發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種基于解鏈溫度測(cè)定間接檢測(cè)多個(gè)靶dna序列的qpcr方法。本發(fā)明還涉及一種由多個(gè)部分構(gòu)成的試劑盒。

發(fā)明背景

通過(guò)pcr檢測(cè)dna樣品中的特定序列已成為一種標(biāo)準(zhǔn)方法。該技術(shù)用于從基因缺失分析到病原體鑒定以及模板定量的一系列不同目的。通常使用不同顏色的熒光團(tuán)來(lái)檢測(cè)不同的靶。然而，由于可以容易地彼此區(qū)分的熒光團(tuán)的數(shù)目有限，這對(duì)可以檢測(cè)到的特定靶的數(shù)目產(chǎn)生限制。

此外，pcr反應(yīng)期間的dna雜交步驟受離子強(qiáng)度、堿基組成、核酸已經(jīng)減少到的片段長(zhǎng)度、錯(cuò)配程度和變性劑的存在影響?；赿na雜交的技術(shù)是在核酸序列測(cè)定以及臨床診斷、遺傳研究和法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室分析中非常有用的工具。然而，缺點(diǎn)是大部分依賴于雜交的常規(guī)方法可能由于探針和非靶核酸序列之間的非特異性雜交而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果。因此，仍然存在提高它們的可靠性的待解決問(wèn)題。

韓國(guó)首爾的seegene已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種還可以通過(guò)解鏈曲線分析來(lái)適應(yīng)多重化的技術(shù)。如wo2013115442a1中所述，seegene的toce技術(shù)基于在水解時(shí)釋放引物片段的探針。此片段然后需要充當(dāng)?shù)诙斯ぐ猩系囊?，其中產(chǎn)生具有特定解鏈輪廓、可與該特定探針連接的雙鏈靶。雖然該體系也可以通過(guò)解鏈來(lái)適應(yīng)高多重化，但因?yàn)橐筢尫诺钠卧谌斯ぐ猩蠁?dòng)并完成第二延伸，所以其固有地比本發(fā)明更復(fù)雜。在本發(fā)明中產(chǎn)生的片段將直接提供標(biāo)記的解鏈片段。

荷蘭馬斯特里赫特的pathofinderbv已開(kāi)發(fā)了一種也可以通過(guò)解鏈曲線分析來(lái)適應(yīng)多重化的技術(shù)。如美國(guó)專利申請(qǐng)20100297630a1中所述，此體系基于提供2個(gè)靶特異性探針，這2個(gè)靶特異性探針當(dāng)在靶上相鄰地雜交時(shí)可以通過(guò)連接酶結(jié)合，此結(jié)合產(chǎn)生具有特異于特定靶探針的解鏈輪廓的可解鏈片段。然而，如美國(guó)專利申請(qǐng)20100297630a1所述，此體系不是真正均相的測(cè)定，而是需要在第一次pcr反應(yīng)之后打開(kāi)樣品管來(lái)添加例如連接酶溶液。此額外步驟在本發(fā)明的方法中是不需要的，并且由于被pcr產(chǎn)物污染的風(fēng)險(xiǎn)而是高度不期望的，并且還涉及附加處理步驟。

羅氏診斷公司(rochediagnostics)已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種用于膿毒癥檢測(cè)方法和測(cè)定法，該方法和測(cè)定法也通過(guò)解鏈曲線分析來(lái)適應(yīng)多重化。此體系依賴于fret探針，其中具有相互作用標(biāo)記的2個(gè)探針被設(shè)計(jì)成與單個(gè)靶相鄰地結(jié)合，在結(jié)合的情況下第一探針的熒光團(tuán)與第二探針相互作用以產(chǎn)生信號(hào)。可以設(shè)計(jì)2個(gè)探針，使得當(dāng)經(jīng)受溫度梯度時(shí)，探針可以產(chǎn)生特定的解鏈曲線。此體系的缺點(diǎn)是解鏈輪廓必須在特定靶序列內(nèi)設(shè)計(jì)，其中本發(fā)明的方法提供一旦優(yōu)化就可附接至任何靶特異性探針的解鏈標(biāo)簽。此外，由于fret探針需要2個(gè)標(biāo)記，所以相較于每個(gè)探針攜帶一個(gè)熒光團(tuán)的本發(fā)明，這樣的體系可以適應(yīng)在使用5個(gè)熒光團(tuán)檢測(cè)通道的pcr體系上的較低水平的多重化。

多重dna靶檢測(cè)的其他方法取決于固體表面綴合，例如基于芯片的探針的固體表面綴合。盡管這些基于芯片的方法可能能夠區(qū)分多種靶核酸序列，但是芯片組裝過(guò)程是麻煩的并且通常涉及復(fù)雜、昂貴和精巧的設(shè)備。

因此，仍然需要對(duì)多個(gè)靶核酸序列的方便、可靠和可再現(xiàn)的檢測(cè)。此外，需要不受熒光標(biāo)記數(shù)目限制的新穎靶檢測(cè)方法。此外，還需要降低多重核酸序列分析中的復(fù)雜性和步驟數(shù)目，從而促進(jìn)更具成本效益和簡(jiǎn)單的臨床診斷方法、遺傳研究方案和法醫(yī)實(shí)驗(yàn)室分析。

發(fā)明概要

本發(fā)明提供了一種檢測(cè)多個(gè)靶dna序列的簡(jiǎn)單、方便、可靠和可再現(xiàn)的方法。本發(fā)明使用解鏈曲線測(cè)定來(lái)按照熒光團(tuán)檢測(cè)若干靶序列。通過(guò)這種方法，可以用單個(gè)熒光團(tuán)檢測(cè)眾多個(gè)靶，和/或可以通過(guò)采用不同的解鏈溫度和不同熒光團(tuán)兩者來(lái)檢測(cè)大量的靶。本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種雙重猝滅測(cè)定以與解鏈曲線測(cè)定結(jié)合用于使用不同的探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸(pto)和單一捕獲和猝滅寡核苷酸(cqo)來(lái)對(duì)靶dna序列進(jìn)行多重檢測(cè)，所述pto各自包含不同的解鏈溫度依賴區(qū)(mtdr)。使用本發(fā)明的若干cqo和pto進(jìn)一步增加了可以在單次測(cè)定中檢測(cè)到的靶序列的數(shù)目。本發(fā)明的構(gòu)思(被稱為meltplex體系)于圖1中示出。

本發(fā)明通過(guò)以下項(xiàng)的組合來(lái)防止對(duì)靶核酸序列的假陽(yáng)性檢測(cè)：1)與靶核酸序列的序列特異性雜交，以及2)靶信號(hào)檢測(cè)所需的激活的標(biāo)簽雙鏈片段的序列特異性酶促釋放(圖1)。通過(guò)激活的標(biāo)簽雙鏈片段的存在而對(duì)靶核酸序列進(jìn)行的此間接測(cè)量確保了極好的準(zhǔn)確性，但是如果不能完全克服假陽(yáng)性結(jié)果的問(wèn)題，則準(zhǔn)確性會(huì)降低。

meltplex體系的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是一個(gè)cqo可以檢測(cè)用數(shù)個(gè)獨(dú)特的pto鑒定的多個(gè)靶序列。對(duì)于每個(gè)待檢測(cè)的靶核酸序列，設(shè)計(jì)具有mtdr序列(解鏈溫度依賴區(qū))的pto，所述mtdr序列在具有相同熒光團(tuán)的pto內(nèi)是獨(dú)特的。因此，能夠僅使用單個(gè)熒光標(biāo)記檢測(cè)到的靶核酸序列的數(shù)目增加。具有與相同cqo相容的相似熒光團(tuán)的不同pto可被稱為pto組，因?yàn)樗鼈兒邢嗨坪?或相同的熒光標(biāo)記。每個(gè)pto組可以用單一cqo檢測(cè)，由此形成激活的標(biāo)簽雙鏈體，其中基于由于組中各個(gè)pto上的獨(dú)特mtdr導(dǎo)致的解鏈溫度差異來(lái)區(qū)分各個(gè)激活的標(biāo)簽雙鏈體片段。也可以用單一cqo檢測(cè)若干pto組，任選地通過(guò)在cqo中包含多于一個(gè)猝滅劑(quencher)以允許用相同的cqo猝滅眾多熒光團(tuán)。因此，本發(fā)明能夠增加在測(cè)定中可以檢測(cè)到的靶核酸序列的數(shù)目，而不需要使用針對(duì)每個(gè)檢測(cè)到的核酸靶核酸序列的不同類型的熒光標(biāo)記。本發(fā)明可以應(yīng)用針對(duì)不同pto組的若干熒光標(biāo)記，這進(jìn)一步增加了能夠在測(cè)定中使用標(biāo)準(zhǔn)實(shí)驗(yàn)室設(shè)備檢測(cè)到的靶核酸序列的數(shù)目。

此外，本發(fā)明的cqo不依賴于所述靶序列。因此，已被證明在某些測(cè)定中得到可靠結(jié)果的cqo可以在其他測(cè)定中重新使用。當(dāng)設(shè)計(jì)新的測(cè)定時(shí)，探針的這種重復(fù)使用可以節(jié)省大量資源。

污染是基于pcr的技術(shù)的主要問(wèn)題。限制污染風(fēng)險(xiǎn)的一種選擇是使用在測(cè)定開(kāi)始后不需要重新打開(kāi)反應(yīng)管瓶的技術(shù)。本發(fā)明不需要在測(cè)定開(kāi)始后重新打開(kāi)反應(yīng)管瓶，因此較不易發(fā)生污染。

本發(fā)明的主要方面涉及一種用于檢測(cè)靶核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟：

(a)將靶核酸序列與pto(探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸)雜交；所述pto包含(i)包含與所述靶核酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含與靶核酸序列不互補(bǔ)的核苷酸序列的解鏈溫度決定區(qū)(mtdr)，以及(iii)至少一組相互作用標(biāo)記，包括至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑；其中所述pto的所述靶向部分能夠與所述靶核酸序列雜交，并且所述pto的所述mtdr不與所述靶核酸序列雜交；

(b)將所述pto與cqo(捕獲和猝滅寡核苷酸)雜交；其中所述cqo包含(i)捕獲部分，其包含與所述pto的mtdr反向互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(ii)至少一個(gè)猝滅分子；其中所述pto的所述mtdr被配置為與所述cqo的所述捕獲部分雜交以形成標(biāo)簽雙鏈體；

(c)使所述標(biāo)簽雙鏈體與具有核酸酶活性的酶接觸；其中當(dāng)所述標(biāo)簽雙鏈體與所述靶核酸序列雜交時(shí)，所述具有核酸酶活性的酶誘導(dǎo)所述標(biāo)簽雙鏈體的切割，從而釋放激活的標(biāo)簽雙鏈體片段，所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段包含pto片段，所述pto片段包含與所述cqo的所述捕獲部分雜交的所述mtdr和所述至少一個(gè)熒光團(tuán)，其中所述pto片段與所述cqo的所述捕獲部分雜交；

(d)使所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段解鏈和/或雜交以獲得來(lái)自所述至少一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)；以及

(e)通過(guò)測(cè)量來(lái)自所述至少一個(gè)熒光團(tuán)的所述信號(hào)來(lái)檢測(cè)所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段；其中所述信號(hào)指示所述靶核酸序列的存在。

所述方法的步驟a)和b)可以按任何順序進(jìn)行，即標(biāo)簽雙鏈體可以在將pto/標(biāo)簽雙鏈體與靶核酸結(jié)合之前形成。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(c)和(b)被互換，因此所述方法包括以下步驟：(a)將pto與靶雜交，(c)使pto和靶與具有核酸酶活性的酶接觸，從而釋放激活的pto，以及(b)將所述激活的pto與cqo雜交，從而形成激活的標(biāo)簽雙鏈體，隨后如上文所公開(kāi)進(jìn)行步驟(d)和(e)。

可以重復(fù)所述方法的各步驟。

記錄激活的pto或激活的標(biāo)簽雙鏈體的存在。

記錄標(biāo)簽雙鏈體解鏈(步驟d)時(shí)的溫度。

本發(fā)明的測(cè)定具有多種應(yīng)用。應(yīng)用的非詳盡清單包括：

●人和/或獸醫(yī)診斷

●食品和/或飼料質(zhì)量和安全性

●環(huán)境監(jiān)測(cè)

●科學(xué)研究

本發(fā)明的測(cè)定可以作為由多個(gè)部分構(gòu)成的試劑盒出售。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于檢測(cè)如本文所述的靶核酸序列的由多個(gè)部分構(gòu)成的試劑盒，所述試劑盒包括：

i.任選地至少一個(gè)本文所述的pto，以及

ii.至少一個(gè)本文所述的cqo，以及

iii.關(guān)于如何檢測(cè)靶核酸序列的說(shuō)明。

因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是用單一cqo檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列。

附圖簡(jiǎn)述

圖1：本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的非限制性圖解。

圖2：ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈曲線分析：如期望的，在陰性對(duì)照中dec486p不產(chǎn)生解鏈曲線，而所有其他設(shè)計(jì)在ntc反應(yīng)中顯示出增大水平的解鏈曲線信號(hào)。(結(jié)果一式三份地進(jìn)行——示出為單重方式)?！穑篸ec486p，△：dec487p，x：dec488p，□：dec489p，◇：dec490p。

圖3：針對(duì)標(biāo)記探針dec486p的具有和不具有模板的pcr反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈曲線分析。在陰性對(duì)照中ntc(x)不產(chǎn)生解鏈曲線，但是存在與使用模板(◇)的反應(yīng)明顯可區(qū)分的信號(hào)。此外，在沒(méi)有猝滅探針(○)的反應(yīng)中未看到解鏈曲線。(結(jié)果一式三份地進(jìn)行——示出為單重方式)。

圖4：針對(duì)標(biāo)記探針dec487p的具有和不具有模板的pcr反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈曲線分析。在陰性對(duì)照中ntc(x)產(chǎn)生小解鏈曲線，但是存在與使用模板(◇)的反應(yīng)明顯可區(qū)分的信號(hào)。此外，在沒(méi)有猝滅探針(○)的反應(yīng)中未看到解鏈曲線。(結(jié)果一式三份地進(jìn)行——示出為單重方式)。

圖5：針對(duì)標(biāo)記探針dec488p的具有和不具有模板的pcr反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈曲線分析。在陰性對(duì)照中ntc(x)產(chǎn)生適度的解鏈曲線，但是存在與使用模板(◇)的反應(yīng)明顯可區(qū)分的信號(hào)。此外，在沒(méi)有猝滅探針(○)的反應(yīng)中未看到解鏈曲線。(結(jié)果一式三份地進(jìn)行——示出為單重方式)。

圖6：針對(duì)標(biāo)記探針dec489p的具有和不具有模板的pcr反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈曲線分析。在陰性對(duì)照中ntc(x)產(chǎn)生清晰的解鏈曲線，但是存在與使用模板(◇)的反應(yīng)明顯可區(qū)分的信號(hào)。此外，在沒(méi)有猝滅探針(○)的反應(yīng)中未看到解鏈曲線。(結(jié)果一式三份地進(jìn)行——示出為單重方式)。

圖7：針對(duì)標(biāo)記探針dec490p的具有和不具有模板的pcr反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈曲線分析。在陰性對(duì)照中ntc(x)產(chǎn)生顯著的解鏈曲線，其與使用模板(◇)的反應(yīng)不是明顯可區(qū)分的。此外，在沒(méi)有猝滅探針(○)的反應(yīng)中未看到解鏈曲線。(結(jié)果一式三份地進(jìn)行——示出為單重方式)。

圖8：陽(yáng)性樣品上標(biāo)記探針dec486p至dec490p的q-pcr擴(kuò)增曲線?！穑篸ec486p，△：dec487p，x：dec488p，□：dec489p，◇：dec490p，實(shí)線：dec464。盡管標(biāo)記探針的信號(hào)強(qiáng)度低于taqman型探針，但所有探針均明顯地產(chǎn)生ct值介于16與20之間的陽(yáng)性信號(hào)讀數(shù)。

圖8a：是本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的非限制性圖解。

圖9：靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈曲線分析：如期望的，dec500p在陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生解鏈曲線而在陰性對(duì)照中不產(chǎn)生解鏈曲線(結(jié)果一式三份進(jìn)行——示出為單重方式)?！酰篸ec500p，-：dec500pntc(無(wú)模板對(duì)照)

圖10：靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線：如期望的，dec500p在陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生擴(kuò)增曲線而在陰性對(duì)照中不產(chǎn)生擴(kuò)增曲線(結(jié)果一式三份進(jìn)行——示出為單重方式)。□：dec500p，-：dec500pntc(無(wú)模板對(duì)照)

圖11：靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈曲線分析：如期望的，dec502p在陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生解鏈曲線而在陰性對(duì)照中不產(chǎn)生解鏈曲線(結(jié)果一式三份進(jìn)行——示出為單重方式)?！酰篸ec500p，◇：dec502p，-：dec502pntc(無(wú)模板對(duì)照)

圖12：靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線：如期望的，dec502p在陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生擴(kuò)增曲線而在陰性對(duì)照中不產(chǎn)生擴(kuò)增曲線(結(jié)果一式三份進(jìn)行——示出為單重方式)?！酰篸ec500p，◇：dec502p，-：dec502pntc(無(wú)模板對(duì)照)

圖13：靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈曲線分析：如期望的，dec503p在陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生解鏈曲線而在陰性對(duì)照中不產(chǎn)生解鏈曲線(結(jié)果一式三份進(jìn)行——示出為單重方式)。x：dec503p，-：dec503pntc(無(wú)模板對(duì)照)

圖14：靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線：如期望的，dec503p在陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生擴(kuò)增曲線而在陰性對(duì)照中不產(chǎn)生擴(kuò)增曲線(結(jié)果一式三份進(jìn)行——示出為單重方式)。x：dec503p，-：dec503pntc(無(wú)模板對(duì)照)

圖15：如所期望的，使用dec500p和dec502p的靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)的解鏈曲線分析在陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生了2個(gè)單獨(dú)可區(qū)分的解鏈曲線，而在陰性對(duì)照中則不產(chǎn)生(結(jié)果一式三份進(jìn)行——示出為單重方式)?！穑篸ec500p+dec502p，-：dec500p+dec502pntc(無(wú)模板對(duì)照)。

圖16：如所期望的，使用dec500p和dec502p的靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線在陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生擴(kuò)增曲線，而在陰性對(duì)照中則不產(chǎn)生(結(jié)果一式三份進(jìn)行——示出為單重方式)。○：dec500p+dec502p，-：dec500p+dec502pntc(無(wú)模板對(duì)照)。

圖17：使用dec500p和dec503p的靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈曲線分析在陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生了2個(gè)單獨(dú)可區(qū)分的解鏈曲線，而在陰性對(duì)照中則不產(chǎn)生(結(jié)果一式三份進(jìn)行——示出為單重方式)?！鳎篸ec500p+dec503p，-：dec500p+dec503pntc(無(wú)模板對(duì)照)

圖18：如所期望的，使用dec500p和dec503p的靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線在陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生擴(kuò)增曲線而在陰性對(duì)照中不產(chǎn)生擴(kuò)增曲線(結(jié)果一式三份進(jìn)行——示出為單重方式)?！鳎篸ec500p+dec503p，-：dec500p+dec503pntc(無(wú)模板對(duì)照)

圖19：靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈曲線分析：如期望的，rmd7p在陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生解鏈曲線而在陰性對(duì)照中不產(chǎn)生解鏈曲線(結(jié)果一式三份進(jìn)行——示出為單重方式)?！穑簉md7p，-：rmd7pntc(無(wú)模板對(duì)照)。

圖20：靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線：如期望的，rmd7p在陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生擴(kuò)增曲線而在陰性對(duì)照中不產(chǎn)生擴(kuò)增曲線(結(jié)果一式三份進(jìn)行——示出為單重方式)?！穑簉md7p，-：rmd7pntc(無(wú)模板對(duì)照)。

圖21：靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈曲線分析：如期望的，rmd8p在陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生解鏈曲線而在陰性對(duì)照中不產(chǎn)生解鏈曲線(結(jié)果一式三份進(jìn)行——示出為單重方式)。x：rmd8p，-：rmd8pntc(無(wú)模板對(duì)照)。

圖22：靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線：如期望的，rmd8p在陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生擴(kuò)增曲線而在陰性對(duì)照中不產(chǎn)生擴(kuò)增曲線(結(jié)果一式三份進(jìn)行——示出為單重方式)。x：rmd8p，-：rmd8pntc(無(wú)模板對(duì)照)。

圖23.rmd測(cè)定的平均cq值，作為聚合酶濃度的函數(shù)繪制成曲線圖。x軸：任意單位。

圖24.mvalidprime測(cè)定的平均cq值，作為聚合酶濃度的函數(shù)繪制成曲線圖。x軸：任意單位，其中1是制造商推薦的濃度。

圖25.步驟2(95℃)中的rmd擴(kuò)增曲線的幅度為聚合酶濃度的函數(shù)。x軸：任意單位，其中1是制造商推薦的濃度。

圖26.步驟2(95℃)中的mvalidprime擴(kuò)增曲線的幅度為聚合酶濃度的函數(shù)。x軸：任意單位，其中1是制造商推薦的濃度。

圖27.rmd探針/猝滅劑雙鏈體的解鏈溫度作為聚合酶濃度的函數(shù)。x軸：任意單位，其中1是制造商推薦的濃度。

圖28：(a)靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的擴(kuò)增曲線：如期望的，dec486p在對(duì)應(yīng)于靶濃度的陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生具有cq值的擴(kuò)增曲線，而在陰性對(duì)照中則不產(chǎn)生(結(jié)果一式兩份進(jìn)行——示出為單重方式)?！鳎?倍稀釋液，x：25倍稀釋液，□：125倍稀釋液，◇：625倍稀釋液，○：3125倍稀釋液，-：15625倍稀釋液，ntc：(無(wú)模板對(duì)照)。(b)靶陽(yáng)性和ntc(無(wú)模板對(duì)照)pcr反應(yīng)產(chǎn)物的解鏈曲線分析：如期望的，dec486p在對(duì)應(yīng)于靶濃度的陽(yáng)性樣品中產(chǎn)生解鏈曲線幅度，而在陰性對(duì)照中則不產(chǎn)生(結(jié)果一式兩份進(jìn)行——示出為單重方式)?！鳎?倍稀釋液，x：25倍稀釋液，□：125倍稀釋液，◇：625倍稀釋液，○：3125倍稀釋液，-：15625倍稀釋液，ntc：(無(wú)模板對(duì)照)。

發(fā)明詳述

多重pcr的主要挑戰(zhàn)是使用簡(jiǎn)單、方便且可靠的方法容易地檢測(cè)多個(gè)靶dna序列。本發(fā)明人已經(jīng)開(kāi)發(fā)了一種雙重猝滅測(cè)定法以與解鏈曲線測(cè)定結(jié)合用于按照標(biāo)記物(即按照熒光團(tuán))檢測(cè)若干種靶dna序列。本發(fā)明的非限制性構(gòu)思于圖1中示出。

定義

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“雙重猝滅測(cè)定”是指對(duì)于至少一個(gè)熒光團(tuán)使用至少兩個(gè)猝滅劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，一個(gè)猝滅劑位于cqo上，而另一個(gè)猝滅劑位于pto上。在一個(gè)實(shí)施方案中，熒光團(tuán)位于pto上。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“相互作用標(biāo)記”或“一組相互作用標(biāo)記”是指至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑，它們當(dāng)相鄰定位時(shí)能夠相互作用。當(dāng)相互作用標(biāo)記相鄰定位時(shí)，猝滅劑能夠猝滅熒光團(tuán)信號(hào)。該相互作用可以由熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)介導(dǎo)。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“相鄰定位”是指兩個(gè)對(duì)象之間的物理距離。如果熒光團(tuán)和猝滅劑相鄰地定位，則猝滅劑能夠部分或全部地猝滅熒光團(tuán)信號(hào)。fret猝滅通?？梢栽谥炼嗉s的距離內(nèi)發(fā)生。如本文所用的相鄰定位是指低于和/或大約的距離。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸”或“pto”是指包含至少一組相互作用標(biāo)記的寡核苷酸。本發(fā)明的pto被配置為與靶核酸序列雜交。pto包括靶向部分、“解鏈溫度決定區(qū)”或“mtdr”(見(jiàn)下文定義)，以及任選地在靶向部分與mtdr之間的接頭。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“pto組”是指具有相同組相互作用標(biāo)記的多個(gè)pto，其中該組中的每個(gè)pto具有獨(dú)特的靶向序列和mtdr區(qū)。一組中的每個(gè)pto可以被配置用于檢測(cè)不同的靶核酸序列，并且獨(dú)特的mtdr有助于利用如本文所述的解鏈溫度來(lái)區(qū)分該組中各個(gè)pto。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“捕獲和猝滅寡核苷酸”或“cqo”是指包含至少一個(gè)猝滅劑和捕獲部分的寡核苷酸。cqo的捕獲部分被配置為與本發(fā)明的pto雜交。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)簽雙鏈體”是指雜交的pto和cqo。pto還可以與靶核酸序列雜交。

本文所用的術(shù)語(yǔ)“標(biāo)簽雙鏈體片段”或“激活的標(biāo)簽雙鏈體片段”或激活的標(biāo)簽雙鏈體是指雜交的pto片段和cqo，其中不存在pto的猝滅劑。作為具有核酸酶活性的酶誘導(dǎo)標(biāo)簽雙鏈體的切割和pto猝滅劑的釋放的結(jié)果，pto的猝滅劑已被釋放?！凹せ畹膒to”是指猝滅劑已被去除的pto。激活的pto的存在可以使用qpcr和/或?qū)崟r(shí)pcr來(lái)測(cè)量。根據(jù)本文公開(kāi)的方法的步驟順序，測(cè)量激活的pto或激活的標(biāo)簽雙鏈體的存在。在優(yōu)選實(shí)施方案中，僅激活的標(biāo)簽雙鏈體能夠通過(guò)實(shí)時(shí)pcr檢測(cè)到。在最優(yōu)選的實(shí)施方案中，由于pto熒光團(tuán)被cqo猝滅劑完全猝滅，所以僅激活的標(biāo)簽雙鏈體能夠通過(guò)實(shí)時(shí)pcr檢測(cè)。在其他實(shí)施方案中，在由激活的pto檢測(cè)到任何信號(hào)之后校準(zhǔn)測(cè)定。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“熒光標(biāo)記”或“熒光團(tuán)”是指在光激發(fā)時(shí)可以重新發(fā)射光的熒光化學(xué)化合物。熒光團(tuán)吸收特定波長(zhǎng)的光能并重新發(fā)射更長(zhǎng)波長(zhǎng)的光。吸收的波長(zhǎng)、能量轉(zhuǎn)移效率和發(fā)射前的時(shí)間取決于熒光團(tuán)結(jié)構(gòu)及其化學(xué)環(huán)境，因?yàn)榉肿釉谄浼ぐl(fā)態(tài)時(shí)與周圍的分子相互作用。最大吸收(≈激發(fā))和發(fā)射的波長(zhǎng)(例如，吸收/發(fā)射＝485nm/517nm)是用于指代給定熒光團(tuán)的典型術(shù)語(yǔ)，但考慮完整光譜可能也是重要的。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“猝滅(quench/quenching)”是指降低給定物質(zhì)諸如熒光團(tuán)的熒光強(qiáng)度的任何方法。猝滅可以由熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)介導(dǎo)。fret基于供體(例如熒光團(tuán))和受體(例如猝滅劑)的躍遷偶極之間的經(jīng)典偶極-偶極相互作用，并且取決于供體-受體距離。fret通?？梢园l(fā)生在至多的距離內(nèi)。fret還取決于供體-受體光譜重疊度以及供體和受體躍遷偶極矩的相對(duì)取向。熒光團(tuán)的猝滅也可能由于一個(gè)熒光團(tuán)與另一熒光團(tuán)或非熒光分子之間形成非熒光復(fù)合物而發(fā)生。這種機(jī)理被稱為“接觸猝滅”、“靜態(tài)猝滅”或“基態(tài)復(fù)合物形成”

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“猝滅劑”是指能夠猝滅給定物質(zhì)諸如熒光團(tuán)的化學(xué)化合物。

在多重pcr中，可以檢測(cè)多于一個(gè)靶核酸序列。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“解鏈溫度決定區(qū)”或“mtdr”是指位于pto的5'端的多核苷酸區(qū)。mtdr中多核苷酸的性質(zhì)和/或數(shù)目對(duì)于例如包含pto片段和cqo的激活的標(biāo)簽雙鏈體的解鏈溫度具決定性。同樣，mtdr對(duì)于例如包含pto片段和cqo的激活的標(biāo)簽雙鏈體的雜交溫度具決定性。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“解鏈溫度”或“tm”是指dna雙鏈體的一半將解離而變成單鏈的溫度，因此指示雙鏈體穩(wěn)定性。影響tm的主要因素是鹽濃度、dna濃度、ph和變性劑(諸如甲酰胺或dmso)的存在。諸如序列、長(zhǎng)度和雜交條件等其他影響因素也很重要。序列的gc含量和鹽濃度可以很好地指示引物的tm。使用如kibbe等人在2007年描述的最鄰近熱力學(xué)理論來(lái)計(jì)算在本發(fā)明中提及的解鏈溫度。相應(yīng)的tm計(jì)算器可在url:http://basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html處獲得。已經(jīng)基于800nmcqo(“引物”)和50nm(na⁺)計(jì)算本發(fā)明中給出的tm值。在包含腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶和/或鳥嘌呤的類似物的寡核苷酸的解鏈溫度計(jì)算中，將類似物用其相應(yīng)的核酸替代。計(jì)算解鏈溫度時(shí)不應(yīng)考慮寡核苷酸上的熒光團(tuán)和猝滅劑。可以通過(guò)加熱dna雙鏈體或通過(guò)冷卻(雜交)兩條基本上互補(bǔ)的單鏈dna鏈來(lái)進(jìn)行解鏈溫度的測(cè)定。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“變性”是通過(guò)破壞dna的互補(bǔ)堿基之間的氫鍵而變成單鏈的解離。其也可以指pcr反應(yīng)循環(huán)事件，并且可以例如包括將反應(yīng)加熱至90℃至100℃，持續(xù)3至240秒。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“即用丸粒”是指基本上無(wú)水的組合物，其包含本發(fā)明的至少一個(gè)pto和/或至少一個(gè)cqo。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“背景解鏈曲線生成”是指在解鏈曲線分析期間的背景信號(hào)。如果pto上的至少一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)未被pto的至少一個(gè)猝滅劑完全猝滅，則可能會(huì)存在背景信號(hào)。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“tina”是指扭曲插入核酸，并且是如在美國(guó)專利9,102,937中描述的一組核酸插入分子。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“鎖核酸”(lna)是指經(jīng)修飾的rna核苷酸。lna核苷酸的核糖部分由連接2'氧和4'碳的額外橋修飾。橋?qū)⒑颂恰版i”在3'-內(nèi)型(north)構(gòu)象中，其通常存在于a型雙鏈體中。lna核苷酸可以在需要時(shí)與寡核苷酸中的dna或rna殘基混合，并根據(jù)watson-crick堿基配對(duì)法則與dna或rna雜交。此類寡聚物是化學(xué)合成的并且可商購(gòu)獲得。鎖定的核糖構(gòu)象增強(qiáng)了堿基堆積和主鏈預(yù)組織。這通過(guò)增加雙鏈體的熱穩(wěn)定性而顯著地增加了寡核苷酸的雜交性質(zhì)。lna及其合成方法為本領(lǐng)域中的技術(shù)人員已知，并且描述于例如歐洲專利ep1015469和ep1015469中。

如本文所用的術(shù)語(yǔ)“反向互補(bǔ)”表示核酸序列能夠與作為其反向互補(bǔ)序列的另一核酸序列雜交。例如，序列5’-n1n2n3n4...nx-3’的反向互補(bǔ)序列是5’-nx’...n4’n3’n2’n1’-3’，其中nx’、n4’、n3’、n2’、n1’表示分別與nx、n4、n3、n2、n1互補(bǔ)的核苷酸。

靶檢測(cè)

本發(fā)明涉及一種新穎的雙重猝滅測(cè)定法，其允許每個(gè)熒光標(biāo)記物同時(shí)檢測(cè)多個(gè)靶核酸。樣品中多個(gè)靶核酸序列的存在導(dǎo)致形成多個(gè)標(biāo)簽雙鏈體片段，所述多個(gè)標(biāo)簽雙鏈體片段可以基于標(biāo)簽雙鏈體片段解鏈溫度和/或雜交溫度的差異來(lái)區(qū)分。標(biāo)簽雙鏈體包含雜交的pto和cqo。當(dāng)每個(gè)激活的標(biāo)簽雙鏈體片段解鏈時(shí)，獲得來(lái)自pto的標(biāo)記的信號(hào)。因此，在特定溫度下的信號(hào)指示pto所特異于的靶序列的存在。當(dāng)每個(gè)激活的標(biāo)簽雙鏈體片段雜交時(shí)，來(lái)自pto的標(biāo)記的信號(hào)被猝滅。因此，在特定溫度下的猝滅信號(hào)指示pto所特異于的靶序列的存在。本發(fā)明的基本構(gòu)思于圖1中示出。本發(fā)明通過(guò)以下方式的組合來(lái)防止假陽(yáng)性信號(hào)：1)利用pto靶向部分與靶核酸序列進(jìn)行序列特異性雜交，以及2)利用在靶序列的上游延伸寡核苷酸的聚合酶的核酸酶活性，序列特異性地酶促釋放靶信號(hào)檢測(cè)所需的激活的標(biāo)簽雙鏈體片段。通過(guò)激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的存在間接測(cè)量靶核酸序列確保了極好的準(zhǔn)確性并且克服了假陽(yáng)性的問(wèn)題。單一cqo可以與許多pto和/或許多組pto雜交。因此，本發(fā)明涉及在單一cqo的輔助下檢測(cè)一種或多種此類多重核酸。

多個(gè)靶核酸序列的解鏈溫度介導(dǎo)鑒定

使用一個(gè)cqo檢測(cè)具有獨(dú)特mtdr的若干pto產(chǎn)生更簡(jiǎn)單的測(cè)定設(shè)置，其可以按照熒光團(tuán)(例如按照pto組)檢測(cè)若干靶核酸序列。能夠使用一個(gè)熒光團(tuán)區(qū)分的pto組中的pto的數(shù)目取決于用于在激活的標(biāo)簽雙鏈體片段解鏈時(shí)檢測(cè)熒光標(biāo)簽信號(hào)的分析設(shè)備的靈敏度。在此處通過(guò)舉例方式提供的簡(jiǎn)單設(shè)置中：可以使用一個(gè)cqo來(lái)鑒定pto組中的至少三個(gè)pto；因此，使用具有兩種不同熒光團(tuán)的兩個(gè)pto組可以有助于在單次反應(yīng)中檢測(cè)至少6個(gè)pto。每個(gè)pto指示靶核酸序列的存在。通過(guò)使用具有不同熒光標(biāo)簽的三個(gè)或三個(gè)以上pto組，可以進(jìn)一步增加待鑒定的靶數(shù)目。單一cqo當(dāng)然可以能夠與兩個(gè)以上的pto雜交，諸如三個(gè)、四個(gè)或四個(gè)以上pto。pto組可以包括2個(gè)、3個(gè)、4個(gè)、5個(gè)、6個(gè)、7個(gè)或7個(gè)以上pto，并且可以使用單一cqo來(lái)檢測(cè)這些pto中的每一個(gè)。同時(shí)，也可以使用相同的cqo來(lái)檢測(cè)其他pto組(具有不同熒光團(tuán)的pto)。以這種方式，可以使用單一cqo來(lái)檢測(cè)多個(gè)靶。在一個(gè)實(shí)施方案中，單一cqo能夠因此檢測(cè)2個(gè)、4個(gè)、6個(gè)、8個(gè)、10個(gè)、15個(gè)、20個(gè)、30個(gè)、40個(gè)、50個(gè)或50個(gè)以上pto，因此該測(cè)定能夠檢測(cè)相應(yīng)數(shù)目的靶核酸。

本發(fā)明的雙重猝滅測(cè)定的設(shè)置產(chǎn)生了一種用于靶核酸的多重檢測(cè)的簡(jiǎn)單可靠的測(cè)定法。本發(fā)明的簡(jiǎn)單測(cè)定法具有多種應(yīng)用。本發(fā)明的測(cè)定法的非詳盡應(yīng)用清單可以是：

●使用本發(fā)明的方法用于人和/或獸醫(yī)診斷。例如，對(duì)來(lái)自受試者的身體樣品中至少一種微生物諸如病原體或致癌基因或微衛(wèi)星的靶核酸的臨床鑒定和/或定量。

●使用本發(fā)明的方法進(jìn)行環(huán)境監(jiān)測(cè)。例如，對(duì)來(lái)自任何樣品(例如水樣品)中的至少一種(微)生物體的靶核酸的鑒定和/或定量。

●使用本發(fā)明的方法用于食品和/或飼料質(zhì)量和安全性測(cè)定，例如對(duì)來(lái)自任何樣品(諸如飼料和/或食物產(chǎn)品諸如飲料樣品)中的至少一種生物體的靶核酸的鑒定和/或定量。

●使用本發(fā)明的方法進(jìn)行科學(xué)研究。

在一個(gè)主要方面，本發(fā)明涉及一種用于檢測(cè)靶核酸序列的方法，所述方法包括以下步驟：

步驟(a)將靶核酸序列與pto(探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸)雜交；所述pto包含(i)包含與所述靶核酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含與所述靶核酸序列不互補(bǔ)的核苷酸序列的解鏈溫度決定區(qū)(mtdr)，以及(iii)至少一組相互作用標(biāo)記，包括至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑；

步驟(b)將所述pto與cqo(捕獲和猝滅寡核苷酸)雜交；其中所述cqo包含(i)捕獲部分，其包含與所述pto的mtdr反向互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(ii)至少一個(gè)猝滅分子；其中所述pto的mtdr被配置為與所述cqo的捕獲部分雜交以形成標(biāo)簽雙鏈體；

步驟(c)使所述標(biāo)簽雙鏈體與具有核酸酶活性的酶接觸；其中當(dāng)所述標(biāo)簽雙鏈體與靶核酸序列雜交時(shí)，所述具有核酸酶活性的酶誘導(dǎo)所述標(biāo)簽雙鏈體的切割，從而釋放激活的標(biāo)簽雙鏈體片段，所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段包含pto片段，所述pto片段包含與cqo的捕獲部分雜交的mtdr和至少一個(gè)熒光團(tuán)；

步驟(d)使所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段解鏈和/或雜交以獲得來(lái)自所述至少一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)，以及

步驟(e)通過(guò)測(cè)量來(lái)自所述至少一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)來(lái)檢測(cè)所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段；其中所述信號(hào)指示所述靶核酸序列的存在。

所述方法的任何本文實(shí)施方案的步驟(a)、(b)和(c)可以形成pcr反應(yīng)的一部分。添加一組寡核苷酸引物，所述組寡核苷酸引物將擴(kuò)增靶序列。此擴(kuò)增將由于存在具有外切核酸酶活性的聚合酶而導(dǎo)致由此激活的pto或激活的標(biāo)簽雙鏈體的釋放。術(shù)語(yǔ)激活的是指pto上猝滅劑不存在?？梢杂涗?檢測(cè)激活的pto或激活的標(biāo)簽雙鏈體的任何存在。如果pcr反應(yīng)是qpcr反應(yīng)，則可以定量激活的pto或激活的標(biāo)簽雙鏈體的量。所述寡核苷酸引物對(duì)包含與所述靶核酸互補(bǔ)并引發(fā)與所述靶核酸互補(bǔ)的第一延伸產(chǎn)物的合成的第一引物，以及與所述第一延伸產(chǎn)物互補(bǔ)并引發(fā)第二延伸產(chǎn)物的合成的第二引物。pto可與靶核苷酸序列雜交，尤其與擴(kuò)增產(chǎn)物雜交。

在一個(gè)實(shí)施方案中，檢測(cè)激活的pto和/或激活的標(biāo)簽雙鏈體的存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，定量激活的pto和/或激活的標(biāo)簽雙鏈體的量。激活的pto和/或激活的標(biāo)簽雙鏈體的存在的檢測(cè)和/或定量可以是一旦激活的pto和/或激活的標(biāo)簽雙鏈體形成就可以包括的任選步驟。

步驟(d)和(e)構(gòu)成了解鏈測(cè)定的一部分，其中基于激活的標(biāo)簽雙鏈體的tm來(lái)確定靶的存在和/或不存在。解鏈測(cè)定可以在pcr機(jī)中進(jìn)行。

步驟(a)和(b)可以任何順序發(fā)生。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法包括以下步驟：

步驟(b)將pto(探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸)與cqo(捕獲和猝滅寡核苷酸)雜交；所述pto包含(i)包含與所述靶核酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含與所述靶核酸序列不互補(bǔ)的核苷酸序列的解鏈溫度決定區(qū)(mtdr)，以及(iii)至少一組相互作用標(biāo)記，包括至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑；并且其中所述cqo包含(i)捕獲部分，其包含與所述pto的mtdr反向互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(ii)至少一個(gè)猝滅分子；其中所述pto的所述mtdr被配置為與所述cqo的所述捕獲部分雜交以形成標(biāo)簽雙鏈體；

步驟(a)將所述靶核酸序列與標(biāo)簽雙鏈體的pto雜交；

步驟(c)使所述標(biāo)簽雙鏈體與具有核酸酶活性的酶接觸；其中當(dāng)所述標(biāo)簽雙鏈體與所述靶核酸序列雜交時(shí)，所述具有核酸酶活性的酶誘導(dǎo)所述標(biāo)簽雙鏈體的切割，從而釋放激活的標(biāo)簽雙鏈體片段，所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段包含pto片段，所述pto片段包含與cqo的捕獲部分雜交的mtdr和至少一個(gè)熒光團(tuán)；

步驟(d)使所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段解鏈和/或雜交以獲得來(lái)自所述至少一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)，以及

步驟(e)通過(guò)測(cè)量來(lái)自所述至少一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)來(lái)檢測(cè)所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段；其中所述信號(hào)指示所述靶核酸序列的存在。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(b)和步驟(c)以相反順序進(jìn)行。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法包括以下步驟：

步驟(a)將靶核酸序列與pto(探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸)雜交；所述pto包含(i)包含與所述靶核酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含與所述靶核酸序列不互補(bǔ)的核苷酸序列的解鏈溫度決定區(qū)(mtdr)，以及(iii)至少一組相互作用標(biāo)記，包括至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑；

步驟(c)使所述雜交的pto與具有核酸酶活性的酶接觸；其中當(dāng)所述pto與所述靶核酸序列雜交時(shí)，所述具有核酸酶活性的酶誘導(dǎo)所述pto的切割，從而釋放激活的pto片段，所述激活的pto片段包含所述mtdr和所述至少一個(gè)熒光團(tuán)；

步驟(b)將所述激活的pto與cqo(捕獲和猝滅寡核苷酸)雜交；其中所述cqo包含(i)捕獲部分，其包含與所述pto的mtdr反向互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(ii)至少一個(gè)猝滅分子；其中所述pto的所述mtdr被配置為與所述cqo的所述捕獲部分雜交以形成激活的標(biāo)簽雙鏈體；

步驟(d)使所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段解鏈和/或雜交以獲得來(lái)自所述至少一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)，以及

步驟(e)通過(guò)測(cè)量來(lái)自所述至少一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)來(lái)檢測(cè)所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段；其中所述信號(hào)指示所述靶核酸序列的存在。

在所有的測(cè)定中，可以重復(fù)這些步驟。具體地，以上針對(duì)各種測(cè)定所示的順序的步驟(a)和(c)可以重復(fù)一次或多次。重復(fù)次數(shù)可以如進(jìn)行pcr反應(yīng)所慣用的。

記錄標(biāo)簽雙鏈體在所述方法的步驟(d)中解鏈的溫度。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(d)包括：

步驟(d)使所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段解鏈和/或雜交以獲得來(lái)自所述至少一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)，以及記錄所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的解鏈溫度。

在一個(gè)實(shí)施方案中，上述方法還包括重復(fù)步驟(a)-(b)、(a)-(c)、(a)-(d)和/或(a)-(e)，其中在重復(fù)循環(huán)之間變性。因此，在以步驟(b)開(kāi)始的一個(gè)實(shí)施方案中，重復(fù)步驟(b)-(a)、(b)-(c)和/或(b)至(e)，其中[smei]在重復(fù)循環(huán)之間變性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，各步驟在一個(gè)反應(yīng)容器中進(jìn)行，或者步驟(a)-(e)或(b)-(e)中的一些在一個(gè)或多個(gè)分開(kāi)的反應(yīng)容器中進(jìn)行。在一個(gè)以步驟(a)、(c)和(b)開(kāi)始的實(shí)施方案中，可以通過(guò)重復(fù)步驟(a)-(c)、(a)-(b)、(a)-(d)和/或(a)-(e)并在重復(fù)循環(huán)之間變性來(lái)重復(fù)各步驟。在所有方法的另一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(a)、(b)和(c)同時(shí)發(fā)生或大致同時(shí)發(fā)生且/或步驟(d)和(e)同時(shí)發(fā)生或大致同時(shí)發(fā)生。

說(shuō)明兩個(gè)靶序列的檢測(cè)的非限制性實(shí)例可以是：

一種混合物，其包含：

1)pto#1，其包含靶向部分#1和被配置以產(chǎn)生50℃的解鏈溫度的mtdr#1，其中pto#1可以與靶核酸序列#1雜交，以及

2)pto#2，其包含靶向部分#2和被配置以產(chǎn)生60℃的解鏈溫度的mtdr#2，其中pto#2可以與靶核酸序列#2雜交，以及

3)cqo，其配置為與如上文所述的mdtr#1和mdtr#2雜交。

在靶核酸序列#1和靶核酸序列#2的存在下，本發(fā)明的方法產(chǎn)生激活的標(biāo)簽雙鏈體片段#1，其中cqo與pto#1的mtdr#1雜交；和激活的標(biāo)簽雙鏈體片段#2，其中cqo與pto#2的mtdr#2雜交。當(dāng)在某一溫度范圍內(nèi)解鏈包含激活的標(biāo)簽雙鏈體片段#1和標(biāo)簽雙鏈體片段#2的混合物時(shí)，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時(shí)產(chǎn)生第一信號(hào)，并且當(dāng)溫度達(dá)到60℃時(shí)產(chǎn)生第二信號(hào)。在此簡(jiǎn)化實(shí)例中，第一信號(hào)(在50℃時(shí))指示靶核酸序列#1的存在，并且第二信號(hào)指示靶核酸序列#2的存在。因此，使用一個(gè)熒光團(tuán)能夠檢測(cè)至少兩個(gè)不同的靶。技術(shù)人員可以容易地看出如何通過(guò)本發(fā)明的方法來(lái)測(cè)定眾多個(gè)靶。

本發(fā)明還可以包括包含至少一組相互作用標(biāo)記的至少一個(gè)標(biāo)簽雙鏈體或dna雙鏈體，所述組相互作用標(biāo)記包括至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑，所述猝滅劑可用作對(duì)照樣品以例如用于校準(zhǔn)分析設(shè)備的tm。寡核苷酸的tm可以根據(jù)例如鹽濃度、dna濃度、ph和變性劑(諸如甲酰胺或dmso)的存在而變化。如果要分析的樣品含有不同的即各種鹽濃度，則可能需要包括對(duì)照樣品。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法還包括分析對(duì)照樣品和/或?qū)φ諛?biāo)簽雙鏈體。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法還包括分析對(duì)照樣品和/或?qū)φ諛?biāo)簽雙鏈體以校準(zhǔn)分析設(shè)備的tm輸出。因此，在不存在靶序列的情況下，本發(fā)明的方法將檢測(cè)pto和未因pto上的猝滅劑去除而被激活的標(biāo)簽雙鏈體的存在。如本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知：當(dāng)如本文所公開(kāi)的那些測(cè)定進(jìn)行測(cè)定時(shí)，可以包括陰性對(duì)照(不存在靶)和陽(yáng)性對(duì)照(存在靶)。所述對(duì)照可用于校準(zhǔn)測(cè)定。用于基因組dna的存在的市售對(duì)照的一個(gè)實(shí)例是validprime:http://www.tataa.com/wp-ontent/uploads/2012/10/tataa-manualvalidprimeprobev011.pdf。

如本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知，雙鏈體的解鏈溫度通常不取決于序列的性質(zhì)，而是取決于各個(gè)核苷酸的相對(duì)量。技術(shù)人員還知曉避免可能導(dǎo)致可能妨礙反應(yīng)的二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)生成的特定序列。如實(shí)施例中所示，本發(fā)明方法利用具有不同序列的mtdr作用。

mtdr包含與靶核酸序列不互補(bǔ)的核苷酸序列。在此背景下，術(shù)語(yǔ)“不互補(bǔ)”將被技術(shù)人員理解為是指在正常pcr條件和/或嚴(yán)格條件下與靶核酸序列基本上不互補(bǔ)，即基本上不能雜交的序列。

類似地，術(shù)語(yǔ)“與靶核酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列”是指能夠以用聚合酶延伸為有效的或甚至可行的方式與靶核酸序列雜交的核苷酸序列。如對(duì)于技術(shù)人員將顯而易見(jiàn)的，可以存在一些錯(cuò)配，前提條件是它們不會(huì)妨礙核苷酸序列與靶核酸序列的雜交到不能用聚合酶延伸的程度。

pto

針對(duì)要鑒定的各個(gè)靶核酸序列，獲得配置為與各個(gè)靶核酸序列雜交的pto。每個(gè)pto具有mtdr，所述mtdr在共用相同或相似的熒光團(tuán)的pto中是獨(dú)特的。pto的mtdr對(duì)于激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的解鏈溫度具決定性。每個(gè)標(biāo)簽雙鏈體片段包含具有唯一mtdr和至少一個(gè)熒光團(tuán)的pto片段，其中pto片段的mtdr與cqo的捕獲部分雜交。獨(dú)特的mtdr意指賦予標(biāo)簽雙鏈體和/或標(biāo)簽雙鏈體片段的解鏈溫度具獨(dú)特性的mtdr。因此，獨(dú)特的mtdr在一組pto中是獨(dú)特的。獨(dú)特的mtdr因此可以用于具有不同標(biāo)記/熒光團(tuán)的若干pto中。

在一個(gè)實(shí)施方案中，靶向部分位于pto的5'端。在另一個(gè)實(shí)施方案中，mtdr位于pto的3'端。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，pto包含非核酸分子和/或核酸類似物。

解鏈溫度決定區(qū)(mtdr)

形成激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的pto的mtdr的長(zhǎng)度改變了所述標(biāo)簽雙鏈體片段的解鏈溫度。使用短mtdr區(qū)(例如短于10個(gè)核酸)將產(chǎn)生低解鏈溫度。本發(fā)明人已使用不同長(zhǎng)度(諸如約16至約40個(gè)核酸)的mtdr。然而，本發(fā)明的mtdr區(qū)可以包含5至100個(gè)核酸和/或核酸類似物，諸如10至80個(gè)，諸如15至70個(gè)，優(yōu)選諸如13至60個(gè)，更優(yōu)選諸如16至39個(gè)核酸和/或核酸類似物。因此，在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，mtdr包含5至50個(gè)核酸和/或核酸類似物，諸如10至40個(gè)，諸如13至30個(gè)核酸和/或核酸類似物。當(dāng)使用長(zhǎng)mtdr區(qū)(例如超過(guò)50個(gè)核酸)時(shí)，應(yīng)注意避免在mtdr本身內(nèi)形成二級(jí)結(jié)構(gòu)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的mtdr區(qū)包含13至25個(gè)核酸和/或核酸類似物，諸如鎖核酸(lna)。核酸類似物的具體實(shí)例還包括但不限于堿基對(duì)組合形式的以下堿基：iso-c/iso-g、iso-dc/iso-dg。

在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(a)包括將靶核酸序列與pto雜交；所述pto包含(i)包含與靶核酸序列基本上互補(bǔ)的雜交核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含與靶核酸序列不互補(bǔ)的核苷酸序列的mtdr，其中所述mdtr包含5至50個(gè)核酸和/或核酸類似物，諸如10至40個(gè)，諸如13至30個(gè)核酸和/或核酸類似物，以及(iii)至少一組相互作用標(biāo)記，包括至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑；其中pto的靶向部分被配置為與靶核酸序列雜交，并且pto的mtdr不被配置為與靶核酸序列雜交。

本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是一個(gè)cqo可以檢測(cè)由多個(gè)獨(dú)特的pto鑒定的多個(gè)靶序列。對(duì)于要檢測(cè)的每個(gè)靶核酸序列，設(shè)計(jì)具有mtdr序列的pto，所述mtdr序列對(duì)于具有相同或相似熒光標(biāo)記的pto是獨(dú)特的，如果這些不同的pto含有相似和/或相同的熒光標(biāo)記，則它們可被稱為pto組。每個(gè)pto組可以用單一cqo檢測(cè)，由此形成激活的標(biāo)簽雙鏈體片段，其中基于由于組中各個(gè)pto上的獨(dú)特mtdr導(dǎo)致的解鏈溫度差異來(lái)區(qū)分激活的標(biāo)簽雙鏈體片段。因此，能夠僅使用單個(gè)熒光標(biāo)記來(lái)檢測(cè)的靶核酸序列的數(shù)量增加。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)于每個(gè)可區(qū)分的熒光標(biāo)記，本文所述的方法可以基于靶核酸序列的相應(yīng)標(biāo)簽雙鏈體片段的解鏈溫度差異來(lái)將至少一個(gè)靶核酸序列彼此區(qū)分，諸如至少兩個(gè)、諸如至少三個(gè)、諸如至少四個(gè)、諸如至少五個(gè)、諸如至少十個(gè)靶核酸序列，其中每個(gè)標(biāo)簽雙鏈體片段的解鏈溫度由mtdr的長(zhǎng)度和組成決定。在另一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所述的mtdr的長(zhǎng)度和/或組成決定了如上文所述的激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的解鏈溫度。激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的解鏈溫度可以是任何溫度；然而，優(yōu)選是高于室溫的溫度。pcr反應(yīng)在通常具有接近100℃的沸點(diǎn)的水性緩沖液中進(jìn)行。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的解鏈溫度在30℃至100℃之間，諸如在35℃至90℃之間，諸如在40℃至75℃之間，諸如在45℃至75℃之間。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的解鏈溫度在35℃至90℃之間，諸如在50℃至85℃之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，形成標(biāo)簽雙鏈體片段的pto的mtdr被配置為產(chǎn)生在30℃至100℃之間，諸如在35℃至80℃之間，諸如在40℃至75℃之間，諸如在45℃至75℃之間的激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的解鏈溫度。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，形成標(biāo)簽雙鏈體片段的pto的mtdr被配置成產(chǎn)生在50℃至75℃之間，諸如在50℃至70℃之間的解鏈溫度。優(yōu)選選擇一組pto的mtdr，使得容易檢測(cè)和記錄它們各自的解鏈溫度。因此，一組pto的mtdr各自的解鏈溫度可以相差2、3、4、5、6、7、8、9、10度或10度以上。

在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(a)包括將靶核酸序列與pto雜交；所述pto包含(i)包含與靶核酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含與靶核酸序列不互補(bǔ)的核苷酸序列的mtdr，其中所述mdtr被配置為產(chǎn)生在50℃至75℃之間的解鏈溫度，諸如在50℃至70℃之間，以及(iii)至少一組相互作用標(biāo)記，包括至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑；其中pto的靶向部分被配置為與靶核酸序列雜交，并且pto的mtdr不被配置為與靶核酸序列雜交。

接頭分子

pto還可以包含接頭分子，所述接頭分子與靶核酸序列和cqo不互補(bǔ)，位于pto的靶向部分與mtdr之間。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所述的pto還包含位于pto的靶向部分與mtdr之間的接頭分子。

在一些實(shí)施方案中，接頭是與靶核酸序列和cqo不互補(bǔ)的接頭，并且其中接頭分子包含1至200個(gè)核苷酸，諸如1至50個(gè)核苷酸，諸如1至30個(gè)核苷酸，諸如2至20個(gè)核苷酸，諸如約4至14個(gè)核苷酸，諸如6至13個(gè)核苷酸，諸如8至12個(gè)核苷酸，諸如9至12個(gè)核苷酸，諸如11個(gè)核苷酸。接頭分子可以包含以下項(xiàng)或由以下項(xiàng)組成：非核酸，諸如非天然或其他有機(jī)化合物，諸如碳鏈，諸如c1-c40烷烴，諸如c6碳鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，接頭包含核酸和非核酸的混合物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，接頭包含任何有機(jī)化合物。接頭可以是二醇接頭，或者是本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的任何接頭。非核酸的優(yōu)點(diǎn)可能是此類接頭阻止聚合酶沿著pto前進(jìn)。

封端基團(tuán)

優(yōu)選地，pto和/或cqo的3'端被“封閉”以阻止其在pcr反應(yīng)中延伸。封端可以根據(jù)常規(guī)方法實(shí)現(xiàn)。例如，可以通過(guò)對(duì)最后一個(gè)核苷酸的3'-羥基添加化學(xué)部分諸如生物素、磷酸基、烷基、非核苷酸接頭、硫代磷酸酯和/或烷二醇來(lái)進(jìn)行封端?；蛘撸梢酝ㄟ^(guò)去除最后一個(gè)核苷酸的3'-羥基或使用沒(méi)有3'-羥基的核苷酸諸如雙脫氧核苷酸來(lái)進(jìn)行封端。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，pto和/或cqo還包含在3'端的封端基團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述封端基團(tuán)選自由生物素、磷酸基、烷基、非核苷酸接頭、硫代磷酸酯和/或烷二醇組成的組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)去除pto和/或cqo的最后一個(gè)核苷酸的3'-羥基，或通過(guò)使用沒(méi)有3'-羥基的核苷酸諸如雙脫氧核苷酸來(lái)阻止pto和/或cqo的3'端的延伸。cqo上的猝滅劑可以充當(dāng)封端基團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，cqo上的所述封端基團(tuán)是猝滅劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，cqo上的所述封端基團(tuán)是位于所述cqo的3'端的猝滅劑。

pto可以通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)來(lái)合成。特定的mtdr可以用于多個(gè)測(cè)定，而pto的靶向部分取決于要測(cè)量的靶而變化。因此，這兩個(gè)元件和任選的接頭可以如本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知通過(guò)點(diǎn)擊化學(xué)進(jìn)行接合；另參見(jiàn)nucleicacidssympser(2008)52(1):47-48。

cqo

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，每個(gè)cqo在本發(fā)明方法中用于測(cè)定至少一個(gè)靶核酸序列，諸如至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)、八個(gè)或九個(gè)，諸如至少十個(gè)靶核酸序列，諸如15個(gè)、20個(gè)、25個(gè)、30個(gè)、35個(gè)、40個(gè)、45個(gè)、50個(gè)或多于50個(gè)靶核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用兩個(gè)cqo來(lái)鑒定多個(gè)靶序列，其中每個(gè)cqo用于鑒定至少一個(gè)靶核酸序列，諸如至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)，諸如至少十個(gè)或十個(gè)以上靶核酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用三個(gè)cqo，諸如至少四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)，諸如至少八個(gè)cqo來(lái)鑒定眾多個(gè)靶序列，其中每個(gè)cqo用于鑒定至少一個(gè)，諸如至少兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)，諸如至少十個(gè)靶核酸序列。

在一個(gè)實(shí)施方案中，cqo和任選地具有核酸酶活性的酶在液體懸浮液或液體溶液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)cqo和任選地具有核酸酶活性的酶在即用的液體懸浮液或液體溶液中。即用意味著滿足進(jìn)行pcr反應(yīng)的所有條件，即存在所需的鹽、ph等。在一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)cqo和任選地具有核酸酶活性的酶在即用丸粒中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的至少一個(gè)pto和至少一個(gè)cqo以及任選地具有核酸酶活性的酶在液體懸浮液或液體溶液中。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的至少一個(gè)pto和至少一個(gè)cqo以及任選地具有核酸酶活性的酶在即用的液體懸浮液或液體溶液中。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一個(gè)pto和至少一個(gè)cqo以及任選地具有核酸酶活性的酶在即用丸粒中。在一個(gè)實(shí)施方案中，即用丸粒包含基本上無(wú)水的組合物，包括用于進(jìn)行pcr反應(yīng)的鹽和/或核苷酸。

在另一個(gè)實(shí)施方案中，cqo包含非核酸分子。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及一種寡核苷酸，即包含至少一個(gè)猝滅劑和捕獲部分的cqo，其中所述cqo的捕獲部分被配置為與本發(fā)明的至少一個(gè)，諸如兩個(gè)或兩個(gè)以上pto雜交，其中單一cqo可用于檢測(cè)眾多個(gè)靶核酸序列。cqo與pto的mtdr區(qū)雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，cqo不與pto的靶向部分和/或pto的任選接頭雜交。

cqo用于根據(jù)本發(fā)明的測(cè)定使用。

pto和cqo的融合

pto和cqo可以連接并配置成可逆地形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，其中pto的mtdr與cqo的捕獲部分雜交，由此產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)。圖8a示出了pto和cqo可如何產(chǎn)生發(fā)夾結(jié)構(gòu)的實(shí)例。在一個(gè)實(shí)施方案中，pto和cqo存在于相同的寡核苷酸上。在另一個(gè)實(shí)施方案中，pto和cqo連接。在另一個(gè)實(shí)施方案中，pto和cqo位于相同的寡核苷酸上，其中pto的mtdr和cqo的捕獲部分被配置為可逆地形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)。

pto和/或cqo中的各者的總長(zhǎng)度可以變化。在一個(gè)實(shí)施方案中，pto的總長(zhǎng)度在10與500個(gè)核苷酸之間，諸如在20與100個(gè)核苷酸之間，諸如在30與70個(gè)核苷酸之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，cqo的總長(zhǎng)度在10與500個(gè)核苷酸或堿基對(duì)之間，諸如在15與100個(gè)核苷酸或堿基對(duì)之間，諸如在20與50個(gè)核苷酸或堿基對(duì)之間。在pto和cqo融合或連接的情況下，融合產(chǎn)物的總長(zhǎng)度可以在20與600個(gè)核苷酸之間。在另一個(gè)實(shí)施方案中，pto和/或cqo包含非天然堿基。人工核酸(或異種核酸(xenonucleicacid)，xna)的實(shí)例包括但不限于pna、lna、gna和tna。這些化合物及其用途是技術(shù)人員已知的。非天然堿基的特定實(shí)例還包括但不限于堿基對(duì)組合形式的以下堿基：iso-c/iso-g、iso-dc/iso-dg[pwg2]。在另一個(gè)實(shí)施方案中，pto和/或cqo包含非核酸分子。

熒光團(tuán)和猝滅劑

本發(fā)明人已證明，位于pto上的熒光團(tuán)和位于cqo上的猝滅劑之間的距離影響背景解鏈曲線的生成。在一個(gè)實(shí)施方案中，pto熒光團(tuán)和cqo猝滅劑分子之間的距離在6與60個(gè)堿基對(duì)之間，諸如在10至35個(gè)堿基對(duì)之間，諸如15至25個(gè)堿基對(duì)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，pto的熒光團(tuán)和cqo的猝滅劑(最鄰近的猝滅劑)間隔開(kāi)1與40個(gè)核苷酸或堿基對(duì)之間的距離，諸如在6至35之間、10至30之間、15至25之間，諸如約18個(gè)核苷酸。

pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)和cqo的至少一個(gè)最鄰近的猝滅劑之間的距離優(yōu)選使得猝滅足以允許在pto與cqo不雜交并且信號(hào)不被猝滅的情況下區(qū)分激活的標(biāo)簽雙鏈體與解鏈的標(biāo)簽雙鏈體之間的信號(hào)。因此，可以存在一些背景信號(hào)，前提條件是此信號(hào)弱于真陽(yáng)性信號(hào)，從而允許在背景信號(hào)和陽(yáng)性信號(hào)之間進(jìn)行辨別。同樣，熒光團(tuán)和猝滅劑的選擇也應(yīng)當(dāng)使得可以如技術(shù)人員所知曉的那樣辨別背景信號(hào)和陽(yáng)性信號(hào)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的步驟(b)包括使pto和cqo雜交；其中所述cqo包含(i)捕獲部分，其包含與所述pto的mtdr反向互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(ii)至少一個(gè)猝滅分子；其中所述pto的所述mtdr被配置為與所述cqo的所述捕獲部分雜交以形成標(biāo)簽雙鏈體，其中pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)和cqo的至少一個(gè)猝滅劑間隔開(kāi)1與40個(gè)核苷酸或堿基對(duì)之間的距離，諸如在6至35之間、在10至30之間、在15至25之間，諸如約20個(gè)核苷酸。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的至少一組相互作用標(biāo)記包含熒光團(tuán)和猝滅劑，其中來(lái)自所述熒光團(tuán)的熒光發(fā)射被所述猝滅劑猝滅。一組相互作用標(biāo)記被配置為具有相容的熒光團(tuán)和猝滅劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一組相互作用標(biāo)記包括一組、兩組、三組、四組、五組、六組、七組或七組以上相互作用標(biāo)記。在另一個(gè)實(shí)施方案中，使用至少兩組pto和cqo來(lái)檢測(cè)至少兩個(gè)靶核酸序列，其中每組pto和每組cqo被配置為具有相容的熒光團(tuán)和猝滅劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，至少一組相互作用標(biāo)記之間的主要相互作用由熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fret)介導(dǎo)。

本發(fā)明人還已證明，包含至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑的pto的相互作用標(biāo)記組之間的距離也會(huì)影響不希望的背景解鏈曲線生成。在一個(gè)實(shí)施方案中，pto的相互作用標(biāo)記組間隔開(kāi)1與40個(gè)核苷酸或堿基對(duì)之間的距離，諸如在6與35個(gè)之間、在10至30個(gè)之間、在15至25個(gè)之間，諸如約20個(gè)核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法的步驟(a)包括將靶核酸序列與pto雜交；所述pto包含(i)包含與所述靶核酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含與所述靶核酸序列不互補(bǔ)的核苷酸序列的mtdr，以及(iii)至少一組相互作用標(biāo)記，包括至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑，其中所述至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑間隔開(kāi)在與之間的距離，諸如在與之間，在與之間，在與之間，諸如約其中所述pto的靶向部分被配置為與所述靶核酸序列雜交，并且所述pto的mtdr不被配置為與所述靶核酸序列雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的方法的步驟(a)包括將靶核酸序列與pto雜交；所述pto包含(i)包含與所述靶核酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含與所述靶核酸序列不互補(bǔ)的核苷酸序列的mtdr，以及(iii)至少一組相互作用標(biāo)記，包括至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑，其中所述至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑間隔開(kāi)1與40個(gè)核苷酸或堿基對(duì)之間的距離，諸如在6與35個(gè)之間、在10至30個(gè)之間、在15至25個(gè)之間，諸如約18個(gè)核苷酸；其中所述pto的靶向部分被配置為與所述靶核酸序列雜交，并且所述pto的mtdr不被配置為與所述靶核酸序列雜交。

在一個(gè)實(shí)施方案中，pto的相互作用標(biāo)記組被放置為使得當(dāng)pto和cqo雜交時(shí)，來(lái)自pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射被pto的至少一個(gè)猝滅劑和被cqo的至少一個(gè)猝滅劑猝滅。在另一個(gè)實(shí)施方案中，pto的相互作用標(biāo)記組被放置為使得來(lái)自pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射被pto的至少一個(gè)猝滅劑和cqo的至少一個(gè)猝滅劑猝滅，其中當(dāng)pto和cqo雜交時(shí)，pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)被pto的至少一個(gè)猝滅劑和cqo的至少一個(gè)猝滅劑猝滅的水平基本上相似。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，pto的相互作用標(biāo)記組被放置為使得來(lái)自pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射被pto的至少一個(gè)猝滅劑和cqo的至少一個(gè)猝滅劑猝滅，其中當(dāng)pto和cqo雜交時(shí)，pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)與pto的至少一個(gè)猝滅劑和cqo的至少一個(gè)猝滅劑之間的距離基本上相似。在另一個(gè)實(shí)施方案中，pto的相互作用標(biāo)記組被放置為使得當(dāng)pto和cqo雜交時(shí)，pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)被pto的至少一個(gè)猝滅劑猝滅的水平基本上類似于和/或強(qiáng)于其被cqo的至少一個(gè)猝滅劑猝滅的水平。在另一個(gè)實(shí)施方案中，pto的相互作用標(biāo)記被放置為使得當(dāng)pto和cqo雜交時(shí)，pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)與pto的至少一個(gè)猝滅劑的距離基本上類似于和/或短于pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)與cqo的至少一個(gè)猝滅劑的距離。

可與寡核苷酸綴合的熒光團(tuán)可用于本發(fā)明。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的pto包含至少一個(gè)熒光團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)選自包括6-羧基熒光素(fam)、四氯熒光素(tet)或它們的組合的組。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的pto包含多于一個(gè)熒光團(tuán)，諸如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)和/或諸如八個(gè)熒光團(tuán)。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的pto包含兩個(gè)或兩個(gè)以上相同的熒光團(tuán)，諸如三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)和/或諸如八個(gè)相同的熒光團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的pto包含兩個(gè)或兩個(gè)以上不同的熒光團(tuán)，諸如三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)和/或諸如八個(gè)不同的熒光團(tuán)。

為了促進(jìn)對(duì)如本文所述的pto上的至少一個(gè)熒光團(tuán)的猝滅，pto包含至少一個(gè)猝滅劑分子。可與寡核苷酸綴合的猝滅劑可用于本發(fā)明。pto的至少一個(gè)猝滅劑和至少一個(gè)熒光團(tuán)被配置為至少一組相互作用標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的pto包含至少一個(gè)猝滅劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，pto的至少一個(gè)猝滅劑被配置用于猝滅pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，pto的至少一種熒光團(tuán)選自包括以下項(xiàng)的組：黑洞猝滅劑(blackholequencher，bhq)1、bhq2和bhq3、cosmic猝滅劑(例如購(gòu)自美國(guó)諾瓦托biosearchtechnologies)、excellentbioneer猝滅劑(ebq)(例如購(gòu)自韓國(guó)大田市bioneer)，或者它們的組合。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的pto包含多于一個(gè)猝滅劑，諸如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)和/或諸如八個(gè)猝滅劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的pto包含兩個(gè)或兩個(gè)以上相同的猝滅劑，諸如三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)和/或諸如八個(gè)相同的猝滅劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的pto包含兩個(gè)或兩個(gè)以上不同的猝滅劑，諸如三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)和/或諸如八個(gè)不同的熒光團(tuán)。

為了促進(jìn)對(duì)如本文所述的pto上的至少一個(gè)熒光團(tuán)的猝滅，cqo包含至少一個(gè)猝滅劑分子。可與寡核苷酸綴合的大多數(shù)猝滅劑可用于本發(fā)明。然而，cqo的至少一個(gè)猝滅劑和pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)可以被配置為至少一組相互作用標(biāo)記。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的cqo包含至少一個(gè)猝滅劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，cqo的至少一個(gè)猝滅劑被配置用于猝滅如本文所述的pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，cqo的至少一個(gè)猝滅劑選自包括以下項(xiàng)的組：黑洞猝滅劑(bhq)1、bhq2以及bhq3(購(gòu)自美國(guó)諾瓦托biosearchtechnologies)。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的cqo包含多于一個(gè)猝滅劑，例如兩個(gè)、三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)和/或諸如八個(gè)猝滅劑。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的cqo包含兩個(gè)或兩個(gè)以上相同的猝滅劑，諸如三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)和/或諸如八個(gè)相同的猝滅劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的cqo包含兩個(gè)或兩個(gè)以上不同的猝滅劑，諸如三個(gè)、四個(gè)、五個(gè)、六個(gè)、七個(gè)和/或諸如八個(gè)不同的熒光團(tuán)。

可用于本發(fā)明的熒光團(tuán)可以包括本領(lǐng)域已知的任何熒光分子。熒光團(tuán)的實(shí)例是：cy2^tmcfflfi)、yo-prn^tm-1(509)、ydyo^tm-1(509)、鈣黃綠素(517)、fitc(518)、fluorx^tm(519)、alexa^tm(520)、羅丹明110(520)、oregongreen^tm500(522)、oregongreen^tm488(524)、ribogreen^tm(525)、rhodaminegreen^tm(527)、羅丹明123(529)、magnesiumgreen^tm(531)、calciumgreen^tm(533)、to-pro^tm-i(533)、totoi(533)、joe(548)、bodipy530/550(550)、dil(565)、bodipytmr(568)、bodipy558/568(568)、bodipy564/570(570)、cy3^tm(570)、alexa^tm546(570)、tritc(572)、magnesiumorange^tm(575)、藻紅蛋白r&b(575)、羅丹明標(biāo)記鬼筆環(huán)肽(575)、calciumorange^tm(576)、派洛寧y(580)、羅丹明b(580)、tamra(582)、rhodaminered^tm(590)、cy3.5(tm)(596)、rox(608)、calciumcrimson^tm(615)、alexa^tm594(615)、texasred(615)、尼羅紅(628)、yo-pro^tm-3(631)、yoyo^tm-3(631)、r-藻藍(lán)蛋白(642)、c-藻藍(lán)蛋白(648)、to-pro^tm-3(660)、tot03(660)、diddilc(5)(665)、cy5^tm(670)、硫雜二羰花青(671)、cy5.5(694)、hex(556)、tet(536)、biosearchblue(447)、calfluorgold540(544)、calfluororange560(559)、calfluorred590(591)、calfluorred610(610)、calfluorred635(637)、fam(520)、熒光素(520)、熒光素-c3(520)、pulsar650(566)、guasar570(667)、guasar670(705)和guasar705(610)。括號(hào)中的數(shù)字是以納米為單位的最大發(fā)射波長(zhǎng)。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，熒光團(tuán)選自由fam和/或tet組成的組。值得注意的是，能夠猝滅寬范圍波長(zhǎng)或特定波長(zhǎng)的熒光的非熒光暗猝滅劑分子可用于本發(fā)明。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，相互作用標(biāo)記組是fam/bhq。其他合適的熒光團(tuán)/猝滅劑為業(yè)內(nèi)已知。

步驟(a)將pto與靶序列雜交

本發(fā)明的步驟(a)涉及本發(fā)明的pto與靶核酸的雜交。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述方法的步驟(a)涉及將靶核酸序列與pto雜交；所述pto包含(i)包含與靶核酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含與靶核酸序列不互補(bǔ)的核苷酸序列的mtdr，以及(iii)至少一組相互作用標(biāo)記，包括至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑；其中pto的靶向部分被配置為與靶核酸序列雜交，并且pto的mtdr不被配置為與靶核酸序列雜交。

在一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(a)包括將靶核酸序列與pto雜交；所述pto包含(i)包含與靶核酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含與靶核酸序列不互補(bǔ)的核苷酸序列的mtdr，以及(iii)至少一組相互作用標(biāo)記，包括至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑；其中pto的靶向部分被配置為與靶核酸序列雜交，并且pto的mtdr不被配置為與靶核酸序列雜交，其中所述pto在10與500個(gè)核苷酸之間，諸如在20與100個(gè)之間，諸如在30與70個(gè)核苷酸或堿基對(duì)之間。

可以在本發(fā)明中加入靶序列之前預(yù)混合本發(fā)明的pto和cqo。因此，本發(fā)明步驟(b)的標(biāo)簽雙鏈體形成可以在pto與靶序列的雜交之前形成。在一個(gè)實(shí)施方案中，如下在步驟(a)之前進(jìn)行步驟(b)：

(b)將pto與cqo(捕獲和猝滅寡核苷酸)雜交；其中所述pto包含(i)包含與靶核酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含與靶核酸序列不互補(bǔ)的核苷酸序列的解鏈溫度決定區(qū)(mtdr)，以及(iii)至少一組相互作用標(biāo)記，包括至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑；其中pto的靶向部分被配置為與靶核酸序列雜交，并且pto的mtdr不被配置為與靶核酸序列雜交；其中所述cqo包含(i)捕獲部分，其包含與所述pto的mtdr反向互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(ii)至少一個(gè)猝滅分子；其中所述pto的所述mtdr被配置為與所述cqo的所述捕獲部分雜交以形成標(biāo)簽雙鏈體；

以及

(a)將所述靶核酸序列與所述標(biāo)簽雙鏈體雜交；

(c)使所述標(biāo)簽雙鏈體與具有核酸酶活性的酶接觸；其中當(dāng)所述標(biāo)簽雙鏈體與靶核酸序列雜交時(shí)，所述具有核酸酶活性的酶誘導(dǎo)所述標(biāo)簽雙鏈體的切割，從而釋放激活的標(biāo)簽雙鏈體片段，所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段包含pto片段，所述pto片段包含與cqo的捕獲部分雜交的mtdr和至少一個(gè)熒光團(tuán)；

(d)使所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段解鏈和/或雜交以獲得來(lái)自所述至少一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)，以及

(e)通過(guò)測(cè)量來(lái)自所述至少一個(gè)熒光團(tuán)的所述信號(hào)來(lái)檢測(cè)所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段；其中所述信號(hào)指示在核酸混合物中所述靶核酸序列的存在。

應(yīng)當(dāng)理解，為了獲得來(lái)自至少一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)，所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段不包含包含在mtdr的至少一組相互作用標(biāo)記中的至少一個(gè)猝滅劑。換句話說(shuō)，所述信號(hào)是當(dāng)至少一組相互作用標(biāo)記的至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑不再相互作用時(shí)獲得的。

本發(fā)明的pto、cqo和靶序列也可以同時(shí)混合。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的步驟(a)和步驟(b)可以按任何順序或同時(shí)進(jìn)行。

上游和下游寡核苷酸

將位于pto的結(jié)合位點(diǎn)的上游和下游的一對(duì)pcr引物添加至靶核酸序列增加了pcr測(cè)定的特異性并且有助于避免假陽(yáng)性雜交信號(hào)。因此，本發(fā)明還可以包括與靶核酸互補(bǔ)的上游引物和可在靶核酸上pto結(jié)合位點(diǎn)的下游雜交的下游引物。上游和下游寡核苷酸被配置為不與靶核酸序列的pto結(jié)合位點(diǎn)重疊。上游引物和下游引物可以位于靶核酸序列的2000個(gè)堿基對(duì)內(nèi)。在一個(gè)實(shí)施方案中，上游寡核苷酸和下游核苷酸位于來(lái)自靶核酸序列的pto結(jié)合位點(diǎn)的至少一個(gè)堿基對(duì)處。在另一個(gè)實(shí)施方案中，上游和/或下游寡核苷酸位于來(lái)自靶核酸序列的pto結(jié)合位點(diǎn)的1至2000個(gè)堿基對(duì)之間。上游和/或下游寡核苷酸可以定位為距靶核酸序列超過(guò)2000個(gè)堿基對(duì)(2kb)，距離靶核酸序列諸如2.5kb、諸如3kb、諸如3.5kb、諸如4kb、諸如5kb、諸如10kb、諸如20kb。

凈化

反應(yīng)容器的凈化可以在步驟(a)之前進(jìn)行。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(a)之前使用ung處理步驟(biotechniques38：569-575(2005年4月))和/或變性步驟?？梢詰?yīng)用本領(lǐng)域的技術(shù)人員已知的rna凈化處理。在一個(gè)實(shí)施方案中，在步驟(a)之前使用凈化處理步驟和/或變性步驟。

步驟(b)將cqo與pto雜交以形成標(biāo)簽雙鏈體

本發(fā)明方法的步驟(b)涉及pto與cqo的雜交，此雜交形成標(biāo)簽雙鏈體。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的步驟(b)包括將所述pto與所述cqo雜交；其中所述cqo包含(i)捕獲部分，其包含與所述pto的mtdr反向互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(ii)至少一個(gè)猝滅分子；其中所述pto的mtdr被配置為與所述cqo的捕獲部分雜交以形成標(biāo)簽雙鏈體。

如先前所述，本發(fā)明人已證明，位于pto上的熒光團(tuán)和位于cqo上的猝滅劑之間的距離影響背景解鏈曲線的生成。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的步驟(b)包括將所述pto與所述cqo雜交；其中所述cqo包含(i)捕獲部分，其包含與所述pto的mtdr反向互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(ii)至少一個(gè)猝滅分子；其中所述pto的mtdr被配置為與所述cqo的捕獲部分雜交以形成標(biāo)簽雙鏈體，其中pto上的至少一個(gè)熒光團(tuán)與cqo猝滅劑分子上的至少一個(gè)猝滅分子之間的距離在1與60個(gè)堿基對(duì)之間，諸如在10與35個(gè)堿基對(duì)之間，諸如15至25個(gè)堿基對(duì)，諸如約18個(gè)堿基對(duì)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明方法的步驟(b)包括將所述pto與所述cqo雜交；其中所述cqo包含(i)捕獲部分，其包含與所述pto的mtdr反向互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(ii)至少一個(gè)猝滅分子，所述至少一個(gè)猝滅分子被配置為猝滅所述pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)；其中所述pto的mtdr被配置為與所述cqo的捕獲部分雜交以形成標(biāo)簽雙鏈體。

步驟(c)釋放激活的標(biāo)簽雙鏈體片段

本發(fā)明的步驟(c)涉及標(biāo)簽雙鏈體的核酸酶介導(dǎo)切割，此切割形成釋放的標(biāo)簽雙鏈體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的步驟(c)包括使來(lái)自步驟(b)的標(biāo)簽雙鏈體與具有核酸酶活性的酶接觸；其中當(dāng)所述標(biāo)簽雙鏈體與所述靶核酸序列雜交時(shí)，所述具有核酸酶活性的酶誘導(dǎo)所述標(biāo)簽雙鏈體的切割，從而釋放激活的標(biāo)簽雙鏈體片段，所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段包含pto片段，所述pto片段包含與所述cqo的所述捕獲部分雜交的所述mtdr和所述至少一個(gè)熒光團(tuán)。

為了避免假陽(yáng)性信號(hào)，cqo的至少一個(gè)猝滅劑被配置為當(dāng)激活的標(biāo)簽雙鏈體片段雜交時(shí)可逆地猝滅pto的至少一個(gè)熒光團(tuán)。在本發(fā)明方法的一個(gè)實(shí)施方案中，cqo的至少一個(gè)猝滅劑被配置為可逆地猝滅激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的至少一個(gè)熒光團(tuán)。如上所述，cqo的猝滅劑和pto的熒光團(tuán)應(yīng)選擇為使得能辨別背景信號(hào)和陽(yáng)性信號(hào)。同樣，cqo的猝滅劑和pto的熒光團(tuán)之間的距離可能必須被優(yōu)化以獲得期望的信號(hào)辨別。

任何具有核酸酶活性的酶都可能誘發(fā)標(biāo)簽雙鏈體的釋放，如圖1所示。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述核酸酶活性是fen核酸酶(瓣?duì)顑?nèi)切核酸酶)的5'核酸酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有核酸酶活性的酶是模板依賴性dna聚合酶，諸如熱穩(wěn)定的模板依賴性dna聚合酶，諸如taq聚合酶和/或sso7d融合聚合酶或它們的混合物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有核酸酶活性的酶是sso7d-融合聚合酶。在另一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，具有核酸酶活性的酶是gotaq聚合酶。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有核酸酶活性的酶是具有5'至3'核酸外切酶活性的模板依賴性dna聚合酶。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，核酸酶是核酸外切酶。

技術(shù)人員了解聚合酶的濃度可以影響其活性。最佳濃度還可以取決于其他參數(shù)，諸如靶濃度、模板、或存在于反應(yīng)中的核酸的序列。技術(shù)人員了解如何優(yōu)化聚合酶濃度以獲得良好的結(jié)果。

導(dǎo)致形成激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的標(biāo)簽雙鏈體釋放由當(dāng)本文所述的上游寡核苷酸延伸時(shí)具有核酸酶活性的酶介導(dǎo)。在一個(gè)實(shí)施方案中，用延伸上游寡核苷酸的所述模板依賴性dna聚合酶誘導(dǎo)標(biāo)簽雙鏈體的pto部分的切割，其中所述聚合酶具有5'核酸酶活性。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)上游寡核苷酸延伸時(shí)，由所述模板依賴性dna聚合酶誘導(dǎo)標(biāo)簽雙鏈體的pto部分的切割，其中所述聚合酶具有5'核酸酶活性。

當(dāng)pto的含5'靶向部分的部分被切割時(shí)，標(biāo)簽雙鏈體片段被釋放。該切割導(dǎo)致pto的靶向部分與靶核酸序列之間的親和力降低，這因此導(dǎo)致靶核酸序列和標(biāo)簽雙鏈體的解離，從而形成激活的標(biāo)簽雙鏈體片段。在一個(gè)實(shí)施方案中，如本文所述的pto上的至少一個(gè)猝滅劑由具有核酸酶活性的酶從pto釋放。在另一個(gè)實(shí)施方案中，具有核酸酶活性的酶去除了激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的pto部分的至少一個(gè)猝滅劑。在另一個(gè)實(shí)施方案中，激活的標(biāo)簽雙鏈體片段包含pto片段，其中不存在pto的至少一個(gè)猝滅劑。由于如本文所述并且在圖1上示出的具有核酸酶活性的酶的核酸酶活性，激活的標(biāo)簽雙鏈體片段上可能不存在至少一個(gè)猝滅劑。

激活的標(biāo)簽雙鏈體和/或激活的pto的存在可以通過(guò)qpcr和/或?qū)崟r(shí)pcr檢測(cè)。優(yōu)選地，僅激活的標(biāo)簽雙鏈體被實(shí)時(shí)pcr檢測(cè)到。

步驟(d)使激活的標(biāo)簽雙鏈體片段解鏈

本發(fā)明步驟(d)涉及來(lái)自步驟(c)的激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的解鏈。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的步驟(d)包括使所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段解鏈和/或雜交以獲得來(lái)自所述至少一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)。記錄發(fā)生解鏈時(shí)的溫度。

解鏈可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)進(jìn)行，包括但不限于加熱、堿、甲酰胺、尿素和乙二醛處理，酶法(如解旋酶作用)以及結(jié)合蛋白。例如，可以通過(guò)在30℃至100℃的溫度范圍內(nèi)加熱來(lái)實(shí)現(xiàn)解鏈。

當(dāng)在一定溫度范圍內(nèi)加熱激活的標(biāo)簽雙鏈片段時(shí)，pto的mtdr與本發(fā)明的cqo解離。激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的一半將解離成單鏈的溫度由標(biāo)簽雙鏈體的穩(wěn)定性決定，而標(biāo)簽雙鏈體的穩(wěn)定性由解鏈溫度區(qū)(mtdr)決定。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，在一定溫度范圍內(nèi)加熱激活的標(biāo)簽雙鏈體片段i。在另一個(gè)實(shí)施方案中，將激活的標(biāo)簽雙鏈體片段從30℃加熱至100℃，諸如從35℃至100℃，諸如從40℃至75℃，諸如從45℃至70℃。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的解鏈溫度為45℃至70℃。在另一個(gè)實(shí)施方案中，激活的標(biāo)簽雙鏈體片段在預(yù)定溫度下解鏈。

只要激活的標(biāo)簽雙鏈體片段是雙鏈的，來(lái)自pto上的至少一個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射就基本上被cqo上的至少一個(gè)猝滅劑猝滅。當(dāng)激活的標(biāo)簽雙鏈片段解離并變成單鏈時(shí)，pto上的至少一個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射可以不被cqo上的至少一個(gè)猝滅劑猝滅。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在步驟(d)中標(biāo)簽雙鏈體解鏈時(shí)，來(lái)自至少一個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射不被猝滅。在另一個(gè)實(shí)施方案中，當(dāng)在步驟(d)中標(biāo)簽雙鏈解離并變成單鏈時(shí)，來(lái)自至少一個(gè)熒光團(tuán)的發(fā)射不被猝滅。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)解鏈曲線分析和/或雜交曲線分析來(lái)確定激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的存在。在另一個(gè)實(shí)施方案中，通過(guò)解鏈曲線分析和/或雜交曲線分析來(lái)確定激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的存在，其中所鑒定的激活的標(biāo)簽雙鏈體片段的解鏈溫度由本文所述的pto的mtdr決定。

步驟(e)檢測(cè)來(lái)自解鏈的標(biāo)簽雙鏈體片段的信號(hào)。

本發(fā)明的步驟(e)涉及檢測(cè)作為步驟(d)中標(biāo)簽雙鏈體解鏈的結(jié)果的信號(hào)。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，步驟(e)包括通過(guò)測(cè)量來(lái)自所述至少一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)來(lái)檢測(cè)所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段；其中所述信號(hào)指示核酸混合物中所述靶核酸序列的存在。

要測(cè)量的信號(hào)的性質(zhì)取決于pto上的至少一個(gè)熒光團(tuán)，并且可以通過(guò)一系列分析方法(例如實(shí)時(shí)pcr檢測(cè)系統(tǒng))來(lái)確定。

可以通過(guò)常規(guī)技術(shù)來(lái)獲得解鏈曲線或雜交曲線。例如，解鏈曲線或雜交曲線可以包括使用雜交嚴(yán)格性參數(shù)的輸出信號(hào)的變化的圖形曲線或圖形顯示。可以直接根據(jù)雜交參數(shù)繪制輸出信號(hào)的曲線圖。通常，解鏈曲線或雜交曲線將具有輸出信號(hào)，例如熒光，其表示雙鏈體結(jié)構(gòu)的程度(即雜交程度)，繪制在y軸上，并且雜交參數(shù)繪制在x軸上(即，溫度)。

為了用熒光記錄解鏈曲線，通常可以逐步升高或降低總體樣品溫度，其中在每個(gè)溫度下的設(shè)定平衡時(shí)間為0至360秒。通常使用在0.5℃與2℃之間的步長(zhǎng)，但是根據(jù)期望的精度可以將其降至0.1℃。記錄每個(gè)溫度下相關(guān)波長(zhǎng)的熒光讀數(shù)?；诮怄溓€，可以確定dna雙鏈體在所應(yīng)用條件下的tm。

在分子生物學(xué)的所有領(lǐng)域中選擇用于核酸(dna、rna)定量的方法是實(shí)時(shí)pcr或定量pcr(qpcr)。方法這樣稱謂是因?yàn)橛镁酆厦告湻磻?yīng)(pcr)擴(kuò)增dna是被實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)的(qpcr循環(huán)儀不斷掃描qpcr板)。

熒光報(bào)告探針(taqman探針或雙標(biāo)記探針)僅檢測(cè)含有與探針互補(bǔ)的序列的dna；因此，使用報(bào)告探針顯著增加了特異性，并且使得即使在其他dsdna的存在下也能夠進(jìn)行該技術(shù)。通過(guò)使用不同顏色的標(biāo)記，熒光探針可在多重測(cè)定中用于監(jiān)測(cè)同一管中的若干靶序列。該方法依賴于在一端具有熒光報(bào)告分子并且在探針的相對(duì)端具有熒光猝滅劑的基于dna的探針。報(bào)告分子與猝滅劑緊鄰而阻止了對(duì)其熒光的檢測(cè)；利用taq聚合酶的5'至3'核酸外切酶活性分解探針破壞了報(bào)告分子與猝滅劑的接近，從而允許熒光發(fā)射不被猝滅，該熒光發(fā)射可以在用激光激發(fā)后檢測(cè)到。因此，在每次pcr循環(huán)中報(bào)告探針?biāo)邢虻漠a(chǎn)物的增加導(dǎo)致熒光由于探針的分解和報(bào)告分子的釋放而成比例增加。正常準(zhǔn)備pcr，并加入報(bào)告探針。當(dāng)反應(yīng)開(kāi)始時(shí)，在pcr的退火階段期間，將探針和引物都與dna靶退火。從引物開(kāi)始新dna鏈的聚合，并且一旦聚合酶到達(dá)探針，其5'-3'核酸外切酶使探針降解，將熒光報(bào)告分子與猝滅劑實(shí)體分離，從而導(dǎo)致熒光增加。在實(shí)時(shí)pcr機(jī)器中檢測(cè)和測(cè)量熒光，并且使用熒光對(duì)應(yīng)于產(chǎn)物指數(shù)增長(zhǎng)的幾何級(jí)數(shù)增長(zhǎng)來(lái)確定每次反應(yīng)中的定量循環(huán)數(shù)(cq)。

該信號(hào)可以在反應(yīng)中存在的雙鏈體的退火溫度或變性溫度下測(cè)量。因此，該信號(hào)可以在55℃與65℃之間的溫度下測(cè)量，諸如在56℃與64℃之間，諸如在57℃與63℃之間，諸如在58℃與62℃之間，諸如在59℃與61℃之間，諸如60℃。在其他實(shí)施方案中，該信號(hào)可以在90℃與100℃之間的溫度下測(cè)量，諸如在91℃與99℃之間，諸如在92℃與98℃之間，諸如在94℃與97℃之間，諸如在95℃與96℃之間，諸如在95℃。技術(shù)人員了解如何確定哪個(gè)溫度提供最佳讀出信號(hào)。

如實(shí)施例5中所示，靶濃度影響將檢測(cè)到的信號(hào)的強(qiáng)度。因此，如果需要，可以調(diào)整靶濃度以改善信號(hào)。

靶核酸序列

如本文所用的靶核酸序列是指需要在核酸序列混合物中鑒定的任何序列。本發(fā)明的簡(jiǎn)單測(cè)定法具有眾多種應(yīng)用。本發(fā)明的測(cè)定法的非詳盡應(yīng)用的清單可以是：

●人和/或獸醫(yī)診斷

●食品和/或飼料質(zhì)量和安全性

●環(huán)境監(jiān)測(cè)

●科學(xué)研究

因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶核酸序列來(lái)自病原生物，諸如細(xì)菌、病毒、真菌和/或原生動(dòng)物。在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶核酸序列來(lái)自能夠感染農(nóng)場(chǎng)動(dòng)物諸如牛、雞、豬、馬、綿羊和/或山羊的病原生物。在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶核酸序列來(lái)自能夠感染哺乳動(dòng)物諸如人、牛、豬、馬、綿羊和/或山羊的病原生物。在一個(gè)更優(yōu)選的實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶核酸序列來(lái)自能夠感染人的病原生物。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶核酸序列來(lái)自能夠感染人的病毒。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶核酸序列來(lái)自能夠感染人、導(dǎo)致高于10％的死亡率的病毒。在一個(gè)實(shí)施方案中，病毒是埃博拉病毒。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶核酸序列來(lái)自能夠感染人的細(xì)菌。在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶核酸序列來(lái)自能夠感染人、導(dǎo)致高于10％的死亡率的細(xì)菌。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶核酸序列來(lái)自引起性傳播疾病的病原生物。該性傳播疾病選自由衣原體感染、淋病和皰疹組成的組。

在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的靶核酸序列來(lái)自選自包括耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillinresistantstaphylococcusaureus，mrsa)的組的病原生物。

用于檢測(cè)靶核酸序列的試劑盒

本發(fā)明的元件可以包含在由多個(gè)部分構(gòu)成的試劑盒中。因此，本發(fā)明的一個(gè)方面涉及用于檢測(cè)靶核酸序列的多個(gè)部分構(gòu)成的試劑盒，所述試劑盒包括：

i.任選地至少一個(gè)如本文所述的pto，以及

ii.至少一個(gè)本文所述的cqo，以及

iii.任選地具有核酸酶活性的酶，以及

iv.任選地關(guān)于如何檢測(cè)靶核酸序列的說(shuō)明。

所述試劑盒可用于檢測(cè)多于一個(gè)靶核酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的試劑盒還包括：

i.任選地來(lái)自至少兩個(gè)不同pto組的至少兩個(gè)pto，以及

ii.至少兩個(gè)cqo。

所述試劑盒還可以含有至少一個(gè)如本文所述的下游和/或上游寡核苷酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含如本文所述的下游寡核苷酸和/或上游寡核苷酸。

另外，所述試劑盒還可以包含具有核酸酶活性的酶。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述試劑盒還包含如本文所述的具有核酸酶活性的酶。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的試劑盒是液體懸浮液或液體溶液。在一個(gè)實(shí)施方案中，上述試劑盒是即用液體懸浮液或液體溶液。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所描述的試劑盒是即用丸粒。在一個(gè)實(shí)施方案中，即用丸粒包含基本上無(wú)水的組合物，該組合物包含所述試劑盒的i)、ii)和iii)。

在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的試劑盒包含部分和/或完全雜交的pto和cqo。

試劑盒還可以包含至少一個(gè)標(biāo)簽雙鏈體，所述至少一個(gè)標(biāo)簽雙鏈體可以用作對(duì)照和用于例如所應(yīng)用的分析設(shè)備的tm校準(zhǔn)。寡核苷酸的tm可以根據(jù)例如鹽濃度、dna濃度、ph和變性劑(如甲酰胺或dmso)的存在而變化。如果要分析的樣品含有變化即不同的鹽濃度，則這種對(duì)照可能是需要的。在一個(gè)實(shí)施方案中，本文所述的試劑盒還包含對(duì)照樣品和/或?qū)φ諛?biāo)簽雙鏈體。

診斷

本發(fā)明的方法可用于診斷和/或治療有需要的個(gè)體。

因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案涉及一種診斷個(gè)體患有特征在于存在靶核酸序列的疾病或病癥的方法，所述方法包括如其他地方所示并且導(dǎo)致檢測(cè)到所述靶核酸序列的測(cè)定步驟。

其非限制性實(shí)例是：一種診斷個(gè)體患有特征在于存在靶核酸序列的疾病或病癥的方法，所述方法包括以下步驟：

步驟(a)將靶核酸序列與pto(探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸)雜交；所述pto包含(i)包含與所述靶核酸序列基本上互補(bǔ)的核苷酸序列的靶向部分，以及(ii)包含與所述靶核酸序列不互補(bǔ)的核苷酸序列的解鏈溫度決定區(qū)(mtdr)，以及(iii)至少一組相互作用標(biāo)記，包括至少一個(gè)熒光團(tuán)和至少一個(gè)猝滅劑；

步驟(b)將所述pto與cqo(捕獲和猝滅寡核苷酸)雜交；其中所述cqo包含(i)捕獲部分，其包含與所述pto的mtdr反向互補(bǔ)的核苷酸序列，以及(ii)至少一個(gè)猝滅分子；其中所述pto的mtdr被配置為與所述cqo的捕獲部分雜交以形成標(biāo)簽雙鏈體；

步驟(c)使所述標(biāo)簽雙鏈體與具有核酸酶活性的酶接觸；其中當(dāng)所述標(biāo)簽雙鏈體與靶核酸序列雜交時(shí)，所述具有核酸酶活性的酶誘導(dǎo)所述標(biāo)簽雙鏈體的切割，從而釋放激活的標(biāo)簽雙鏈體片段，所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段包含pto片段，所述pto片段包含與cqo的捕獲部分雜交的mtdr和至少一個(gè)熒光團(tuán)；

步驟(d)使所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段解鏈和/或雜交以獲得來(lái)自所述至少一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)，以及

步驟(e)通過(guò)測(cè)量來(lái)自所述至少一個(gè)熒光團(tuán)的信號(hào)來(lái)檢測(cè)所述激活的標(biāo)簽雙鏈體片段；其中所述信號(hào)指示所述個(gè)體中所述靶核酸序列的存在以及因此疾病或病癥的存在。

所述疾病或病癥可以是感染引起的(即由病原體引起的)或是遺傳性病癥或疾病。

反應(yīng)混合物

在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括一種反應(yīng)混合物。因此，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案提供了一種用于擴(kuò)增和/或檢測(cè)樣品中靶核酸序列的方法的反應(yīng)混合物，其中在擴(kuò)增前所述反應(yīng)混合物包含至少一對(duì)寡核苷酸引物、至少一個(gè)pto和至少一個(gè)cqo，其中所述引物對(duì)、pto和cqo的特征在于所述寡核苷酸引物對(duì)包含與所述靶核酸互補(bǔ)并引發(fā)與所述靶核酸互補(bǔ)的第一延伸產(chǎn)物的合成的第一引物，和與所述第一延伸產(chǎn)物互補(bǔ)并引發(fā)第二延伸產(chǎn)物的合成的第二引物；并且所述pto與基本上與所述靶核酸序列互補(bǔ)的核苷酸序列或所述靶核酸的互補(bǔ)序列雜交，其中所述區(qū)在所述引物對(duì)的一個(gè)成員與所述引物對(duì)的另一個(gè)成員的互補(bǔ)序列之間，并且所述pto包含至少一組相互作用標(biāo)記、mtdr、以及任選地在所述靶向部分和所述mtdr之間的接頭；并且其中所述cqo包含至少一個(gè)猝滅劑和捕獲部分，所述捕獲部分被配置為與所述pto雜交。所述反應(yīng)混合物可以包含若干寡核苷酸引物對(duì)、若干pto以及單一cqo。所述反應(yīng)混合物可以包含被配置為與所述反應(yīng)混合物中的所有pto雜交的單一cqo。

計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)的方法

本發(fā)明的另一方面涉及一種用于鑒定至少一個(gè)靶序列的計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)的方法，所述方法包括以下步驟：1)提供關(guān)于pto、cqo、靶序列的信息，以及2)獲得來(lái)自至少一個(gè)解鏈的標(biāo)簽雙鏈體片段的信號(hào)，以及3)基于所述所提供的信息和所獲得的信號(hào)來(lái)鑒定至少一個(gè)靶序列。

實(shí)施例

實(shí)施例1熒光團(tuán)和cqo猝滅劑之間的距離

以下實(shí)施例顯示了包含特異于ipah基因的5種不同的標(biāo)記探針和taqman探針設(shè)計(jì)的pcr反應(yīng)的結(jié)果。所有反應(yīng)均用2種常用引物(dec229f和dec230r)進(jìn)行。設(shè)計(jì)標(biāo)記探針，使得fam被插置為離dec486p中的pto的雜交靶向部分中的猝滅劑位置最遠(yuǎn)，并且最接近dec490p中pto的雜交靶向部分中的猝滅劑位置。與單個(gè)cqo設(shè)計(jì)(dec481rp)結(jié)合地測(cè)試這五種不同的標(biāo)記探針設(shè)計(jì)。結(jié)果表明，通過(guò)增加fam與pto的雜交靶向部分中的猝滅劑位置之間的距離，背景解鏈曲線的生成減少。其還表明，優(yōu)選的pto設(shè)計(jì)(dec486p)僅在存在特異靶時(shí)產(chǎn)生pcr擴(kuò)增曲線，并且還僅在存在經(jīng)擴(kuò)增的靶時(shí)產(chǎn)生解鏈曲線信號(hào)。所包括的其他設(shè)計(jì)(dec487p至dec490p)都在ntc反應(yīng)中顯示出背景解鏈曲線，這指示假陽(yáng)性結(jié)果。taqman探針dec464被包括作為pcr反應(yīng)的陽(yáng)性對(duì)照。

表1：引物和探針序列(5'至3')：

z＝tina，bhq1＝黑洞猝滅劑1，bhq2＝黑洞猝滅劑2，bhq3＝黑洞猝滅劑3，(dt-fam)＝附接到t的內(nèi)部fam。(dt-bhq1)＝附接到t的內(nèi)部bhq1。(dt-bhq2)＝附接到t的內(nèi)部bhq2。

pcr反應(yīng)：

制備含有1倍ssoadvanced通用探針supermix(產(chǎn)品號(hào)172-5280，bio-rad)、200nm正向和反向引物、400nm標(biāo)記探針、800nm猝滅探針、靶的1:200稀釋液、0.25u的1u/μl尿嘧啶dna糖基化酶(產(chǎn)品號(hào)en0361，fermentas)的10μl反應(yīng)物。通過(guò)將單個(gè)大腸桿菌菌落在200μl水中混合并在95℃煮沸15分鐘來(lái)制備靶。隨后將25μl煮沸的靶加入到100μl無(wú)菌水中以作為靶母液，該靶母液在最終pcr反應(yīng)中稀釋5倍。將反應(yīng)物裝入abgenesuperplate96孔pcr板(編錄號(hào)ab2800)中并用光學(xué)透明、粘性的microsealb膜(bio-rad,目錄號(hào)msb1001)密封。

使pcr反應(yīng)混合物經(jīng)歷以下pcr循環(huán)和解鏈曲線程序(bio-radcfx96實(shí)時(shí)pcr檢測(cè)系統(tǒng))：

pcr程序：

實(shí)施例2多重pcr反應(yīng)

以下實(shí)施例顯示了包含特異于ipah基因、攜帶漸增的mtdr區(qū)長(zhǎng)度的3種不同pto(標(biāo)記探針)設(shè)計(jì)的pcr反應(yīng)的結(jié)果，其中dec500p具有最短的mtdr并且因此具有最低的tm，而dec503p具有最長(zhǎng)的mtdr并且因此具有最高的tm。所有反應(yīng)均用2種常用引物(dec229f和dec230r)進(jìn)行。與單個(gè)cqo(猝滅探針)設(shè)計(jì)(dec481rp)結(jié)合地測(cè)試這3種不同的標(biāo)記探針。這3種pto設(shè)計(jì)被單獨(dú)測(cè)試(圖9至圖14)、組合探針dec500p與dec502p測(cè)試(圖15至圖16)，以及組合探針dec500p和dec503p(圖17至圖18)測(cè)試。結(jié)果表明，每個(gè)pto單獨(dú)和組合時(shí)在pcr中都表現(xiàn)良好。具體地，結(jié)果進(jìn)一步表明，組合探針dec500p與dec502p提供了2個(gè)單獨(dú)可區(qū)分的解鏈曲線，表明兩個(gè)探針都檢測(cè)到了特異性信號(hào)。結(jié)果還表明，組合探針dec500p與dec503p也提供了2個(gè)單獨(dú)可區(qū)分的解鏈曲線，具有與dec500p和dec503p的mtdr之間的較大tm差異一致的甚至更寬的間隔曲線，同時(shí)仍表明兩個(gè)探針都檢測(cè)到了特異性信號(hào)。結(jié)果還顯示，所有探針都在ntc反應(yīng)中提供非常低的背景解鏈曲線，表明pto探針在不存在特異性靶的情況下不提供信號(hào)。

表2：引物和探針序列(5'至3')：

z＝tina，bhq1＝黑洞猝滅劑1，bhq2＝黑洞猝滅劑2，bhq3＝黑洞猝滅劑3，(dt-fam)＝附接到t的內(nèi)部fam。(dt-bhq1)＝附接到t的內(nèi)部bhq1。(dt-bhq2)＝附接到t的內(nèi)部bhq2。phos＝用于阻止延伸的磷酸基。

pcr反應(yīng)：

制備含有1倍gotaq探針qpcr主混合物(產(chǎn)品號(hào)promegaa6101)、200nm正向和反向引物、400nm標(biāo)記探針、800nm猝滅探針、靶的1:200稀釋液、0.25u的1u/μl尿嘧啶dna糖基化酶(產(chǎn)品號(hào)en0361，fermentas)的10μl反應(yīng)物。通過(guò)將攜帶有ipah基因的單個(gè)大腸桿菌菌落在200μl水中混合并在95℃煮沸15分鐘來(lái)制備靶。隨后將25μl煮沸的靶加入到100μl無(wú)菌水中以作為靶母液，該靶母液在最終pcr反應(yīng)中稀釋5倍。將反應(yīng)物裝入abgenesuperplate96孔pcr板(編錄號(hào)ab2800)中并用光學(xué)透明、粘性的microsealb膜(bio-rad,目錄號(hào)msb1001)密封。

使pcr反應(yīng)混合物經(jīng)歷以下pcr循環(huán)和解鏈曲線程序(bio-radcfx96實(shí)時(shí)pcr檢測(cè)系統(tǒng))：

pcr程序：

實(shí)施例3環(huán)狀探針的設(shè)計(jì)

以下實(shí)施例顯示了包含特異于ipah基因、攜帶環(huán)狀設(shè)計(jì)作為mtdr區(qū)的2種不同pto(標(biāo)記探針)設(shè)計(jì)的pcr反應(yīng)的結(jié)果，其中pto(標(biāo)記探針)的最后部分包含通過(guò)環(huán)區(qū)域與mtdr區(qū)間隔開(kāi)的靶向部分(猝滅探針部分)。所有反應(yīng)均用2種常用引物(dec229f和dec230r)進(jìn)行。這2種不同的pto(標(biāo)記探針)被單獨(dú)測(cè)試(rmd7p，圖19至圖20，和rmd8p，圖21至圖22)。結(jié)果表明，每個(gè)pto都在pcr中表現(xiàn)良好并且僅在特異性靶的存在下提供擴(kuò)增曲線。此外，結(jié)果表明，兩種探針都在正確靶的存在下提供解鏈曲線，但是在ntc中沒(méi)有靶。

表3：引物和探針序列(5'至3')：

z＝tina，bhq1＝黑洞猝滅劑1，bhq2＝黑洞猝滅劑2，bhq3＝黑洞猝滅劑3，(dt-fam)＝附接到t的內(nèi)部fam。(dt-bhq1)＝附接到t的內(nèi)部bhq1。(dt-bhq2)＝附接到t的內(nèi)部bhq2。phos＝用于阻止延伸的磷酸基。

pcr反應(yīng)：

制備含有1倍ssoadvanced通用探針supermix(產(chǎn)品號(hào)172-5280，bio-rad)、200nm正向和反向引物、400nm標(biāo)記探針、靶的1:200稀釋液、0.25u的1u/μl尿嘧啶dna糖基化酶(產(chǎn)品號(hào)en0361，fermentas)的10μl反應(yīng)物。通過(guò)將單個(gè)大腸桿菌菌落在200μl水中混合并在95℃煮沸15分鐘來(lái)制備靶。隨后將25μl煮沸的靶加入到100μl無(wú)菌水中以作為靶母液，該靶母液在最終pcr反應(yīng)中稀釋5倍。將反應(yīng)物裝入abgenesuperplate96孔pcr板(編錄號(hào)ab2800)中并用光學(xué)透明、粘性的microsealb膜(bio-rad,目錄號(hào)msb1001)密封。

使該pcr反應(yīng)混合物經(jīng)歷以下pcr循環(huán)和解鏈曲線程序(bio-radcfx96實(shí)時(shí)pcr檢測(cè)系統(tǒng))：

表4-pcr程序

pcr程序：

實(shí)施例4：測(cè)試不同的mtdr

在本實(shí)驗(yàn)中，我們測(cè)試了一些具有與先前實(shí)施例不同的序列的pto探針(rmd)和匹配的猝滅劑探針(cqo)，以闡明是否不同的序列可能不太有效地結(jié)合聚合酶。引物和探針靶與ipah探針相同。如同ipah探針測(cè)量所進(jìn)行的，測(cè)試正常的水解探針測(cè)定mvalidprime，其中樣品中還存在rmdpto探針和猝滅劑。我們想通過(guò)這個(gè)測(cè)試來(lái)評(píng)估此測(cè)定的qpcr反應(yīng)是否也會(huì)因有限的聚合酶接近而變得被抑制。

方法

qpcr

在lightcycler480儀器(roche)上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。用作rmd測(cè)定的模板(表5)和用于mvalidprime測(cè)定的gblocks是從idt訂購(gòu)的。主混合物是tataa探針grandmaster混合物。將taqdna聚合酶加入到該主混合物中以產(chǎn)生為主混合物中正常聚合酶濃度的1倍、2.5倍、5倍和10倍的聚合酶濃度，其中正常濃度定義為由制造商指示為進(jìn)行反應(yīng)的最佳濃度的濃度。用5個(gè)用于rmd測(cè)定的探針進(jìn)行qpcr測(cè)定(表6)。每個(gè)探針在10種不同的混合物中進(jìn)行測(cè)試，如表7所示。僅使用rmd體系制備一組五種混合物，具有四個(gè)不同濃度的聚合酶和一個(gè)ntc。制備一組另外五種混合物，它們不含ipah引物和模板，但存在用于小鼠validprime測(cè)定的引物、探針和模板。將試劑混合至表8所示的濃度。所有樣品都以一式兩份的方式運(yùn)行。溫度程序于表9中示出。在此，在程序的步驟2(60℃)和步驟3(95℃)中均測(cè)量熒光。熒光通常僅在60℃步驟中測(cè)量。由于探針可能與猝滅(cqo)探針雜交，并且熒光可能在60℃被猝滅，所以我們?cè)诖艘苍谒须p鏈dna被解鏈的95℃下進(jìn)行測(cè)量。

表5.gbiocks的序列。

帶顏色的密碼子：

正向引物

反向引物

探針靶

表6.探針和引物的序列

表7.混合方案。體積以μl計(jì)。

表8.試劑濃度

表9.用于探針qpcr運(yùn)行的溫度程序。

結(jié)果

cq值

計(jì)算rmd樣品(a至d)的cq值的一式兩份平均值。在圖23中將它們作為聚合酶濃度的函數(shù)繪制曲線圖。擴(kuò)增通常隨著聚合酶濃度的增加而增加。

圖24示出含有mvalidprime探針的樣品的cq值。樣品還含有多種rmd探針，但是由于樣品中沒(méi)有這些探針的引物或模板，所以只有mvalidprime靶被擴(kuò)增，并且熒光主要來(lái)自mvalidprime探針。擴(kuò)增通常隨著聚合酶濃度的增加而增加。

擴(kuò)增曲線

可以通過(guò)改變探針長(zhǎng)度和聚合酶濃度來(lái)調(diào)節(jié)擴(kuò)增曲線的幅度，如圖25所示。該圖示出了在95℃的變性步驟中在最后一個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中測(cè)得的熒光幅度。通常，在較高的聚合酶濃度下，所有探針都達(dá)到較高的幅度。

mvalidprime探針的幅度(圖26)在所測(cè)試聚合酶濃度范圍內(nèi)基本上穩(wěn)定。

解鏈溫度

所測(cè)得的rmd探針的解鏈溫度見(jiàn)圖27。僅觀察到了含有rmd模板、混合物a、b、c和d的樣品的解鏈曲線。解鏈溫度隨著探針長(zhǎng)度的增加而增加，并且它們隨著聚合酶濃度的增加而略有降低。

實(shí)施例5：靶濃度

以下實(shí)施例顯示了利用特異于ipah基因的探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸(pto)dec486p檢測(cè)的6種不同靶濃度的5倍稀釋曲線的pcr反應(yīng)的結(jié)果。用2種常用引物(dec229f和dec230r)進(jìn)行反應(yīng)。與單一捕獲和猝滅探針設(shè)計(jì)(dec481rp)結(jié)合地測(cè)試所述探測(cè)和標(biāo)記寡核苷酸。結(jié)果表明，所述探測(cè)和標(biāo)記探針通過(guò)提供對(duì)應(yīng)于靶稀釋度的擴(kuò)增曲線和解鏈曲線來(lái)起作用。如從ntc反應(yīng)可以看出，dec486p探針表現(xiàn)出極少的背景。

表10：引物和探針序列(5'至3')：

z＝tina，bhq1＝黑洞猝滅劑1，bhq2＝黑洞猝滅劑2，bhq3＝黑洞猝滅劑3，(dt-fam)＝附接到t的內(nèi)部熒光素標(biāo)記。fam＝熒光素。(dt-bhq1)＝附接到t的內(nèi)部bhq1。(dt-bhq2)＝附接到t的內(nèi)部bhq2。phos＝用于阻止延伸的磷酸基。

pcr反應(yīng)：制備含有1倍ssoadvanced通用探針supermix(產(chǎn)品號(hào)promegaa6101)、200nm正向和反向引物、400nm探測(cè)和標(biāo)記探針、800nm捕獲和猝滅探針、靶的1:200稀釋液、0.25u的1u/μl尿嘧啶dna糖基化酶(產(chǎn)品號(hào)en0361，fermentas)的10μl反應(yīng)物。通過(guò)將攜帶有ipah基因的單個(gè)大腸桿菌菌落在200μl水中混合并在95℃煮沸15分鐘來(lái)制備靶。隨后將25μl煮沸的靶加入到100μl無(wú)菌水中以作為靶母液，該靶母液在最終pcr反應(yīng)中稀釋5至15625倍。將反應(yīng)物裝入abgenesuperplate96孔pcr板(編錄號(hào)ab2800)中并用光學(xué)透明、粘性的microsealb膜(bio-rad,目錄號(hào)msb1001)密封。

使pcr反應(yīng)混合物經(jīng)歷以下pcr循環(huán)和解鏈曲線程序(bio-radcfx96實(shí)時(shí)pcr檢測(cè)系統(tǒng))：

表11

pcr程序：

參考文獻(xiàn)

kibbewa.′oligocalc：anonlineoligonucleotidepropertiescalculator′.(2007)

nucleicacidsres.35(webserverissue)：may25.

http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html

biotechniques38：569-575(april2005)

nucleicacidssympser(2008)52(1)：47-48.

序列表

<110>anapabiotecha/s

<120>多重pcr

<130>p3649pc00

<160>21

<170>patentin3.5版

<210>1

<211>20

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>tina（扭曲嵌入核酸）

<400>1

gtccatcaggcatcagaagg20

<210>2

<211>22

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>tina（扭曲嵌入核酸）

<400>2

ggtagacttctatctcatccac22

<210>3

<211>57

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>猝滅探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(50)..(50)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(54)..(54)

<223>bhq2=黑洞猝滅劑2

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(57)..(57)

<223>bhq3=黑洞猝滅劑3

<400>3

gatactagagtttcatagttcgtagtcaagatgatagattggaagtgcgtcagtcag57

<210>4

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>標(biāo)記探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(12)..(12)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(48)..(48)

<223>磷酸基團(tuán)

<400>4

aatgttccgcctcgaaattctggagtatatcgactgacgcacttccaa48

<210>5

<211>48

<212>dna<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>標(biāo)記探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(6)..(6)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(18)..(18)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(48)..(48)

<223>磷酸基團(tuán)

<400>5

aatgttccgcctcgaaattctggagtatatcgactgacgcacttccaa48

<210>6

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>標(biāo)記探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(18)..(18)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(48)..(48)

<223>磷酸基團(tuán)

<400>6

aatgttccgcctcgaaattctggagtatatcgactgacgcacttccaa48

<210>7

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>標(biāo)記探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(21)..(21)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(48)..(48)

<223>磷酸基團(tuán)

<400>7

aatgttccgcctcgaaattctggagtatatcgactgacgcacttccaa48

<210>8

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>標(biāo)記探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(26)..(26)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(48)..(48)

<223>磷酸基團(tuán)

<400>8

aatgttccgcctcgaaattctggagtatatcgactgacgcacttccaa48

<210>9

<211>25

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>taqman探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(25)..(25)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<400>9

aatgttccgcctcgaaattctggag25

<210>10

<211>48

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>標(biāo)記探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(12)..(12)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(48)..(48)

<223>磷酸基團(tuán)

<400>10

aatgttccgcctcgaaattctggagtatactgactgacgcacttccaa48

<210>11

<211>57

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>標(biāo)記探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(12)..(12)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(57)..(57)

<223>磷酸基團(tuán)

<400>11

aatgttccgcctcgaaattctggagtatactgactgacgcacttccaatctatcatc57

<210>12

<211>66

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>標(biāo)記探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(12)..(12)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(66)..(66)

<223>磷酸基團(tuán)

<400>12

aatgttccgcctcgaaattctggagtatactgactgacgcacttccaatctatcatcttg60

actacg66

<210>13

<211>59

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>標(biāo)記序列

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(12)..(12)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(59)..(59)

<223>磷酸基團(tuán)

<400>13

aatgttccgcctcgaaattctggagatatcgaacgcgaaaaaaaaaaaaaacgcgttcg59

<210>14

<211>49

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>標(biāo)記探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(12)..(12)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(47)..(47)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(49)..(49)

<223>磷酸基團(tuán)

<400>14

aatgttccgcctcgaaattctggagatatcgaacgcgaaaacgcgttcg49

<210>15

<211>360

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>rmd序列

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(360)

<223>rmd序列

<400>15

gaggaccgtgtcgcgctcacatggaacaatctccggaaaaccctcctggtccatcaggca60

tcagaaggccttttcgataatgataccggcgctctgctctccctgggcagggaaatgttc120

cgcctcgaaattctggaggacattgcccgggataaagtcagaactctccattttgtggat180

gagatagaagtctacctggccttccagaccatgctcgcagagaaacttcagctctctact240

gccgtgaaggaaatgcgtttctatggcgtgtcgggagtgacagcaaatgacctccgcact300

gccgaagccatggtcagaagccgtgaagagaatgaatttacggactggttctccctctgg360

<210>16

<211>57

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>猝滅探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(50)..(50)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(54)..(54)

<223>bhq2=黑洞猝滅劑2

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(57)..(57)

<223>bhq3=黑洞猝滅劑3

<400>16

gatactagagtttcatagttcgtagtcaagatgatagattggaagtgcgtcagtcag57

<210>17

<211>46

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(12)..(12)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(46)..(46)

<223>磷酸基團(tuán)

<400>17

aatgttccgcctcgaaattctggagtatacggccgattagatatag46

<210>18

<211>51

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(12)..(12)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(51)..(51)

<223>磷酸基團(tuán)

<400>18

aatgttccgcctcgaaattctggagtatacggccgattagatatagaatgg51

<210>19

<211>58

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(12)..(12)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(58)..(58)

<223>磷酸基團(tuán)

<400>19

aatgttccgcctcgaaattctggagtatacggccgattagatatagaatggatatcgc58

<210>20

<211>74

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(12)..(12)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(74)..(74)

<223>磷酸基團(tuán)

<400>20

aatgttccgcctcgaaattctggagtatacggccgattagatatagaatggatatcgcta60

tagatcttattcgg74

<210>21

<211>91

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>探針

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(1)..(1)

<223>bhq1=黑洞猝滅劑1

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(12)..(12)

<223>fam

<220>

<221>雜項(xiàng)特征

<222>(91)..(91)

<223>磷酸基團(tuán)

<400>21

aatgttccgcctcgaaattctggagtatacggccgattagatatagaatggatatcgcta60

tagatcttattcggttaagatagttgtaggc91