本發(fā)明涉及新型化合物、它們的應(yīng)用以及與之相關(guān)的治療方法。

更具體地，本發(fā)明涉及新型熒光合成類視色素(retinoid)化合物及其在控制細胞分化中的應(yīng)用。本發(fā)明還提供了使用本發(fā)明的新型化合物的藥物治療方法。

背景技術(shù)：

維生素a(視黃醇)及其衍生物屬于被稱為類視色素的一類化合物。類視色素是一類重要的信號分子，該信號分子參與控制從胚胎發(fā)生到成體內(nèi)穩(wěn)態(tài)的許多重要的生物學(xué)途徑以及干細胞發(fā)育的許多方面，如干細胞增殖、分化和凋亡。

類視色素在結(jié)構(gòu)和/或功能上與維生素a有關(guān)；并且許多類視色素具有生物活性，包括全反式視黃酸(atra)。atra是最豐富的內(nèi)源性類視色素并且已被廣泛研究多年；atra在生理和實驗條件下異構(gòu)化，具有激活不同受體的不同異構(gòu)體，因此解釋了對這些小分子觀察到的各種生物學(xué)效應(yīng)。

盡管類視色素的毒性抑制了其廣泛使用，但是由于類視色素在正常細胞和腫瘤細胞兩者中能夠控制分化和凋亡，因此使得它們具有作為化學(xué)預(yù)防劑和化學(xué)治療劑的潛力。

然而，atra顯示出差的穩(wěn)定性，特別是在暴露于光下時。atra化合物在暴露于光下時會異構(gòu)化和降解。為了克服這個問題，人們努力在暗處存儲和使用atra，但是這樣的預(yù)防措施增加了與使用atra有關(guān)的成本，并且不能完全減輕該問題。此外，由于atra在儲存時易于光異構(gòu)化和降解，因此難以準確地預(yù)測以單劑量施用的活性化合物的量。人們試圖通過合成穩(wěn)定的類視色素化合物從而克服與atra有關(guān)的問題。通常認為atra由于其共軛連接基團而易于光解異構(gòu)化。

國際專利申請no.pct/gb2007/003237(wo2008/025965)公開了表現(xiàn)出良好穩(wěn)定性并誘導(dǎo)細胞分化的新的類視色素化合物。

一個特別令人關(guān)注的化合物是其由reinnervate銷售：

通常表現(xiàn)出良好的光照穩(wěn)定性，并且在儲存時表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性。還發(fā)現(xiàn)不易于代謝降解，因此在人體或動物體中可能具有相對長的相關(guān)半衰期。然而，僅是弱熒光，并且需要可能會損害生物樣品的紫外線激發(fā)。

熒光成像已經(jīng)迅速成為調(diào)查生物學(xué)過程的有力工具，特別是在活細胞中，其中在活細胞的生理環(huán)境中可能觀察到細胞事件。單分子可視化技術(shù)的發(fā)展極大增強了熒光顯微術(shù)對此類應(yīng)用的有效性，使得能夠在其內(nèi)源環(huán)境中跟蹤蛋白質(zhì)和小分子。

熒光是一種發(fā)光形式，其中吸收了光或其他電磁輻射的物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)發(fā)射光。在熒光中，發(fā)射光的波長通常比吸收光的波長更長(并且能量更低)。這種現(xiàn)象被稱為斯托克斯位移，并且歸因于在發(fā)射吸收的光子之前，通常通過振動弛豫到第一激發(fā)態(tài)(s1)的最低能級而導(dǎo)致的能量損失。量子效率給出了熒光過程的效率：它定義為發(fā)射的光子數(shù)與吸收的光子數(shù)之比(最大值＝1，即，每個吸收光子都會產(chǎn)生發(fā)射光子)。熒光衰減通常是指數(shù)衰減，并且熒光壽命是指在經(jīng)歷松弛回到基態(tài)之前保持在激發(fā)態(tài)的分子的半衰期的量度。在磷光中，觀察到較長的激發(fā)態(tài)壽命，隨后是來自激發(fā)三重線態(tài)的輻射衰減(即光子發(fā)射)。

阿霉素是用于治療許多癌癥的化療藥物，這些癌癥包括白血病、霍奇金淋巴瘤、膀胱癌、乳腺癌、胃癌、肺癌、卵巢癌和甲狀腺癌。分子的兩親性質(zhì)和兩性性質(zhì)是指藥物能夠同時結(jié)合細胞膜和蛋白質(zhì)。

由于阿霉素的固有熒光，該化合物也成為熒光成像領(lǐng)域中的通用研究工具，因此已經(jīng)在各種細胞和組織中看到了其分布。由于發(fā)現(xiàn)阿霉素的熒光強度取決于其濃度和微環(huán)境，所以能夠通過考慮阿霉素與諸如dna、組蛋白和磷脂之類的細胞成分的相互作用來表征卵巢癌a2780細胞中的藥物的細胞內(nèi)攝取和運輸。

目前，阿霉素是唯一已知的具有固有熒光發(fā)射性以及顯著生物活性的小分子。因此，如果可以將熒光摻入至干細胞發(fā)育的小分子調(diào)節(jié)劑中，這本身就構(gòu)成了強大的探針，并且不需要使用熒光染料、蛋白質(zhì)和量子點。特別地，使用活細胞跟蹤技術(shù)將提供關(guān)于細胞攝取和定位的寶貴信息，從而提供對類視色素活性和新陳代謝的新見解。此外，由于不再需要將大熒光實體附著至目標分子上，所以目標分子可以在其天然環(huán)境的生理背景下被追蹤。此外，產(chǎn)生可能具有有用的熒光性質(zhì)的惰性熒光探針也可能是有利的。

因此，為了改進熒光成像，需要這樣的新型熒光團，該熒光團表現(xiàn)出良好儲存穩(wěn)定性并且不易于代謝降解，因此在體內(nèi)具有相對長的相關(guān)半衰期。因此，本發(fā)明的目的是提供穩(wěn)定的熒光類視色素。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明通過制備具有給電子氮的新型分子體系以提供高度共軛結(jié)構(gòu)，從而提供型分子的熒光型。

因此，根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種游離形式或鹽形式的式i的化合物及其異構(gòu)體：

其中

r¹為氫、烷基c1-10或酰基；

r²、r³、r⁴和r⁵可以相同或不同，并且分別為氫或烷基c1-4，或者成對的r²和r⁴或成對的r³和r⁵表示鍵；

r⁶和r⁷可以相同或不同，并且分別為氫、烷基c1-4，或者成對的r⁴和r⁶或成對的r⁵和r⁷表示鍵，或r⁶和r⁷一起形成基團：

＝cr¹¹r¹²；

條件是：如果來自r²、r³、r⁴和r⁵的一對基團表示鍵，則成對的r⁴和r⁶或成對的r⁵和r⁷不表示鍵；

r⁸和r⁹可以相同或不同，并且分別為氫、烷基c1-10、芳基、芳烷基、鹵素、三氟烷基、氰基、硝基、-nr^ar^b、-or^a、-c(o)r^a、-c(o)or^a、-oc(o)r^a、-s(o)r^ar^b和-c(o)nr^ar^b；

r¹¹和r¹²可以相同或不同，并且分別為氫或烷基c1-10；以及

r^a和r^b可以相同或不同，并且分別為氫或烷基c1-10；

r¹⁰為基團ii、iii、iv、v、vi、vii、viii、ix、x或xi：

其中r¹³為氫或烷基c1-10。

如本文所用，術(shù)語“烷基”是指完全飽和的、支鏈的、無支鏈的或環(huán)狀的烴部分，即伯烷基、仲烷基或叔烷基，或者在適當(dāng)?shù)那闆r下，其指的是環(huán)烷基或被環(huán)烷基取代的烷基，它們也可以是飽和或不飽和的烷基。如果沒有另外指出，則烷基優(yōu)選包含1至10個碳原子、更優(yōu)選1至7個碳原子或1至4個碳原子。烷基的代表性實例包括但不限于甲基、乙基、正丙基、異丙基、正丁基、仲丁基、異丁基、叔丁基、正戊基、異戊基、新戊基、正己基、3-甲基己基、2,2-二甲基戊基、2,3-二甲基戊基、正庚基、正辛基、正壬基、正癸基等。

如本文所用，術(shù)語“芳基”是指僅由氫和碳組成且包含6至19個碳原子、優(yōu)選6至10個碳原子的芳族單環(huán)或多環(huán)烴環(huán)體系，其中該環(huán)體系可以是部分飽和的。芳基包括但不限于諸如芴基、苯基、茚基和萘基之類的基團。除非在本說明書中另有具體說明，否則術(shù)語“芳基”或前綴“芳(ar)-”(例如“芳烷基”)意在包括任選被一個或多個取代基取代的芳基，所述取代基選自由烷基、烯基、炔基、鹵素、鹵代烷基、氰基、硝基、氨基、脒基、芳基、芳烷基、環(huán)烷基、環(huán)烷基烷基、雜環(huán)基、雜環(huán)基烷基、雜芳基或雜芳基烷基構(gòu)成的組中。優(yōu)選的芳基是任選被取代的苯基或萘基。

芳基可以為單環(huán)、雙環(huán)、三環(huán)或多環(huán)，優(yōu)選為單環(huán)、雙環(huán)或三環(huán)，更優(yōu)選為單環(huán)或雙環(huán)。

在本發(fā)明的一個方面中，r¹⁰為如本文所限定的基團ii、iii或iv。

在本發(fā)明的一個方面中，r¹為烷基c1-10，優(yōu)選為烷基c1-3。

在本發(fā)明的一個方面中，r²、r³、r⁴和r⁵分別為氫。

在本發(fā)明的一個方面中，成對的r²和r⁴或成對的r³和r⁵表示鍵。

在本發(fā)明的一個方面中，r⁶和r⁷相同或不同；r⁶和r⁷可以分別表示烷基c1-4，例如甲基。

如本文所用，術(shù)語“鹵素”或“鹵代”是指氟、氯、溴和碘。

在本發(fā)明的另一方面中，r¹⁰為如本文所限定的基團ii。

在本發(fā)明的另一方面中，r¹⁰為如本文所限定的基團iii。

在本發(fā)明的另一方面中，r¹⁰為如本文所限定的基團iv。

在本發(fā)明的另一方面中，r¹⁰為如本文所限定的基團v。

在本發(fā)明的另一方面中，r¹⁰為如本文所限定的基團vi。

在本發(fā)明的另一方面中，r¹⁰為如本文所限定的基團vii。

在本發(fā)明的另一方面中，r¹⁰為如本文所限定的基團viii。

在本發(fā)明的另一方面中，r¹⁰為如本文所限定的基團ix。

在本發(fā)明的另一方面中，r¹⁰為如本文所限定的基團x。

在本發(fā)明的另一方面中，r¹⁰為如本文所限定的基團xi。

部分–co2r¹³優(yōu)選位于4位，即在乙炔基的對位。r¹³優(yōu)選為氫。

可以提及的式i的化合物包括選自由以下化合物構(gòu)成的組中的那些化合物：

游離形式或鹽形式的4-2-[4,4-二甲基-1-(丙-2-基)-1,2,3,4-四氫喹啉-6-基]乙炔基苯甲酸(9)；和

6-(1,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氫喹啉-6-基)-萘-2-羧酸甲酯(11)；

3-[4-(1,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氫喹啉-6-基)-苯基]-丙烯酸甲酯(13)；和

4-2-[2,4,4-三甲基-1-(丙-2-基)-1,4-二氫喹啉-6-基]乙炔基苯甲酸(17)；以它們的異構(gòu)體。

諸如atra之類的類視色素化合物在儲存時是不穩(wěn)定的。特別地，當(dāng)這種化合物暴露于300nm至400nm區(qū)域的光時易于光異構(gòu)化和降解。令人驚奇的是，本發(fā)明的式i的化合物在暴露于光時是穩(wěn)定的，并且經(jīng)歷的光異構(gòu)化和降解遠少于atra。通常，式1的化合物的穩(wěn)定性比諸如atra之類的類視色素好得多，特別是式1的化合物受光異構(gòu)化的影響更小。通常，在本發(fā)明的化合物暴露于波長為300nm至400nm的光3天后，其經(jīng)歷的異構(gòu)化和降解比atra少得多。通常，在本發(fā)明的化合物暴露于波長為300nm至400nm的光3天后，保留有至少60重量％的本發(fā)明化合物(而atra為小于40重量％)。

通常，本發(fā)明的化合物誘導(dǎo)干細胞(例如人神經(jīng)干細胞)分化為神經(jīng)亞型。通常，本發(fā)明的化合物誘導(dǎo)細胞分化至與已知類視色素(例如atra)相當(dāng)或更大的程度。

將包含干細胞(例如，源自人胎兒腦組織的腹側(cè)中腦的細胞)的樣品暴露于補充有本發(fā)明化合物的基質(zhì)后，可以顯著增加表達神經(jīng)元標記物的分化細胞數(shù)。通常，可以將樣品暴露于這種基質(zhì)約7天。

在根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選應(yīng)用中，提供了如本文定義的化合物或組合物在干細胞分化為至少一種分化細胞類型中的應(yīng)用。

干細胞通?？梢允侨嘶騽游锶芨杉毎貏e是非人全能干細胞，例如哺乳動物(例如小鼠、大鼠或兔)的全能細胞。

可選地，干細胞可以是人或動物亞全能干細胞，優(yōu)選為人亞全能干細胞。

在本發(fā)明的可替代的優(yōu)選實施方案中，所述干細胞是人或動物的多能干細胞。

在本發(fā)明的優(yōu)選實施方案中，所述多能干細胞選自由以下細胞構(gòu)成的組：造血干細胞、神經(jīng)干細胞、骨干細胞、肌肉干細胞、間充質(zhì)干細胞、上皮干細胞(源自諸如皮膚、胃腸粘膜、腎臟、膀胱、乳腺、子宮、前列腺和垂體等內(nèi)分泌腺之類的器官)、外胚層干細胞、中胚層干細胞或內(nèi)胚層干細胞(例如源自諸如肝臟、胰腺、肺和血管之類的器官)。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了一種誘導(dǎo)干細胞的分化的方法，其包括以下步驟：

(i)在適于維持所述干細胞的細胞培養(yǎng)基中形成干細胞的制備物，其中所述培養(yǎng)基包含根據(jù)式i的化合物；以及

(ii)在使所述干細胞分化成至少一種分化細胞類型的條件下培養(yǎng)所述干細胞。

在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述干細胞是多能干細胞或亞全能干細胞。根據(jù)一個實施方案，所述干細胞不是全能干細胞。優(yōu)選地，所述干細胞是人源的。

在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，所述分化細胞選自由以下細胞構(gòu)成的組：角質(zhì)形成細胞、成纖維細胞(例如皮膚、角膜、腸粘膜、口腔粘膜、膀胱、尿道、前列腺、肝臟)、上皮細胞(例如皮膚、角膜、腸粘膜、口腔粘膜、膀胱、尿道、前列腺、肝臟)、神經(jīng)元膠質(zhì)細胞或神經(jīng)細胞、肝細胞、間充質(zhì)細胞、肌細胞(心肌細胞或肌管細胞)、腎細胞、血細胞(例如，cd4+淋巴細胞、cd8+淋巴細胞)、胰腺細胞或內(nèi)皮細胞。

通常，培養(yǎng)基中本發(fā)明化合物的濃度為0.1μm至20μm；典型地為約10μm。

在本發(fā)明的優(yōu)選方法中，該方法在可見光和/或uv光、不超過50℃的溫度和/或氧化試劑(例如空氣或dmso)的存在下進行。本發(fā)明的方法可以在離體(exvivo)、體內(nèi)或體外(invitro)進行。

本發(fā)明的化合物表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性并且可以用于控制細胞分化和細胞凋亡。

因此，根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了根據(jù)式i的化合物在治療或預(yù)防將會受益于類視色素治療的疾病或病癥中的應(yīng)用。

式i的化合物在將細胞分化和細胞凋亡控制在與atra相當(dāng)或更大的程度的同時，表現(xiàn)出良好的穩(wěn)定性，并且與atra相比，更不容易經(jīng)歷光異構(gòu)化。

根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了用于控制細胞分化或凋亡的式i化合物。

疾病或病癥通常受益于對細胞分化或凋亡的控制。

可能受益于類視色素治療的疾病或病癥包括癌癥(例如神經(jīng)瘤)、皮膚疾病(諸如痤瘡)、皮膚創(chuàng)傷(例如燙傷、紫外線損傷、皮膚老化)。

由于本發(fā)明化合物具有控制正常細胞和腫瘤細胞中的分化和凋亡的能力，因而可以作為化學(xué)治療劑或化學(xué)預(yù)防劑。特別地，本發(fā)明的化合物可能特別適合于治療或預(yù)防癌癥前期病癥或癌性病癥，該癌癥前期病癥或癌癥病癥包括皮膚、口腔、喉、肺、膀胱、外陰、乳腺、消化道的癌癥前期病癥或癌癥病癥。本發(fā)明的化合物可用于治療或預(yù)防包括頭頸部腫瘤和膀胱腫瘤在內(nèi)的基底細胞癌、鱗狀細胞癌。特別適用于通過使用本發(fā)明化合物治療或預(yù)防的癌癥包括白血病，例如骨髓性白血病，特別是急性早幼粒細胞白血病。

據(jù)信，本發(fā)明的化合物抑制體外細胞的轉(zhuǎn)化并抑制癌發(fā)生。據(jù)信，本發(fā)明的化合物因此表現(xiàn)出對腫瘤擴大和/或腫瘤發(fā)生的抑制作用。當(dāng)將本發(fā)明的化合物用作化學(xué)治療劑時，本發(fā)明的化合物通常阻止或逆轉(zhuǎn)致癌分級，從而減少或避免明顯惡性腫瘤的臨床后果。

據(jù)信，由于本發(fā)明的化合物具有調(diào)節(jié)體外和體內(nèi)中的正常細胞、惡化前細胞和惡性細胞的生長、分化和凋亡的能力，因而表現(xiàn)出化學(xué)治療和/或化學(xué)預(yù)防性能。

根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了本發(fā)明化合物在促進細胞增殖，例如皮膚或神經(jīng)細胞增殖中的應(yīng)用。

根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了本發(fā)明化合物在促進組織健康和發(fā)育，特別是在促進人或動物體的皮膚、骨骼、神經(jīng)、牙齒、毛發(fā)和/或粘膜的健康和發(fā)育中的應(yīng)用。本發(fā)明的化合物可用于預(yù)防或治療老化跡象(特別是皺紋和老年斑)、皮膚病癥如痤瘡(特別是嚴重痤瘡和/或頑固性痤瘡)、牛皮癬、妊娠紋、毛發(fā)角化病、氣腫、禿發(fā)。

根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明的化合物可用于治療或預(yù)防眼睛的疾病或病癥，或可用于維持視力或使視力處于最佳狀態(tài)。

根據(jù)本發(fā)明的又一方面，本發(fā)明的化合物可以用作抗氧化劑，特別用于人體或動物體內(nèi)或用于人體或動物體上。

本發(fā)明化合物對人或動物體的施用劑量取決于預(yù)期應(yīng)用。例如，適用于局部施用的制劑通常包含0.025重量％至1重量％的本發(fā)明的化合物，特別是0.025重量％至0.1重量％。對于化學(xué)治療應(yīng)用，常規(guī)劑量為20mg/m²/天至80mg/m²/天，適宜為40mg/m²/天至50mg/m²/天，更適宜為約45mg/m²/天。

如本文所述，本發(fā)明的化合物是固有熒光的。

因此，根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了包含如本文所述的式i的化合物的探針。

本發(fā)明還提供監(jiān)測細胞分化或凋亡的方法，該方法包括施用有效量的式i的化合物并且通過熒光醫(yī)學(xué)成像檢測由所述式i的化合物發(fā)出的熒光。

本發(fā)明還提供通過使用包括但不限于熒光壽命成像顯微術(shù)(flim)的技術(shù)檢測由所述化合物發(fā)出的熒光，從而對式i的化合物的分布進行成像，由此來監(jiān)測細胞分化或細胞凋亡的方法。

在另一方面，本發(fā)明還提供通過包括但不限于相干反斯托克斯拉曼散射(cars)和受激拉曼散射(srs)等的技術(shù)檢測受刺激的拉曼散射信號，從而對式i的化合物的分布進行成像，由此來監(jiān)測細胞分化或凋亡的方法。

本發(fā)明還提供通過包括但不限于多元曲線分辨(mcr)和拉曼散射信號的最小二乘分析的技術(shù)來制作離體、體內(nèi)或體外中的式i化合物的濃度圖，從而監(jiān)測式i的化合物的細胞內(nèi)或細胞外的濃度和分布的方法。

此外，本發(fā)明提供了用于將由式i的化合物發(fā)出的熒光與由式i的化合物刺激的拉曼散射信號疊加的方法。用于疊加發(fā)射熒光的方法可用于本文描述的監(jiān)測細胞分化或凋亡的方法中。

式i的化合物的有利之處還在于：該化合物可以選擇性地用于不同的細胞類型，即，可以將可見成像、熒光成像和/或拉曼成像用于鑒定對本發(fā)明的合成分子更有響應(yīng)的細胞類型。這可以提供細胞識別方法。觀察本發(fā)明的化合物的熒光壽命可以提供關(guān)于局部環(huán)境的信息，并且潛在地提供關(guān)于化合物正在進行的作用的信息。此外，然后可以用其他分子處理已用本發(fā)明的熒光化合物處理的細胞，例如，“置換”熒光化合物，以給出相對親和力的量度，這尤其可以用于藥物篩選等。因此，本發(fā)明的熒光化合物可以與其他合適的已知化合物組合使用。

根據(jù)本發(fā)明的又一方面，提供了一種組合物，其包含一種或多種本發(fā)明的化合物聯(lián)合一種或多種藥學(xué)上可接受的賦形劑。

本發(fā)明的組合物還包含一種或多種藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑、佐劑或稀釋劑。本文中采用的短語“藥學(xué)上可接受的”是指在合理的醫(yī)學(xué)判斷范圍內(nèi)適合用于與人的組織接觸的那些化合物、材料、組合物和/或劑型，或是指可能與合理的利益/風(fēng)險比相稱的情況(沒有過度毒性、刺激性、過敏反應(yīng)或其他問題或并發(fā)癥的動物)。

當(dāng)制備本發(fā)明的組合物用于口服施用時，上述化合物通常與藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑組合以形成藥物制劑或單位劑型。

對于口服施用而言，組合物可以是粉末、顆粒狀、溶液、懸浮液、乳液或用于從口香糖攝取活性成分的天然或合成聚合物或樹脂的形式。該組合物也可以為丸劑、藥糖劑或糊劑。也可以將本發(fā)明口服施用的組合物配制為用于持續(xù)釋放，例如，可以將上述化合物包被、微囊化或以其他方式置于持續(xù)遞送裝置內(nèi)。這些制劑中的總活性成分占制劑重量的0.1％至99.9％。

因此，包含本發(fā)明的化合物的一種或多種合適的單位劑型可以通過多種途徑施用，包括口服，腸胃外(包括皮下、靜脈內(nèi)、肌內(nèi)和腹膜內(nèi))、直腸、經(jīng)皮、透皮、胸內(nèi)、肺內(nèi)、粘膜、眼內(nèi)和鼻內(nèi)(呼吸)途徑。也可以在脂質(zhì)制劑中配制該組合物或(例如)利用微囊化將該組合物配制為用于持續(xù)釋放。在適當(dāng)?shù)那闆r下，制劑可以方便地為離散的單位劑型，并且可以通過藥學(xué)領(lǐng)域公知的任何方法來制備。這樣的方法可以包括以下步驟：將治療劑與液體載體、固體基質(zhì)、半固體載體、細分的固體載體或其組合混合，然后(如果需要)將產(chǎn)品引入到所需的遞送系統(tǒng)或在所需的遞送系統(tǒng)中使該產(chǎn)品成形。

可以通過本領(lǐng)域已知的方法，使用公知且易于獲得的成分來制備包含本發(fā)明的化合物的藥物制劑。例如，可以將該化合物與普通賦形劑、稀釋劑或載體一起配制，并形成片劑、膠囊劑、溶液、混懸劑、粉劑、氣霧劑等。適用于這種制劑的賦形劑、稀釋劑和載體的實例包括緩沖劑、以及諸如淀粉、纖維素、糖、甘露醇和硅衍生物之類的填料和填充劑。

還可以包含粘合劑，例如羧甲基纖維素、羥甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素和其他纖維素衍生物，藻酸鹽，明膠和聚乙烯吡咯烷酮?？梢园駝?例如，甘油)、崩解劑(例如，碳酸鈣和碳酸氫鈉)。還可以包含延遲溶解的試劑，例如石蠟。還可以包含吸收加速劑，如季銨化合物?？梢园T如鯨蠟醇和單硬脂酸甘油酯之類的表面活性劑?？梢约尤胫T如高嶺土和膨潤土之類的吸附載體。還可以包含諸如滑石、硬脂酸鈣、硬脂酸鎂和固體聚乙二醇之類的潤滑劑。也可添加防腐劑。本發(fā)明的組合物還可以包含諸如纖維素和/或纖維素衍生物之類的增稠劑。本發(fā)明的組合物還可以包含膠類，例如黃原膠、瓜爾膠或carbo膠或阿拉伯膠，或者作為替代的聚乙二醇、膨潤土和蒙脫石等。

例如，含有本發(fā)明的化合物的片劑或囊片(caplets)可以包含緩沖劑，例如碳酸鈣、氧化鎂和碳酸鎂。合適的緩沖劑還可以包括乙酸的鹽形式、檸檬酸的鹽形式、硼酸的鹽形式和磷酸的鹽形式。囊片和片劑還可以包含無活性成分，例如纖維素、預(yù)凝膠化淀粉、二氧化硅、羥丙基甲基纖維素、硬脂酸鎂、微晶纖維素、淀粉、滑石、二氧化鈦、苯甲酸、檸檬酸、玉米淀粉、礦物油、聚丙二醇、磷酸鈉、硬脂酸鋅等。含有至少一種本發(fā)明的化合物的硬質(zhì)或軟質(zhì)明膠膠囊可以包含無活性成分，例如明膠、微晶纖維素、月桂基硫酸鈉、淀粉、滑石和二氧化鈦等，以及液體賦形劑，例如聚乙二醇(peg)和植物油。此外，包含一種或多種本發(fā)明的化合物的腸溶包衣囊片或片劑被設(shè)計為能夠抵抗在胃中的崩解并溶解在十二指腸的更中性至堿性環(huán)境中。

也可以將本發(fā)明的治療性化合物配制成用于方便口服施用的酏劑或溶液，或配制成適用于腸胃外施用(例如通過肌內(nèi)、皮下、腹膜內(nèi)或靜脈內(nèi)途徑施用)的溶液。本發(fā)明的治療性化合物的藥物制劑還可以呈水溶液或無水溶液或分散體的形式，或者呈乳劑或懸浮液或藥膏的形式。

因此，治療性化合物可以被配制用于胃腸外施用(例如通過注射，如團注或連續(xù)輸注)，并且可以以單位劑型存在于安瓿、預(yù)填充注射器、小體積輸注容器或多劑量容器中。如上所述，可以添加防腐劑以幫助維持劑型的擱置壽命?；钚曰衔锖推渌煞挚梢栽谟托曰蛩再x形劑中形成懸浮液、溶液或乳液，并且可以含有配制劑，例如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑。可選地，活性化合物和其他成分可以是通過無菌固體的無菌分離或通過從溶液中凍干得到的粉末形式，并在使用前加入適合的賦形劑(例如滅菌無熱原水)進行配制。

根據(jù)需要，可以添加佐劑，該佐劑選自抗氧化劑、表面活性劑、其他防腐劑、成膜劑、角質(zhì)離解劑或除粉刺劑(comedolyticagents)、香料、矯味劑和著色劑。可以添加氧化劑，例如叔丁基氫醌、丁基化羥基苯甲醚、丁基化羥基甲苯和α-生育酚以及它們的衍生物。

這些制劑可以包含本領(lǐng)域公知的藥學(xué)上可接受的載體、賦形劑和佐劑。例如，可以使用從生理學(xué)角度來看可接受的一種或多種有機溶劑來制備溶液，該有機溶劑除了水之外還從以下溶劑中選擇，如丙酮、乙酸、乙醇、異丙醇、二甲基亞砜、乙二醇醚(例如，以名稱“dowanol”出售的產(chǎn)品)、聚二醇和聚乙二醇，短鏈酸的c1-c4烷基酯、乳酸乙酯或乳酸異丙酯、脂肪酸甘油三酸酯(例如，以名稱“miglyol”銷售的產(chǎn)品)、肉豆蔻酸異丙酯、動物油、礦物油和植物油以及聚硅氧烷。

優(yōu)選地，組合物是包含如上所述的一種或多種化合物的溶劑或稀釋劑的形式。溶劑或稀釋劑可以包括酸溶液、二甲基砜、n-(2-巰基丙?；?甘氨酸、2-正壬基-1,3-二氧戊環(huán)和乙醇。優(yōu)選地，該溶劑/稀釋劑是酸性溶劑，例如乙酸、檸檬酸、硼酸、乳酸、丙酸、磷酸、苯甲酸、丁酸、蘋果酸、丙二酸、草酸、琥珀酸或酒石酸。

本發(fā)明的藥物制劑可以包含藥學(xué)上可接受的載體、稀釋劑、增溶劑或乳化劑、以及本領(lǐng)域可用的各種類型的鹽作為任選成分。這些物質(zhì)的實例包括常規(guī)生理鹽水溶液，例如生理緩沖鹽水溶液和水?？捎糜诒景l(fā)明的藥物制劑的載體和/或稀釋劑的具體非限制性實例包括水和生理上可接受的緩沖鹽水溶液，例如ph7.0-8.0的磷酸鹽緩沖鹽水溶液。

溶劑可以包含乙酸溶液。溶劑(例如乙酸溶液)可以以小于1％、0.5％、0.25％、0.1％、0.05％或0.01％(w/w)(例如乙酸)的濃度存在于組合物中。

本發(fā)明的組合物可以包含一種或多種其他治療劑。例如，在本發(fā)明的組合物用于治療或預(yù)防癌癥的情況下，可以包含一種或多種其他化學(xué)治療劑和/或化學(xué)預(yù)防劑。在將該組合物用于護膚品的情況下，可以使用一種或多種其他護膚劑，例如一種或多種保濕劑或抗菌劑。

另外，本發(fā)明的化合物非常適合于作為持續(xù)釋放劑型等的制劑?？梢赃@樣配置該制劑，使得制劑可能在一段時間內(nèi)，(例如)在腸道或呼吸道的特定部分中釋放活性化合物?？梢杂梢韵挛镔|(zhì)來制備包衣、包膜和保護基質(zhì)：聚合物(如聚交酯-羥乙酸酯)、脂質(zhì)體、微乳劑、微粒、納米顆?；蛳灐＿@些包衣、包膜和保護基質(zhì)可以用于涂覆留置裝置，例如支架、導(dǎo)管、腹膜透析管、排液裝置等。

對于局部施用而言，可以如本領(lǐng)域已知的那樣來配制活性劑以直接應(yīng)用于目標區(qū)域。主要適用于局部應(yīng)用的形式為(例如)霜劑、乳劑、凝膠劑、粉劑、分散劑或微乳劑、較大或較小程度上增稠的洗劑、浸漬墊、軟膏或棒劑、氣溶膠制劑(例如噴霧劑或泡沫劑)、皂劑、清潔劑、洗劑或皂塊的形式。用于此目的的其他常規(guī)形式包括傷口敷料、包被繃帶或其他聚合物覆蓋物、軟膏、霜劑、洗劑、糊劑、凝膠劑、噴霧劑和氣霧劑。因此，本發(fā)明的治療性化合物可以經(jīng)由貼劑或繃帶遞送用于皮膚給藥?？蛇x地，可以將該治療性化合物配制成粘合劑聚合物(例如，聚丙烯酸酯或丙烯酸酯/乙酸乙烯酯共聚物)的一部分。對于長期應(yīng)用，可能期望使用微孔和/或可透氣襯墊層合片，以至于使皮膚的水化或浸軟最小化。襯墊層可以具有能提供期望的保護和支撐功能的任何合適厚度。合適的厚度通常為約10μm至約200μm。

用于局部施用的藥物制劑可包含(例如)生理上可接受的緩沖鹽水溶液，該生理上可接受的緩沖鹽水溶液包含介于約0.001mg/ml至約100mg/ml、例如介于0.1mg/ml至10mg/ml之間的一種或多種對于待治療的適應(yīng)癥或疾病具有特異性的本發(fā)明化合物。

例如，可以用添加有合適的增稠劑和/或膠凝劑的水性或油性基質(zhì)來配制軟膏和霜劑。洗劑可以用水性或油性基質(zhì)來配制并且通常還包含一種或多種乳化劑、穩(wěn)定劑、分散劑、懸浮劑、增稠劑或著色劑。也可以通過離子電滲法遞送活性化合物。存在于局部制劑中的本發(fā)明的治療劑的重量百分數(shù)將取決于各種因素，但通常為制劑總重量的0.01％至95％，典型地為0.1重量％至85重量％。

可以在含有一種或多種分散劑、增溶劑或懸浮劑的水性或非水性基質(zhì)中，使用一種或多種治療性化合物來配制滴劑(例如，滴眼劑或滴鼻劑)。液體噴霧劑可以泵送，或由加壓包裝方便地遞送。滴劑可以經(jīng)由簡單的眼用帶帽滴瓶、經(jīng)由適于逐滴遞送液體內(nèi)容物的塑料瓶、或經(jīng)由特定形狀的封閉物來遞送。

還可以進一步將治療性化合物配制用于口腔或咽喉中的局部施用。例如，活性成分可以配制成：還包含調(diào)味基質(zhì)的錠劑，該調(diào)味基質(zhì)通常為蔗糖和阿拉伯膠或黃蓍膠；在惰性基質(zhì)中含有所述組合物的軟錠劑，該惰性基質(zhì)例如為明膠和甘油或蔗糖和阿拉伯樹膠；以及在合適的液體載體中包含本發(fā)明的組合物的漱口劑。

也可以將本發(fā)明的化合物施用于呼吸道。因此，本發(fā)明還提供了用于本發(fā)明方法的氣溶膠藥物制劑和劑型。通常，這樣的劑型包含有效治療或預(yù)防特定感染、適應(yīng)癥或疾病的臨床癥狀的至少一種本發(fā)明藥劑的量。在本發(fā)明范圍內(nèi)已經(jīng)根據(jù)本發(fā)明的方法治療的感染、適應(yīng)癥或疾病的一種或多種癥狀的任何統(tǒng)計學(xué)的顯著衰減被認為是這種感染、適應(yīng)癥或疾病的治療。

可選地，對于通過吸入或吹入的施用，組合物可以呈干粉的形式，例如治療劑和合適的粉末基質(zhì)(如乳糖或淀粉)的粉末混合物。粉末組合物可以以(例如)膠囊或藥筒(cartridge)的單位劑量形式存在，或者(例如)為可以借助吸入器、吹入器或定量吸入器來施用粉末的明膠或泡罩包裝。

當(dāng)以氣溶膠形式或吸入形式施用本發(fā)明的化合物時，本發(fā)明的化合物也可以以水溶液的形式施用。因此，其他氣溶膠藥物制劑可以包含(例如)生理上可接受的緩沖鹽水溶液，該緩沖鹽水溶液包含介于約0.001mg/ml和約100mg/ml之間的一種或多種對待治療的適應(yīng)癥或疾病具有特異性的本發(fā)明的化合物。上述化合物的細分固體顆粒形式的干燥氣溶膠也用于本發(fā)明的實踐中，其中上述化合物不溶于或懸浮于液體中。本發(fā)明的化合物可以配制成細粉(dustingpowder)并且包含平均粒度介于約1μm至5μm、或者介于2μm至3μm之間的細分顆粒?？梢允褂帽绢I(lǐng)域公知的技術(shù)，通過粉碎和篩濾來制備細分顆粒?？梢酝ㄟ^吸入預(yù)定量的細分材料來施用顆粒，該細分材料可以是粉末形式。應(yīng)當(dāng)理解，每種劑型的單個氣溶膠劑量中所含的活性成分或成分的單位含量本身不需要構(gòu)成用于治療特定感染、適應(yīng)癥或疾病的有效量，因為通過多個劑量單位的給藥可以達到必要的有效量。此外，可以使用比劑型中更少的劑量，通過單獨施用或系列施用來達到有效量。

對于通過吸入對上(鼻)或下呼吸道給藥，本發(fā)明的治療性化合物方便地從霧化器或加壓包裝或其它方便遞送氣溶膠噴霧劑的方式遞送。加壓包裝可以包括合適的推進劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適的氣體。在加壓氣溶膠的情況下，可以通過設(shè)置閥來遞送一定的計量從而可以確定劑量單位。

此外，活性成分也可以與其他治療劑聯(lián)合使用，其他治療劑(例如)為止痛劑、消炎劑、抗組胺劑、支氣管擴張劑、化學(xué)保護劑、化學(xué)治療劑、抗菌劑等中的一種或多種。

根據(jù)本發(fā)明的另一方面，提供了用于制備如本文所述的式i的化合物的工藝，其包括使式xii的化合物與式xiii的化合物反應(yīng)：

其中r¹、r²、r³、r⁴、r⁵、r⁶、r⁷、r⁸和r⁹分別如本文所限定；并且

z為離去基團，例如鹵素、假鹵素、硼酸或硼酸酯；

r¹⁰hxiii

其中r¹⁰如本文所限定。

或者，一種用于制造如本文所述的式i的化合物的工藝可以包括使式xv的化合物與式xiv的化合物反應(yīng)：

其中r¹、r²、r³、r⁴、r⁵、r⁶、r⁷、r⁸和r⁹分別如本文所限定；

r¹⁰zxiv

其中z為離去基團，例如鹵素、假鹵素、硼酸或硼酸酯。

可以通過其中r¹⁰是如本文所述的烷基的式i的化合物的脫烷基化來制備其中r¹⁰是氫的式i的化合物。

可以使用本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法或本文所述的方法來制備式i、xii、xiii和xiv的化合物。這些制備的實例示意性示出如下：

可以通過將適當(dāng)?shù)姆蓟鹚狨シ謩e與適當(dāng)?shù)妮敛糠?例如，6-溴-萘-2-羧酸甲酯)和適當(dāng)?shù)娜夤鹚狨?例如，3-溴-肉桂酸甲酯)偶聯(lián)來制備萘酯化合物(化合物11)和丙烯酸酯化合物(化合物13)。

在dmso中，在5摩爾％pd(dppf)cl2催化劑和2當(dāng)量koac堿的存在下，通過碘化物14與b2pin2或b2neop2的pd催化的硼?；瘉碇苽浞蓟鹚狨?，得到良好產(chǎn)率的芳基硼酸酯12和10，如此提供了將相對于給電子氨基的對位選擇性官能化的有效方法。

首先可以通過酰胺3的格利雅甲基化，然后進行sonogashira偶聯(lián)和皂化，從而制備二氫喹啉衍生化合物(如17)。

附圖說明

現(xiàn)在將僅參考附圖通過實施例的方式對本發(fā)明進行描述，其中：

圖1示出了在多種溶劑中的標準化激發(fā)光譜；

圖2示出了在300nm的激發(fā)下，在各種溶劑中的標準化發(fā)射光譜；

圖3示出了實施例3的化合物9在各種溶劑中的標準化激發(fā)光譜；

圖4示出了在275nm至300nm范圍內(nèi)的激發(fā)下，實施例3的化合物9在各種溶劑中的標準化發(fā)射光譜；

圖5示出了實施例6的化合物17在氯仿中的標準化激發(fā)光譜；

圖6示出了在378nm的激發(fā)下，實施例6的化合物17在氯仿中的標準化發(fā)射光譜；

圖7示出了實施例3的化合物9在不存在光的情況下在環(huán)境溫度下儲存后的¹hnmr光譜；

圖8示出了實施例3的化合物9在環(huán)境溫度下用典型實驗室光處理72小時后的¹hnmr光譜；

表1示出了與nestin染色的atra、和dmso相比，干細胞中實施例3的化合物9的活性；

表2示出了與ck8染色的atra、和dmso相比，干細胞中實施例3的化合物9的活性；

表3示出了與tuj-1染色的atra、和dmso相比，干細胞中實施例3的化合物9的活性；

表4示出了與oct4染色的atra、和dmso相比，干細胞中實施例3的化合物9的活性；

表5示出了與sox2染色的atra、和dmso相比，干細胞中實施例3的化合物9的活性；

圖9示出了與atra、和dmso相比，實施例3的化合物9的流式細胞術(shù)評價，測定了干細胞標記物ssea-3的表達；

圖10示出了與atra、和dmso相比，實施例3的化合物9的流式細胞術(shù)評價，測定了干細胞標記物tra160的表達；

圖11示出了與atra、和dmso相比，實施例3的化合物9的流式細胞術(shù)評價，測定了干細胞標記物a2b5的表達；

表6示出了用實施例3的化合物9、atra、和dmso處理的細胞群的相襯圖像(phasecontrastimage)；

圖12示出了在1μm的處理濃度下，實施例3的化合物9與atra、和dmso相比較的mtt細胞活力分析；

圖13示出了在10μm的處理濃度下，實施例3的化合物9與atra、和dmso相比較的mtt細胞活力分析；

圖14示出了用各種濃度的化合物9處理并在7天后用共焦顯微術(shù)成像的tera-2干細胞；

圖15示出了用實施例3的化合物9(10μm)處理并在8小時后用共焦顯微術(shù)成像的shsy5y細胞(神經(jīng)母細胞瘤)；

圖16示出了用實施例3的化合物9(10μm)處理并在24小時后用共焦顯微術(shù)成像的細胞；

圖17示出了用實施例3的化合物9(10μm)處理7天，用4％多聚甲醛固定并用共聚焦顯微術(shù)成像的tera-2干細胞；

圖18示出了用實施例3的化合物9(10μm)處理5天的hacat角質(zhì)化皮膚細胞；

圖19示出了用實施例3的化合物9(10μm)處理5天并用involucrin和k14染色的hacat角質(zhì)化皮膚細胞；

圖20示出了用實施例6的化合物17(10μm)處理5天的hacat角質(zhì)化皮膚細胞；

圖21示出了用實施例6的化合物17(10μm)處理5天并用involucrin和k14染色的hacat角質(zhì)化皮膚細胞；以及

圖22示出了實施例3的化合物9的拉曼光譜。在2190cm^-1處觀察到高強度乙炔帶，其位于細胞沉默區(qū)域(1800-2800cm^-1)，其中沒有觀察到生物來源的信號，例如酰胺鍵。

在附圖中，所指代的dc271均指的是實施例3的化合物9。

在實施例和說明書的其他部分中使用以下縮寫：

atra：全反式視黃酸

b2pin2：雙(頻哪醇合)二硼

dcm：二氯甲烷

dmf：n,n-二甲基甲酰胺

dmso：二甲基亞砜

dppf：1,1′-雙(二苯基膦基)二茂鐵

edta：乙二胺四乙酸

etoac：乙酸乙酯

gcms：氣相色譜-質(zhì)譜

h：小時

koac：乙酸鉀

rt：室溫

thf：四氫呋喃

具體實施方式

一般試驗

除非另有說明，否則試劑從sigma-aldrich、acrosorganics、alfa-aesar和fluorochem購得并且未經(jīng)進一步純化而使用。直接使用所提供的溶劑，并且如果有說明的話，在使用前用適當(dāng)?shù)母稍飫└稍镌撊軇?。通過tlc或nmr光譜法原位監(jiān)測反應(yīng)。使用通過uv燈而可視化的merckmillipore硅膠60gf25425玻璃板進行薄層色譜法(tlc)。使用來自sigma-aldrich的sio2(230-400目，40-63μm，)進行快速柱層析，并使用tlc進行監(jiān)測。除非另有說明，否則在環(huán)境探針溫度下操作的varianvnmrs-700、varianvnmrs-600、brukeravance-400或varianmercury-400光譜儀上記錄nmr光譜。在購自gossscientific的cdcl3或dmso-d6中記錄nmr光譜。所報道的nmr峰為單峰、雙峰(d)、三重峰(t)、四重峰(q)、寬峰(br)、七重峰(hept)、它們的組合或多重峰(m)。使用tqd(watersuk)質(zhì)譜儀和acquityuplc(watersltd,uk)由達勒姆大學(xué)部門服務(wù)(durhamuniversitydepartmentalservice)進行es-ms，并使用qtofpremier質(zhì)譜儀和acquityuplc(watersltd,uk)獲得精確的質(zhì)量測定。由達勒姆大學(xué)部門服務(wù)使用shimadzuqp2010-ultra進行g(shù)cms。在perkinelmerft-ir光譜儀上記錄ir光譜。使用gallenkamp熔點裝置獲得熔點。由達勒姆大學(xué)部門服務(wù)使用exeteranalyticalce-440分析儀獲得元素分析。

合成方法

實施例1

6-碘-4,4-二甲基-1-(丙-2-基)-1,2,3,4-四氫喹啉(4)

1(a)n-(4-碘苯基)-3-甲基丁-2-烯酰胺，(1)

向4-碘代苯胺(25.0g、114.0mmol)的dcm溶液(400ml)中添加3,3-二甲基丙烯酰氯(13.36ml、120.0mmol)并且將所得白色懸浮液攪拌0.5小時，之后加入吡啶(9.70ml、120mmol)并且在rt下將該溶液攪拌16小時。將溶液用h2o淬火，用dcm稀釋，用飽和nh4cl、h2o和鹽水洗滌，干燥(mgso4)并蒸發(fā)，以得到粗的淺棕色固體(33g)。該淺棕色固體從etoh中重結(jié)晶以得到白色結(jié)晶固體1(31.8g，93％)：¹hnmr(700mhz,cdcl3)δ1.91(s,3h)、2.22(s,3h)、5.68(s,1h)、7.01(s,1h)、7.33(m,2h)、7.60(d,j＝8.8hz,2h)；¹³cnmr(101mhz,cdcl3)δ20.2、27.7、87.2、118.5、121.8、138.0、138.2、154.5、165.2；ir(neat)vmax/cm^–13294m、3094、2964w、2890w、1666m、1586m、1430m、821s、650m；ms(es):m/z＝302.0[m+h]⁺；hrms(es)理論值c11h13noi[m+h]⁺:302.0042，實測值：302.0050；實測值：c,43.87；h,4.02；n4.64。理論值c11h12noi:c,43.88；h,4.02；n4.65％；m.p.＝136-138℃。

1(b)6-碘-4,4-二甲基-1,2,3,4-四氫喹啉-2-酮，(2)

將alcl3(7.66g、57.5mmol)添加至無水dcm(150ml)中并將所得漿料攪拌0.5小時。向該漿料中添加1(11.5g、38.3mmol)并在rt下將該溶液劇烈攪拌2.5小時。將該反應(yīng)物用h2o緩慢淬火，用dcm稀釋，用5％naoh洗滌，直到該溶液變?yōu)榛野咨缓筮M一步用h2o和鹽水洗滌，干燥(mgso4)并蒸發(fā)，以得到粗的黃色固體。該黃色固體從etoh中重結(jié)晶以得到白色結(jié)晶固體2(10.2g、88％)：¹hnmr(700mhz,cdcl3)δ1.32(s,6h)、2.47(s,2h)、6.62(d,j＝8.3hz,1h)、7.47(dd,j＝8.3,1.9hz,1h)、7.56(d,j＝1.8hz,1h)、9.20(s,1h)；¹³cnmr(176mhz,cdcl3)δ27.7、34.2、45.2、86.8、118.1、133.7、135.1、135.9、136.6、171.3；ir(neat)vmax/cm^–13164m、3102、3040w、2953m、1671s、1596m、1484m、817s；ms(es):m/z＝302.0[m+h]⁺；hrms(es)理論值c11h13noi[m+h]⁺：302.0042，實測值：302.0042；實測值：c,43.91；h,4.02；n4.63。理論值c11h12ino：c,43.87；h,4.02；n4.65％；m.p.＝199-202℃。

1(c)6-碘-4,4-二甲基-1-(丙-2-基)-1,2,3,4-四氫喹啉-2-酮，(3)

向2(7.05g、23.4mmol)的無水dmf溶液(200ml)中加入粉碎的koh(4.08g、70.2mmol)并在50℃下將所得漿料攪拌1h。向該漿料中添加2-碘丙烷(7.00ml、70.2mmol)并在50℃下將溶液攪拌40小時。該反應(yīng)物用h2o緩慢淬火，用etoac稀釋，用飽和nh4cl、h2o和鹽水洗滌，干燥(mgso4)并蒸發(fā)，得到粗的透明油狀物(7.2g)。通過sio2層析(含有1％et3n的己烷：etoac(9:1)作為洗脫液)對該透明油狀物進行純化，以得到無色油狀物3(3.93g、49％)：¹hnmr(700mhz,cdcl3)δ1.25(s,6h)、1.49(s,3h)、1.50(s,3h)、2.38(s,2h)、4.66(hept,j＝7.0hz,1h)、6.87(d,j＝8.6hz,1h)、7.50(dd,j＝8.6,2.1hz,1h)、7.52(d,j＝2.1hz,1h)；¹³cnmr(176mhz,cdcl3)δ20.3、26.8、33.1、47.2、48.8、86.9、118.9、133.4、135.7、138.9、139.1、169.5；ir(neat)vmax/cm^–12961m、2934w、2870w、1667s、1582m、1482m、809s；ms(es):m/z＝344.0[m+h]⁺；hrms(es)理論值c11h13noi[m+h]⁺：344.0511,實測值：344.0512。

1(d)6-碘-4,4-二甲基-1-(丙-2-基)-1,2,3,4-四氫喹啉，(4)

在0℃下向3(1.25g、3.63mmol)的無水甲苯溶液(15ml)中滴加硼烷二甲硫醚復(fù)合物(2.0m的thf溶液、1.91ml、3.81mmol)并在回流下將所得溶液攪拌16小時。將該溶液冷卻至rt，然后添加10％的na2co3水溶液(25ml)并將該溶液攪拌0.5小時，用etoac稀釋，用h2o和鹽水洗滌，干燥(mgso4)并蒸發(fā)，以得到粗的無色油狀物(1.12g)。通過sio2層析(含有1％et3n的己烷：etoac(9:1)作為洗脫液)對該無色油狀物進行純化以得到無色油狀物4(1.08g、90％)：¹hnmr(700mhz,cdcl3)δ1.19(s,3h)、1.19(s,3h)、1.24(s,6h)、1.65-1.67(m,2h)、3.14-3.17(m,2h)、4.06(hept,j＝6.6hz,1h)、6.46(d,j＝8.8hz,1h)、7.28(dd,j＝8.9,2.1hz,1h)、7.39(d,j＝2.2hz,1h)；¹³cnmr(176mhz,cdcl3)δ18.9、30.3、32.4、36.6、36.8、47.3、76.1、113.4、134.5、134.8、135.6、144.0；ir(純)vmax/cm^–12957m、2927w、2863w、1580m、1489m、792s、684w；ms(es):m/z＝330.1[m+h]⁺；hrms(es)理論值c11h13noi[m+h]⁺：330.0719,實測值：330.0717。

實施例2

4-乙炔基苯甲酸甲酯(7)

2(a)4-碘代苯甲酸甲酯(5)

將4-碘代苯甲酸(25g、100.8mmol)懸浮于meoh(250ml)中，然后加入濃h2so4(5ml)并在回流下將所得溶液攪拌過夜。然后將透明溶液緩慢冷卻至rt，然后冷卻至0℃。將所得固體過濾，用冷meoh洗滌并干燥，以得到無色結(jié)晶固體5(23.7g、90％)：¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ3.90(s,3h)、7.73(d,j＝8.6hz,2h)、7.79(d,j＝8.6hz,2h)；¹³cnmr(176mhz,cdcl3)δ52.5、100.9、129.8、131.2、137.9、166.7；ir(neat)vmax/cm^–13040w、2996w、2946w、1709s、1596m、1436m、1269s、1114s、843s、683m；ms(gc):m/z＝261.9[m]⁺；實測值：c,36.54；h,2.71。理論值c8h7io2：c,36.67；h,2.69％。

2(b)4–((三甲基甲硅烷基)乙炔基)苯甲酸甲酯(6)

在減壓下將經(jīng)烘干的500mlschlenk燒瓶抽真空并用ar再填充，然后添加pd(pph3)2cl2(1.18g、1.68mmol)、cui(1.68g、1.68mmol)和5(22.0g、83.98mmol)，用隔膜密封該燒瓶。添加三乙胺(200ml)和三甲基甲硅烷基乙炔(13.94ml、100.8mmol)并將燒瓶再次抽空，并用ar(3x)再填充。在rt下將混合物攪拌過夜。用己烷稀釋該溶液，在真空下通過硅藻土(celite)/sio2并蒸發(fā)，以得到灰白色固體6(19.8g)。無需純化即可使該灰白色固體進行下一步驟：ms(gc)：m/z＝232.1[m]+；實測值：c,66.90；h,6.88。理論值c13h16o2si：c,67.2；h,6.94％。

3(c)4-乙炔基苯甲酸甲酯(7)

向meoh：dcm溶液(2:1，300ml)中添加6(18.5g，79.5mmol)和k2co3(22.0g，159mmol)。在ar下將混合物攪拌6小時。然后將溶液蒸發(fā)至1/3體積，用己烷稀釋，通過硅藻土并蒸發(fā)，以得到淺棕色固體，通過減壓升華將該淺棕色固體純化以得到白色固體7(11.1g、兩步收率83％)：¹hnmr(600mhz,cdcl3)δ3.23(s,1h)、3.91(s,3h)、7.54(d,j＝8.4hz,2h,)、7.98(d,j＝8.6hz,2h)；¹³cnmr(176mhz,cdcl3)δ52.5、80.2、83.0、126.9、129.6、130.3、132.3、166.6；ir(neat)vmax/cm^–13035w、3006w、2950w、2103w、1699s、1605m、1433m、1277s、1107s、859s；ms(gc)：m/z＝160.1[m]+；實測值：c,74.62；h,5.01。理論值c10h8o2:c,74.99；h,5.03％。

實施例3

4-2-[4,4-二甲基-1-(丙-2-基)-1,2,3,4-四氫喹啉-6-基]乙炔基苯甲酸(9)

3(a)4-2-[4,4-二甲基-1-(丙-2-基)-1,2,3,4-四氫喹啉-6-基]乙炔基苯甲酸酯(8)

在減壓下將經(jīng)烘干的schlenk燒瓶抽真空并用ar再填充，然后添加將pd(pph3)2cl2(0.0744g、0.106mmol)、cui(0.0202g、0.106mmol)和7(0.219g、1.37mmol)，用隔膜密封該燒瓶。添加溶解于三乙胺(6ml)中的4(0.349g、1.06mmol)的溶液并將燒瓶再次抽空并用ar(3x)再填充。在rt下將混合物攪拌72小時。將該混合物用et2o稀釋，在真空下通過硅藻土/sio2并蒸發(fā)，以得到粗的橙色固體(0.47g)。通過sio2層析(含有1％et3n的己烷：etoac(8:2)作為洗脫液)對該橙色固體進行純化以得到橙色固體8(0.105g、27％)：¹hnmr(700mhz,cdcl3)δ1.21/1.23(s,6h)、1.28(s,6h,)、1.66-1.71(m,2h)、3.19-3.24(m,2h)、3.92(s,3h)、4.15(hept,j＝6.6hz,1h)、6.64(d,j＝8.7hz,1h)、7.24-7.25(m,1h)、7.36(d,j＝1.8hz,1h)、7.54(d,j＝8.3hz,2h)、7.98(d,j＝8.3hz,2h)；¹³cnmr(151mhz,cdcl3)δ19.1、30.1、32.2、36.7、36.8、47.4、52.3、86.8、95.2、108.0、110.6、128.5、129.5、129.6、131.1、131.2、131.7、145.0、167.0；ms(es):m/z＝362.2[m+h]⁺；hrms(es)理論值c24h28no2[m+h]⁺：362.2120，實測值：362.2114。

3(b)4-2-[4,4-二甲基-1-(丙-2-基)-1,2,3,4-四氫喹啉-6-基]乙炔基苯甲酸(9)

在減壓下將經(jīng)烘干的schlenk燒瓶抽真空并用ar再填充，然后添加pd(pph3)2cl2(0.253g、0.36mmol)、cui(0.0686g、0.36mmol)和7(0.634g、3.96mmol)，用隔膜密封該燒瓶。在真空下，通過超聲對溶解于三乙胺(30ml)中的4(1.185g、1.06mmol)的溶液進行脫氣，并用ar(3x)回填。然后，將該溶液加入至schlenk燒瓶中，再次在真空下脫氣并用ar回填，在rt下將所得混合物攪拌72小時。然后將反應(yīng)混合物蒸干，并先用己烷、然后用己烷:etoac(9:1)通過薄的celite/sio2塞進行洗脫。然后用飽和nh4cl、3％的edta水溶液、h2o和鹽水洗滌該有機物，干燥(mgso4)并蒸發(fā)，以得到橙色固體(1.38g)。將該橙色固體溶于thf(30ml)中并添加20％的naoh水溶液(3ml)。在回流下將所得溶液攪拌40小時，然后將混合物冷卻并加入h2o。該溶液用5％hcl中和，用etoac稀釋，用飽和nahco3、h2o和鹽水洗滌，干燥(mgso4)并蒸發(fā)，以得到粗的黃色固體(1.0g)。通過溶劑分層(dcm/己烷)將該黃色固體重結(jié)晶兩次，得到亮黃色針狀結(jié)晶17(0.73g、兩步收率58％)：¹hnmr(700mhz；(cd3)2so)δ1.16(s,3h)、1.17(s,3h)、1.22(s,6h)、1.60-1.64(m,2h)、3.17-3.21(m,2h)、4.15(hept,j＝7.0hz)、6.70(d,j＝9.3hz,1h)、7.19(dd,j＝8.6,2.1hz,1h)、7.30(d,j＝2.1hz,1h)、7.56(d,j＝8.5hz,2h)、7.92(d,j＝8.6hz,2h)、13.02(s,1h)；¹³cnmr(700mhz,(cd3)2so)δ18.6、29.7、31.6、35.8、36.1、46.7、86.5、94.9、106.5、109.5、110.5、128.9、129.4、130.7、130.7、131.2、144.7、166.8；ms(es):m/z＝348.2[m+h]⁺；hrms(es)理論值c23h26no2[m+h]⁺：348.1964，實測值：348.1965。

實施例4

3-[4-(1,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氫喹啉-6-基)-苯基]-丙烯酸甲酯(13)

4(a)甲基-(3-甲基-丁-2-烯基)-苯基-胺

在500ml圓底燒瓶中，將溶解于160mlmecn中的n-甲基苯胺(3.24g、30.32mmol)、1-溴-3-甲基-丁-2-烯(5.0g、33.56mmol)和k2co3(4.63g、33.56mmol)的溶液在85℃下加熱18小時，此時通過原位es⁺-ms的分析顯示反應(yīng)完成。用et2o(100ml)將該混合物稀釋并用h2o(3×100ml)進行洗滌。用mgso4干燥有機層，過濾并真空蒸發(fā)，以得到粗的油狀物，通過二氧化硅墊將該油狀物過濾，并用己烷洗脫。在真空中除去溶劑以得到標題化合物，其為透明油狀物(3.82g、72％)；m/z(es⁺-ms)176(mh⁺)；¹hnmr(499.76mhz,cdcl3)7.28(2h,d,j＝7.0hz)、6.79(2h,d,j＝7.0hz)、6.75(1h,tr,j＝7.0hz)、5.25(1h,tr,j＝6.0hz)、3.93(2hd,j＝6.0hz)、2.93(3h,s)1.76(6h,s)；¹³c{¹h}nmr(100.61mhz,cdcl3)149.86、134.54、129.08、120.91、116.42、112.97、50.53、37.91、25.70、17.92；hrms理論值c12h18n([m+h]⁺)176.14338，實測值176.14336。

4(b)1,4,4-三甲基1,2,3,4-四氫喹啉

在500ml圓底燒瓶中，在120℃下將甲基-(3-甲基-丁-2-烯基)-苯基-胺(18.0g、102.86mmol)和多磷酸(75ml)的混合物加熱18小時，此時通過¹hnmr光譜對混合物的純化等分試樣的分析顯示反應(yīng)完成。通過在5分鐘內(nèi)緩慢加入h2o(100ml)來稀釋該混合物。通過加入koh水溶液將該溶液小心地堿化，然后用et2o(1l)萃取。將有機層用h2o(3×200ml)洗滌，用mgso4干燥，過濾并真空除去溶劑，以得到粗的油狀物，將其通過二氧化硅墊過濾，用己烷洗脫。真空除去溶劑，以得到標題化合物，其為透明油狀物(14.93g、83％)；m/z(ei-ms)175(50％,m⁺)、160(60％,m⁺-me)；¹hnmr(499.76mhz,cdcl3)δ7.23(1h，dd,j＝7.5,1.5hz)、7.11(1h,雙峰的三重峰,j＝7.5,1.5hz)、6.63(1h,雙峰的三重峰,j＝7.5,1.5hz)、6.62(1h,d,j＝7.5hz)、3.25(2h,tr,j＝6.0hz)、2.92(3h,s)、1.80(2h,tr,j＝6.0hz)；¹³c{¹h}nmr(125.67mhz,cdcl3)δ145.74、131.61、126.94、126.02、116.25、111.09、47.88、39.50、37.50、32.19、31.21，hrms理論值c12h18n([m+h]⁺)176.14338，實測值176.14332。

4(c)6-碘-1,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氫喹啉

向溶解于dcm(100ml)中的1,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氫-喹啉(2.10g、12.0mmol)和碘(3.05g、12.0mmol)的溶液中添加紅色hgo(2.59g、12.0mmol)。在室溫下攪拌反應(yīng)物，直到通過¹hnmr的分析顯示反應(yīng)完成為止(2小時)。將混合物過濾，用稀的na2s2o3水溶液(100ml)和h2o(100ml)洗滌。用mgso4干燥有機層并真空除去溶劑。通過氧化鋁塞將殘余物過濾，用dcm洗脫并真空除去溶劑，以得到標題化合物，其為淺黃色油狀物(2.50g、69％)；

m/z(ei-ms)301(100％,m⁺)、286(80％,m⁺-me)；¹hnmr(499.67mhz,cdcl3)δ7.40(1h,d,j＝2.0hz)、7.32(1h,dd,j＝8.5,2.0hz)、6.35(1h,d,j＝8.5hz)、3.24(2h,tr,j＝6.0hz)、2.89(3h,s)、1.74(2h,tr,j＝6.0hz)1.27(6h,s)；¹³c{¹h}nmr(125.67mhz,cdcl3)δ144.92、135.49、134.34、127.22、126.52、113.35、47.58、39.30、36.87、32.29、30.79；hrms理論值c12h17ni([m+h]⁺)302.04003，實測值302.04008。

4(d)1,4,4-三甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧雜硼雜環(huán)戊烷-2-基)-1,2,3,4-四氫喹啉(12)

在干燥的、n2填充的手套箱中，將pd(dppf)cl2(0.126g、0.15mmol)、6-碘-1,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氫-喹啉(0.93g、3.09mmol)、b2pin2(0.78g、3.09mmol)和koac(0.61g、6.18mmol)在裝有young's龍頭的厚壁玻璃管中混合。添加經(jīng)脫氣的dmso(10ml)并在80℃下將混合物加熱18小時，此時gcms分析顯示反應(yīng)完成。用et2o(100ml)將混合物稀釋并用h2o(3×100ml)洗滌。用mgso4干燥有機層，過濾并真空除去溶劑，以得到殘余物，通過二氧化硅墊將該殘余物過濾并用1:1的dcm/己烷洗脫。在真空中去除溶劑得到粗產(chǎn)物，在-20℃下將該粗產(chǎn)物從meoh中重結(jié)晶，以得到白色針狀結(jié)晶12(0.66g、70％)；mp140-141℃；m/z(ei-ms)301(100％,m⁺)、286(100％,m⁺-me)；¹hnmr(699.73mhz,cdcl3)δ7.63(1h，s)7.55(1h,d,j＝8.0hz)、6.56(1h,d,j＝8.0hz)、3.29(2h,tr,j＝6.0hz)、2.94(3h,s)、1.75(2h,tr,j＝6.0hz)、1.33(12h,s)、1.31(6h,s)；¹³c{¹h}nmr(175.73mhz,cdcl3)：δ147.8、134.4、132.3、130.3、110.1、83.2、47.7、39.2、37.2、32.1、30.7、25.0，未觀察到附著于硼的碳的共振；¹¹b{¹h}nmr(128.38mhz,cdcl3)δ31.01；元素分析理論值(％)c18h28bno2：c71.77、h9.37、n4.65；實測值：c71.79、h9.27、n4.60。

4(e)3-[4-(1,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氫喹啉-6-基)-苯基]-丙烯酸甲酯(13)

在干燥的、n2填充的手套箱中，將pd(dppf)cl2(25mg、0.03mmol)、1,4,4-三甲基-6-(4,4,5,5-四甲基-[1,3,2]二氧雜硼雜環(huán)戊烷-2-基)-1,2,3,4-四氫喹啉(0.49g、1.55mmol)、3-(4-溴-苯基)-丙烯酸甲酯(0.37g、0.83mmol)和k3po4·2h2o(0.77g、3.10mmol)在裝有young's龍頭的厚壁玻璃管中混合。添加經(jīng)脫氣的ⁱproh(10ml)和h2o(1ml)并在80℃下將混合物加熱18小時，此時gcms分析顯示反應(yīng)完成。真空除去溶劑并在dcm(100ml)中溶解殘余物并用h2o(3×20ml)洗滌。用mgso4干燥有機層，過濾并真空除去溶劑，以得到殘余物，通過二氧化硅墊將該殘余物過濾并用dcm洗脫。在真空中去除溶劑得到黃色固體，在-20℃下該黃色固體從meoh中重結(jié)晶，以得到黃白色針狀結(jié)晶13(0.32g、62％)；mp121-123℃；uv-vis(chcl3)λmax(ε)380nm(23900lmol^-1cm^-1)；λem(chcl3)536nm；m/z(es⁺-ms)336([m-h]⁺)；¹hnmr(499.77mhz,cdcl3)δ7.73(1h,d,j＝16.0hz)、7.58(2h,d,j＝8.5hz)、7.56(2h,d,j＝8.5hz)、7.48(1h,s)、7.37(1h,d,j＝8.0hz)、6.66(1h,d,j＝8.0hz)、6.45(1h,d,j＝16.0hz)、3.83(3h,s)、3.30(2h,tr,j＝5.5hz)、2.97(3h,s)、1.81(2h,tr,j＝5.5hz)、1.35(6h,s)；¹³c{¹h}nmr(125.67mhz,cdcl3)δ167.87、145.49、144.98、143.89、131.85(2個峰重疊)、12.71、127.45、126.49、125.63、124.56、116.56、111.28、51.79、47.75、39.40、37.24、32.34、30.97；hrms理論值c22h26no2([m-h]⁺)336.19581，實測值336.19577。

實施例5

6-(1,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氫喹啉-6-基)-萘-2-羧酸甲酯(11)

5(a)6-(5,5-二甲基-[1,3,2]二氧雜硼烷-2-基)-1,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氫喹啉(10)

在干燥的、n2填充的手套箱中，將pd(dppf)cl2(0.135g、0.17mmol)、6-碘-1,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氫-喹啉(1.0g、3.22mmol)、b2pin2(0.75g、3.32mmol)和koac(0.65g、6.64mmol)在裝有young's龍頭的厚壁玻璃管中混合。加入經(jīng)脫氣的dmso(10ml)并在80℃下將混合物加熱18小時，此時gcms分析顯示反應(yīng)完成。用et2o(100ml)稀釋混合物并用h2o(3×100ml)洗滌。用mgso4干燥有機層，過濾并真空除去溶劑，以得到殘余物，通過二氧化硅墊過濾該殘余物并用1:1的dcm/己烷洗脫。在真空中去除溶劑得到粗產(chǎn)物，在-20℃下該粗產(chǎn)物從meoh中重結(jié)晶，以得到白色針狀結(jié)晶10(0.80g、88％)；mp151-153℃；m/z(ei-ms)287(90％,m⁺)，272(100％,m⁺-me)；¹hnmr(499.77mhz,cdcl3)δ7.64(1h,d,j＝1.5hz)、7.54(1h,dd,j＝8.5,1.5hz)、7.27(1h,s)、6.57(1h,d,j＝8.5hz)、3.75(4h,s)、3.28(2h,tr,j＝6.0hz)、2.94(3h,s)、1.76(2h,tr,j＝6.0hz)、1.32(6h,s)、1.02(6h,s)；¹³c{¹h}nmr(125.67mhz,cdcl3)δ147.49、133.29、131.42、130.19、110.09、72.33、47.75、39.24、37.29、32.05、32.03、30.83、20.12，未觀察到附著于硼的碳的共振；¹¹b{¹h}nmr(128.38mhz,cdcl3)δ27.02；元素分析理論值(％)c17h26bno2：c71.09、h9.12、n4.88；實測值：c71.00、h9.12、n4.81。

5(b)6-(1,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氫喹啉-6-基)-萘-2-羧酸甲酯，(11)

在干燥的、n2填充的手套箱中，將pd(dppf)cl2(13mg、0.02mmol)、6-(5,5-二甲基-[1,3,2]二氧雜硼烷-2-基)-1,4,4-三甲基-1,2,3,4-四氫-喹啉(0.25g、0.87mmol)、6-溴-萘-2-羧酸甲酯(0.22g、0.83mmol)和k3po4·2h2o(0.43g、1.74mmol)在裝有young's龍頭的厚壁玻璃管中混合。添加經(jīng)脫氣的dmso(15ml)和h2o(3ml)并在80℃下將混合物加熱18小時，此時gcms分析顯示反應(yīng)完成。用et2o(100ml)稀釋混合物并用h2o(3×100ml)洗滌。用mgso4干燥有機層，過濾并真空除去溶劑，以得到殘余物，通過二氧化硅墊過濾該殘余物并用dcm洗脫。在真空中去除溶劑得到黃色固體，在-20℃下該黃色固體從meoh中重結(jié)晶，以得到黃白色針狀結(jié)晶11(0.28g、94％)；mp166-167℃；uv-vis(chcl3)λmax(ε)243nm(53200lmol^-1cm^-1)；λem(chcl3)494nm；m/z(ei-ms)359(100％,m⁺)、344(60％,m⁺-me)；¹hnmr(699.73mhz,cdcl3)δ8.60(1h,s)、8.06(1h,dd,j＝8.5,1.5hz)、7.99(1h,s)、1.97(1h,d,j＝8.5hz)、7.90(1h,d,j＝8.0hz)、7.81(1h,dd,j＝8.5,1.5hz)、7.60(1h,d,j＝2.0hz)、7.49(1h,dd,j＝8.5,2.0hz)、6.71(1h,d,j＝8.5hz)、3.99(3h,s)、3.32(2h,tr,j＝6.0hz)、2.99(3h,s)、1.84(2h,tr,j＝6.0hz)、1.39(6h,s)；¹³c{¹h}nmr(175.73mhz,cdcl3)δ167.55、145.49、141.72、136.29、131,99、131.08、129.74、128.74、128.18、126.62、126.31、126.05、125.62、124.97、123.74、111.41、52.29、47.79、39.43、37.31、32.40、31.03；hrms理論值c24h25no2(m⁺)359.18798，實測值359.18789。

實施例6

4-2-[2,4,4-三甲基-1-(丙-2-基)-1,4-二氫喹啉-6-基]乙炔基苯甲酸，(17)

6(a)6-碘-2,4,4-三甲基-1-(丙-2-基)-1,4-二氫喹啉，(15)

向3(1.17g、3.42mmol)的無水thf溶液(50ml)中添加memgbr(3.0m的et2o溶液，2.28ml，6.84mmol)并在回流下將所得溶液攪拌16小時。將溶液冷卻，用20％hcl(1.14ml)和h2o淬火，用etoac稀釋，用h2o和鹽水洗滌，干燥(mgso4)并蒸發(fā)，以得到粗的無色油狀物(0.95g)。立即通過sio2層析(含有1％et3n的己烷：etoac(97.5：2.5)作為洗脫液)純化以得到粉紅色油狀物15(0.35g，、30％)，將該粉紅色油狀物立即用于下一個反應(yīng)：¹hnmr(400mhz,cdcl3)δ1.20(s,6h)、1.45(s,3h)、1.46(s,3h)、1.98(d,j＝0.9hz,3h)、4.16(hept,j＝7.1hz,1h)、4.50(q,j＝1.2hz,1h)、6.73(d,j＝8.7hz,1h,)、7.34(dd,j＝8.7,2.2hz,1h)、7.42(d,j＝2.1hz,1h)。

6(b)4-2-[2,4,4-三甲基-1-(丙-2-基)-1,4-二氫喹啉-6-基]乙炔基苯甲酸，(17)

在ar下，向schlenk燒瓶中加入pd(pph3)2cl2(0.073g、0.104mmol)、cui(0.0198g、0.104mmol)和7(0.176g、1.10mmol)。將燒瓶抽真空并用ar再填充。加入溶解在三乙胺(12ml)中的15(0.356g、1.04mmol)并將燒瓶再次抽真空/用ar再填充(3x)。在rt下將混合物攪拌72小時。用et2o稀釋溶液，在真空下通過硅藻土/sio2并蒸發(fā)，以得到粗的綠色固體(0.4g)。通過sio2層析(具有1％et3n的己烷：etoac(8：2)作為洗脫液)純化以得到16(示意圖iv)，其為淺綠色固體(0.12g、30％)。然后將16(0.073g、0.195mmol)溶于thf(10ml)中，并向其中添加20％naoh水溶液(2ml)。在回流下將所得溶液攪拌40小時，然后將混合物冷卻并加入h2o和et2o。用5％hcl將溶液酸化至ph7，用et2o稀釋，用鹽水洗滌，干燥(mgso4)并蒸發(fā)，以得到黃色固體17(0.070g、99％)：¹hnmr(400mhz；cdcl3)δ1.24(s,6h)、1.47(s,3h)、1.49(s,3h)、2.01(d,j＝0.9hz,3h)、4.23(hept,j＝7.2hz,1h)、4.53(d,j＝1.1hz,1h)、6.93(d,j＝8.6hz,1h)、7.27-7.29(m,1h)、7.37(d,j＝2.0hz,1h)、7.54(d,j＝8.3hz,2h)、8.03(d,j＝8.4hz,2h)。

實施例7

實施例3的化合物9和實施例6的化合物17的初始熒光表征

在各種溶劑中獲得9的吸收光譜和發(fā)射光譜(圖3和圖4)。9與的比較(圖1和圖2)示出了最大吸收和發(fā)射波長的顯著增加。在低至1nm的濃度下也容易檢測到來自9的熒光，并且觀察到溶劑依賴性效應(yīng)，其中在非極性溶劑中檢測到高強度熒光，然而特別地，在水中觀察到顯著的熒光猝滅。熒光發(fā)射波長也非常依賴于溶劑極性，其中當(dāng)與非極性溶劑相比時，在極性溶劑中發(fā)生顯著的紅移。該初始表征表明，當(dāng)將9應(yīng)用于細胞時，根據(jù)局部極性，可以預(yù)期在離散的細胞位置中辨別出9的熒光。

化合物17呈現(xiàn)出與化合物9類似的發(fā)射曲線(圖6)，但也呈現(xiàn)出更長的最大吸收波長(圖5)。該吸收帶在約379nm處達到峰值，并且進入靛藍/藍色(440nm)。該較長的波長吸收帶表明化合物17將比化合物9更有效地激發(fā)，該化合物9具有在熒光顯微鏡上典型的405nm激發(fā)源。

實施例3的化合物9的光穩(wěn)定性

在不存在光的情況下化合物9在環(huán)境溫度下儲存后，記錄化合物9在dmso-d6中的¹hnmr光譜(圖7)。然后將相同的化合物9的樣品以30cm的距離暴露于標準實驗室光72小時，然后記錄¹hnmr光譜(圖8)。盡管化合物9的一小部分轉(zhuǎn)化為結(jié)構(gòu)相似的烯胺形式，但是在這段時間內(nèi)，化合物9對典型的實驗室照明是穩(wěn)定的?；衔?保持穩(wěn)定，直到化合物9暴露大約16天，此時一些降解跡象變得明顯。雖然22天的暴露后觀察到更顯著的降解，但是化合物9仍然占樣品的主要成分(>60％)。

化合物9和化合物17的生物學(xué)評價

定義類視色素的性質(zhì)是類視色素誘導(dǎo)特定細胞類型分化以及誘導(dǎo)對視黃酸直接響應(yīng)的基因表達的能力，該視黃酸與結(jié)合配體激活的視黃酸受體(rar)的定義序列(視黃酸反應(yīng)單元，rare)的dna連接，從而使基因轉(zhuǎn)錄機器能夠募集到待表達基因的信使rna轉(zhuǎn)錄物所需的基因調(diào)控序列(啟動子)。

為了示出熒光類視色素呈現(xiàn)出類視色素活性，用1μm和10μm的atra、和化合物9處理tera-2細胞(胚胎癌細胞系)，所得樣品用各種免疫細胞化學(xué)染色劑進行染色。表1示出了在巢蛋白(通常在神經(jīng)干細胞中表達的中間絲狀體)的存在下，用1μm和10μm的atra、和化合物9以及用載體溶劑dmso處理tera-2細胞的結(jié)果。在10μm的和化合物9樣品中，所有條件對于可能在較小程度上染色的巢蛋白是陽性的。

表2示出了在細胞角蛋白8(ck8)，非神經(jīng)分化的標記物的存在下，用1μm和10μm的atra、和化合物9以及用載體溶劑dmso處理tera-2細胞的結(jié)果。如典型的非神經(jīng)分化中的減少類似，在atra和的10μm樣品中染色較不強烈，但與1μm樣品相比，用化合物9的染色稍微更亮。對于ck8，dmso處理顯示非常亮的染色。

表3示出了在tuj-1泛神經(jīng)元標記物的存在下，用1μm和10μm的atra、和化合物9以及用載體溶劑dmso處理tera-2細胞的結(jié)果。對于tuj-1，用atra、和化合物9處理的樣品顯示顯著的染色，其中增加的染色對10μm處理的樣品更明顯。經(jīng)dmso處理的細胞僅顯示有限的tuj-1染色。

表4示出了在oct4(作為亞全能性的標記物的轉(zhuǎn)錄因子)的存在下，用1μm和10μm的atra、和化合物9以及用載體溶劑dmso處理tera-2細胞的結(jié)果。對于oct4，經(jīng)dmso處理的細胞顯示明顯的陽性染色，并且在1μm的atra處理中染色也明顯。對于oct4，所有其他條件沒有呈現(xiàn)出染色，表明和化合物9容易通過促進分化來下調(diào)亞全能性的標記物。

表5示出了在sox2(作為亞全能性的標記物的轉(zhuǎn)錄因子)的存在下，用1μm和10μm的atra、和化合物9以及用載體溶劑dmso處理tera-2細胞的結(jié)果。對于sox2，經(jīng)dmso處理的細胞顯示明顯的陽性染色，而在用atra、和化合物9處理的細胞中染色顯著減少。該觀察結(jié)果表明atra、和化合物9容易通過促進分化來下調(diào)亞全能性的標記物。

圖9示出了用atra、和化合物9以及dmso處理的tera-2細胞的流式細胞術(shù)分析。測定了干細胞標記物ssea-3的表達，當(dāng)用類視色素處理細胞時，該表達通常降低。ssea-3流式細胞術(shù)顯示，與經(jīng)dmso處理的細胞相比，ssea-3的表達在經(jīng)類視色素處理的細胞中顯著降低。在1μm和10μm處理下，經(jīng)化合物9處理的細胞顯示出比atra和高的ssea-3水平。

圖10示出了用atra、和化合物9以及dmso處理的tera-2細胞的流式細胞術(shù)分析。測定了干細胞標記物tra160的表達，當(dāng)用類視色素處理細胞時，該表達通常降低。tra160流式細胞術(shù)顯示，與經(jīng)dmso處理的細胞相比，tra160的表達在經(jīng)類視色素處理的細胞中顯著降低。在1μm和10μm處理下，經(jīng)化合物9處理的細胞顯示出比atra和略高的tra160水平。

圖11示出了用atra、和化合物9以及dmso處理的tera-2細胞的流式細胞術(shù)分析。測定了早期神經(jīng)元標記物a2b5的表達，當(dāng)用類視色素處理細胞時，該表達通常增加。a2b5流式細胞術(shù)顯示，與經(jīng)dmso處理的細胞相比，a2b5的表達在經(jīng)類視色素處理的細胞中顯著增加。與和化合物9相比，經(jīng)atra處理的細胞表達更高的a2b5水平。

表6示出了已用atra、和化合物9以及dmso處理的細胞群的相差圖像。在用dmso處理的細胞群中，細胞很小，并且密集地堆積在一起。相比之下，用atra、和化合物9處理的細胞群體密度較低，并且細胞擴散得更開。

圖12和圖13示出了atra、和化合物9以及dmso的1μm和10μm處理的mtt細胞活力分析。所有處理呈現(xiàn)出與dmso相當(dāng)?shù)幕盍?，表明用類視色素處理的細胞不具有顯著的毒性作用。

圖14示出了用10μm、1μm、0.1μm、0.01μm濃度的化合物9處理并在7天后用共焦熒光顯微鏡成像的tera-2細胞。即使在最低處理濃度下，化合物9的熒光也是可見的，其中0.1μm至10μm處理容易成像。化合物9主要位于核被膜周圍，并且似乎也位于其他細胞結(jié)構(gòu)周圍。

圖15、16和17分別示出了用10μm的化合物9處理并在8小時(shsy5y)、24小時(成纖維細胞)和7天(tera-2)后用共焦熒光顯微鏡成像的shsy5y細胞(神經(jīng)母細胞瘤)、成纖維細胞和tera-2細胞。化合物9再次清晰可見，并在核被膜周圍具有明顯的定位。

圖18示出了用10μm的化合物9處理5天，固定，然后用共焦熒光顯微鏡成像的hacat角質(zhì)化皮膚細胞。

圖19示出了用化合物9(10μm)處理5天的hacat角質(zhì)化皮膚細胞。然后用involucrin(綠色)和k14(紅色)將固定的蓋玻片染色，并使用共聚焦顯微鏡成像。將化合物9的熒光染成藍色。involucrin選擇性地將細胞視黃酸結(jié)合蛋白(crabp)染色，該細胞視黃酸結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)運細胞核內(nèi)和周圍的類視色素。k14是分解基底角質(zhì)細胞的原型標記物，并且有助于維持表皮細胞的形狀。

圖21示出了用化合物17(10μm)處理5天的hacat角質(zhì)化皮膚細胞。然后用involucrin(綠色)和k14(紅色)將固定的蓋玻片染色，并使用共聚焦顯微鏡成像。將化合物17的熒光染成藍色。involucrin選擇性地將細胞視黃酸結(jié)合蛋白(crabp)染色，該細胞視黃酸結(jié)合蛋白轉(zhuǎn)運細胞核內(nèi)和周圍的類視色素。k14是分解基底角質(zhì)細胞的原型標記物，并且有助于維持表皮細胞的形狀。如圖20所示，在相同條件下，來自化合物17的熒光比由化合物9呈現(xiàn)出的熒光顯著更強烈(圖19)。

圖22示出了化合物9的拉曼光譜。在2190cm^-1處觀察到高強度的乙炔帶。這位于細胞沉默區(qū)域(1800-2800cm^-1)，其中沒有觀察到生物來源的信號，例如酰胺鍵。當(dāng)使用拉曼顯微鏡/光譜法來成像或分析細胞樣品時，該光譜分離使得細胞沉默區(qū)域中的拉曼帶更容易被檢測。