專(zhuān)利名稱：克列維醇在制備酪氨酸酶抑制劑的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種克列維醇，尤其是涉及一種來(lái)源于紅樹(shù)林內(nèi)生真菌一矮棒曲霉BYY-1(A.clavatonanicus)真菌代謝產(chǎn)物克列維醇作為酪氨酸酶抑制劑在醫(yī)藥品、化妝品及食品領(lǐng)域的用途。
背景技術(shù)：
酪氨酸酶廣泛存在于人、動(dòng)物、植物和微生物中，是一種以Cu2+為輔助因子的金屬酶。該酶兼有加氧酶和氧化酶的雙重功能，在黑色素合成過(guò)程中起關(guān)鍵作用，是黑色素合成過(guò)程的限速酶。它能夠催化單酚羥化成二酚，并把二酚氧化成醌；醌在非酶促條件下形成最終的反應(yīng)產(chǎn)物黑色素。酪氨酸酶的活性與黑色素合成量密切相關(guān)，在人體內(nèi)的活性增高會(huì)導(dǎo)致產(chǎn)生黃褐斑、雀斑、老人斑等色素沉著性疾病。食物(果蔬、蝦、蟹等)中的酪氨酸酶會(huì)引起食物在加工及貯藏過(guò)程中的褐變反應(yīng)，導(dǎo)致食品品質(zhì)變差，貨架期縮短(1、Slominski A，Tobin DJ，Shibahara S，et al.Melanin pigmentation in ammalian skin and its hormonal regulation.Physiol Rev，2004，841155-1228；2、丁大鵬，馬文麗，鄭文嶺.酪氨酸酶抑制劑的研究進(jìn)展.實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2005，211364-1366)。
鑒于酪氨酸酶與人體健康疾病的關(guān)系十分密切，而且又是影響食品質(zhì)量的主要原因，因此尋找具有抗酪氨酸酶的活性化合物，已成為制藥、食品及化妝品等不同領(lǐng)域的研究開(kāi)發(fā)熱點(diǎn)。
目前，已有不少來(lái)源于化學(xué)合成和天然產(chǎn)物的酪氨酸酶抑制劑作為藥品、化妝品或食品添加劑使用。已普遍應(yīng)用的酪氨酸酶抑制劑有氫醌、曲酸、壬二酸、熊果苷和黃酮類(lèi)化合物等。但現(xiàn)有的酪氨酸酶抑制劑在活性、穩(wěn)定性或安全性等多方面存在著不同程度的缺陷。例如氫醌作為酪氨酸酶抑制劑使用一定時(shí)間后，會(huì)引起對(duì)皮膚的原發(fā)性刺激反應(yīng)、接觸性皮炎和炎癥后新的色素沉著，從而可能會(huì)導(dǎo)致皮膚顏色進(jìn)一步加深。因此，繼續(xù)尋找活性高、安全性好、性質(zhì)穩(wěn)定的酪氨酸酶抑制劑仍然具有十分重要的意義。
海洋真菌種類(lèi)多，分布廣，既可生活在水體和底泥中，又可棲息在紅樹(shù)植物、海綿、珊瑚、海鞘、海藻等不同的海洋動(dòng)植物體上。國(guó)內(nèi)外對(duì)海洋真菌的系統(tǒng)研究起步較遲，對(duì)其代謝產(chǎn)物化學(xué)及生物活性的研究水平遠(yuǎn)不及陸生真菌，但近幾年來(lái)研究進(jìn)展較快，目前已從這類(lèi)真菌中分離并鑒定了許多活性化合物，其中有些具有很強(qiáng)的抑制酪氨酸酶活性(1、BugniT S，Ireland C M.Marine-derived fungia chemically and biologically diverse group ofmicroorganisms.Nat.Prod.Rep.，2004，21143-163；2、Imada C，Sugimoto Y，Makimura T，kobayashi T，Hamada N，Watanabe E.Isolation and characterization of tyrosinaseinhibitorproducing microorganisms from marine environment.Fisheries science.2001，671151-1156.)。已有的研究結(jié)果表明海洋真菌代謝產(chǎn)物中蘊(yùn)藏著許多具有生物活性的新化合物，是開(kāi)發(fā)活性物質(zhì)的寶貴資源。
紅樹(shù)植物內(nèi)生真菌是海洋真菌的重要成員，這類(lèi)微生物能產(chǎn)生許多與宿主植物相同或不同的活性代謝產(chǎn)物，包括一些在陸棲微生物中未曾發(fā)現(xiàn)過(guò)的生物活性物質(zhì)，是發(fā)掘天然的酪氨酸酶抑制劑的重要資源，但目前鮮見(jiàn)從這類(lèi)真菌中尋找酪氨酸酶抑制劑乙酰膽堿酯酶抑制劑的研究開(kāi)發(fā)報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種來(lái)源于紅樹(shù)林內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物克列維醇在制備酪氨酸酶抑制劑的應(yīng)用。
本發(fā)明所用的紅樹(shù)林內(nèi)生真菌為矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)，已于2006年7月3日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(CCTCC中國(guó)武漢大學(xué)校內(nèi))，保藏號(hào)為CCTCC NOM206063。
本發(fā)明所述的克列維醇(clavatol)為2，4-Dihydroxy-3，5-dimethylacetophenone，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下 所述的克列維醇的制備方法為1)矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)的種子培養(yǎng)A.配制斜面培養(yǎng)基馬鈴薯去皮切塊，放入海水中，煮后過(guò)濾，濾液用海水定容，得馬鈴薯汁，然后添加葡萄糖或蔗糖及瓊脂，分裝試管，滅菌后制成斜面培養(yǎng)基。將矮棒曲霉BYY-1轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)。
B.配制種子液在馬鈴薯汁中添加葡萄糖或蔗糖，分裝后滅菌，得種子培養(yǎng)基。將上述培養(yǎng)的斜面菌種接入到分裝后的種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)，得種子液。
C.種子罐種子培養(yǎng)先配制種子培養(yǎng)基(配方同上)，將種子培養(yǎng)基裝入種子罐，將上述培養(yǎng)的種子液接入種子罐中，培養(yǎng)后得培養(yǎng)后的種子液。
2、克列維醇的發(fā)酵配制發(fā)酵培養(yǎng)基(配方同種子培養(yǎng)基)，將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，將上述培養(yǎng)后的種子液接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵后得發(fā)酵液。
3、克列維醇的提取將發(fā)酵液過(guò)濾除菌體，濾液減壓濃縮后用有機(jī)溶劑萃取，收集有機(jī)相并減壓濃縮成浸膏。
4、克列維醇的精制浸膏用甲醇溶解得克列維醇甲醇溶液，在克列維醇甲醇溶液中加入硅膠拌樣，上硅膠柱進(jìn)行分離，以石油醚/乙酸乙酯(石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100)為洗脫劑梯度洗脫，收集當(dāng)石油醚/乙酸乙酯的體積比例為(50～3)∶1時(shí)的洗脫液，合并洗脫液并減壓濃縮至干，得微黃色晶體，加溶劑溶解后重結(jié)晶至少2次，得目標(biāo)產(chǎn)物，即克列維醇。
在步驟1)中，配制斜面培養(yǎng)基的馬鈴薯去皮切成小塊，取150～300g放入1L 20％～100％海水(海水與自來(lái)水按體積比混合)中，煮后過(guò)濾，濾液用20％～100％海水定容至1000ml，得馬鈴薯汁，然后添加葡萄糖或蔗糖10～30g，瓊脂1.5～3.0g，分裝試管，121℃滅菌30min后制成斜面培養(yǎng)基，將矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上后25～32℃下培養(yǎng)3～7d；配制種子液時(shí)，在每升馬鈴薯汁(制備方法同上)中添加葡萄糖或蔗糖10～30g，分裝后滅菌(121℃，30min)，得種子培養(yǎng)基，將上述培養(yǎng)的斜面菌種接入到分裝后的種子培養(yǎng)基中，25～32℃下，120～250r/min搖瓶培養(yǎng)2～5d，得種子液；種子罐種子培養(yǎng)時(shí)，將種子培養(yǎng)基裝入種子罐的裝罐量為種子罐容積的60％～70％，將上述培養(yǎng)的種子液按接種量2％～10％接入種子罐中，在溫度25～32℃、攪拌轉(zhuǎn)速120～220r/min和通氣量0.3～1.2vvm的條件下培養(yǎng)2～4d，得培養(yǎng)后的種子液。
在步驟2)中，配制發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐的裝罐量為發(fā)酵罐容積的60％～70％，將上述培養(yǎng)后的種子液按接種量5％～10％接入發(fā)酵罐中，在溫度25～32℃、攪拌轉(zhuǎn)速120～200r/min和通氣量0.3～1.5vvm的條件下發(fā)酵4～7d，得發(fā)酵液。
在步驟3)中，將發(fā)酵液過(guò)濾除菌體，濾液減壓濃縮至發(fā)酵液體積的35％～20％后用有機(jī)溶劑萃取至少2次，收集有機(jī)相并減壓濃縮成浸膏，有機(jī)溶劑選自乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳、甲苯中的一種。
在步驟4)中，在克列維醇甲醇溶液中加入質(zhì)量為浸膏5～10倍的硅膠拌樣，收集當(dāng)石油醚/乙酸乙酯的體積比例為(50～3)/1時(shí)的洗脫液。溶劑選自甲醇、乙酸乙酯和丙酮中的一種。
所得的化合物無(wú)色針狀晶體，mp180～182℃，ESIMSm/z(rel.int.)179.0[M-H]-；1H-NMR和13C-NMR(500MHz，DMSO，ppm)數(shù)據(jù)見(jiàn)表1。經(jīng)譜圖綜合解析結(jié)果證實(shí)該化合物為克列維醇。
表1.克列維醇的NMR數(shù)據(jù)

經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)該化合物具有顯著的抑制酪氨酸酶活性，可用于制備酪氨酸酶抑制劑并應(yīng)用于醫(yī)藥品、化妝品及食品中。本發(fā)明所述的來(lái)源于紅樹(shù)林內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物克列維醇可通過(guò)發(fā)酵制得，無(wú)原材料之憂，且提取精制方法簡(jiǎn)單，適合規(guī)?；a(chǎn)。


圖1 克列維醇對(duì)酪氨酸酶活力的影響。在圖1中，橫坐標(biāo)為Clavatol(μg/ml)，縱坐標(biāo)為Inhibitior(％)。
圖2 clavatol對(duì)蘑菇酪氨酸酶抑制機(jī)理的判斷。在圖2中，直線0，1，2，3，4的克列維醇濃度分別為1.67μg/ml，3.33μg/ml，5.0μg/ml，6.67μg/ml。橫坐標(biāo)為CE/μg·ml-1，縱坐標(biāo)為Activity/μmol·L-1。
圖3化合物clavatol對(duì)mushroom tyrosinase抑制作用的Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖。在圖3中，橫坐標(biāo)為S-1/mmol-1·L，縱坐標(biāo)為v-1/μmol-1·L·min。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合具體實(shí)例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例1A.培養(yǎng)基配方斜面培養(yǎng)基配方每升馬鈴薯汁(馬鈴薯去皮切成小塊，取200g放入1L 50％海水中，煮30min，過(guò)濾，濾液用50％海水(海水與自來(lái)水按體積比混合)定容至1000ml)中添加葡萄糖20g，瓊脂2.0g。種子培養(yǎng)基配方每升馬鈴薯汁(制法同上)中添加葡萄糖20g。發(fā)酵培養(yǎng)基配方同種子培養(yǎng)基。
B.發(fā)酵工藝斜面培養(yǎng)按上述斜面培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝試管，121℃滅菌30min后制斜面。將保存的紅樹(shù)植物內(nèi)生真菌一矮棒曲霉CCTCC NOM206063菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)7d。搖瓶培養(yǎng)按種子培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝500錐型瓶(80ml/瓶)，滅菌(121℃，30min)后將培養(yǎng)的斜面菌種接入，28℃下，140r/min搖瓶培養(yǎng)3d。種子罐培養(yǎng)按種子培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，20L種子罐培養(yǎng)基裝量為12L，121℃滅菌30min，冷卻后將培養(yǎng)的搖瓶種子按接種量2％接入種子罐中，在溫度28℃、攪拌轉(zhuǎn)速120r/min和通氣量0.5vvm的條件下培養(yǎng)3d。發(fā)酵罐培養(yǎng)按發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，200L發(fā)酵罐培養(yǎng)基裝量為120L，121℃滅菌30min，待冷卻至28℃后將上述種子罐已培養(yǎng)好的種子按接種量10％接入罐中，在溫度28℃、攪拌轉(zhuǎn)速120r/min和通氣量0.3vvm的條件下培養(yǎng)7d。
C.克列維醇的提取發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液過(guò)濾除菌體，濾液減壓濃縮至原液體積的25％后用乙酸乙酯萃取3次，收集有機(jī)相并減壓濃縮成浸膏。
D.克列維醇的精制浸膏用少量的甲醇溶解后加入適量硅膠拌樣，上硅膠柱進(jìn)行分離，以石油醚-乙酸乙酯＝50∶1(v/v)為洗脫劑洗脫，收集洗脫液并減壓濃縮至干，得微黃色晶體，加適量的乙酸乙酯溶解，于室溫下重結(jié)晶，同法再重結(jié)晶4次。
實(shí)施例2A.培養(yǎng)基配方斜面培養(yǎng)基配方每升馬鈴薯汁(馬鈴薯去皮切成小塊，取300g放入1L 100％海水中，煮30min，過(guò)濾，濾液用100％海水定容至1000ml)中添加葡萄糖30g，瓊脂3.0g。種子培養(yǎng)基配方每升馬鈴薯汁(制法同上)中添加蔗糖30g。發(fā)酵培養(yǎng)基配方同種子培養(yǎng)基。
B.發(fā)酵工藝斜面培養(yǎng)按上述斜面培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝試管，121℃滅菌30min后制斜面。將保存的紅樹(shù)植物內(nèi)生真菌一矮棒曲霉CCTCC NOM206063菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，28℃下培養(yǎng)5d。搖瓶培養(yǎng)按上述種子培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝錐型瓶(100ml/瓶)，滅菌(121℃，30min)后將上述培養(yǎng)的斜面菌種接入，28℃下，220r/min搖瓶培養(yǎng)3d。種子罐培養(yǎng)按上述種子培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，20L種子罐培養(yǎng)基裝量為12L，121℃滅菌30min，冷卻后將上述培養(yǎng)的搖瓶種子按接種量5％接入種子罐中，在溫度25℃、攪拌轉(zhuǎn)速220r/min和通氣量0.5vvm的條件下培養(yǎng)3d。發(fā)酵罐培養(yǎng)按上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，200L發(fā)酵罐培養(yǎng)基裝量為120L，121℃滅菌30min，待冷卻至25℃后將上述種子罐已培養(yǎng)好的種子按接種量5％接入罐中，在溫度25℃、攪拌轉(zhuǎn)速220r/min和通氣量0.5vvm的條件下培養(yǎng)3d。
C.克列維醇的提取發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液過(guò)濾除菌體，濾液減壓濃縮至原液體積的20％后用乙酸乙酯萃取5次，收集有機(jī)相并減壓濃縮成浸膏。
D.克列維醇的精制浸膏用少量的甲醇溶解后加入適量硅膠拌樣，上硅膠柱進(jìn)行分離，以石油醚-乙酸乙酯＝20∶1(v/v)為洗脫劑洗脫，收集洗脫液并減壓濃縮至干，得微黃色晶體，加適量的甲醇溶解，于室溫下重結(jié)晶，同法再重結(jié)晶2次。
實(shí)施例3A.培養(yǎng)基配方斜面培養(yǎng)基配方每升馬鈴薯汁(馬鈴薯去皮切成小塊，取150g放入1L 20％海水中，煮30min，過(guò)濾，濾液用20％海水(海水與自來(lái)水按體積比混合)定容至1000ml)中添加葡萄糖15g，瓊脂1.5g。種子培養(yǎng)基配方每升馬鈴薯汁(制法同上)中添加葡萄糖15g。
發(fā)酵培養(yǎng)基配方同種子培養(yǎng)基。
B.發(fā)酵工藝斜面培養(yǎng)按上述斜面培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝試管，121℃滅菌30min后制斜面。將保存的紅樹(shù)植物內(nèi)生真菌一矮棒曲霉CCTCC NOM206063菌種轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上，32℃下培養(yǎng)5d。搖瓶培養(yǎng)按上述種子培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，分裝500錐型瓶(120ml/瓶)，滅菌(121℃，30min)后將上述培養(yǎng)的斜面菌種接入，32℃下，180r/min搖瓶培養(yǎng)5d。種子罐培養(yǎng)按上述種子培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，50L種子罐培養(yǎng)基裝量為30L，121℃滅菌30min，冷卻后將上述培養(yǎng)的搖瓶種子按接種量5％接入種子罐中，在溫度32℃、攪拌轉(zhuǎn)速180r/min和通氣量1.2vvm的條件下培養(yǎng)5d。發(fā)酵罐培養(yǎng)按上述發(fā)酵培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，500L發(fā)酵罐培養(yǎng)基裝量為120L，121℃滅菌30min，待冷卻至32℃后將上述種子罐已培養(yǎng)好的種子按接種量10％接入罐中，在溫度32℃、攪拌轉(zhuǎn)速180r/min和通氣量1.2vvm的條件下培養(yǎng)5d。
C.克列維醇的提取發(fā)酵結(jié)束后，發(fā)酵液過(guò)濾除菌體，濾液減壓濃縮至原液體積的35％后用乙酸乙酯萃取3次，收集有機(jī)相并減壓濃縮成浸膏。
D.克列維醇的精制浸膏用少量的甲醇溶解后加入適量硅膠拌樣，上硅膠柱進(jìn)行分離，以石油醚-乙酸乙酯＝10∶1(v/v)為洗脫劑洗脫，收集洗脫液并減壓濃縮至干，得微黃色晶體，加適量的丙酮溶解，于室溫下重結(jié)晶，同法再重結(jié)晶3次。
實(shí)施例4采用分光光度法測(cè)定克列維醇對(duì)酪氨酸酶抑制的抑制活性在比色杯中先后加入0.1mL含不同濃度的克列維醇(溶于甲醇溶液)，2.8mL的0.5mmol/L L-DOPA(L-3，4-Dihydroxyphenylalanine，)溶液(0.05mol/L磷酸緩沖液配制)，0.1mL蘑菇酪氨酸酶水溶液(133U/ml)，立刻混勻，于Beckman DU650分光光度計(jì)，30℃恒溫下測(cè)定475nm的光密度值隨時(shí)間的增長(zhǎng)直線，從直線的斜率求得酶活力(參見(jiàn)圖1)。
將測(cè)定結(jié)果經(jīng)回歸統(tǒng)計(jì)分析軟件得到克列維醇對(duì)酪氨酸酶的IC50(抑制酶活力50％時(shí)的抑制劑濃度)為6.94μmol/L，顯示該化合物對(duì)酪氨酸酶具有很強(qiáng)的抑制作用。
實(shí)施例5在上述測(cè)活體系中，固定底物濃度(L-DOPA，0.5mmol/L)，加入不同濃度的克列維醇，改變加入的酶量，測(cè)定不同濃度的克列維醇對(duì)酪氨酸酶活力的影響，以酶活力對(duì)酶量作圖得到一組通過(guò)原點(diǎn)的直線(參見(jiàn)圖2)，且隨著化合物濃度的增大，直線的斜率降低。說(shuō)明克列維醇與酶的結(jié)合為可逆結(jié)合，是可逆抑制劑。
實(shí)施例6在上述測(cè)活體系中，固定酶的濃度，改變底物(L-DOPA)的濃度，測(cè)定不同濃度的克列維醇對(duì)酶活力的影響，以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，得到一組交叉于縱軸的直線(參見(jiàn)圖3)，說(shuō)明該化合物作為酪氨酸酶的抑制劑，不改變酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速度(Vmax)，只影響米氏常數(shù)(Km)，其抑制類(lèi)型為競(jìng)爭(zhēng)性抑制類(lèi)型。從直線斜率可以求得抑制常數(shù)Ki為0.166μmol/L。
權(quán)利要求
1.克列維醇的制備方法，所述的克列維醇來(lái)源于紅樹(shù)林內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物，紅樹(shù)林內(nèi)生真菌為矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)，已于2006年7月3日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為CCTCC NOM206063，所述的克列維醇為2，4-Dihydroxy-3，5-dimethylacetophenone，其化學(xué)結(jié)構(gòu)式如下 其特征在于包括以下步驟1)矮棒曲霉BYY-1(Aspergillus clavatonanicus BYY-1)的種子培養(yǎng)A.配制斜面培養(yǎng)基馬鈴薯去皮切塊，放入海水中，煮后過(guò)濾，濾液用海水定容，得馬鈴薯汁，然后添加葡萄糖或蔗糖及瓊脂，分裝試管，滅菌后制成斜面培養(yǎng)基，將矮棒曲霉BYY-1轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)；B.配制種子液在馬鈴薯汁中添加葡萄糖或蔗糖，分裝后滅菌，得種子培養(yǎng)基，將培養(yǎng)的斜面菌種接入到分裝后的種子培養(yǎng)基中，搖瓶培養(yǎng)，得種子液；C.種子罐種子培養(yǎng)先配制種子培養(yǎng)基，將種子培養(yǎng)基裝入種子罐，將培養(yǎng)的種子液接入種子罐中，培養(yǎng)后得培養(yǎng)后的種子液；2)克列維醇的發(fā)酵配制發(fā)酵培養(yǎng)基，將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐，將培養(yǎng)后的種子液接入發(fā)酵罐中，發(fā)酵后得發(fā)酵液；3)克列維醇的提取將發(fā)酵液過(guò)濾除菌體，濾液減壓濃縮后用有機(jī)溶劑萃取，收集有機(jī)相并減壓濃縮成浸膏；4)克列維醇的精制浸膏用甲醇溶解得克列維醇甲醇溶液，在克列維醇甲醇溶液中加入硅膠拌樣，上硅膠柱進(jìn)行分離，以石油醚/乙酸乙酯為洗脫劑梯度洗脫，收集當(dāng)石油醚/乙酸乙酯的體積比例為50～3∶1時(shí)的洗脫液，合并洗脫液并減壓濃縮至干，得微黃色晶體，加溶劑溶解后重結(jié)晶至少2次，得目標(biāo)產(chǎn)物，即克列維醇，石油醚/乙酸乙酯＝100/0到0/100。
2.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟1)中，配制斜面培養(yǎng)基的馬鈴薯去皮切成小塊，取150～300g放入1L 20％～100％海水中，煮后過(guò)濾，濾液用20％～100％海水定容至1000ml，得馬鈴薯汁。
3.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟1)中，添加葡萄糖或蔗糖的量為10～30g，瓊脂1.5～3.0g，分裝試管，121℃滅菌30min后制成斜面培養(yǎng)基，將矮棒曲霉BYY-1轉(zhuǎn)接至斜面培養(yǎng)基上后25～32℃下培養(yǎng)3～7d。
4.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟1)中，配制種子液時(shí)，在每升馬鈴薯汁中添加葡萄糖或蔗糖10～30g，分裝后121℃滅菌30min，得種子培養(yǎng)基，將培養(yǎng)的斜面菌種接入到分裝后的種子培養(yǎng)基中，25～32℃下，120～250r/min搖瓶培養(yǎng)2～5d，得種子液。
5.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟1)中，種子罐種子培養(yǎng)時(shí)，將種子培養(yǎng)基裝入種子罐的裝罐量為種子罐容積的60％～70％，將培養(yǎng)的種子液按接種量2％～10％接入種子罐中，在溫度25～32℃、攪拌轉(zhuǎn)速120～220r/min和通氣量0.3～1.2vvm的條件下培養(yǎng)2～4d，得培養(yǎng)后的種子液。
6.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟2)中，配制發(fā)酵培養(yǎng)基時(shí)，將發(fā)酵培養(yǎng)基裝入發(fā)酵罐的裝罐量為發(fā)酵罐容積的60％～70％，將培養(yǎng)后的種子液按接種量5％～10％接入發(fā)酵罐中，在溫度25～32℃、攪拌轉(zhuǎn)速120～200r/min和通氣量0.3～1.5vvm的條件下發(fā)酵4～7d，得發(fā)酵液。
7.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟3)中，將發(fā)酵液過(guò)濾除菌體，濾液減壓濃縮至發(fā)酵液體積的35％～20％后用有機(jī)溶劑萃取至少2次，收集有機(jī)相并減壓濃縮成浸膏。
8.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟3)中，有機(jī)溶劑選自乙酸乙酯、氯仿、四氯化碳、甲苯中的一種。
9.如權(quán)利要求1所述的克列維醇的制備方法，其特征在于在步驟4)中，在克列維醇甲醇溶液中加入質(zhì)量為浸膏5～10倍的硅膠拌樣，收集當(dāng)石油醚/乙酸乙酯的體積比例為(50～3)/1時(shí)的洗脫液，溶劑選自甲醇、乙酸乙酯和丙酮中的一種。
10.如權(quán)利要求1所述的克列維醇在制備酪氨酸酶抑制劑中的應(yīng)用。
全文摘要
克列維醇在制備酪氨酸酶抑制劑的應(yīng)用，涉及一種克列維醇。提供一種來(lái)源于紅樹(shù)林內(nèi)生真菌次級(jí)代謝產(chǎn)物克列維醇在制備酪氨酸酶抑制劑的應(yīng)用。制備方法為矮棒曲霉BYY－1種子培養(yǎng)；液體深層發(fā)酵；發(fā)酵液過(guò)濾除菌體；濾液減壓濃縮后用有機(jī)溶劑多次萃取，收集有機(jī)相并減壓濃縮獲得粗提物；粗提物經(jīng)硅膠柱色譜及重結(jié)晶精制后制得克列維醇。經(jīng)藥理實(shí)驗(yàn)證實(shí)該化合物具有顯著的抑制酪氨酸酶活性，可用于制備酪氨酸酶抑制劑并應(yīng)用于醫(yī)藥品、化妝品及食品中?？赏ㄟ^(guò)發(fā)酵制得，無(wú)原材料之憂，且提取精制方法簡(jiǎn)單，適合規(guī)?；a(chǎn)。
文檔編號(hào)C12R1/66GK101070552SQ200710008930
公開(kāi)日2007年11月14日 申請(qǐng)日期2007年4月29日 優(yōu)先權(quán)日2007年4月29日
發(fā)明者沈月毛, 黃珊珊, 鄭忠輝, 杜希萍, 黃耀堅(jiān), 宋思揚(yáng) 申請(qǐng)人:廈門(mén)大學(xué)