本發(fā)明涉及阿爾茨海默氏病及其它與淀粉樣β(Abeta)肽、淀粉樣前體蛋白(APP)的神經(jīng)毒性和高度聚集肽片段有關(guān)的疾病和病癥的領(lǐng)域。阿爾茨海默氏病是在世界范圍內(nèi)影響數(shù)百萬(wàn)患者的破壞性的神經(jīng)變性病癥。由于目前批準(zhǔn)的上市藥劑對(duì)于患者只有暫時(shí)的癥狀性益處，所以，在阿爾茨海默氏病的治療方面，還存在顯著的未滿足的需要。

阿爾茨海默氏病的特點(diǎn)在于：在腦中形成、聚集和沉積Abeta。在小鼠模型中，已經(jīng)證明，完全或部分抑制β-分泌酶(β位點(diǎn)淀粉樣前體蛋白裂解酶；BACE)，對(duì)于斑塊相關(guān)和斑塊依賴性病變具有顯著的效果，這說(shuō)明，即使少量降低Abeta肽水平，也可以導(dǎo)致斑塊負(fù)荷以及突觸缺陷的長(zhǎng)期明顯減少，由此提供顯著的治療益處，尤其是治療阿爾茨海默氏病。

美國(guó)專利US 8,158,620公開(kāi)了具有BACE抑制活性的稠合的氨基二氫噻嗪衍生物，并且進(jìn)一步公開(kāi)了作為Aβ肽所引起的神經(jīng)變性疾病的有效治療劑，例如，阿爾海默氏類型的癡呆。另外，J. Neuroscience，31(46)，16507-16516頁(yè)(2011)公開(kāi)了(S)-4-(2,4-二氟-5-嘧啶-5-基-苯基)-4-甲基-5,6-二氫-4H-[1,3]噻嗪-2-基胺，它是口服給予的CNS活性的BACE抑制劑。

需要BACE抑制劑的結(jié)晶形式使得藥學(xué)制劑容易制備，并提供穩(wěn)定性提高的藥物組合物。

相應(yīng)地，本發(fā)明提供了式I的化合物∶

式I

它是晶體。

本發(fā)明還提供了治療患者的阿爾茨海默氏病的方法，所述方法包括：給予需要這種治療的患者有效量的晶體形式的式I化合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了防止患者的輕微認(rèn)知損害發(fā)展成為阿爾茨海默氏病的方法，所述方法包括：給予需要這種治療的患者有效量的晶體形式的式I化合物。本發(fā)明還提供了抑制患者的BACE的方法，所述方法包括：給予需要這種治療的患者有效量的晶體形式的式I化合物。本發(fā)明還提供了抑制BACE介導(dǎo)的淀粉樣前體蛋白斷裂的方法，所述方法包括：給予需要這種治療的患者有效量的晶體形式的式I化合物。本發(fā)明進(jìn)一步提供了抑制Abeta肽產(chǎn)生的方法，所述方法包括：給予需要這種治療的患者有效量的晶體形式的式I化合物。

此外，本發(fā)明提供了用于治療的晶體形式的式I化合物，尤其是用于治療阿爾茨海默氏病，或用于防止輕微的認(rèn)知損害發(fā)展成為阿爾茨海默氏病。再此外，本發(fā)明提供了晶體形式的式I化合物用于制備藥物的用途，所述藥物用于治療阿爾茨海默氏病，或用于防止輕微的認(rèn)知損害發(fā)展成為阿爾茨海默氏病。

本發(fā)明進(jìn)一步提供了含有晶體形式的式I化合物以及一或多種可藥用載體、稀釋劑或賦形劑的藥物組合物。本發(fā)明還包括合成晶體形式的式I化合物的新的中間體和方法。

輕微認(rèn)知損害定義為：基于臨床表現(xiàn)和表現(xiàn)為輕度認(rèn)知損害的患者隨時(shí)間推移向阿爾茨海默氏癡呆的進(jìn)展，與阿爾茨海默氏病相關(guān)的癡呆的潛在的有前驅(qū)癥狀的階段(Morris等人，Arch. Neurol., 58, 397-405(2001); Petersen等人，Arch. Neurol., 56, 303-308(1999))。術(shù)語(yǔ)“防止輕微認(rèn)知損害發(fā)展成為阿爾茨海默氏病”包括減緩、阻滯或逆轉(zhuǎn)患者的輕微認(rèn)知損害向阿爾茨海默氏病的發(fā)展。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“治療”包括限制、減緩、終止或逆轉(zhuǎn)所存在的癥狀或病癥的進(jìn)展或嚴(yán)重程度。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“患者”是指人。

術(shù)語(yǔ)“抑制Abeta肽的產(chǎn)生”是指降低患者的體內(nèi)Abeta肽的水平。

本文使用的術(shù)語(yǔ)“有效量”是指本發(fā)明化合物或其可藥用鹽的數(shù)量或劑量，當(dāng)給予患者單或多劑量時(shí)，這種數(shù)量或劑量能夠?yàn)樵\斷或治療中的患者提供預(yù)期效果。

作為本領(lǐng)域技術(shù)人員，診斷醫(yī)生通過(guò)利用已知的技術(shù)，并且觀察在類似情況下所獲得的結(jié)果，可以容易地確定有效量。在確定患者的有效量的過(guò)程中，診斷醫(yī)生會(huì)考慮大量因素，包括但不限于∶患者的種類；它的體量、年齡和常規(guī)健康情況；所涉及的具體疾病或病癥；疾病或病癥的復(fù)雜度或嚴(yán)重程度；個(gè)體患者的響應(yīng)；給予的具體化合物；給藥模式；給予的制劑的生物利用度特征；選擇的劑量方案；使用的伴隨藥物；及其它相關(guān)的情況。

本發(fā)明的化合物通常在很寬的劑量范圍內(nèi)是有效的。例如，日劑量通常在大約0.01至大約20 mg/kg體重范圍內(nèi)。在有些情況下，低于上述范圍的下限的劑量水平可能是更合適的，而在其它情況下，在副作用可接受的條件下，可以使用更大的劑量，因此，上述劑量范圍不是打算以任何方式限制本發(fā)明的范圍。

優(yōu)選，將本發(fā)明的化合物配制為藥物組合物，通過(guò)能夠使化合物生物可利用的任何途徑給予，包括口服、透皮和腸胃外途徑。最優(yōu)選，口服或透皮給予這樣的組合物，尤其優(yōu)選口服。這樣的藥物組合物和其制備方法在本領(lǐng)域?yàn)榇蠹宜熘?參見(jiàn)，例如，Remington: The Science and Practice of Pharmacy(D.B. Troy, Editor, 21st Edition, Lippincott, Williams & Wilkins, 2006)。

晶體形式的式I化合物尤其在本發(fā)明的治療方法中是有效的，但優(yōu)選某些形式。下列段落描述這種形式?？梢岳斫猓@些優(yōu)選形式適用于本發(fā)明的治療方法和新的化合物兩者。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式1；

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式2；

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式2，其特點(diǎn)在于：在X射線衍射譜中，在11.8°的衍射角2θ處存在實(shí)質(zhì)的峰，還具有一個(gè)或多個(gè)選自18.6°、19.3°和26.7°的峰；衍射角的容許誤差為0.2度；

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式3；和

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式3，其特點(diǎn)在于：在X射線衍射譜中，在15.7°的衍射角2θ處存在實(shí)質(zhì)的峰，還具有一個(gè)或多個(gè)選自18.1°、27.0°和19.7°的峰；衍射角的容許誤差為0.2度，是優(yōu)選的。

特別優(yōu)選N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式2。

尤其優(yōu)選N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式2，其特點(diǎn)在于：在X射線衍射譜中，在11.8°的衍射角2θ處存在實(shí)質(zhì)的峰，還具有一個(gè)或多個(gè)選自18.6°、19.3°和26.7°的峰；衍射角的容許誤差為0.2度。

本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以理解，本發(fā)明的化合物可以存在互變異構(gòu)形式，如反應(yīng)路線A所述。當(dāng)本申請(qǐng)給出本發(fā)明化合物的任何一個(gè)具體互變異構(gòu)體時(shí)，應(yīng)該理解為，它包括互變異構(gòu)形式和其所有的混合物。

反應(yīng)路線A

另外，下面反應(yīng)路線所描述的某些中間體可以包含一個(gè)或多個(gè)氮保護(hù)基?？勺兊谋Ｗo(hù)基在每次出現(xiàn)時(shí)可以相同或不同，這取決于具體反應(yīng)條件和所進(jìn)行的具體轉(zhuǎn)化。技術(shù)人員熟知保護(hù)和脫保護(hù)條件，并且在文獻(xiàn)中進(jìn)行了描述(參見(jiàn)，例如，“Greene’s Protective Groups in Organic Synthesis”, 第四版, Peter G.M. Wuts 和 Theodora W. Greene, John Wiley and Sons, Inc. 2007)。

為了清楚起見(jiàn)，未指明某些立體化學(xué)核心，并且下列反應(yīng)路線刪除了某些取代基，但并沒(méi)有以任何方式限制反應(yīng)路線內(nèi)容的意圖。此外，在合成本發(fā)明化合物的過(guò)程中，在任何方便的點(diǎn)，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員可以利用(例如)選擇結(jié)晶技術(shù)或手性色譜方法分離或拆分單一異構(gòu)體、對(duì)映體和非對(duì)映體(參見(jiàn)，例如，J. Jacques等人，"Enantiomers, Racemates, and Resolutions", John Wiley and Sons, Inc., 1981, 和 E.L. Eliel 和 S.H. Wilen, “Stereochemistry of Organic Compounds”, Wiley-Interscience, 1994)。名稱“異構(gòu)體1”和“異構(gòu)體2”是指分別從手性色譜第一個(gè)和第二個(gè)洗脫的化合物，如果在合成的早期開(kāi)始手性色譜，則同樣的名稱用于隨后的中間體和實(shí)施例。

某些縮寫定義如下∶“APP”是指淀粉樣前體蛋白；“CSF”是指腦脊液；“DCM”是指二氯甲烷；“DIPEA”是指二異丙基乙胺或N-乙基-N-異丙基-丙-2-胺；“DMEM”是指Dulbecco's改進(jìn)的Eagle's培養(yǎng)基；“DMF”是指二甲基甲酰胺；“DMSO”是指二甲亞砜；“EDCI”是指1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽；“ee”是指對(duì)映體過(guò)量；“EtOAc”是指乙酸乙酯；“Ex”是指實(shí)施例；“F12”是指Ham's F12培養(yǎng)基；“FBS”是指胎牛血清；“FRET”是指熒光共振能量轉(zhuǎn)移；“HEK”是指人胚腎；“HOAc”是指乙酸；“HOBt”是指1-羥基苯并三唑水合物；“HPLC”是指高效液相色譜；“IC50”是指可以產(chǎn)生對(duì)該試劑可能的最大抑制響應(yīng)的50%時(shí)的試劑濃度；“min”是指分鐘；“MTBE”是指甲基叔丁基醚；“PDAPP“是指血小板衍生的淀粉樣前體蛋白；“Prep”是指制備；“RFU”是指相對(duì)熒光單位；“SCX”是指強(qiáng)陽(yáng)離子交換；“Rt”是指保留時(shí)間；“THF”是指四氫呋喃。

本發(fā)明的化合物可以用本領(lǐng)域已知的各種方法制備，在下面的制備例和實(shí)施例中，舉例說(shuō)明了其中一些方法。所描述的每個(gè)途徑的具體合成步驟可以以不同的方式組合，或與各種制備方法的步驟結(jié)合，制備本發(fā)明的化合物?？梢允褂帽绢I(lǐng)域眾所周知的常規(guī)方法，回收每個(gè)步驟的產(chǎn)物，包括提取、蒸發(fā)、沉淀、色譜、過(guò)濾、研磨或結(jié)晶。對(duì)本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，很容易得到試劑和起始原料。

制備例1

2-溴-1-(5-溴-2-氟苯基)乙烷-1-酮

在35℃，將N-溴代琥珀酰亞胺(984g，5.53mol)逐份加入到1-(5-溴-2-氟苯基)乙-1-酮(1000 g，4.6mol)和對(duì)甲苯磺酸(1315 g，7.64mol)的DCM(7 L)溶液中。攪拌該混合物，并加熱到40℃。將該混合物冷卻至24℃，并加入7% NaHCO₃(5 L)。分離各層，并用10% Na₂SO₃(5 L)和水(5 L)洗滌有機(jī)層。將有機(jī)層濃縮至1/2-1/3體積，得到標(biāo)題化合物，其不用進(jìn)一步純化，直接使用。

制備例2

5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)-1-(4-甲氧苯甲基)六氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑

向2-溴-1-(5-溴-2-氟苯基)乙烷-1-酮(1363 g，4.61 mol)的甲苯(10 L)溶液中加入二烯丙基胺(537 g，5.53 mol)和DIPEA(2381 g，18.42 mol)。將該混合物在40℃攪拌4小時(shí)，得到1-(5-溴-2-氟苯基)-2-(二烯丙基氨基)乙烷-1-酮，不用分離。將N-(4-甲氧苯甲基)羥胺(847g，5.53mol)和Ti(OiPr)₄(1965 g，6.91 mol)加入到含有粗品1-(5-溴-2-氟苯基)-2-(二烯丙基氨基)乙烷-1-酮的混合物中。將該混合物在90℃下攪拌2小時(shí)。將該混合物冷卻至20℃，并加入50%檸檬酸一水合物(4 L)和飽和Na₂CO₃(4 L)。分離各層，并將水層用MTBE(5 L)提取。用水(5 L)洗滌有機(jī)提取物，通過(guò)硅藻土過(guò)濾，并濃縮至干。將EtOAc(10 L)和草酸(580g)加入到殘余物中，濾出固體，并加入到1N NaOH(13 L)中。加入MTBE(5 L)，并將該混合物通過(guò)硅藻土過(guò)濾。分離各層，并將有機(jī)層濃縮至1/2體積。加入庚烷(3 L)，并將該溶液冷卻至10℃。將得到的固體濾出，得到標(biāo)題化合物(1330 g，64%)。¹H NMR(400 MHz, CDCl₃)δ2.51-2.49(m, 3H), 3.09-3.04(m, 3H),3.78-3.41(m, 6H),4.01(m, 1H),5.24-5.01(m, 2H),5.89-5.85(m, 1H),6.82-6.80(m, 2H),7.51-7.13(m, 3H),7.63-7.62(m, 1H),7.65-7.64(m, 1H)。

制備例3

5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)六氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑鹽酸鹽

將三氟乙酸(4 L，52.9 mol)逐滴加入到5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)-1-(4-甲氧苯甲基)六氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑(1990 g，4.45 mol)的DCM(12 L)溶液中，加入速度應(yīng)保持溫度低于35℃。加入完成之后，將該混合物升溫至33-43℃，并攪拌6小時(shí)。加入NaOH(20%，10 L)，加入速度應(yīng)保持溫度低于35℃。分離各層，并將有機(jī)層用水(6 L)洗滌。濃縮該溶液，加入乙醇(16 L)，并將該混合物通過(guò)硅藻土過(guò)濾。濃縮濾液，并加入EtOAc(10 L)。加入4M HCl/EtOAc(8 L)，并濾出所得到的固體，干燥，得到標(biāo)題化合物(1385 g，85.6%)。ES m/z 327.1(M+1)。

制備例4

(1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯烷-3-基)甲醇

將飽和碳酸鈉水溶液加入到5-烯丙基-6a-(5-溴-2-氟苯基)六氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑鹽酸鹽(1400g，3.85 mol)的DCM(7 L)溶液中，達(dá)到pH>9。分離各層，并將有機(jī)提取物濃縮至2/3體積。加入乙酸(1.38 L)，并將該溶液濃縮至2 L。加入乙酸(7 L)和鋅粉(2.5 kg，38.5 mol)，將該混合物加熱至40-50℃，并攪拌3小時(shí)。加入EtOAc(9.8L)，并將該混合物通過(guò)硅藻土過(guò)濾。將濾餅用EtOAc(4 L)洗滌。分離濾液，并將水(7 L)加入到合并的有機(jī)物中。加入氫氧化銨，達(dá)到pH≥9。分離各層，并將有機(jī)層濃縮至2 L。加入乙醇(2.8 L)，并將該溶液濃縮至2 L。加入乙醇(19 L)，并將該混合物通過(guò)硅藻土過(guò)濾，得到標(biāo)題化合物的乙醇溶液，其不用進(jìn)一步純化，直接使用。

制備例5

[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥甲基)吡咯烷-3-基]銨；(2S,3S)-4-羥基-2,3-二[(4-甲基苯甲?；?氧基]-4-氧代-丁酸鹽

將二-對(duì)甲苯酰-L-酒石酸一水合物(1.04 kg，2.69 mol)加入到(1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯烷-3-基)甲醇(1264 g，3.85 mmol)的乙醇(21 L)溶液中。將該混合物加熱至65-75℃，并攪拌3小時(shí)。將該混合物冷卻至5-10℃，加入[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥甲基)吡咯烷-3-基]銨；(2S,3S)-4-羥基-2,3-二[(4-甲基苯甲?；?氧基]-4-氧代-丁酸鹽(1.0 g)的晶種，并將該混合物攪拌3小時(shí)。濾出固體，并將濾餅用冷乙醇(1.4 L)洗滌。干燥濾餅，得到標(biāo)題化合物的白色固體。第二個(gè)洗脫的異構(gòu)體的手性分析∶柱∶IC Chiralpak，4.6 mm * 250 mm * 5μm；洗脫液∶90%己烷(0.3%二乙胺)∶10%乙醇(0.3%二乙胺)；流速∶1.0 ml/min，在UV 270 nm，確證了對(duì)映體富含(99% ee)的對(duì)映體，Rt=7.4分鐘(1050g，38%)。¹H NMR(400 MHz, CD₃OD)δ2.40(s, 6H), 3.05-3.04(m, 1H),3.57-3.31(m, 3H),3.66-3.58(m, 4H),3.75-3.74(m, 2H),5.38-5.36(m, 1H),5.50-5.46(m, 1H),5.88(s, 2H),5.97-5.91(m, 1H),7.10-7.05(m, 1H),7.29(d, J=8.0 Hz, 4H),7.53-7.51(m, 1H),7.80-7.78(m, 1H),8.01(d, J=8.0 Hz, 4H)。

制備例6

((3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯烷-3-基)甲醇

將1N HCl(500 ml，500 mmol)加入到0℃的[(3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥甲基)吡咯烷-3-基]銨；(2S,3S)-4-羥基-2,3-二[(4-甲基苯甲?；?氧基]-4-氧代-丁酸鹽(100 g，139.4 mmol)的EtOAc(500 ml)溶液中。將該混合物攪拌1小時(shí)。分離水層，并用1N NaOH將pH值調(diào)節(jié)至8。將水層用EtOAc(350 ml×2)提取。合并有機(jī)層，用水(500 ml)洗滌，濃縮，得到標(biāo)題化合物(40g，87%)。第二個(gè)洗脫的異構(gòu)體的手性分析∶柱∶IC Chiralpak，4.6 mm * 250 mm * 5μm；洗脫液∶90%己烷(0.3%二乙胺)∶10%乙醇(0.3%二乙胺)；流速∶1.0 ml/min，UV 270 nm證明了對(duì)映體富集(99.7% ee)的對(duì)映體，Rt=7.4分鐘。¹H NMR(400 MHz, CDCl₃)δ2.78-2.70(m, 5H),3.16-3.00(m, 3H),3.87-3.75(m, 1H),3.90-3.84(m, 1H),5.24-5.11(m, 2H),5.91-5.87(m, 1H), 6.95-6.91(m, 1H),7.35-7.32(m, 1H),7.67-7.65(m, 1H)。

制備例7

N-(((3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟苯基)-4-(羥甲基)吡咯烷-3-基)硫代氨基甲酰基)苯甲酰胺

將苯甲酰異硫氰酸酯(15.0 g，91.9 mmol)加入到0℃的((3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(5-溴-2-氟苯基)吡咯烷-3-基)甲醇(30 g，91.1 mmol)的THF(400 ml)溶液中。將該溶液升溫至25℃，并攪拌1小時(shí)，得到標(biāo)題化合物的THF溶液，其不用進(jìn)一步純化，直接使用。

制備例8

N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺二鹽酸鹽

將三苯基膦(36.8 g，140.3 mmol)加入到N-(((3S,4R)-1-烯丙基-3-(5-溴-2-氟苯基)-4-(羥甲基)吡咯烷-3-基)硫代氨基甲?；?苯甲酰胺(91.1 mmol)的THF(400 ml)溶液中。加入偶氮二甲酸二叔丁基酯(31.6 g，137.2 mmol)/THF(100 ml)。將該混合物在20-30℃下攪拌2小時(shí)。濃縮該混合物，并加入MTBE(400 ml)。通過(guò)硅藻土過(guò)濾該溶液，并將濾餅用MTBE(130 ml)洗滌。將濾液合并，并加入1N HCl/EtOAc(200 ml)。將該混合物攪拌2小時(shí)，而后濃縮至500 ml。加入MTBE(320 ml)，并過(guò)濾該溶液，并用庚烷(130 ml)洗滌。使固體在EtOAc(650 ml)中形成漿液，并在50-60℃下攪拌2小時(shí)。將熱漿液過(guò)濾，并將固體用EtOAc(130 ml)和庚烷(130 ml)洗滌。使固體在EtOAc(650 ml)中再形成漿液，并在50-60℃下攪拌2小時(shí)。將熱漿液過(guò)濾，并用EtOAc(130 ml)和庚烷(130 ml)洗滌。將固體干燥，得到標(biāo)題化合物的二-HCl鹽(40 g，80%，99.5% ee)。第一個(gè)洗脫的異構(gòu)體的手性分析∶柱∶IC Chiralpak，4.6 mm * 250 mm * 5μm；洗脫液∶85%己烷(0.1%二乙胺)∶15%異丙醇(0.1%二乙胺)；流速∶1.0 ml/min，UV 282 nm證明了對(duì)映體富集(99.5% ee)的對(duì)映體，Rt=12.5分鐘。

制備例9

N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟-5-(2,2,2-三氟乙酰胺基)苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺

將15%碳酸鈉(440 ml)加入到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺二鹽酸鹽(495 g，717.88 mmol)的EtOAc(3 L)和水(784 ml)溶液中。將該混合物攪拌1-2小時(shí)。分離各層，通過(guò)硅膠(40 g)過(guò)濾有機(jī)層，并用EtOAc(600 ml)洗滌。將濾液濃縮至干，得到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺。將三氟乙酰胺(136.7 g，1.21mol)、NaI(182.5 g，1.22mol)、4?分子篩(342g)和K₂CO₃(170.9g，1.24mol)加入到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-溴-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(341 g，494.54mmol)的DMSO(525 ml)和1,4-二噁烷(1.025 L)溶液中。將反式-N,N'-二甲基環(huán)己烷(81.6 g，573.66 mmol)和碘化亞銅(27.3 g，143.34 mmol)/DMSO(500 ml)加入到該反應(yīng)混合物中。將該混合物攪拌5分鐘。將該混合物升溫至100℃，攪拌8小時(shí)，并冷卻至24℃。加入水(5.9 L)和DCM(5.9 L)，過(guò)濾該混合物，并分離各層。將有機(jī)層用水(5.9 L)洗滌，獲得標(biāo)題化合物的DCM溶液，其不用進(jìn)一步純化，直接使用。

制備例10

N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺鹽酸鹽

將氫氧化鈉(28.7 g)和水(2.7 L)加入到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟-5-(2,2,2-三氟乙酰胺基)苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(250 g，494.4mmol)的DCM溶液中，并將該混合物在24℃下攪拌68小時(shí)。加入1N HCl(3.5 L)，獲得1-3的pH值。分離各層，并將水層用DCM(680 ml)洗滌。將DCM(4 L)加入到該水溶液中，而后加入21%氫氧化銨，獲得8-10的pH值。分離各層，將有機(jī)提取物合并，通過(guò)硅膠(170 g)過(guò)濾，并用DCM(1.4 L)洗滌。將溶劑濃縮至干，并用EtOAc(4 L)稀釋。在低于25℃的溫度下，加入1N HCl/EtOAc(700 ml)，并將該混合物攪拌1小時(shí)。將該混合物濃縮至大約1/7-1/8體積，并加入EtOAc(2.8 L)。將得到的沉淀濾出，并用EtOAc(400 ml)洗滌。將固體干燥，得到標(biāo)題化合物(246 g，52%)。

制備例11

N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-6-烯丙基-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺

將乙酸酐(23.5g，0.23 mol)加入到N-((4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺鹽酸鹽(100 g，0.153 mol)和三乙胺(54.3g，0.535 mol)的DCM(800ml)溶液中。在20-25℃下攪拌1小時(shí)之后，加入飽和NaHCO₃(700 ml)和水(600 ml)。分離各層，得到標(biāo)題化合物的DCM溶液，其不用進(jìn)一步純化，直接使用。

制備例12

N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺

將三苯基膦(4.0g，0.015 mol)和1,3-二甲基巴比妥酸(15.2 g，0.097 mol)加入到N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-6-烯丙基-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(0.153 mol)的DCM溶液中。加入乙酸鈀(1.7g，7.7 mmol)，并將該混合物在20至30℃下攪拌1小時(shí)。加入25%氫氧化銨，并分離各層。用HOAc(3.0當(dāng)量，在500 ml水中)洗滌有機(jī)層，并用25%氫氧化銨將pH值調(diào)節(jié)至8-9。將水層用DCM(2× 500 ml)提取。將有機(jī)提取物合并，并濃縮至1/3-1/4體積。加入MTBE(1 L)，并將該混合物過(guò)濾。濃縮該混合物，并加入庚烷(1 L)。濾出所得到的固體，收集，并干燥，得到標(biāo)題化合物(48 g，76%)。¹H NMR(400 MHz, CDCl₃) δ 2.15(s, 3H),2.87-2.83(m, 1H),3.43-3.23(m, 5H),3.70-3.67(m, 1H),7.12-7.07(m, 1H),7.28-7.27(m, 1H),7.52-7.41(m, 4H),7.79(m, 1H),8.18-8.16(m, 2H)。ES m/z 413.1(M+1)。

制備例13

N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺

將2-氯-5-氟嘧啶(28.9 g，218 mmol)和碳酸鉀(33.46 g，242.1 mmol)加入到N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(50 g，121.22 mmol)的DMF(100 ml)溶液中。將該混合物加熱至80-85℃，保持8小時(shí)。將該混合物冷卻至24℃，過(guò)濾，并用DMF(100 ml)洗滌。使固體在水(2 L)中形成漿液，過(guò)濾，獲得標(biāo)題化合物(68.5g，98%)。LC-MS: m/z=509.2(M+1)+, ¹H NMR(400 MHz, d₆-DMSO) δ ppm 1.22(t, J=7.28 Hz, 2 H)1.92-2.07(m, 6 H)2.89-3.20(m, 2 H)3.36-3.44(m, 1 H)3.67(t, J=9.54 Hz, 1 H)3.84(br. s., 1 H)4.16(br. s., 2 H)7.23(br. s., 2 H)7.35-7.61(m, 8 H)7.77(br. s., 2 H)7.85-8.18(m, 4 H)8.48(s, 4 H)10.15(br. s., 1 H)10.46-10.59(m, 1 H)。

制備例14

(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺

將氫氧化鋰(8.6 g，204.9 mmol)加入到N-((4aR,7aS)-7a-(5-乙酰氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,6,7,7a-六氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基)苯甲酰胺(80 g，157.3 mmol)的甲醇(400 ml)溶液中。將該混合物加熱至60-70℃，保持4小時(shí)。加入濃HCl(132 g)，并將該混合物在55℃下攪拌18小時(shí)。將該混合物冷卻至30℃，并濃縮，除去甲醇。加入水，并將水層用DCM(3×)提取，獲得標(biāo)題化合物的920 g的水溶液，其中，總質(zhì)量的5.6%是標(biāo)題化合物，其不用進(jìn)一步純化，直接使用。

制備例15

N-烯丙基-N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸芐基酯

在氮?dú)夥諊?，將N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸芐基酯(50 g，208.9 mmol)的甲苯(180 ml)溶液用固體氫氧化鉀(51.6 g，919.69 mmol)處理。10分鐘之后，加入芐基三乙基氯化銨(0.8 g，3.1 mmol)。再經(jīng)過(guò)10分鐘之后，用10分鐘逐滴加入烯丙基溴(33 g，272.8 mmol)的甲苯(50 ml)溶液。將得到的混合物在50℃下攪拌48小時(shí)。將該混合物冷卻至室溫，并用水淬滅。分離有機(jī)層，用鹽水洗滌，用硫酸鎂干燥，濃縮至干，得到標(biāo)題化合物(44 g，75%)。ES/MS(m/e): 280(M+H)。

制備例16

N-烯丙基-N-(2-氧代乙基)氨基甲酸芐基酯

將N-烯丙基-N-(2,2-二甲氧基乙基)氨基甲酸芐基酯(30 g，107 mmol)的甲酸(36.8 ml，860 mmol)和水(4.84 ml)溶液在室溫下攪拌過(guò)夜。濃縮該混合物，并用己烷/EtOAc(1:2)和水稀釋。分離有機(jī)層，用鹽水溶液洗滌，直到pH=6為止，并用硫酸鈉干燥。蒸發(fā)溶劑，得到標(biāo)題化合物(25g，99%)。ES/MS(m/e): 234(M+H)。

制備例17

N-烯丙基-N-[2-羥基亞氨基乙基]氨基甲酸芐基酯

將N-烯丙基-N-(2-氧代乙基)氨基甲酸芐基酯(25 g，107 mmol)的乙腈(150 ml)溶液用鹽酸羥胺(9.68 g，139 mmol)和三水乙酸鈉(16 g，117.9 mmol)水溶液(75 ml)處理。將該混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。蒸發(fā)乙腈，并將該水溶液用EtOAc提取。分離有機(jī)層，用硫酸鎂干燥，真空濃縮，得到標(biāo)題化合物(24 g，90%)。ES/MS(m/e): 249(M+H)。

制備例18

3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸芐基酯

用10分鐘，將N-烯丙基-N-[2-羥基亞氨基乙基]氨基甲酸芐基酯(24 g，96.6 mmol)的DCM(338 ml)溶液用5% w/w次氯酸鈉水溶液(106.08 mmol，143.06 ml)逐滴處理。將得到的混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。將該反應(yīng)用40%亞硫酸氫鈉(7 g)水溶液淬滅。分離有機(jī)層，用硫酸鎂干燥，并真空濃縮。用硅膠純化粗品，用5% EtOAc/己烷洗脫，得到標(biāo)題化合物(18 g，75%)。ES/MS(m/e): 247(M+H)。

制備例19

6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸芐基酯

將1.6M正丁基鋰己烷溶液(25.4 ml，40.6 mmol)逐滴加入到-78℃的4-溴-1-氟-2-碘苯(12.22 g，40.6 mmol)的THF(60 ml)溶液中，得到黃色溶液，并將其在-78℃下攪拌15分鐘。

將三氟化硼醚合物(5.14 ml，40.6 mmol)加入到單獨(dú)的-78℃的3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸芐基酯(5 g，20.3 mmol)的THF(60 ml)溶液中，并將該混合物在-78℃下攪拌5分鐘。將此溶液通過(guò)小管加入到先前制備的-78℃的有機(jī)鋰混合物中。將合并的混合物在-78℃下攪拌30分鐘。將該混合物用飽和氯化銨水溶液淬滅，并升溫至室溫。將該混合物用EtOAc(3×)提取，將有機(jī)提取物合并，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并真空除去溶劑。用硅膠純化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，經(jīng)過(guò)35分鐘，得到標(biāo)題化合物(2.27 g，27%)。ES/MS(m/e):(⁷⁹Br/⁸¹Br)421/423(M+H)。

制備例20

1-(苯甲酰硫代氨基甲酰基)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸芐基酯

將苯甲酰異硫氰酸酯(2.87 ml，21.28 mmol)逐滴加入到6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸芐基酯(5.977 g，14.2 mmol)的THF(95 ml)溶液中，并在氮?dú)夥諊袛嚢柽^(guò)夜。真空除去溶劑。用硅膠純化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，經(jīng)過(guò)30分鐘，得到標(biāo)題化合物(6.05 g，73%)。ES/MS(m/e):(⁷⁹Br/⁸¹Br)584/586(M+H)。

制備例21

3-(苯甲酰硫代氨基甲?；被?-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥甲基)吡咯烷-1-甲酸芐基酯

在室溫下，在氮?dú)夥諊?，?-(苯甲酰硫代氨基甲酰基)-6a-(5-溴-2-氟-苯基)-3,3a,4,6-四氫吡咯并[3,4-c]異噁唑-5-甲酸芐基酯(6.05 g 10.4 mmol)和鋅(粉末，<10微米)(6.77 g，103.5 mmol)的混合物在乙酸(52 ml)中攪拌過(guò)夜。將該反應(yīng)用EtOAc稀釋，并通過(guò)硅藻土過(guò)濾。真空除去溶劑，并將殘余物用EtOAc、水和飽和碳酸氫鈉水溶液稀釋。將該混合物用EtOAc(3×)提取，將有機(jī)層合并，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并真空除去溶劑。用硅膠純化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，經(jīng)過(guò)30分鐘，得到標(biāo)題化合物(5.222 g，86%)。ES/MS(m/e):(⁷⁹Br/⁸¹Br)586/588(M+H)。

制備例22

2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸芐基酯

將1,1'-羰二咪唑(2.87 g，17.7 mmol)加入到3-(苯甲酰硫代氨基甲?；被?-3-(5-溴-2-氟-苯基)-4-(羥甲基)吡咯烷-1-甲酸芐基酯(5.198 g，8.86 mmol)的THF(52 ml)溶液中。將該混合物在室溫下攪拌1.5小時(shí)，而后將該反應(yīng)在氮?dú)夥諊?、在回流下加熱過(guò)夜。冷卻該反應(yīng)，用水稀釋，并用EtOAc(3×)提取。將有機(jī)層合并，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并真空除去溶劑。用硅膠純化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，經(jīng)過(guò)30分鐘，得到標(biāo)題化合物(2.93 g，58%)。ES/MS(m/e):(⁷⁹Br/⁸¹Br)568/570(M+H)。

制備例23

N-[7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

將碘代三甲基甲硅烷(2.21 ml，15.46 mmol)逐滴加入到室溫的2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸芐基酯(2.93 g，5.15 mmol)的乙腈(44 ml)溶液中。在室溫下攪拌該反應(yīng)兩個(gè)小時(shí)，并真空除去溶劑。用SCX柱純化粗品，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后2∶1的DCM∶7N氨/甲醇，得到標(biāo)題化合物(2.098 g，94%)。ES/MS(m/e):(⁷⁹Br/⁸¹Br)434/436(M+H)。

制備例24

2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯

將二碳酸二叔丁基酯(1.16 g，5.31 mmol)和三乙胺(1.01 ml，7.25 mmol)加入到N-[7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(2.098 g，4.83 mmol)的DCM(48 ml)溶液中。將該反應(yīng)在室溫下、在氮?dú)夥諊袛嚢?小時(shí)。真空除去溶劑，用硅膠純化粗品，使用5%至100% EtOAc/己烷的梯度，經(jīng)過(guò)30分鐘，得到標(biāo)題化合物(2.556 g，99%)。ES/MS(m/e):(⁷⁹Br/⁸¹Br)534/536(M+H)。

制備例25

7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-2-苯甲酰胺基-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯

將2-苯甲酰胺基-7a-(5-溴-2-氟-苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯(2.556 g，4.8 mmol)和反式-N,N'-二甲基-1,2-環(huán)己二胺(150 mg，1.1 mmol)的乙醇(50 ml)溶液用疊氮化鈉(933 mg，14.3 mmol)處理。加入L-抗壞血酸鈉鹽的水溶液(0.66M，3.2 ml，2.1 mmol)和水(1 ml)，并將燒瓶的頂部用氮?dú)獯祾?。將該混合物用硫酸銅(II)五水合物的水溶液(0.33M，3.2 ml，1.1 mmol)處理，并在80℃下，在氮?dú)夥諊校瑢⒃摶旌衔锪⒓丛陬A(yù)熱的加熱板上加熱1.5小時(shí)。一旦加熱，獲得均勻混合物。冷卻該反應(yīng)，用冰水稀釋，并將該混合物用EtOAc(3×)提取。將有機(jī)提取物合并，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，真空除去溶劑，得到粗品疊氮化物。將該粗品疊氮化物與10%鈀/炭(1 g)/冷乙醇(150 ml)混合，并使用真空/氮?dú)?，而后真?氫氣，吹掃該混合物。將該混合物在室溫下、在30 psi的氫氣氛圍中攪拌5小時(shí)。排出反應(yīng)物，通過(guò)硅藻土過(guò)濾，并將濾餅用DCM沖洗。從濾液中真空除去溶劑，并將粗品用硅膠純化，使用50% EtOAc/DCM，得到標(biāo)題化合物(2.014 g，89%)。ES/MS(m/e): 471(M+H)。

制備例26

N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

將三氟乙酸(10 ml)加入到7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-2-苯甲酰胺基-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-6-甲酸叔丁基酯(2.013 g，4.28 mmol)的DCM(30 ml)溶液中，并將該混合物在室溫下、在氮?dú)夥諊袛嚢?小時(shí)。真空除去溶劑，用SCX柱純化粗品，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后使用2∶1的DCM∶7N氨/甲醇，得到標(biāo)題化合物(1.555 g，98%)。ES/MS(m/e): 371(M+H)。

制備例27

N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

在氮?dú)夥諊校瑢-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(705 mg，1.90 mmol)、5-氟-2-氯嘧啶(1.01 g,7.61 mmol)和DIPEA(1.66 ml，9.52 mmol)在1,4-二噁烷(20 ml)中加熱至回流，保持4小時(shí)。冷卻該反應(yīng)，用水稀釋，并用EtOAc(3×)提取。將有機(jī)層合并，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并真空除去溶劑，得到粗品。用硅膠純化粗品，使用5%至100%的EtOAc/己烷的梯度，經(jīng)過(guò)25分鐘，得到標(biāo)題化合物(590 mg，66%)。ES/MS(m/e): 467(M+H)。

制備例28

N-[(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(異構(gòu)體1)

將外消旋的N-[7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(1.694 g，3.63 mmol)用手性HPLC純化(柱∶Chiralcel OJ，8 x 35 cm；洗脫液∶90%甲醇(0.2%二甲基乙胺)和10%乙腈；流速400 ml/min，UV 280 nm)。第一個(gè)洗脫的異構(gòu)體的分析(柱∶Chiralcel OJ-H，0.46 x 15 cm；洗脫液∶10∶90的乙腈∶甲醇(含有0.2%二甲基乙胺)；流速∶0.6 ml/min，UV 280 nm)證明了對(duì)映體富集(99% ee)的對(duì)映體，Rt=6.70分鐘(723 mg，43%)。ES/MS(m/e): 467(M+H)。

制備例29

N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺(異構(gòu)體1)

將N-[(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟-苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(0.361 g，0.77 mmol，異構(gòu)體1)溶于DCM(4 ml)和DMF(0.5 ml)的混合物中。將5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(240 mg，1.55 mmol)、HOBT(210 mg，1.55 mmol)和EDCI(300 mg，1.55 mmol)加入到該混合物中，并將該混合物在室溫下攪拌過(guò)夜。將反應(yīng)溶液直接加到12g硅膠裝載的柱上，使用40 g硅膠柱純化，用0-100%的EtOAc/己烷的梯度進(jìn)行洗脫。將產(chǎn)物溶于EtOAc(200 ml)中，用1N NaOH(2×50 ml)和鹽水(1×50 ml)洗滌。重復(fù)上述硅膠純化，得到標(biāo)題化合物(350 mg，74%)。ES/MS(m/e): 603(M+H)。

制備例30

5-烯丙基-6a-(2-氟苯基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑

流動(dòng)化學(xué)反應(yīng)步驟∶將343 ml無(wú)縫不銹鋼管式反應(yīng)器(O.D=1/8英寸)放在GC爐內(nèi)部，并以20 ml/min的速度用甲苯?jīng)_洗20分鐘。施加氮?dú)獗硥?720 psig)，并將GC的溫度設(shè)定在210℃。溫度達(dá)到210℃之后，使用一對(duì)以連續(xù)方式工作的高壓注射泵，使2-(二烯丙基氨基)-1-(2-氟苯基)乙酮肟(480.51 g，1.74mol)的甲苯(5.81 L)溶液以22.866 ml/min的速度泵送通過(guò)反應(yīng)器，產(chǎn)生停留時(shí)間15分鐘。消耗了所有儲(chǔ)備溶液之后，將反應(yīng)器以22.866 ml/min的速度用甲苯?jīng)_洗30分鐘。GC爐的溫度設(shè)置在25℃，收集全部溶液，并真空濃縮。蒸發(fā)溶劑，并將殘余物溶于二氯甲烷(2.5 L)和水(5 L)中。用鹽酸將pH值調(diào)節(jié)至1，分離水層，并用氫氧化鈉中和，將pH值調(diào)節(jié)至10。用MTBE(3×2.5 L)提取水層。將有機(jī)提取物合并，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并蒸干，得到粗品標(biāo)題化合物(248 g，47%)，其不用進(jìn)一步純化，直接使用。ES/MS(m/e): 249(M+1)。

制備例31

1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇

將鋅粉(590 g，9 mol)加入到5-烯丙基-6a-(2-氟苯基)-3,3a,4,6-四氫-1H-吡咯并[3,4-c]異噁唑(3559 g，1.29 mol)的溶液(在甲醇(2.85 L)和飽和氯化銨水溶液(3.56 L)的混合物中)中，并將該混合物在70℃下加熱16小時(shí)。將該反應(yīng)冷卻至60℃，用THF(2.85 L)稀釋，趁熱時(shí)在硅藻土上過(guò)濾。蒸發(fā)濾液，除去有機(jī)溶劑，并將該水性混合物用10% w/w枸櫞酸水溶液(4 L)和EtOAc(3.5 L)稀釋。分離有機(jī)層，并將水層用EtOAc(2×2 L)洗滌。將水層用50% w/w氫氧化鈉中和，將pH值調(diào)節(jié)至10，而后用EtOAc(2×1.5 L)提取。將有機(jī)提取物合并，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并蒸干，得到粗品標(biāo)題化合物(299 g，92%)。ES/MS(m/e): 251(M+1)。

制備例32

[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇；2,3-二[(4-甲基苯甲?；?氧基]丁二酸

將二-對(duì)甲苯酰-L-酒石酸(348.6 g，884 mmol)的1-甲氧基-2-丙醇(1.13 L)溶液加入到預(yù)先在40℃加熱的[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇(225.9 g，902 mmol)的1-甲氧基-2-丙醇(1.13 L)溶液中。將該反應(yīng)冷卻至22℃，并攪拌18小時(shí)。過(guò)濾收集白色固體，并用1-甲氧基-2-丙醇(600ml)洗滌。將收集的固體干燥，得到標(biāo)題化合物(183.01 g，31.8%)。ES/MS(m/e): 251(M+1)。

制備例33

[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇

將[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇；2,3-二[(4-甲基苯甲酰基)氧基]丁二酸(211 g，331 mmol)溶于水(2.1L)和EtOAc(2.3L)中。加入35% w/w鹽酸，將pH值調(diào)節(jié)至1。分離水層，用50% w/w氫氧化鈉將pH值調(diào)節(jié)至10，并用EtOAc(2×)提取。將水層的pH值用NaOH水溶液調(diào)節(jié)至10，并用MTBE(3×)提取，同時(shí)保持該水溶液的pH值=10。將有機(jī)提取物合并，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并濃縮至干，得到粗品標(biāo)題化合物(73 g，88%，94.8%ee)。用手性色譜分析產(chǎn)物∶柱∶AS-H，洗脫液∶10%異丙醇、2%異丙胺；流速∶3 ml/min，UV 220；壓力∶100 bar，在35℃下以第二個(gè)洗脫的異構(gòu)體得到標(biāo)題化合物，Rf=2.26分鐘。ES/MS(m/e): 251(M+1)。

制備例34

N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

在氮?dú)夥諊?，?℃，將[(3R,4S)-1-烯丙基-4-氨基-4-(2-氟苯基)吡咯烷-3-基]甲醇(129.7 g，414 mmol)的THF(2.3L)溶液冷卻。加入苯甲酰異硫氰酸酯(61.5 ml，456 mmol)，保持溫度低于5℃。用3小時(shí)將該反應(yīng)升溫至室溫，加入1,1'-羰二咪唑(87.4 g，538.9 mmol)，并將該反應(yīng)在22℃下攪拌1小時(shí)，而后在70℃下加熱16小時(shí)。將該反應(yīng)混合物冷卻至22℃，并蒸發(fā)溶劑。將殘余物在EtOAc(1L)和水(1L)中分配。分離有機(jī)層，并將水層用EtOAc(2×400 ml)提取。將有機(jī)物合并，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并蒸干，得到粗品標(biāo)題化合物。用硅膠色譜純化粗品，用EtOAc/DCM(0-40% DCM)的梯度進(jìn)行洗脫，得到標(biāo)題化合物的淺黃色固體(170 g，99%)，其含有殘余溶劑。ES/MS(m/e): 396(M+1)。

制備例35

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

在氮?dú)夥諊?，將苯甲酸?-巰基-(122 g，793 mmol)、二(二亞芐基丙酮)鈀(4.15 g，7.21 mmol)和1,4-二(二苯基膦基)丁烷(3.14 g，7.21 mmol)加入到N-[(4aR,7aS)-6-烯丙基-7a-(2-氟苯基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(178.21 g，360 mmol)的無(wú)水2-甲基四氫呋喃(1.96 L)溶液中。通過(guò)真空/氮?dú)庋h(huán)三次，將該溶液脫氣，而后向該反應(yīng)中鼓入氮?dú)?5分鐘。將該反應(yīng)混合物加熱至40℃，同時(shí)向該反應(yīng)中鼓入氮?dú)?。?dāng)反應(yīng)達(dá)到40℃時(shí)，停止鼓入氮?dú)?，并在氮?dú)夥諊校瑢⒃摲磻?yīng)混合物在40℃下攪拌3小時(shí)。將該反應(yīng)冷卻至22℃，并用水(2 L)稀釋。加入HCl(5M)溶液，將pH值調(diào)節(jié)至1。分離水層，并用額外的EtOAc(2×800 ml)洗滌。將水層的pH值用50% w/w氫氧化鈉調(diào)節(jié)至10，而后用EtOAc(10L)提取。用額外的EtOAc(2×750mL)洗滌水層。將有機(jī)提取物合并，用鹽水洗滌，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并蒸干，得到粗品標(biāo)題化合物的淺黃色固體(124.7 g，97%)。ES/MS(m/e): 356(M+1)。

制備例36

N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺

將N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-4a,5,6,7-四氫-4H-吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(124.7 g，256 mmol)、DIPEA(67ml)、5-氟-2-氯嘧啶(29.3 ml，307 mmol)的N-甲基吡咯烷酮(997 ml)溶液加熱至100℃，保持16小時(shí)。將該反應(yīng)冷卻至22℃，并倒入10℃冷水(10 L)中，保持溫度低于15℃。過(guò)濾收集淡色的膏狀固體，并用額外的水洗滌。將濕的固體溶于EtOAc(2 L)中，并轉(zhuǎn)入分液漏斗中。加入5% w/w氯化鈉水溶液(1 L)，分離有機(jī)層，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，并減壓蒸發(fā)濾液。用硅膠色譜純化產(chǎn)物，使用0-40%的EtOAc/異己烷的梯度，得到標(biāo)題化合物的淺黃色固體(116 g，70%)。ES/MS(m/e): 452(M+1)。

制備例37

(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺

將氫氧化鋰(9.26 g，386 mmol)加入到N-[(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-基]苯甲酰胺(158.6 g，351.6 mmol)的甲醇(1.6 L)混合物中。將該混合物在70℃下加熱4小時(shí)，而后冷卻至22℃。真空蒸發(fā)該反應(yīng)混合物，得到黃色殘余物。將殘余物在水(1L)和EtOAc(750 ml)中分配。加入HCl(5M水溶液)，將pH值調(diào)節(jié)至1。分離水層，并將有機(jī)層用EtOAc(2×200 ml)洗滌。將水層的pH值用50% w/w氫氧化鈉水溶液調(diào)節(jié)至pH=10，并用EtOAc(3×1L)提取。將有機(jī)提取物合并，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸發(fā)，得到粗品標(biāo)題化合物的淺黃色固體(133.3 g，99%，含有12%殘余的EtOAc)。ES/MS(m/e): 348(M+1)。

制備例38

(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺

將硫酸(33.4 ml，626.6 mmol)加入到(4aR,7aS)-7a-(2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(45.8 g，125.3 mmol)的三氟乙酸(626 ml)溶液中。將該混合物冷卻至0℃，并攪拌20分鐘。加入發(fā)煙硝酸(6.2 mL，144.1 mmol)，將該反應(yīng)混合物升溫至22℃，并攪拌3小時(shí)。蒸發(fā)該反應(yīng)混合物，加入MTBE(250 ml)，并蒸發(fā)兩次。將殘余物真空干燥至恒重，而后溶于水(147 ml)和乙醇(885 ml)中，并鼓入氮?dú)?5分鐘，進(jìn)行脫氣。將該溶液轉(zhuǎn)入壓力反應(yīng)器中，并加入87L類型的10% Pd/C糊狀物(6.6 g，6.27 mmol)。將該混合物用額外的乙醇(700 ml)稀釋，并在80 psi下用氫氣加壓16小時(shí)。過(guò)濾該反應(yīng)混合物，而后將第二個(gè)催化劑進(jìn)料加入87L糊狀物型態(tài)的10% Pd/C(6.6 g，6.27 mmol)，并在壓力反應(yīng)器中，將該混合物加壓到80 psi，攪拌3天。用氮?dú)獯祾咴摲磻?yīng)混合物，并用硅藻土過(guò)濾。蒸發(fā)濾液，并將殘余物在水(200ml)和EtOAc(200 ml)之間分配。分離水層，冷卻至5℃，并用15% w/w氫氧化銨中和。將水層用EtOAc(3×150 ml)提取。將有機(jī)物合并，用硫酸鈉干燥，過(guò)濾，減壓蒸發(fā)，得到標(biāo)題化合物的淺棕色固體(47.7 g，99%，含有殘余的EtOAc)。ES/MS(m/e): 363(M+1)。

實(shí)施例1

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺鹽酸鹽

將N-[3-[(4aR,7aS)-2-苯甲酰胺基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺(0.350 g，0.58 mmol，異構(gòu)體1)溶于THF(2 ml)中，而后加入甲醇(4 ml)和乙醇(4 ml)。將O-甲基羥胺鹽酸鹽(495 mg，5.81 mmol)和吡啶(470μl，5.81 mmol)加入到該混合物中，將該反應(yīng)升溫至50℃，并攪拌過(guò)夜。將硅膠(～10 g)加入到該反應(yīng)中，并濃縮該混合物。將在硅膠上干燥的樣品裝載到空柱上，純化，用0-10%的7N氨甲醇/DCM的梯度進(jìn)行洗脫。在SCX柱上再次純化粗品，使用3∶1的DCM∶甲醇，而后使用2∶1的DCM∶7N氨/甲醇。最后一次用硅膠純化該產(chǎn)物，使用0%至10%的7N氨甲醇/DCM的梯度，得到標(biāo)題化合物的游離堿。將該物質(zhì)溶于DCM(5 ml)中，并加入1M鹽酸/乙醚(0.20 ml，660μmol)。真空除去溶劑，得到標(biāo)題化合物(71 mg，23%)。ES/MS(m/e): 498(M+H)。

X射線粉末衍射(XRD)

在配備有CuKa源(λ= 1.54060?)和Vantec檢測(cè)器的Bruker D4 Endeavor X射線粉末衍射儀(在35 kV和50 mA下操作)上獲得結(jié)晶固體的XRD圖。在4和40°(2θ)之間掃描樣品，步長(zhǎng)為0.009°(2θ)，掃描速率為0.5秒/步長(zhǎng)，發(fā)散度0.6 mm，5.28固定的防散射，檢測(cè)器狹縫為9.5 mm。將干粉填裝到石英樣品座上，并使用載玻片獲得光滑表面。在環(huán)境溫度和相對(duì)濕度下收集結(jié)晶形式的衍射圖。結(jié)晶學(xué)領(lǐng)域眾所周知的是，對(duì)于任何給定的結(jié)晶形式，衍射峰的相對(duì)強(qiáng)度可能由于例如晶體形態(tài)和特性等因素引起的優(yōu)先取向而改變。如果存在優(yōu)先取向的效果，峰強(qiáng)度改變，但多晶型物的特征峰位置沒(méi)有變化。參見(jiàn)，例如，The United States Pharmacopeia #23, National Formulary #18, 第1843-1844頁(yè), 1995。此外，結(jié)晶學(xué)領(lǐng)域還眾所周知的是，對(duì)于任何得到的結(jié)晶形態(tài)，有角度的峰位置可能輕微改變。例如，由于分析樣品時(shí)的溫度或濕度變化、樣品替換、或存在或不存在內(nèi)標(biāo)，峰位置可能移動(dòng)。在本發(fā)明的情況下，±0.2(2θ)的峰位置的變化性將會(huì)考慮到這些可能的變化，不會(huì)妨礙明確鑒別所指明的結(jié)晶形式?；谔卣鞣?單位°2θ)的任何獨(dú)特組合，典型地是更突出的峰，可以確定結(jié)晶形式?；贜IST 675標(biāo)準(zhǔn)峰(在8.853和26.774度2θ)，調(diào)節(jié)在環(huán)境溫度和相對(duì)濕度下收集的結(jié)晶形式的衍射圖。

實(shí)施例1a

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式1

將N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺(201 mg，403.20 μmoles)與4 ml乙酸丁酯混合，并在120℃攪拌板上攪拌。大約5分鐘之后，固體溶解，得到清澈的無(wú)色溶液。然后，將樣品冷卻至室溫，從溶液中沉淀出白色固體。然后，在室溫下，使樣品成漿10分鐘，得到白色固體的濃漿液。通過(guò)真空過(guò)濾，將白色固體分離，并在空氣流中干燥5分鐘。將得到的白色固體餅放在稱量瓶(tared vial)中，放在60℃的真空烘箱中度過(guò)周末，提供標(biāo)題化合物(110 mg)。在室溫和小于大約15%的相對(duì)濕度下，N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式1是穩(wěn)定的結(jié)晶形式。

實(shí)施例1b

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式2(水合物)

將草酰氯(888 μl，10.2 mmol)加入到5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(1.6 g，10.2 mmol)的乙腈(53 ml)和DMF(848μl)溶液中。15分鐘之后，將該新制備的溶液加入到(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(2.65 g，7.3 mmol)的溶液(在水(53 ml)和乙醇(53 ml)的混合物中，預(yù)先在50℃下加熱)中。將該反應(yīng)混合物在50℃下攪拌一個(gè)小時(shí)，冷卻至22℃，而后在此溫度下攪拌過(guò)夜。真空蒸發(fā)有機(jī)溶劑，并將該水性混合物用50% w/w的氫氧化鈉水溶液處理，調(diào)節(jié)pH=10。分離淡色的膏狀固體，并用額外的水洗滌。用異丙醇(2×)稀釋固體，并將溶劑蒸發(fā)。用硅膠色譜純化粗品，使用氨化的甲醇(2N)/二氯甲烷的梯度。將含有目標(biāo)產(chǎn)物的級(jí)分合并，蒸發(fā)溶劑，得到標(biāo)題化合物的灰白色固體(1.9 g，52%)。ES/MS(m/e): 499(M+1)。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式2(水合物)的另一個(gè)制備例

將乙腈(500 ml)加入到DMF(19.2 ml，248.9 mmol)中。將草酰氯(39.3 g，309.63 mmol)加入到該DMF/乙腈溶液中，而后加入5-甲氧基吡嗪-2-甲酸(46.0g，298.4 mmol)。在單獨(dú)的燒瓶中，將(4aR,7aS)-7a-(5-氨基-2-氟苯基)-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-2-胺(56.8 g，156.75 mmol)的水溶液加入到乙腈(500 ml)中，并用氫氧化銨(95 ml)將pH值調(diào)節(jié)至9。然后，將該混合物加熱到50-55℃。逐滴加入草酰氯溶液，并將該混合物攪拌3小時(shí)。將pH值用氫氧化銨調(diào)節(jié)至8-9。濾出所得到的沉淀，用水洗滌，干燥，獲得標(biāo)題化合物(123 g)。使固體在丙酮(250 ml)中形成漿液，保持1.5小時(shí)，并過(guò)濾。用丙酮洗滌濕濾餅，獲得標(biāo)題化合物(110g，HPLC純度90.5%)。將THF(1 L)和活性炭(9 g)加入到固體中，并將該混合物加熱至回流過(guò)夜。通過(guò)硅藻土過(guò)濾該混合物，并用THF(150 ml)洗滌。濃縮有機(jī)溶液至1/10體積，并加熱到60℃。加入水(430 ml)，并將該混合物在60℃下攪拌8小時(shí)。將該混合物冷卻至室溫，并攪拌10小時(shí)。濾出所得到的固體，用THF/水(7:6)洗滌，干燥，得到標(biāo)題化合物(69 g，88%)。LC-MS: m/z=499(M+1)，純度∶98.3%。¹H NMR(400 MHz, DMSO-d₆) δ ppm 2.99-3.07(m, 2 H)3.07-3.14(m, 1 H)3.58-3.67(m, 1 H)3.68-3.76(m, 1 H)3.76-3.84(m, 1 H)4.02(s, 3 H)4.07(d, J=10.92 Hz, 1 H)6.08(s, 2 H)7.19(dd, J=11.98, 8.72 Hz, 1 H)7.78-7.89(m, 2 H)8.41(s, 1 H)8.44(s, 2 H)8.88(s, 1 H)10.60(s, 1 H)。

制備N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式2(水合物)的一般方法

在大約23℃，使N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺在THF中形成漿液，濃度為大約71 mg/ml溶劑。在攪拌下，加熱該漿液，在大約60℃至大約63℃出現(xiàn)溶解。將水加入到該熱溶液中，提供大約95∶5的THF∶水溶劑比例。加入N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式2的晶種(大約3重量%負(fù)載)。將得到的稀漿液在大約60℃至大約63℃下保持大約20分鐘，而后，用大約2至大約4小時(shí)加入大約5.3至大約5.5體積的水，形成大約69∶31的THF∶水溶劑比例。然后，將該漿液在大約60℃至大約63℃下保持大約30分鐘，而后用大約1小時(shí)冷卻至大約23℃，而后攪拌大約8-12小時(shí)。然后，過(guò)濾該漿液，用THF∶水(35∶65)輕輕地沖洗，并在大約40℃，真空干燥大約8-12小時(shí)，提供需要的N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式2，它是水合物。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式2的制備樣品的特點(diǎn)在于：使用CuKa輻射的XRD圖具有下面表1所述的衍射峰(2θ值)。具體地說(shuō)，該圖包括處于11.8°的峰，以及一個(gè)或多個(gè)選自18.6°、19.3°和26.7°的峰；衍射角的容許誤差為0.2度。

表1∶實(shí)施例1b的結(jié)晶形式2的X射線粉末衍射峰

在室溫和高于大約15%的相對(duì)濕度下，N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式2是穩(wěn)定的結(jié)晶形式。

實(shí)施例1c

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式3

將N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺加入到熱重分析盤中，加熱至大約170℃，并在170℃下保持大約5分鐘。冷卻至室溫，提供標(biāo)題化合物。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式3的另一個(gè)制備例

在管瓶中，將N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺(121 mg)與乙腈(5 ml)混合，并在90℃攪拌板上加熱。大約30分鐘之后，大部分固體溶解，提供渾濁的溶液。加入結(jié)晶形式3的晶種，并將該樣品在大約90℃下攪拌大約1小時(shí)。去除加熱，攪拌該混合物，提供亮白色固體。通過(guò)真空過(guò)濾分離固體，在空氣流中干燥大約10分鐘，而后在大約80℃下抽真空大約8至12小時(shí)，提供標(biāo)題化合物。

N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的結(jié)晶形式3的制備樣品的特點(diǎn)在于：使用CuKa輻射的XRD圖具有下面表2所述的衍射峰(2θ值)。具體地說(shuō)，該圖包括處于15.7°的峰，以及一個(gè)或多個(gè)選自18.1°、27.0°和19.7°的峰；衍射角的容許誤差為0.2度。

表2∶實(shí)施例1c的結(jié)晶形式3的X射線粉末衍射峰

體外試驗(yàn)方法∶

對(duì)于體外酶和細(xì)胞試驗(yàn)，在DMSO中制備試驗(yàn)化合物，形成10 mM儲(chǔ)備溶液。將儲(chǔ)備溶液在DMSO中連續(xù)稀釋，獲得十點(diǎn)稀釋曲線，在96孔圓底板中，最終化合物濃度范圍是10 mM至0.05nM，而后進(jìn)行體外酶和全細(xì)胞試驗(yàn)。

體外蛋白酶抑制試驗(yàn)∶

人類BACE1的表達(dá)

利用RT-PCR，由整個(gè)腦cDNA克隆人類BACE1(登錄號(hào)∶AF190725)。將氨基酸序列#1至460所對(duì)應(yīng)的核苷酸序列插入到編碼人類IgG₁(Fc)多肽的cDNA中(Vasser等人，Science, 286, 735-741(1999))。將BACE1(1-460)和人類Fc的融合蛋白(名稱為huBACE1:Fc)構(gòu)建到pJB02載體中。在HEK293細(xì)胞中短暫地表達(dá)人類BACE1(1-460):Fc(huBACE1:Fc)。將250 μg的各構(gòu)成的cDNA與Fugene 6混合，并加入到1升HEK293細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染之后四天，采集條件培養(yǎng)基，進(jìn)行純化。

huBACE1:Fc的純化

用蛋白A色譜純化huBACE1:Fc。在少量的等分樣品中，將酶在-80℃下儲(chǔ)存。

BACE1 FRET試驗(yàn)

如上所述，制備試驗(yàn)化合物的系列稀釋物。將化合物在KH₂PO₄緩沖液中進(jìn)一步稀釋20×。在相應(yīng)的低蛋白結(jié)合的黑色板的A排至H排上，將10μL的每個(gè)稀釋物加入到每個(gè)孔中，所述黑色板含有反應(yīng)混合物(25μL的50mM KH₂PO₄，pH4.6，1mM TRITON? X-100，1mg/ml牛血清白蛋白，以及15μM的FRET底物)(參見(jiàn)，Yang等人，J. Neurochemistry, 91(6)1249-59(2004))。在板振蕩器上，將內(nèi)含物充分混合10分鐘。將在KH₂PO₄緩沖液中的15μL的二百pM人類BACE1(1-460):Fc(參見(jiàn)，Vasser等人，Science，286，735-741(1999))加入到含有底物和試驗(yàn)化合物的板中，使反應(yīng)開(kāi)始。在板振蕩器上簡(jiǎn)略混合之后，在激發(fā)波長(zhǎng)355 nm和發(fā)射波長(zhǎng)460 nm下，記錄時(shí)間0時(shí)的混合物的RFU。用鋁箔覆蓋反應(yīng)板，并在室溫下、在黑暗的濕潤(rùn)烘箱中保持16至24小時(shí)。記錄培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的RFU，激發(fā)和發(fā)射設(shè)置與時(shí)間0所使用的相同。時(shí)間0時(shí)的RFU與培養(yǎng)結(jié)束時(shí)的RFU的差值代表在化合物處理?xiàng)l件下的BACE1的活性。將RFU差值相對(duì)于抑制劑濃度作圖，并將曲線與四參數(shù)邏輯斯諦方程擬合，獲得EC₅₀值和IC₅₀值(參見(jiàn)，Sinha等人，Nature, 402, 537-540(2000))。

基本上如上所述，檢驗(yàn)實(shí)施例1的化合物，并且具有0.615 nM的BACE1 IC₅₀值(±0.101，n=5)[平均值±SEM；SEM=平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差。這些數(shù)據(jù)表明，實(shí)施例1的化合物體外抑制純的重組BACE1酶活性。

PDAPP原代神經(jīng)元試驗(yàn)

在PDAPP轉(zhuǎn)基因胚胎期的小鼠中產(chǎn)生的原代神經(jīng)元培養(yǎng)物中，還進(jìn)行驗(yàn)證性的全細(xì)胞試驗(yàn)。由胚胎期的16天PDAPP胚胎，制備原代皮層神經(jīng)元，并在96孔板中培養(yǎng)(15 x 10⁴個(gè)細(xì)胞/孔，在DMEM/F12(1:1)+10% FBS中)。體外2天之后，用不含血清的DMEM/F12(1:1)(含有B27添加物和2μM(最終)Ara-C(Sigma，C1768))替換培養(yǎng)基。體外第5天，在存在/不存在希望濃度的抑制劑(在DMSO中稀釋)的條件下，將神經(jīng)元在37℃下培養(yǎng)24小時(shí)。培養(yǎng)結(jié)束時(shí)，分析條件培養(yǎng)基對(duì)于β-分泌酶活性的證據(jù)，例如，分析Abeta肽。使用單克隆的266作為捕獲抗體，生物素化的3D6作為報(bào)道抗體，利用夾心ELISA測(cè)定全部Abeta肽(Abeta₁-x)。另外，使用單克隆2G3作為對(duì)于Abeta1-40的捕獲抗體，單克隆21F12作為對(duì)于Abeta1-42的捕獲抗體，通過(guò)夾心ELISA，測(cè)定Abeta 1-40和Abeta 1-42肽。Abeta1-40和Abeta1-42 ELISA使用生物素化的3D6作為報(bào)道抗體。在這種條件下，化合物處理之后，條件培養(yǎng)基釋放的Abeta的濃度與BACE1的活性對(duì)應(yīng)。繪制10點(diǎn)抑制曲線，并且與四參數(shù)邏輯斯諦方程擬合，獲得Abeta降低效果的EC₅₀值和IC₅₀值?；旧先缟纤觯瑱z驗(yàn)實(shí)施例1的化合物，對(duì)于Abeta降低效果顯示出下列活性∶

表3

平均值±SEM；SEM=平均值的標(biāo)準(zhǔn)誤差

這些數(shù)據(jù)表明，實(shí)施例1的化合物在全細(xì)胞中抑制Abeta的產(chǎn)生。

體內(nèi)抑制β-分泌酶

一些動(dòng)物模型，包括小鼠、豚鼠、狗和猴子的模型，可以用于篩選化合物處理之后的體內(nèi)β-分泌酶活性抑制作用。本發(fā)明使用的動(dòng)物可以是野生型、轉(zhuǎn)基因或基因敲除的動(dòng)物。例如，按照Games等人在Nature 373(523-527(1995))中所述制備的PDAPP小鼠模型，以及其它非轉(zhuǎn)基因的或基因敲除動(dòng)物，可用于分析在抑制化合物存在下體內(nèi)抑制Abeta和sAPPbeta的產(chǎn)生。通常，給予2至12個(gè)月大的PDAPP小鼠、基因敲除小鼠或非轉(zhuǎn)基因動(dòng)物配制在賦形劑中的化合物，賦形劑可以是，例如，玉米油、環(huán)糊精(cyclodextran)、磷酸鹽緩沖液、PHARMASOLVE?或其它合適的賦形劑。給予化合物之后一至二十四小時(shí)，將動(dòng)物殺死，取出腦以及腦脊液和血漿，用于分析Abetas、C99和sAPP片段(參見(jiàn)，May等人，Journal of Neuroscience, 31, 16507-16516(2011))。

對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)體內(nèi)藥理學(xué)研究，給動(dòng)物服用各種濃度的化合物，并與同時(shí)給藥的賦形劑處理的對(duì)照組進(jìn)行比較。對(duì)于一些時(shí)程研究，從選擇的動(dòng)物中獲得腦組織、血漿或腦脊液，從時(shí)間0開(kāi)始，形成基線。給予其它組化合物或合適的賦形劑，并在給藥之后的各個(gè)時(shí)間，將動(dòng)物殺死。從選擇的動(dòng)物中獲得腦組織、血漿或腦脊液，分析APP斷裂產(chǎn)物的出現(xiàn)，包括Abeta肽、sAPPbeta及其它APP片段，例如，利用特定的夾心ELISA試驗(yàn)。在試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，將動(dòng)物殺死，根據(jù)情況，分析腦組織、血漿或腦脊液中出現(xiàn)的Abeta肽、C99和sAPPbeta。在化合物處理之后，還可以分析APP轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的腦組織中的β-淀粉樣蛋白斑塊的數(shù)量。本文使用的“Abeta 1-x肽”是指從殘基1開(kāi)始和以殘基28以上的C末端結(jié)尾的Abeta種類的總和。這可以檢測(cè)大部分Abeta種類，并且通常稱為“全部Abeta”。

與賦形劑處理的對(duì)照物或零時(shí)對(duì)照物相比較，給予抑制化合物的動(dòng)物(PDAPP或其它APP轉(zhuǎn)基因的或非轉(zhuǎn)基因小鼠)，可以顯示出Abeta或sAPPbeta在腦組織、血漿或腦脊液中的降低，以及β淀粉樣蛋白斑塊在腦組織中的減小。對(duì)于實(shí)施例1，給予0.3、1或3 mg/kg口服劑量的化合物之后3小時(shí)，相比于賦形劑處理的小鼠，Abeta_1-x肽在腦海馬中的水平分別降低大約31%、39%和61%，在大腦皮質(zhì)中分別降低大約28%、42%和64%。

考慮到實(shí)施例1針對(duì)BACE酶的體外活性，這些Abeta降低效果與體內(nèi)BACE抑制一致，并且進(jìn)一步證明了N-[3-[(4aR,7aS)-2-氨基-6-(5-氟嘧啶-2-基)-4,4a,5,7-四氫吡咯并[3,4-d][1,3]噻嗪-7a-基]-4-氟-苯基]-5-甲氧基-吡嗪-2-甲酰胺的CNS滲透性。

這些研究表明，本發(fā)明的化合物抑制BACE，并因此用于降低Abeta水平。