2M Na₂HPO4pH 8.1或0.1ml的0.15M NaCl(分別用于口服和腹膜內(nèi)施用)中重懸的細(xì)菌細(xì)胞用于感染小鼠，每日檢查其發(fā)病率和死亡率直至感染后3周。鼠傷寒沙門氏菌UK-1的口服和腹膜內(nèi)LD₅₀分別為10⁵和<10生物體[30]。將6-8周齡的BALB/c小鼠用于全部毒力研究。保護(hù)測定法.使用鼠傷寒沙門氏菌dam疫苗株以10⁹CFU的劑量口服免疫小鼠[30,19]。為避免歸因于疫苗株在宿主組織中持續(xù)性的瞬時非特異性交叉保護(hù)免疫響應(yīng)[23-25]，直至疫苗株從免疫動物的粘膜(派爾集合淋巴結(jié)；腸系膜淋巴結(jié))和全身組織(肝；脾)清除后4-5周，不使用毒力沙門氏菌屬激發(fā)免疫小鼠。免疫后11周，用相當(dāng)于100-至200-倍LD₅₀的感染劑量的毒力腸沙門氏菌血清型口服激發(fā)小鼠。激發(fā)后每日檢查小鼠的發(fā)病率和死亡率直至激發(fā)后3周。

1.4.構(gòu)建沙門氏菌屬疫苗候選物的抗生素抗性衍生物以評估疫苗和激發(fā)株糞便脫落，和在去離子水和綿羊糞便內(nèi)的持續(xù)性

構(gòu)建鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232雙突變疫苗候選物的卡那霉素抗性(Kn^r)衍生物以評估疫苗糞便脫落。鼠傷寒沙門氏菌株MT2057是野生型參照株14028的Kn^r衍生物，其包含用于將其與其他作為固有地Lac^-的沙門氏菌屬辨別的編碼Kn^r的Lac⁺MudJ轉(zhuǎn)錄融合[19,26]。將生長在供體株MT2057上的噬菌體P22用于將受體沙門氏菌屬dam疫苗候選物轉(zhuǎn)導(dǎo)為卡那霉素抗性[18]，生成Kn^r鼠傷寒沙門氏菌UK-1 dam Δ232雙突變疫苗候選物dam mgtC(MT3183)、dam sifA(MT3184)、dam spvB(MT3186)和dam UK-1親本株(MT3180)。疫苗株脫落.用Kn^r鼠傷寒沙門氏菌UK-1 dam雙突變疫苗候選物通過口服途徑接種BALB/c小鼠(10⁹CFU)。在免疫后第2、4、7、11、14和21天從個體小鼠收集糞便并鋪板用于在卡那霉素50μg/ml LB平板上的CFU/g。激發(fā)株脫落.用Kn^r鼠傷寒沙門氏菌UK-1 dam雙突變疫苗候選物通過口服途徑接種BALB/c小鼠(10⁹CFU)。疫苗株糞便清除發(fā)生在免疫后4周。免疫后11周，用100LD₅₀劑量的鼠傷寒沙門氏菌UK-1的Kn^r衍生物(MT2315；10⁷CFU)激發(fā)接種的小鼠。在免疫后第2、4、7、11、14和21天從個體小鼠收集糞便并鋪板用于在卡那霉素50μg/ml LB平板上的CFU/g。去離子水和綿羊糞便內(nèi)的持續(xù)性.通過將20ml的去離子水添加至5g干燥的綿羊糞便(來自Barbara Byrne,University of California,Davis的禮物；[27,28])制備20％的糞便干物質(zhì)。使用鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232雙突變疫苗候選物的Kn^r衍生物dam mgtC(MT3183)、dam sifA(MT3184)、dam spvB(MT3186)或dam UK-1親本株(MT3180)接種去離子水(20ml)和20％綿羊糞便(2x10⁵CFU)。在具有松頂帽的50ml錐形管中在室溫實施一式三份測定。將樣品渦旋并在兩周期間鋪板用于CFU。

1.5統(tǒng)計學(xué)分析

使用殘留(或受限)的最大似然(REML)分析對連續(xù)重復(fù)的測量數(shù)據(jù)進(jìn)行了分析(Genstat,第15th版,VSN International,UK,[34])。對于因素時間和用于可變的CFU的治療擬合單變量、重復(fù)測量模型。將Wald卡方檢驗用于確定顯著的個體效果和或因素之間顯著的相互作用。從模型中刪除任何非顯著項并重復(fù)分析。如下分析數(shù)據(jù)作為基于預(yù)測模型的平均值表示。預(yù)測的平均值是從擬合模型而非原始樣品平均值獲得的那些。這是重要的，因為預(yù)測的平均值代表調(diào)整至通用變量集合(a common set of variables)的平均值，因此可允許平均值間有效的比較。將小于0.05的P值認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。使用方差分析(ANOVA,Genstat,第15版,VSN International,UK)對尸檢時組織中存在的CFU的數(shù)目進(jìn)行了分析。使用REML和ANOVA計算的個體平均值間的差異通過計算近似最小顯著差異(LSD)確定。超過計算的LSD的平均值差異認(rèn)為是顯著的。

使用邏輯回歸模型(Genstat,第15版,VSN International,UK,[34])分析了二項式數(shù)據(jù)(脫落[是/否]和結(jié)果[活/死])。將疫苗擬合至模型。使用Wald統(tǒng)計評估了整體顯著性(P<0.05)。根據(jù)相對于參照組的t參數(shù)估計評估了固定效果(疫苗)的顯著性。小于0.05的p值認(rèn)為是統(tǒng)計學(xué)上顯著的。

1.6.倫理聲明

全部動物實驗依照國立健康研究院對于實驗室動物的飼養(yǎng)和護(hù)理指南實施，并在加州大學(xué)圣巴巴拉分校機(jī)構(gòu)動物護(hù)理和使用委員會相關(guān)審查和批準(zhǔn)后依照機(jī)構(gòu)規(guī)章實施。

2.結(jié)果

2.1.包含次級毒力減毒突變的沙門氏菌屬dam疫苗候選物的構(gòu)建

修飾的活疫苗的商業(yè)成功取決于治療指數(shù)、安全性/效力的比，且因此將次級毒力減毒突變引入腸沙門氏菌鼠傷寒血清型dam疫苗以改進(jìn)疫苗安全性。構(gòu)建了親本菌株UK-1的抗生素敏感的dam-缺失衍生物以消除抗生素抗性向其他微生物菌株的潛在傳播(材料和方法)。將所得的鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232(MT3134)用作全部研究的親本疫苗背景。隨后將次級毒力減毒突變引入鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232以改進(jìn)疫苗安全性(材料和方法)。這些突變靶向參與細(xì)胞內(nèi)和/或系統(tǒng)性存活的基因，包括aroA(氨基酸生物合成)；htrA(應(yīng)激響應(yīng))；mgtC(鎂運輸)；sifA、spiC、ssaV(沙門氏菌屬致病性島-2(SPI-2)；和spvB(細(xì)胞毒素產(chǎn)生)。隨后評估了所得的沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物dam aroA、dam htrA、dam mgtC、dam sifA、dam spiC、dam spvB、dam ssaV相比親本沙門氏菌屬dam疫苗株改進(jìn)的安全性/效力。

2.2.沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物用于菌落化和在粘膜和全身組織中持續(xù)性的評估

將次級毒力減毒突變引入修飾的活疫苗的主要問題是由于作為加速的疫苗清除的結(jié)果的減少的抗原暴露所致的可能的效力損失。因此，檢查了鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232雙突變疫苗候選物dam aroA、dam htrA、dam mgtC、dam sifA、dam spiC、dam spvB、dam ssaV中維持與在親本鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232疫苗株中發(fā)現(xiàn)的那些相似的菌落化和持續(xù)性的那些。使用沙門氏菌dam雙突變疫苗候選物口服感染BALB/c小鼠(10⁹CFU)，并在感染后第2和4周在粘膜(派爾集合淋巴結(jié)；腸系膜淋巴結(jié))和全身組織(肝和脾)中評估了疫苗株的菌落化/持續(xù)性(圖1)。將沙門氏菌屬dam雙突變候選物分為兩組，I類：相對親本鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232單突變疫苗株顯示相似的菌落化/持續(xù)性的那些(dam mgtC；dam sifA；dam spvB)；和II類：相對由親本沙門氏菌屬dam疫苗所呈現(xiàn)的，呈現(xiàn)菌落化/持續(xù)性的那些(dam aroA、dam htrA、dam spiC、dam ssaV)。這些數(shù)據(jù)指示I類疫苗候選物疫苗在宿主組織中維持低級別的持續(xù)性，而II類疫苗顯示了在接種動物中的快速清除。

2.3.沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物的效力評估

檢查了沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物(I類和II類)以辨別低級別的持續(xù)性是否對賦予與由親本沙門氏菌屬dam疫苗引起的情況相似的保護(hù)性免疫響應(yīng)是必須的。使用7種沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物的每一種口服免疫BALB/c小鼠(10⁹CFU)。為避免歸因于疫苗株在宿主組織中持續(xù)性的瞬時非特異性交叉保護(hù)的免疫響應(yīng)[23-25]，直至疫苗株從免疫動物的粘膜(派爾集合淋巴結(jié)；腸系膜淋巴結(jié))和全身組織(肝；脾)清除后4-5周，不用毒力沙門氏菌屬激發(fā)免疫小鼠。免疫后11周，用200-倍LD₅₀感染劑量以毒力親本株鼠傷寒沙門氏菌UK-1口服激發(fā)小鼠。用全部(3種中的3種)I類疫苗候選物(dam mgtC、dam sifA、dam spvB)免疫的小鼠呈現(xiàn)了抵抗毒力同源激發(fā)的穩(wěn)固保護(hù)，與由親本鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232株呈現(xiàn)的情況相似(圖2)。反過來，呈現(xiàn)加速清除的II類疫苗候選物(dam aroA、dam htrA、dam spiC、dam ssaV)中相比親本鼠傷寒沙門氏菌UK-1 dam 23株無一(4種中的0種)賦予對毒力同源激發(fā)的顯著保護(hù)(**P<0.01,***P<0.001)。

評估了I類疫苗候選物引起對異源株交叉保護(hù)的能力，如已在沙門氏菌病的鼠類[2,9]、鳥類[10,11]、羊[12]和牛[13-15]模型中的沙門氏菌屬dam疫苗株所顯示的。用I類疫苗候選物(dam mgtC、dam sifA或dam spvB；10⁹CFU)口服免疫BALB/c小鼠。免疫后11周，用分別包含血清組C2-C3、B和D、源自綿羊(病牛沙門氏菌174,鼠傷寒沙門氏菌131)和牛(都柏林沙門氏菌8895)的畜牧業(yè)相關(guān)致病性沙門氏菌屬菌株激發(fā)小鼠。全部3種I類疫苗候選物賦予對測試的三種異源毒力株的穩(wěn)固的交叉保護(hù)(圖3；***P<0.001)，與先前用鼠傷寒沙門氏菌14028damΔ232疫苗株接種的小鼠中針對這3種異源激發(fā)株呈現(xiàn)的交叉保護(hù)水平相似[2]。這些數(shù)據(jù)與宿主組織中I類疫苗(dam mgtC、dam sifA和dam spvB)低級別的持續(xù)性可隨時間提供穩(wěn)定的抗原來源(需要其以轉(zhuǎn)變?yōu)樾纬蓮?qiáng)適應(yīng)性免疫響應(yīng))[2,9,19]的假設(shè)一致。

2.4.經(jīng)由回復(fù)至2-AP抗性的評估的疫苗安全性評價

對于全部修飾的活疫苗，關(guān)注的是回復(fù)至提高的毒力。經(jīng)由甲基定向錯配修復(fù)基因中突變的獲得，腹膜內(nèi)(但非口服)感染后沙門氏菌屬dam突變疫苗具有經(jīng)歷回復(fù)至更具毒力狀態(tài)的能力[29]。這種回復(fù)可使用嘌呤類似物2-氨基嘌呤(2-AP)評價，其對缺乏Dam功能的細(xì)菌是毒性的[21]。也就是說，可評估親本dam株(2-AP^S)在全身組織中至2-AP^r的回復(fù)(作為提高的毒力的潛在指標(biāo))[29]。用沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物dam mgtC、dam sifA、dam spvB或親本鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232株(10³CFU)腹膜內(nèi)(i.p.)感染BALB/c小鼠。感染后5天，評估從肝和脾回收的細(xì)菌的2-AP^s(持續(xù)性)和至2-AP^r表型的回復(fù)(圖4)。全部3種疫苗候選物(dam mgtC、dam sifA、dam spvB)顯示了相對親本鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232株的情況相對在脾/肝中顯著減少的菌落化/持續(xù)性(2-AP^s)和減少的至2-AP抗性的回復(fù)(*P<0.05)。

沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物的2-Ap^r衍生物和從感染的小鼠的脾分離的親本dam UK-1疫苗經(jīng)由口服和腹膜內(nèi)致死劑量(LD₅₀)毒力測定法進(jìn)行了評價。野生型UK-1的口服和腹膜內(nèi)LD₅₀分別為10⁵和<10CFU。源自全部沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物的全部2-AP^r分離株(11種中的11種)或親本沙門氏菌屬dam疫苗(5種中的5種)的口服LD₅₀通過口服施用為無毒的(表2)。相反，源自沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物的全部2-AP^r分離株(11種中的11種)經(jīng)由腹膜內(nèi)感染高度減毒，而源自親本dam疫苗的那些(5種中的5種)與回復(fù)至更具毒力的狀態(tài)相關(guān)，如先前所證明的[29]。這些數(shù)據(jù)指示沙門氏菌屬dam mgtC、dam sifA和dam spvB疫苗株呈現(xiàn)了顯著改進(jìn)的疫苗安全性，如通過在感染過程中不能產(chǎn)生毒力回復(fù)體所證實，與沙門氏菌屬dam疫苗相反。

2.5.沙門氏菌屬dam雙突變疫苗株的疫苗和激發(fā)株脫落評價

對于疫苗的安全性，在接種的動物中減少的疫苗和激發(fā)株脫落是合意的性狀。構(gòu)建了鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232雙突變疫苗候選物的卡那霉素抗性衍生物以評估在免疫動物的糞便中疫苗株和激發(fā)株脫落。用沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物(dam mgtC[MT3183]；dam sifA[MT3184]；dam spvB[MT3186])或dam UK-1親本株(MT3180)通過口服途徑免疫BALB/c小鼠(10⁹CFU)。疫苗株脫落.在感染后第2、4、7、11、14和21天獲得糞便顆粒并評估Kn^r細(xì)菌。全部的沙門氏菌屬dam雙缺失疫苗候選物相比親本鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232株的情況呈現(xiàn)顯著減少的疫苗株糞便脫落(圖5；P<0.05)。激發(fā)株脫落.免疫后11周，用100LD₅₀劑量的鼠傷寒沙門氏菌UK-1(MT2315；10⁷CFU)的Kn^r衍生物激發(fā)接種的小鼠。在感染后第2、4、7、11、14和21天獲得糞便顆粒并評估Kn^r細(xì)菌。在3周期間，相對親本鼠傷寒沙門氏菌UK-1 damΔ232疫苗，沙門氏菌屬dam mgtC、dam sifA和dam spvB株呈現(xiàn)了激發(fā)株脫落中的顯著減少，其中dam sifA和dam spvB株從第4天至第21天顯示減少的脫落(圖6；P<0.05)。這些數(shù)據(jù)指示相對親本沙門氏菌屬dam疫苗，用沙門氏菌屬dam雙突變疫苗的接種導(dǎo)致較少的疫苗糞便脫落，且雙缺失接種在毒力激發(fā)后提供比dam親本疫苗更穩(wěn)固的野生型沙門氏菌屬脫落的減毒/弱化。

2.6.沙門氏菌dam雙突變疫苗株的環(huán)境持續(xù)性(去離子水和綿羊糞便)評價

評價了沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物在去離子水和在綿羊糞便中的環(huán)境持續(xù)性。去離子水.用沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物(dam mgtC[MT3183]；dam sifA[MT3184]；dam spvB[MT3186])或dam UK-1親本株(MT3180)的Kn^r衍生物接種去離子水(10⁴CFU/ml)(圖7)。在兩周期間將水樣品鋪板用于CFU/g。相比野生型UK-1株的情況，全部(3種中的3種)沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物和親本dam株在去離子水中在兩周溫育期間顯示顯著減少的活力(圖7；P<0.05)。此外，水中低水平的疫苗持續(xù)性可與槽水疫苗施用兼容。綿羊糞便.用沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物(dam mgtC[MT3183]；dam sifA[MT3184]；dam spvB[MT3186])或dam UK-1親本株(MT3180)的Kn^r衍生物接種20％干物質(zhì)綿羊糞便(10⁴CFU/ml)。在兩周期間將糞便樣品鋪板用于CFU/g。相比野生型UK-1株的情況，全部(3種中的3種)沙門氏菌屬dam雙突變疫苗候選物在綿羊糞便中在兩周溫育期間顯示了顯著減少的活力(圖8；P<0.05)。此外，沙門氏菌屬dam sifA在綿羊糞便中顯示了相對其他3種疫苗株測試顯著更少的活力(P<0.05)。這些數(shù)據(jù)指示相比野生型UK-1株的情況，沙門氏菌屬疫苗候選物在去離子水和綿羊糞便中都顯示減少的環(huán)境持續(xù)性。

3.討論

雖然有良好的農(nóng)業(yè)管理實踐，沙門氏菌病持續(xù)成為在集約化生產(chǎn)系統(tǒng)中利于糞-口傳播的重要問題。疾病主要由增加的病原暴露和疾病易感性導(dǎo)致。環(huán)境條件的波動導(dǎo)致環(huán)境病原體載荷的變化和隨后的宿主激發(fā)。與妊娠和分娩相關(guān)的生理變化增加對疾病的易感性，如新生兒的天然免疫狀態(tài)所表現(xiàn)。管理實踐還可對具有經(jīng)歷農(nóng)場庫存(運輸前的集群、堆場、食物和水剝奪)和運輸過程中(食物和水剝奪、環(huán)境應(yīng)激)和在銷售場(共混、病原體暴露)的積累的應(yīng)激因素的宿主免疫力產(chǎn)生負(fù)面影響。

針對沙門氏菌病的牲畜接種是預(yù)防疾病的可行方法，因為它在開始時防止食品和水供應(yīng)的污染，導(dǎo)致減少的病原體暴露、傳播、動物疾病和牲畜衍生食品的直接污染和水果和蔬菜食品通過污染的水的間接污染。

理想情況下，應(yīng)在原產(chǎn)地農(nóng)場接種牲畜以在牲畜經(jīng)歷與銷售、運輸和進(jìn)入飼養(yǎng)場后的高風(fēng)險期相關(guān)的應(yīng)激因素和病原體暴露前引起免疫。因為疾病的成本不在原產(chǎn)地產(chǎn)生，挑戰(zhàn)是說服為飼養(yǎng)場提供庫存的生產(chǎn)者在銷售前接種動物，這導(dǎo)致在進(jìn)入飼養(yǎng)場后緊接下來的高風(fēng)險期進(jìn)行牲畜免疫的目前實踐。

如果向商業(yè)部門提供可負(fù)擔(dān)和有效的產(chǎn)品，則疫苗可在整個動物生產(chǎn)工業(yè)廣泛應(yīng)用，因為疫苗接種簡單，被生產(chǎn)者理解，并可能被采用，且因此可以在任何全面的食品安全計劃的成功中起關(guān)鍵作用。

作為解決這一問題的潛在手段，修飾的活沙門氏菌屬dam疫苗已顯示在免疫的儲備中是有效的和良好耐受的[10-15]，并且可經(jīng)由飲用水施用[12,16]。然而，活疫苗的主要問題是安全性、脫落和環(huán)境持續(xù)性。

本文中，將次級毒力減毒突變引入沙門氏菌屬dam株以篩選在動物和環(huán)境中安全的疫苗候選物，并保持賦予交叉保護(hù)效力的能力。鼠傷寒沙門氏菌dam sifA呈現(xiàn)了改進(jìn)的疫苗安全性，減少的疫苗和激發(fā)株脫落、減少的環(huán)境持續(xù)性，并賦予了宿主組織中低級別的持續(xù)性，其足以賦予源自感染牲畜的異源致病性沙門氏菌屬血清型的交叉保護(hù)[31]。這些數(shù)據(jù)指示，沙門氏菌屬dam sifA對于商業(yè)應(yīng)用呈現(xiàn)出有利的治療指數(shù)(安全性/效力)，這支持了接種者和環(huán)境中改進(jìn)的安全性，連同引起針對致病性血清型的交叉保護(hù)免疫的能力。

本文中，在接種的動物中和在模擬環(huán)境的條件中評價了疫苗的安全性。沙門氏菌屬dam mgtC、dam sifA和dam spvB疫苗株在宿主組織中維持低級別的持續(xù)性，其與針對源自感染牲畜的異源致病性血清型的交叉保護(hù)免疫力的維持相關(guān)。此外，沙門氏菌屬dam sifA疫苗呈現(xiàn)了改進(jìn)的疫苗安全性(疫苗脫落；激發(fā)株脫落；在全身組織中的持續(xù)性；在環(huán)境中的持續(xù)性)，同時維持了針對用同源和異源致病性血清型的毒力激發(fā)的穩(wěn)固效力。因此，沙門氏菌屬dam sifA疫苗候選物呈現(xiàn)大大增加的安全性而無損交叉保護(hù)效力且可證明是牲畜口服給藥的安全、有效和低成本手段而無顯著的環(huán)境持續(xù)性。

表1.本研究中使用的細(xì)菌株

表2.體內(nèi)選擇的dam雙突變沙門氏菌屬的2-AP^r衍生物經(jīng)由腹膜內(nèi)或口服感染途徑是無毒的

^a獨立分離的、體內(nèi)選擇的沙門氏菌屬dam突變疫苗株的2-氨基嘌呤抗性(2-AP^r)衍生物分離自感染的小鼠的脾，并評價了在未治療小鼠中口服和腹膜內(nèi)(IP)的毒力[29]。這些菌株中的每一種的LD₅₀測定與野生型(UK-1)的情況進(jìn)行了比較。通過感染5只小鼠每激發(fā)劑量確定了腹膜內(nèi)LD₅₀；通過感染10只小鼠每激發(fā)劑量確定了經(jīng)由胃插管的經(jīng)口LD₅₀。野生型UK-1的口服和腹膜內(nèi)LD₅₀分別為10⁵和<10CFU[30]。存活的小鼠評分為感染后>2周。

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