專利名稱：利用核酸色譜法的肺炎病原菌的檢出方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及肺炎病原菌的檢出方法、檢出試劑盒。更具體地說(shuō)，涉及以肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)、流感嗜血桿菌(Haemophilus influenzae)、肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)、肺炎嗜衣原體(Chlamydophilia pneumoniae)、嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)、肺炎克雷伯菌(Klebsiella pneumoniae)、銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa)、卡他莫拉菌(Moraxella catarrhalis)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA) (Staphylococcus aureus (MRSA))、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)作為檢出對(duì)象的肺炎病原菌的檢出方法、檢出試劑盒。
背景技術(shù)：
目前，肺炎在日本人的分原因死亡率中排第四位，作為癌癥等基礎(chǔ)疾病的并發(fā)癥也經(jīng)常發(fā)生，作為患病者數(shù)目非常多的疾病已知。以前，作為成為肺炎病因的微生物(病原菌)的探索試驗(yàn)而進(jìn)行的培養(yǎng)檢查至少需要幾天時(shí)間，若進(jìn)一步對(duì)所培養(yǎng)的病原菌進(jìn)行藥物敏感性試驗(yàn)則花費(fèi)近一周時(shí)間，所以并沒有成為充分有助于治療選擇的檢查方法。對(duì)于需要入住重癥監(jiān)護(hù)病室(ICU)的重癥肺炎來(lái)說(shuō)，迅速且正確地確定病原菌對(duì)于治療選擇是極其重要的，有報(bào)道指出適當(dāng)?shù)某跗谥委熆梢郧袑?shí)地提高肺炎患者的救命幾率。但是實(shí)際上由于替代培養(yǎng)法的病原菌鑒定技術(shù)依然沒有確立，所以現(xiàn)狀是，不得不在病原菌不明的狀態(tài)下進(jìn)行治療，不得不根據(jù)經(jīng)驗(yàn)治療使用抗生素，由此有可能會(huì)導(dǎo)致出現(xiàn)耐藥菌。對(duì)于成為肺炎病因的病原菌，發(fā)生頻率高的菌株占全體的近50%，包含病毒在內(nèi)的主要病原菌為2(Γ30種左右。其中也存在不能利用通常的方法來(lái)培養(yǎng)的病原菌，此外也存在難以通過培養(yǎng)來(lái)確定病原菌的情況。特別是對(duì)于需要根據(jù)菌株 菌量適當(dāng)選擇抗生素來(lái)進(jìn)行治療的肺炎來(lái)說(shuō)，同時(shí)檢出多種肺炎病原菌以及對(duì)檢出的信號(hào)進(jìn)行定量性的解析是非常重要的。此外，雖然最優(yōu)的治療藥根據(jù)病原菌的種類不同而不同，但是實(shí)際情況是，在醫(yī)療道德上不得不在確定病原菌之前開始治療。為了解決這些問題，有待于開發(fā)可以從多種菌株中迅速且定量性地檢出特定菌的方法。例如，提出了使用引物集來(lái)同時(shí)檢出4種的呼吸系統(tǒng)感染癥病原菌的方法(如參照專利文獻(xiàn)I)，所述引物集添加有分別來(lái)自編碼肺炎鏈球菌(Streptococcus pneumoniae)的自溶素(LytA)的LytA基因、編碼流感嗜血桿菌(Haemophilus influenza)的16SrRNA的基因、編碼化膿鏈球菌的16SrRNA的基因、編碼肺炎支原體(Mycoplasma pneumoniae)的16SrRNA的基因的引物,或進(jìn)一步添加有來(lái)自編碼嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)的16SrRNA的基因以及編碼嗜肺軍團(tuán)菌(Legionella pneumophila)的病原因子MIP蛋白的mip基因的引物。此外，提出了與呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的10種細(xì)菌特異性的引物集以及探針寡核苷 酸集(如參照專利文獻(xiàn)2和3)，其由下述構(gòu)成作為與呼吸系統(tǒng)疾病相關(guān)的10種細(xì)菌特異性的引物集的，以從含有細(xì)菌的試樣中分離得到的核酸作為模板，使含有第一寡核苷酸和第二寡核苷酸的百日咳桿菌、肺炎嗜衣原體、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎克雷伯菌、嗜肺軍團(tuán)菌、卡他莫拉菌、銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌中存在的靶序列特異性地?cái)U(kuò)增的引物集，和特異性地檢出上述菌中存在的靶核酸的探針。此外，提出了可以使選自含有10個(gè)以上的連續(xù)堿基片段的寡核苷酸中的5種以上的引起呼吸系統(tǒng)疾病的病毒的靶序列同時(shí)擴(kuò)增的核酸引物集，還提出了用于檢出麻疹病毒、腸病毒、鼻病毒、嚴(yán)重急性呼吸綜合癥相關(guān)的冠狀病毒(SARS-COV)、水痘一帶狀皰疫病毒(VZV)、腺病毒、人類副流感病毒I型(HPIVl)、人類副流感病毒2(HPIV2)、人副流感病毒
3(HPIV3)、流感病毒A(IVA)、流感病毒B(IVB)、呼吸道合胞病毒(RSVA)和呼吸道合胞病毒B (RSVB)中一種以上病毒的探針寡核苷酸,其含有選自含有10個(gè)以上的連續(xù)堿基片段的寡 核苷酸以及與其互補(bǔ)的寡核苷酸中的長(zhǎng)度為IObp IOObp的一種以上的寡核苷酸，記載了含有由試樣得到核酸的步驟、利用上述核酸引物集來(lái)使上述核酸擴(kuò)增的步驟、和檢出上述擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟的要點(diǎn)，記載了從試樣得到核酸的步驟含有從試樣分離RNA的步驟、從分離的RNA得到cDNA的步驟，得到cDNA的步驟例如利用逆轉(zhuǎn)錄酶進(jìn)行，利用逆轉(zhuǎn)錄酶的逆轉(zhuǎn)錄酶反應(yīng)可以使用RT-PCR，上述擴(kuò)增的步驟通過PCR進(jìn)行的要點(diǎn)(如參照專利文獻(xiàn)4)。另一方面，提出了諾如病毒的簡(jiǎn)易高靈敏度檢出法(如參照專利文獻(xiàn)5)，該方法為用于使試樣中微量存在的大致區(qū)分的諾如病毒的基因組的基因組I (G I)和基因組
II(G II)的基因特異性地?cái)U(kuò)增的方法，其特征在于，由包含下述步驟的步驟構(gòu)成由從試樣中抽提的RNA，利用在規(guī)定溫度下可以擴(kuò)增核酸的NASBA法，得到互補(bǔ)的單鏈核酸步驟，和對(duì)于利用該NASBA法得到的擴(kuò)增產(chǎn)物，利用在規(guī)定溫度下可以擴(kuò)增核酸的RT-LAMP法，進(jìn)一步擴(kuò)增核酸的步驟。本發(fā)明人提出了引物集(如參照專利文獻(xiàn)6)，其為用于多種肺炎病原菌的檢出的弓I物集，除了使用通常的PCR，還使用多重PCR、實(shí)時(shí)PCR、RT-PCR等，可以同時(shí)檢出肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體以及肺炎嗜衣原體，本發(fā)明人還提出了靶RNA的檢出·定量方法(如參照專利文獻(xiàn)7)，該方法含有由16SrRNA中的細(xì)菌特異性的RNA鏈，制備在相當(dāng)于靶RNA的特異性序列的DNA序列和標(biāo)簽序列的5’末端附加了 RNA聚合酶啟動(dòng)子序列的液相通用引物，本發(fā)明人還提出了病原微生物的檢出方法(如參照專利文獻(xiàn)8)，其中，為從選自金黃色葡萄球菌(Staphylococcus)屬細(xì)菌、鏈球菌(Streptococcus)屬細(xì)菌、克雷伯菌(Klebsiella)屬細(xì)菌、埃希氏菌(Escherichia)屬細(xì)菌、分枝桿菌(Mycobacterium)屬細(xì)菌、軍團(tuán)菌(Legionella)屬細(xì)菌、弧菌(Vibrio)屬細(xì)菌、芽孢桿菌(Bacillus)屬細(xì)菌、奈瑟氏菌(Neisseria)屬細(xì)菌、彎曲桿菌(Campylobacter)屬細(xì)菌、衣原體(Chlamydia)屬菌、嗜衣體(Chlamydophila)屬菌、支原體(Mycoplasma)屬菌、李斯特氏菌(Listeria)屬細(xì)菌、沙門氏菌(Salmonella)屬細(xì)菌以及耶爾森氏菌(Yersinia)屬細(xì)菌中的I種或2種以上的細(xì)菌中選擇的2種以上，具有使用具有標(biāo)簽序列和對(duì)上述病原微生物保持的DnaJ基因上的靶核酸選擇性退火而得到的堿基序列的至少I種的第I引物集，和具有與上述標(biāo)簽序列實(shí)質(zhì)上相同的標(biāo)簽序列的至少I種的第2引物集，實(shí)施聚合酶鏈反應(yīng)的聚合酶鏈反應(yīng)步驟，和檢出含有上述靶核酸的擴(kuò)增產(chǎn)物的步驟。此外，已經(jīng)開發(fā)了下述核酸的檢出或者定量方法，該方法為用于特異性地檢出或者定量試樣中的靶核酸的方法，含有由試樣中任意抽提的靶核酸，使用未結(jié)合半抗原或者肽的引物，作為單鏈核酸進(jìn)行擴(kuò)增的步驟，與將該擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合于膜的與擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的第I寡核苷酸探針以及用著色高分子載體標(biāo)記的互補(bǔ)的第2寡核苷酸探針進(jìn)行雜交而檢出的步驟，和通過目視判定對(duì)該檢出圖像進(jìn)行評(píng)價(jià)的步驟，例如確立了以從耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)的培養(yǎng)菌株中抽提的全RNA作為模板進(jìn)行NASBA擴(kuò)增反應(yīng)，通過核酸色譜條檢出擴(kuò)增產(chǎn)物的方法(如參照專利文獻(xiàn)9)。雖然報(bào)道了組合NASBA法和核酸色譜法，用于檢出諾如病毒基因的2種基因類型的試劑(X 7卜夕一>諾如病毒G I / G II “力4 7 >”)，但是上述試劑大致區(qū)分并判定遺傳性多樣的15種以上的基因型所屬G I類型和18種以上基因型所屬G II類型，不具有用于鑒定肺炎病原菌的精度。現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)專利文獻(xiàn)I :日本特開2005-110545號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)2 :日本特開2006-174837號(hào)公報(bào)
專利文獻(xiàn)3 :日本專利第4235645號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)4 :日本特開2006-180878號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)5 :日本特開2009-240207號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)6 日本特開2009-39046號(hào)公報(bào)專利文獻(xiàn)7 :國(guó)際公開2009/057330號(hào)小冊(cè)子專利文獻(xiàn)8 :國(guó)際公開2008/041354號(hào)小冊(cè)子專利文獻(xiàn)9 日本專利4268944號(hào)公報(bào)

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是，提供在診斷肺炎患者時(shí)，迅速且正確地檢出肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、金黃色葡萄球菌(這些單獨(dú)的細(xì)菌以下有時(shí)稱為“檢出對(duì)象肺炎菌”、或簡(jiǎn)稱為“肺炎菌”、總稱為“10種檢出對(duì)象肺炎菌”)的方法、用于此的檢出試劑盒。本發(fā)明人為了實(shí)現(xiàn)臨床上的實(shí)用化，對(duì)于進(jìn)一步提高肺炎病原菌檢出精度的方法進(jìn)行研究，以DnaJ基因具有16SrRNA序列的約10倍的基因多態(tài)性的發(fā)現(xiàn)為基礎(chǔ)，以DnaJ區(qū)域?yàn)橹鳎愿鞣N肺炎菌特異性的基因區(qū)域?yàn)橹行?，設(shè)計(jì)對(duì)于10種各肺炎病原菌的DnaJ基因等中含有的10種檢出對(duì)象肺炎菌的各靶區(qū)域的引物對(duì)集，發(fā)現(xiàn)使用該引物對(duì)集，通過NASBA法擴(kuò)增基因產(chǎn)物，定性·定量作為擴(kuò)增產(chǎn)物的靶核酸，可以高精度地檢出多種肺炎病原菌。進(jìn)一步設(shè)計(jì)將該擴(kuò)增產(chǎn)物雜交到與引物對(duì)集不同的10種檢出對(duì)象肺炎菌的各靶區(qū)域內(nèi)的序列而得到的各種肺炎菌固有的探針對(duì)集，發(fā)現(xiàn)通過使用上述探針對(duì)集進(jìn)行核酸色譜法，用一次操作就可以高精度地檢出多種甚至10種的檢出對(duì)象肺炎菌，從而完成了本發(fā)明。S卩，本發(fā)明涉及(1) 一種檢出方法，該檢出方法為以選自肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、金黃色葡萄球菌中的至少3種肺炎菌類作為檢出對(duì)象的肺炎病原菌的檢出方法，其特征在于，該檢出方法具有I)由從試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸，利用引物，作為單鏈核酸擴(kuò)增的步驟(a)，2)制備選自與擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的核苷酸序列中的、因各肺炎菌而不同的至少3種探針對(duì)的步驟(b)，3)使至少3種各肺炎菌的第I探針結(jié)合到標(biāo)記高分子載體上，制備第I探針結(jié)合標(biāo)記高分子載體的步驟(C)，4)制備使與第I探針成對(duì)的至少3種各肺炎菌的第2探針在各肺炎菌可以識(shí)別的規(guī)定位置固相化而成的第2探針負(fù)載展開支持體的步驟(d)，5)將上述擴(kuò)增產(chǎn)物雜交到負(fù)載在展開支持體上的第2探針以及結(jié)合在標(biāo)記高分子載體上的第I探針而進(jìn)行檢出的步驟(e)，6)通過判定檢出圖像來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)的步驟(f)的各步驟；(2)根據(jù)上述⑴記載的檢出方法，其特征在于，引物為選自由序列號(hào)21表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)31表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)22表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)32表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)23表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)33表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)24表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)34表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)25表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)35表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)26表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列 號(hào)36表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)27表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)37表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)28表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)38表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)29表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)39表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)30表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)40表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3種引物對(duì)；(3)根據(jù)上述(I)或者(2)記載的檢出方法，其中，至少3種的各肺炎菌的第I探針由選自序列號(hào)I 10表示的核苷酸序列中的至少3種DNA構(gòu)成，與第I探針成對(duì)的至少3種的各肺炎菌的第2探針為選自序列號(hào)11 20表不的核苷酸序列中的至少3種DNA。此外，本發(fā)明涉及(4) 一種試劑盒，該試劑盒為以選自肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、金黃色葡萄球菌中的至少3種肺炎菌類作為檢出對(duì)象的肺炎病原菌的檢出試劑盒，其特征在于，該試劑盒具有選自可以擴(kuò)增由試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸的、由序列號(hào)21表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)31表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)22表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)32表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)23表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)33表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)24表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)34表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)25表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)35表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)26表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)36表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)27表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)37表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)28表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)38表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)29表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)39表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)30表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)40表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3種引物對(duì)；(5)根據(jù)上述(4)記載的試劑盒，其特征在于，該試劑盒進(jìn)一步具有I)選自與擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的核苷酸序列中的、因各肺炎菌而不同的至少3種各肺炎菌的第I探針結(jié)合在標(biāo)記高分子載體而成的第I探針結(jié)合標(biāo)記高分子載體，2)與第I探針成對(duì)的至少3種各肺炎菌的第2探針在各肺炎菌可以識(shí)別的規(guī)定位置固相化而成的第2探針負(fù)載展開支持體；(6)根據(jù)上述(5)記載的試劑盒，其特征在于，至少3種的各肺炎菌的第I探針由選自序列號(hào)I 10表示的核苷酸序列中的至少3種DNA構(gòu)成，與第I探針成對(duì)的至少3種的各肺炎菌的第2探針為選自序列號(hào)11 20表不的核苷酸序列中的至少3種DNA。
通過本發(fā)明，在診斷肺炎患者時(shí)，可以利用簡(jiǎn)便的方法迅速且正確地鑒定肺炎病原菌。


圖I為表示以8株卡他莫拉菌為對(duì)象，利用引物對(duì)的驗(yàn)證數(shù)據(jù)的圖。圖2為表示利用本發(fā)明中所用的肺炎菌特異性的引物對(duì)，肺炎鏈球菌的利用NASBA法擴(kuò)增靶基因的RNA的數(shù)據(jù)的圖。圖3為表示利用本發(fā)明中所用的肺炎菌特異性的引物，嗜肺軍團(tuán)菌的利用NASBA法擴(kuò)增靶基因的RNA的數(shù)據(jù)的圖。圖4為表示利用本發(fā)明中所用的肺炎菌特異性的引物對(duì)，肺炎克雷伯菌的利用NASBA法擴(kuò)增靶基因的RNA的數(shù)據(jù)的圖。圖5為表示利用本發(fā)明中所用的肺炎菌特異性的引物對(duì)，卡他莫拉菌的利用NASBA法擴(kuò)增靶基因的RNA的數(shù)據(jù)的圖。圖6為表示利用本發(fā)明中所用的肺炎菌特異性的引物對(duì)，金黃色葡萄球菌的利用NASBA法擴(kuò)增靶基因的RNA的數(shù)據(jù)的圖。圖7為表示利用本發(fā)明中所用的肺炎菌特異性的引物對(duì)，肺炎支原體的利用NASBA法擴(kuò)增靶基因的RNA的數(shù)據(jù)的圖。圖8為表示利用本發(fā)明中所用的肺炎菌特異性的引物對(duì)，肺炎嗜衣原體的利用NASBA法擴(kuò)增靶基因的RNA的數(shù)據(jù)的圖。圖9為表示實(shí)施本發(fā)明所用的10對(duì)引物的多重化時(shí)，各引物對(duì)與靶菌以外的對(duì)象菌有無(wú)非特異性反應(yīng)的驗(yàn)證結(jié)果的圖。圖10為表示對(duì)于嗜肺軍團(tuán)菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA、流感嗜血桿菌，通過使用多重引物的NASBA法檢出靶RNA擴(kuò)增產(chǎn)物的圖。圖11為表示對(duì)于金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體，使用對(duì)應(yīng)于各菌的引物對(duì)，通過使用多重引物的NASBA法進(jìn)行RNA擴(kuò)增時(shí)，檢出靶RNA擴(kuò)增產(chǎn)物的圖。圖12為表示對(duì)于卡他莫拉菌，通過實(shí)時(shí)PCR確認(rèn)利用NASBA擴(kuò)增的RNA為目的的靶NASBA產(chǎn)物的圖。圖13為表示本發(fā)明的核酸色譜法的一個(gè)具體例子的示意圖。圖14為表示對(duì)各肺炎菌專用探針間的非特異結(jié)合進(jìn)行研究的圖。圖15為表示對(duì)于嗜肺軍團(tuán)菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體，使用對(duì)應(yīng)于各菌的引物對(duì)，分別利用NASBA法進(jìn)行RNA擴(kuò)增時(shí)，通過核酸色譜檢出靶RNA擴(kuò)增產(chǎn)物的圖。圖16為表示各探針與靶菌以外的對(duì)象菌有無(wú)非特異性反應(yīng)的驗(yàn)證結(jié)果的圖。
圖17為表示對(duì)于嗜肺軍團(tuán)菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體，使用對(duì)應(yīng)于各菌的引物對(duì)，通過使用多重引物的NASBA法進(jìn)行RNA擴(kuò)增時(shí)，通過核酸色譜檢出靶RNA擴(kuò)增產(chǎn)物的圖。圖18為將肺炎病原菌5菌株用于本發(fā)明的核酸色譜測(cè)定用試驗(yàn)片的圖。
具體實(shí)施例方式作為本發(fā)明的檢出肺炎病原菌的方法，若為具有I)由從試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸，利用引物，作為單鏈核酸擴(kuò)增的步驟(a)，2)制備選自與擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的序列號(hào)I 20表示的核苷酸序列中的、因各肺炎菌而不同的至少3種探針對(duì)的步驟(b)，3)使選自序列號(hào)I 10表示的核苷酸序列中的至少3種各肺炎菌的第I探針結(jié)合到標(biāo)記高分子載體上，制備第I探針結(jié)合標(biāo)記高分子載體的步驟(c)，4)制備使選自序列號(hào)11 20表示的核苷酸序列中的、與第I探針成對(duì)的至少3種各肺炎菌的第2探針在各肺炎菌可以識(shí)別的規(guī)定位置固相化而成的負(fù)載固相化第2探針的展開支持體的步驟(d)，5)將上述擴(kuò)增產(chǎn)物雜交到負(fù)載在展開支持體上的固相化第2探針以及結(jié)合在標(biāo)記高分子載體上的第I探針而檢出的步驟(e)，6)通過判定檢出圖像來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)的步驟(f)的，以選自10種檢出對(duì)象肺炎菌中的至少3種檢出對(duì)象肺炎菌作為檢出對(duì)象的方法，則不特別限定，但是作為檢出對(duì)象肺炎菌，優(yōu)選檢出至少5種，即5 10種。作為本發(fā)明的檢出肺炎病原菌的方法，也可以使用具有1)制備選自可以擴(kuò)增由試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸的由序列號(hào)21表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)31表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)22表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)32表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)23表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)33表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)24表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)34表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)25表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)35表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)26表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)36表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)27表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)37表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)28表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)38表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)29表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)39表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)30表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)40表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3種引物對(duì)的步驟(a’)，2)使有可能含有檢出對(duì)象的肺炎菌類的核酸的被檢試樣與至少3種嵌合引物對(duì)接觸，利用RNA擴(kuò)增法擴(kuò)增基因產(chǎn)物的步驟(b’)，3)定性·定量作為擴(kuò)展產(chǎn)物的靶核酸的步驟(c’ )的，以選自10種檢出對(duì)象肺炎病原菌中的至少3種檢出對(duì)象肺炎病原菌作為檢出對(duì)象的方法。該方法中，作為檢出對(duì)象肺炎菌，優(yōu)選檢出至少5種，即5 10種。上述檢出對(duì)象肺炎菌為3種時(shí)，可以舉出由下述構(gòu)成的120組的3種肺炎菌類的組合多在外來(lái)患者中檢出的肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)菌以及肺炎嗜衣原體(以下也稱為“外來(lái)患者用檢出對(duì)象肺炎菌”)中，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌以及肺炎支原體，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌以及嗜肺軍團(tuán)菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌以及肺炎嗜衣原體等3種組合，由于醫(yī)院內(nèi)感染多在住院患者中檢出的銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、MRSA、卡他莫拉菌(以下也稱為“住院患者用檢出對(duì)象肺炎菌”)中，銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌以及金黃色葡萄球菌，肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌以及MRSA，銅綠假單胞菌、MRSA以及卡他莫拉菌，金黃色葡萄球菌、MRSA以及卡他莫拉菌 等3種組合，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌以及MRSA，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌以及銅綠假單胞菌等3種組合等。上述檢出對(duì)象肺炎菌為4種時(shí)，可以舉出由下述構(gòu)成的210組的4種肺炎菌類的組合在外來(lái)患者用檢出對(duì)象肺炎菌中，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體以及嗜肺軍團(tuán)菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體以及肺炎嗜衣原體，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、嗜肺軍團(tuán)菌以及肺炎嗜衣原體，肺炎鏈球菌、肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)菌以及肺炎嗜衣原體，流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)菌以及肺炎嗜衣原體等4種組合，在住院患者用檢出對(duì)象肺炎菌中，銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌以及MRSA，銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA以及卡他莫拉菌，銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、MRSA以及卡他莫拉菌等4種組合，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體以及MRSA，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌以及MRSA等4種組合等。上述檢出對(duì)象肺炎菌為5種時(shí)，可以舉出除了外來(lái)患者用檢出對(duì)象肺炎菌5種、住院患者用檢出對(duì)象肺炎菌5種之外，還有由下述構(gòu)成的252組的5種肺炎菌類的組合肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)菌以及MRSA，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體以及MRSA，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、MRSA以及金黃色葡萄球菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、銅綠假單胞菌以及肺炎嗜衣原體，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、MRSA以及卡他莫拉菌等。上述檢出對(duì)象肺炎菌為6種時(shí)，可以舉出由下述構(gòu)成的210組的6種肺炎菌類的組合外來(lái)患者用檢出對(duì)象肺炎菌以及MRSA，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)菌、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎嗜衣原體以及銅綠假單胞菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)菌、銅綠假單胞菌以及MRSA，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、銅綠假單胞菌以及MRSA，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌等。上述檢出對(duì)象肺炎菌為7種時(shí)，可以舉出由下述構(gòu)成的120組的7種肺炎菌類的組合外來(lái)患者用檢出對(duì)象肺炎菌、MRSA以及金黃色葡萄球菌，外來(lái)患者用檢出對(duì)象肺炎菌、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)菌、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、銅綠假單胞菌、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌等。 上述檢出對(duì)象肺炎菌為8種時(shí)，可以舉出由下述構(gòu)成的90組的8種肺炎菌類的組合外來(lái)患者用檢出對(duì)象肺炎菌、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，外來(lái)患者用檢出對(duì)象肺炎菌、銅綠假單胞菌、MRSA以及金黃色葡萄球菌，外來(lái)患者用檢出對(duì)象肺炎菌、銅綠假單胞菌、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)菌、銅綠假單胞菌、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、銅綠假單胞菌、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌等。上述檢出對(duì)象肺炎菌為9種時(shí)，可以舉出由下述構(gòu)成的10組的9種肺炎菌類的組合外來(lái)患者用檢出對(duì)象肺炎菌、MRSA、金黃色葡萄球菌、卡他莫拉菌以及肺炎克雷伯菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)菌、銅綠假單胞菌、肺炎克雷伯菌、金黃色葡萄球菌、MRSA以及卡他莫拉菌，肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、嗜肺軍團(tuán)菌、銅綠假單胞菌、MRSA、金黃色葡萄球菌以及卡他莫拉菌等。作為上述步驟(a)中的制備擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，若為將從有可能含有檢出對(duì)象肺炎菌的試樣中任意抽提的上述各檢出對(duì)象肺炎菌特異性靶核酸，利用可以擴(kuò)增該靶核酸的引物，作為單鏈核酸進(jìn)行擴(kuò)增的方法則不特別限定。作為上述各肺炎菌特異性的靶核酸，可以舉出肺炎鏈球菌的lytA、流感嗜血桿菌的dnaj、肺炎支原體的dnajl、肺炎嗜衣原體的dnaj、金黃色葡萄球菌的spaA、MRSA的mecA、嗜肺軍團(tuán)菌的dnaj、卡他莫拉菌的dnaj、銅綠假單胞菌的dnaj、肺炎克雷伯菌的dnaj中所含區(qū)域的核酸。上述步驟(a)或者(a’)中所用引物對(duì)是可以擴(kuò)增10種檢出對(duì)象肺炎菌中的各肺炎菌特異性的靶核酸的引物對(duì)，是含有選自序列號(hào)21 40表示的核苷酸序列中的因各檢出對(duì)象肺炎菌而不同的靶序列的引物對(duì)。更具體的說(shuō)，對(duì)于肺炎鏈球菌來(lái)說(shuō)，使用含有5’-CAATCTAGCAGATGAAGCAGG-3，(序列號(hào) 21)和 5’ -GGTTGTTTGGTTGGTTATTCG-3，(序列號(hào)31)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構(gòu)成的引物對(duì)的組合，對(duì)于流感嗜血桿菌來(lái)說(shuō)，使用含有5’ -TCAATACTCTTGCACATTGTGAT-3’ (序列號(hào)22)和5，-ATACGAAGAAACCTTGCTGAC-3’(序列號(hào)32)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構(gòu)成的引物對(duì)的組合，對(duì)于肺炎支原體來(lái)說(shuō)，使用含有5’ -CCGGGATGGTTAGCTGTAACAG-3’(序列號(hào) 2 和 5’ -TACCTTCTTGTACTTACTTCC-3 ’ (序列號(hào)33)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構(gòu)成的引物對(duì)的組合，對(duì)于肺炎嗜衣原體來(lái)說(shuō)，使用含有5’ -CATGGTGTTGAGAAGGAACTTGTAGT-3’ (序列號(hào)24)和5，-TCCACGACTCTGTACCACTTG-3’(序列號(hào)34)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構(gòu)成的引物對(duì)的組合，對(duì)于嗜肺軍團(tuán)菌來(lái)說(shuō)，使用含有5’ -CGTCAATCACGTGGACAAAGAG-3’(序列號(hào) 25)和 5’ -AGTACCATGTCTTGGAACGGT-3 ’ (序列號(hào)35)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構(gòu)成的引物對(duì)的組合，對(duì)于克雷伯菌來(lái)說(shuō)，使用含有5’ -GAAGTTCCGATCAACTTCAC-3’(序列號(hào)26)和5’ -AAGCTCTCCTGAAGCTCTTT-3’(序列號(hào)36)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構(gòu)成的引物對(duì)的組合，對(duì)于銅綠假單胞菌來(lái)說(shuō)，使用含有 5’ -ACAGGGATCGGAAATCAT-3’(序列號(hào) 27)和 5’ -CGCGGACCTGCGCTACACCCTGGACC-3 ’(序列號(hào)37)表不的祀核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構(gòu)成的引物對(duì)的組合，對(duì)于卡他莫拉菌來(lái)說(shuō)，使用含有5’ -CAAAGGCTTGCCCAAAGATA-3’ (序列號(hào)28)和5’ -GAAGCCGAAGAAAAGCTCAA-3’(序列號(hào)38)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構(gòu)成的引物對(duì)的組合，對(duì)于MRSA來(lái)說(shuō)，使用含有 5’ -GTATGTGGAAGTTAGATTGGG-3’(序列號(hào) 29)和 5’ -GATACATTCTTTGGAACGAT-3 ’ (序列號(hào)39)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構(gòu)成的引物對(duì)的組合，對(duì)于金黃色葡萄球菌來(lái)說(shuō)，使用含有5’ -GAGTACATGTCGTTAAACCTGGTG-3 ’(序列號(hào)30)和5’-TACAGTTGTACCGATGAATGG-3’(序列號(hào)40)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構(gòu)成的引物對(duì)的組合。此外，取代上述序列，對(duì)于肺炎克雷伯菌來(lái)說(shuō)，也可以使用含有 5’ -AGCGTATGAAATCCTGACTGAT-3’ (序列號(hào) 54)和 5’ -CAAAGATATCGCTGAAGTCG-3 ’ (序列號(hào)56)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構(gòu)成的引物對(duì)的組合，對(duì)于銅綠假單胞菌來(lái)說(shuō)，也可以使用含有5’ -GCGAGGTGTCGCTCTGCAAC-3’ (序列號(hào)55)和5’-GATGTGCAAGGTGGTGGTGGA-3’(序列號(hào)57)表示的靶核苷酸序列的由正向引物和反向(嵌合)引物構(gòu)成的弓I物對(duì)的組合。作為上述正向引物，使用由序列號(hào)21 30、54或55表不的核苷酸序列構(gòu)成的引物。對(duì)于這些因各檢出對(duì)象肺炎菌而不同的10種各靶序列的5’末端側(cè)可以附加標(biāo)簽序列。作為上述標(biāo)簽序列，可以舉出5’-TAGCAGGATCCCTCTAAG-3’ (序列號(hào)41)。作為上述反向引物，使用由序列號(hào)40、56或57表示的核苷酸序列以及附加于這些因各檢出對(duì)象肺炎菌而不同的10種各靶序列的5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的引物。作為上述RNA聚合酶啟動(dòng)子序列，可以舉出T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列、T3RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列、SP6RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列等，但是其中T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列由于高的RNA擴(kuò)增效率而優(yōu)選。作為T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列，可以舉出例如5’ -AATTCTAATACGACTCACTATAGGGAG-3’ (序列號(hào) 42)、5’ -CTAATACGACTCACTATAGGGAG-3’ (序列號(hào) 43)。上述序列號(hào) 21 40 或者54^57表示的核苷酸序列中，即使I個(gè)堿基或者幾個(gè)(例如Γ5個(gè)，優(yōu)選Γ3個(gè)，更優(yōu)選f 2個(gè)，進(jìn)ー步優(yōu)選I個(gè))堿基缺失、置換或者附加，只要可以擴(kuò)增各肺炎菌特異性的靶核酸，則也可以用作本發(fā)明中的引物。上述正向引物、反向引物，可以使用DNA合成裝置通過常規(guī)方法合成。作為上述步驟(a)或者(b’ )中的有可能含有檢出對(duì)象的肺炎菌類的核酸的被檢試樣，可以舉出肺炎患者的唾液、咳痰、外周血、支氣管肺泡洗滌液、鼻腔洗滌液、漱ロ液、鼻咽拭子以及它們中含有的微生物、上述微生物培養(yǎng)物的細(xì)胞溶解液等。作為用于從上述被檢試樣抽提核酸的方法，除了使用硫氰酸胍的RNA抽提法、使用EDTA-SDS-苯酚-こ醇的核酸抽提法等公知的方法之外，還可以使用Extragen II (東ソー社制)、Mora-Extract (Advanced Microorganism Research 公司制)等市售品?？梢詫⒊樘岬?RNA、DNA適當(dāng)進(jìn)行斷裂處理，制備含有I個(gè)或者多個(gè)的靶RNAJE DNA的5’側(cè)序列和3’側(cè)靶特異性序列的RNA、DNA。靶核酸為靶RNA時(shí)，為了擴(kuò)增上述步驟(a)或者(b’ )中所用的靶核酸，可以使用NASBA法、轉(zhuǎn)錄介導(dǎo)擴(kuò)增法(TMA法)、利用轉(zhuǎn)錄酶和逆轉(zhuǎn)錄酶的協(xié)同反應(yīng)的RNA擴(kuò)增 檢出法(Transcription Reverse Transcription Concerted Reaction, TRC 法)等公知的 RNA擴(kuò)增法，但是可以有利地利用NASBA法、特別是國(guó)際公開2009/057330號(hào)小冊(cè)子中記載的NASBA法。該NASBA法是通過RNA聚合酶、逆轉(zhuǎn)錄酶擴(kuò)增試樣中的靶RNA的方法，例如國(guó)際公開2009/057330號(hào)小冊(cè)子中記載的NASBA法中公開了由下述步驟構(gòu)成的方法(A)將含有相當(dāng)于靶RNA的5’側(cè)靶特異性序列的DNA序列的序列號(hào)f 10表示的嵌合引物的5’末 端固定于基板表面上，制備固相DNA( + )引物的步驟；(B)制備在含有與靶RNA的3’側(cè)序列互補(bǔ)的cDNA序列的引物的5’末端側(cè)附加了 T7RNA聚合酶啟動(dòng)子序列的、序列號(hào)If 20表示的液相cDNA(-)引物的步驟；(B’)根據(jù)需要，制備在標(biāo)簽序列的5’末端附加了 RNA聚合酶啟動(dòng)子序列的液相通用引物的步驟；(C)制備含有靶RNA的3’側(cè)序列和5’側(cè)靶特異性序列的試樣RNA的步驟；(D)使步驟(B)中制備的液相cDNA(-)引物與步驟(C)中制備的試樣RNA鏈在液相中接觸，使液相cDNA (-)引物與試樣RNA雜交，然后通過逆轉(zhuǎn)錄酶延伸DNA㈠鏈，制備cDNA鏈-RNA鏈復(fù)合體的步驟；(E)使特異性分解DNA鏈-RNA鏈復(fù)合體中的RNA鏈的RNA分解酶作用于步驟⑶中制備的cDNA鏈-RNA鏈復(fù)合體，制備單鏈DNA (-)的步驟；(F)使步驟(E)中制備的單鏈DNA(-)與步驟(A)中制備的固相DNA(+)引物在液相中接觸，使單鏈DNA (-)與固相DNA⑴引物雜交，然后通過具有DNA依賴性DNA聚合酶活性能的酶延伸DNA⑴鏈，制備雙鏈DNA的步驟；(G)使RNA聚合酶作用于步驟(F)中制備的雙鏈DNA，利用來(lái)自DNA(-)鏈的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列，擴(kuò)增單鏈RNA(-)的步驟。靶核酸為靶DNA時(shí)，為了擴(kuò)增上述步驟(a)或者(b’ )中所用靶核酸，可以使用NASBA法、PCR法、鏈置換擴(kuò)增法(SDA法)、連接酶鏈反應(yīng)法(LCR法)等。作為正向引物，使用選自序列號(hào)21 30、54或55表不的核苷酸序列中的引物,作為反向引物,使用含有序列號(hào)31 40、56或57表不的核苷酸序列的引物。上述步驟(b)中使用的探針對(duì)，為選自與上述擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的核苷酸序列中的因各肺炎菌而不同的探針對(duì)，例如為選自序列號(hào)廣20表示的核苷酸序列中的因各肺炎菌而不同的探針對(duì)，序列表中為了方便以DNA序列表示，但是可以為由DNA的核苷酸序列構(gòu)成的探針對(duì)，或由RNA的核苷酸序列構(gòu)成的探針。但是由于作為探針的穩(wěn)定性優(yōu)異，優(yōu)選為由DNA的核苷酸序列構(gòu)成的探針對(duì)。作為成為上述檢出對(duì)象的因各肺炎菌而不同的探針對(duì)，可以具體地表示為肺炎鏈球菌的 5’ -ACGCACGAGTATTGCACGAATAACC-3’(序列號(hào) I)和 5’ -TGCCGAAAACGCTTGATACAGGGAGT-3’(序列號(hào) 11),流感嗜血桿菌的 5’ -AAACTTGTCCGCATTGCCACGGTTC-3’(序列號(hào) 2)和5’ -CTCTGGGGCTGAAAAAGGTTCTAAAG-3’ (序列號(hào) 12)，肺炎支原體的 5’ -AGGCCAAACACAAGTGTAAGACTTG-3’ (序列號(hào) 3)和 5’ -AGAATCAACGCTCCATCTTTGGTAC-3 ’ (序列號(hào) 13)，肺炎嗜衣原體的 5’ -ATCTTGTGAAACCTGTTCTGGTCAA-3’ (序列號(hào) 4)和 5’ -TCAAGGGATTAAATCCTGCGAACGT-3’ (序列號(hào) 14)，嗜肺軍團(tuán)菌的 5’ -GAAGTTGAAATTACCGTTCCAAGAC-3’ (序列號(hào) 5)和 5’-CAATTGACCCTTGAAGAAGCAGCTA-3’ (序列號(hào) 15)，肺炎克雷伯菌的 5’-GTGGTGGAGACGCCGGTGGGGCTGA-3’ (序列號(hào) 6)和 5 ’ -TGAAACCCAGACCGGCAAGCTGTTC-3 ’ (序列號(hào) 16)，銅綠假單胞菌的 5’ -GGTGACCGGTGTGGTGCCGG-3’ (序列號(hào) 7)和 5’ -GTCTTGCAACCGACCAGGGTCGGCA-3’ (序列號(hào) 17)，卡他莫拉菌的 5’ -GGTTGCGCGTTTTTCAGGATCACTG-3’ (序列號(hào) 8)和 5’ -CCACCAGAGCCCATGCCTTGTTCAT-3’ (序列號(hào) I8) ,MRSA 的 5’ -AGACCGAAACAATGTGGAATTGGC-3’ (序列號(hào)9)和 5’ -ATGCAGAAAGACCAAAGCATACATAT-3’ (序列號(hào) 19)，以及金黃色葡萄球菌的 5’ -CATGATCAAACCTGGTCAAGAACTTG-3’(序列號(hào) 10)和 5’-CGGCACTACTGCTGACAAAATTGCT-3’(序列號(hào)20)的組合。此外，作為探針對(duì)，也可以使用流感嗜血桿菌的5’-AACTTGTCCGCATTGCCACGGTTCT-3’ (序列號(hào) 44)和 5’ -TGTGATAGCTGTGGTGGCTCTGGGG-3’ (序列號(hào) 49)，肺炎嗜衣原體的 5’ -TCAAGGGATTAAATCCTGCGAACGT-3’ (序列號(hào) 45)和 5’ -ATCTTGTGAAACCTGTTCTGGTCAA-3’ (序列號(hào) 50)，嗜肺軍團(tuán)菌的 5’ -AAGAAGCAGCTATAGGAAAAGAAGT-3’ (序列號(hào) 46)和 5’ -GGGGCGCTGATTTGCAATTTAATGT-3 (序列號(hào) 51)，肺炎克雷伯菌的 5’-TCGAACAGGGCGGCATGGGCGG CGG-3’ (序列號(hào) 47)和 5’ -CAGAAGCGTGCGGCCTACGATCAGT-3’ (序列號(hào) 52)，銅綠假單胞菌的5’-TCCAGGTTCACCGGGGITTCCACC-3’ (序列號(hào) 48)和 5 ’-GCTCTGCAACGACTTGCGGAACTC-3 ’ (序列號(hào)53)的組合?？梢詫⑸鲜?0種探針對(duì)中的任意ー種作成步驟(C)中的第I探針或者步驟(d)中的第2探針，或根據(jù)預(yù)想其存在的檢出對(duì)象肺炎菌等適當(dāng)選擇 確定。此外，上述序列號(hào)1^20或者44 53表示的核苷酸序列中，即使I個(gè)堿基或者幾個(gè)(例如I、個(gè),優(yōu)選為3個(gè)，更優(yōu)選為Γ2個(gè)，進(jìn)ー步優(yōu)選為I個(gè))堿基缺失、置換或者附加，只要可以檢出各肺炎菌特異性的靶核酸，則可以用作本發(fā)明中的探針。作為上述步驟(C)中的第I探針，可以舉出與上述第2探針成對(duì)的至少3種探針，例如選自序列號(hào)I 10表不的核苷酸序列中的與第2探針成對(duì)的至少3種、優(yōu)選至少5種的各肺炎菌的第I探針，例如，可以同時(shí)使用2組的5種各肺炎菌的第I探針結(jié)合在標(biāo)記高分子載體上而成的第I探針結(jié)合標(biāo)記高分子載體。作為將上述多種第I探針結(jié)合到標(biāo)記高分子載體上的方法，可以舉出將具有在5’或者3’末端引入了附加基團(tuán)的序列號(hào)I 10表示的核苷酸序列的DNA，結(jié)合到引入了附加基團(tuán)的標(biāo)記高分子載體上的方法。作為上述附加基團(tuán)，可以舉出氣基、竣基、輕基、疏基等。例如，標(biāo)記聞分子載體被竣基修飾時(shí)優(yōu)選為氣基。此外，由于將多個(gè)第I探針結(jié)合在一個(gè)標(biāo)記高分子載體上，這種情況，在檢出吋，由于沒有必要像以往那樣將ー個(gè)第I探針結(jié)合在一個(gè)標(biāo)記高分子載體而成的第I探針結(jié)合標(biāo)記高分子載體多種混合，所以不僅檢出操作簡(jiǎn)便，而且可以將標(biāo)記膠乳等下述的標(biāo)記高分子載體濃度設(shè)定到最優(yōu)濃度，所以優(yōu)選。本發(fā)明的ー個(gè)具體例以示意圖方式如圖13所示。作為上述標(biāo)記高分子載體中的高分子載體，可以舉出羧基甲基纖維素(CMC)、具有羧基的聚丙烯酸鹽等親水性樹脂，丙烯酸類膠乳、聚酯類膠乳、聚苯こ烯類膠乳、聚氨酯類膠乳、聚こ酸こ烯酯類膠乳、SBR樹脂、NBR樹脂、聚酰胺類膠乳、羧基改性聚苯こ烯類膠乳等膠乳等，而向上述序列號(hào)I 10表示的核苷酸序列中引入氨基時(shí)，利用通過氨基和羧基產(chǎn)生共價(jià)鍵的反應(yīng)，容易將選自序列號(hào)I 10表示的核苷酸序列中的至少3種、優(yōu)選至少5種各肺炎菌的第I探針結(jié)合到標(biāo)記高分子載體上，所以優(yōu)選為在聚苯こ烯類膠乳中引入羧基而成的羧基改性聚苯こ烯類膠乳，具體地說(shuō)，可以使用含羧基的聚苯こ烯膠乳(固體成分4%(w/w)) (Duke Scientific公司制)、含羧基的聚苯こ烯膠乳(固體成分10%(w/w))(Bangs公司制)ο作為具體的結(jié)合了多個(gè)第I探針的標(biāo)記高分子載體的第I探針結(jié)合標(biāo)記高分子載體的制備方法，可以舉出例如將在選自序列號(hào)I 10表示的核苷酸序列中的至少3種各肺炎菌的5’末端引入了氨基的第I探針、和含羧基的聚苯こ烯膠乳(Bangs公司制)、和水溶性碳化ニ亞胺在 50mM 的 MES (2-嗎啉こ橫酸一水合物，2-Morpholinoethanesulfonic acid,monohydrate)(同仁化學(xué)研究所社制)緩沖液中混合，使膠乳中的羧基與第I探針的氨基結(jié)合后，添加單こ醇胺(和光純藥エ業(yè)社制)，進(jìn)ー步進(jìn)行反應(yīng)，將上述反應(yīng)液離心分離后除去上清液，對(duì)得到的沉淀用含有非離子性表面活性劑的HEPES (2-[4-(2-羥基こ基)-1-哌嗪基]こ橫酸，2_[4_ (2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl] ethanesulfonicacid)(埼京化成社制)緩沖液洗滌以及再懸浮來(lái)制備的方法。此外，高分子載體的粒徑尺寸可以適當(dāng)選擇，但是，優(yōu)選從比膜孔徑小的粒徑中選擇，例如可以選擇直徑500nm以下的粒子尺寸。 此外，作為上述標(biāo)記高分子載體，可以使用呈現(xiàn)出可以與展開支持體的顔色區(qū)別的顔色的高分子載體，也可以使用用顔料等著色的高分子載體，除此之外還可以使用熒光標(biāo)記高分子載體。作為上述步驟(d)中的第2探針，可以舉出與上述第I探針成對(duì)的至少3種探針，例如選自序列號(hào)11^20表不的核苷酸序列中的與第I探針成對(duì)的至少3種,優(yōu)選至少5種的各肺炎菌的第2探針。上述第2探針固相化在支持體上，可以使ー個(gè)第2探針在支持體的規(guī)定位置固相化(專用)，也可以使多個(gè)第2探針在支持體的規(guī)定位置固相化(共用)。作為制備負(fù)載展開第2探針的支持體的方法，可以舉出在各肺炎菌展開支持體上可以識(shí)別的規(guī)定位置固相化第2探針的方法?？梢耘e出例如將在5’或者3’末端引入了附加基團(tuán)的具有序列號(hào)If 20表示的核苷酸序列的探針在展開支持體上固相化的方法。作為上述附加基團(tuán)，可以舉出氨基、羧基、羥基、巰基等，但是例如展開支持體被羧基修飾時(shí)優(yōu)選為氨基，無(wú)論有無(wú)附加上述附加基團(tuán)，都可以利用化學(xué)合成法等公知的方法制備第2探針。作為上述展開支持體，可以舉出尼龍膜或羧基修飾尼龍膜等尼龍膜衍生物、纖維素膜或硝酸纖維素膜等纖維素膜衍生物等。但是，在上述序列號(hào)If 20表示的核苷酸序列中引入氨基時(shí)，利用通過氨基和羧基產(chǎn)生共價(jià)鍵的反應(yīng)，容易將選自序列號(hào)1廣20表示的核苷酸序列中的至少3種、優(yōu)選至少5種的各肺炎菌的第2探針在展開支持體上的可以識(shí)別的規(guī)定位置上固相化，所以優(yōu)選為羧基修飾尼龍膜。作為負(fù)載第2探針的展開支持體的具體的制備方法，可以舉出例如將羧基修飾尼龍膜用水溶性碳化ニ亞胺處理，用去離子水洗滌使其活化，在上述活化的羧基修飾尼龍膜上，將具有第2探針序列的核苷酸適當(dāng)在所分配的規(guī)定位置固相化以對(duì)于各肺炎菌可以識(shí)另O，風(fēng)干15分鐘，之后對(duì)固相化了具有第2探針序列的核苷酸的羧基修飾尼龍膜用Tris基礎(chǔ)緩沖液處理，由此除去活性基團(tuán)，將固相化了核苷酸的膜用去離子水洗滌來(lái)制備的方法。作為具有第2探針序列的核苷酸的固相化的方式不特別限定，可以為線狀或圓形點(diǎn)狀。作為步驟(e)中的檢出上述擴(kuò)增產(chǎn)物的方法，若為將所擴(kuò)增的單鏈核酸雜交到負(fù)載在展開支持體上的第2探針以及結(jié)合在標(biāo)記高分子載體上的第I探針而檢出的方法則不特別限定，但是優(yōu)選預(yù)先將多個(gè)第I探針結(jié)合在標(biāo)記高分子載體上而成的第I探針結(jié)合標(biāo)記高分子載體保持在保持部，作為上述保持部，可以合適地舉出ADVANTEC制的吸收墊。通過將由保持了上述第I探針結(jié)合標(biāo)記高分子載體的吸收墊等構(gòu)成的保持部與上述負(fù)載第2探針的展開支持體的另一端依次連接，可以形成可以有利地用于本發(fā)明的檢出方法的核酸色譜用試驗(yàn)片。作為保持部的制造方法，可以舉出將結(jié)合多個(gè)具有第I探針序列的核苷酸的標(biāo)記聞分子載體涂布在保持部，并進(jìn)行干燥的方法。步驟(e)中，作為將上述步驟(a)中的擴(kuò)增產(chǎn)物雜交到負(fù)載在展開支持體的第2探針以及結(jié)合在標(biāo)記高分子載體上的第I探針而檢出的方法，例如可以將上述核酸色譜用試驗(yàn)片浸潰在含擴(kuò)增產(chǎn)物的溶液中，由此將上述第I探針結(jié)合標(biāo)記高分子載體從上述保持部浸出到展開支持體，到達(dá)展開支持體上的與第I探針成對(duì)的各檢出對(duì)象肺炎菌的第2探針固相化的規(guī)定位置時(shí)，在上述規(guī)定位置上，使上述擴(kuò)增產(chǎn)物三明治雜交，由此捕捉。即使擴(kuò)增產(chǎn)物中存在多種靶單鏈核酸時(shí)，也會(huì)依次在規(guī)定位置被各第2探針捕捉。然后，在步驟(f)中，通過結(jié)合了具有第I探針序列的核苷酸的標(biāo)記高分子載體在 到達(dá)具有第2探針序列的核苷酸在展開支持體上固相化的位置的規(guī)定位置蓄積，將出現(xiàn)在規(guī)定位置的著色線或者著色點(diǎn)等的有無(wú)作為檢出圖像，直接或者用熒光可視化裝置進(jìn)行判定，由此可以進(jìn)行評(píng)價(jià)，通過上述評(píng)價(jià)可以檢出檢出對(duì)象肺炎菌(肺炎病原菌)。而且，從簡(jiǎn)便性的觀點(diǎn)考慮，上述判定優(yōu)選為目視判定。此外，對(duì)于由序列號(hào)廣10表示的序列構(gòu)成的第I探針可以替代或者追加使用由序列號(hào)44 48表不的序列構(gòu)成的核苷酸,對(duì)于由序列號(hào)11 20表不的序列構(gòu)成的第2探針可以替代或者追加使用由序列號(hào)49 53表示的序列構(gòu)成的核苷酸。作為步驟(c’ )中的定性·定量靶核酸的方法，可以舉出電泳、雜交法、測(cè)序法。作為電泳法，可以舉出通過利用瓊脂糖凝膠的分子篩效果進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物的分子量解析的方法，利用毛細(xì)管電泳的ァジレン卜テクノロジー株式會(huì)社的解析系統(tǒng)。作為雜交法，可以舉出像實(shí)時(shí)PCR那樣，利用實(shí)時(shí)監(jiān)控用試劑實(shí)時(shí)監(jiān)控?cái)U(kuò)增產(chǎn)物的生成過程并進(jìn)行解析的方法。作為實(shí)時(shí)監(jiān)控試劑，可以舉出例如TaqMan(注冊(cè)■商標(biāo)Applied Biosystems公司制)探針等。雜交法中也可以含有Northern印跡法。作為測(cè)序法，可以舉出利用雙脫氧核苷酸堿基特異性終止DNA聚合酶的合成的雙脫氧法等。作為本發(fā)明的肺炎病原菌的檢出試劑盒，可以用于上述本發(fā)明的肺炎病原菌的檢出方法，可以舉出具有選自可以擴(kuò)增由試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸的由序列號(hào)21表的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)31表的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)22表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)32表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)23表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)33表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)24表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)34表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)25表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)35表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)26表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)36表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)27表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)37表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)28表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)38表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)29表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)39表不的核苷酸序列及附加于其5 ’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)30表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)40表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物，由序列號(hào)54表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)56表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物，由序列號(hào)55表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)57表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3種，優(yōu)選至少5種，即5 10種引物對(duì)的試劑盒，上述試劑盒，除了上述引物對(duì)之外，還可以具有上述步驟(b’ )中的RNA擴(kuò)增法中使用的各種試劑類、上述步驟(c’ )中的為了定性·定量靶核酸而使用的各種試劑類。此外，也可以為具有由從試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸、使用引物作為單鏈核酸擴(kuò)增的擴(kuò)增集，選自與擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的核苷酸序列、例如序列號(hào)I 10或者44^48表示的核苷酸序列中的至少3種各肺炎菌的第I探針結(jié)合在標(biāo)記高分子載體上而成的第I探針結(jié)合標(biāo)記高分子載體，和與第I探針成對(duì)的第2探針、例如選自序列號(hào)11 20或者49 53表示的核苷酸序列中的至少3種各肺炎菌的第2探針在各肺炎菌可以識(shí)別的規(guī)定位置固相化而成的各肺炎菌專用的或者多個(gè)肺炎菌共用的第2探針負(fù)載展開支持體的試劑盒，可以合適地舉出具有上述擴(kuò)增集和上述核酸色譜用試驗(yàn)片的試劑盒。上述試劑盒可以合適地用于上述本發(fā)明的肺炎病原菌的檢出方法中。以下舉出實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行更具體的說(shuō)明，但是本發(fā)明的范圍不被這些例子所限定。
實(shí)施例[卡他莫拉菌dnaj引物的設(shè)計(jì)]迄今，卡他莫拉菌的基因組信息未得到解讀，雖然基于近緣屬種的dnaj基因序列進(jìn)行了設(shè)計(jì)，但是難以設(shè)計(jì)本菌特異性的引物。另ー方面，近年僅清楚本菌的基因組序列信息，因此基于該序列，通過ORF抽提，利用ァライメン卜ソフトDNASISpro (HitachiSoftware公司制)實(shí)施dnaj基因的注釋，由該序列嘗試新的引物的設(shè)計(jì)。利用8株卡他莫拉菌菌株實(shí)施新的引物的驗(yàn)證，作為試劑盒，根據(jù)記載的協(xié)議，利用TaKaRaPCR ThermalCyclerGP，作為儀器，利用 EX Taq Hot start (TaKaRa bio 公司制)，在 95°C、3min，(95°C、IOsec, 65 °C > IOsec, 72 °C > IOsec) X40個(gè)循環(huán)的條件下實(shí)施PCR。所得的PCR產(chǎn)物，用MultiNA通過電泳解析。電泳結(jié)果如圖I所示。任意一種菌株中，所得到的PCR產(chǎn)物都擴(kuò)增，因此可知新設(shè)計(jì)的引物對(duì)對(duì)于卡他莫拉菌的檢出是有用的。[多重化的研究](成為模板的RNA的制備)由于難以培養(yǎng)肺炎支原體以及肺炎嗜衣原體，通過利用質(zhì)粒載體的DNA克隆，制備成為模板的RNA?？寺“谢騾^(qū)域制備重組體。首先，將肺炎支原體或者肺炎嗜衣原體的靶基因dnaj的各DNA片段插入到質(zhì)粒載體中后，分別將成為宿主的大腸桿菌轉(zhuǎn)化。由大腸桿菌抽提質(zhì)粒后，通過PCR進(jìn)行靶基因的DNA擴(kuò)增，由所得到的PCR產(chǎn)物，利用RiboMAX(注冊(cè)商標(biāo))T7Express系統(tǒng)(Promega公司制)，根據(jù)協(xié)議擴(kuò)增RNA，所得到的RNA作為NASBA法的模板。肺炎支原體及肺炎嗜衣原體以外的檢出對(duì)象肺炎菌的RNA通過常規(guī)方法制備。(通過NASBA法進(jìn)行的RNA靶基因的擴(kuò)增)作為正向引物，使用在選自序列號(hào)40表示的核苷酸序列中的各檢出對(duì)象肺炎菌10種各靶序列的5’末端側(cè)附加TAGCAGGATCCCTCTAAG(序列號(hào)41)而成的引物。作為反向引物，使用在各檢出對(duì)象肺炎菌不同的10種各靶序列的5’末端側(cè)附加作為T7RNA聚合酶的啟動(dòng)子序列的CTAATACGACTCACTATAGGGAG(序列號(hào)43)的啟動(dòng)子而成啟動(dòng)子。從上述肺炎鏈球菌、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎克雷伯菌、卡他莫拉菌、金黃色葡萄球菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體7種標(biāo)準(zhǔn)菌株抽提得到的RNA作為模板，對(duì)每I種菌株實(shí)施NASBA法，表示擴(kuò)增靶基因的 RNA 的數(shù)據(jù)。RNA 抽提利用 MORA-EXTRACT (Advanced Microorganism Research 公司制)、根據(jù)隨附協(xié)議實(shí)施，NASBA法利用NASBA Amplification試劑盒(力イノス制)、根據(jù)隨附協(xié)議實(shí)施。作為肺炎鏈球菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎克雷伯菌、 卡他莫拉菌、金黃色葡萄球菌的各模板的RNA試樣分別使用稀釋到I、1/10、1/100、1/1000倍的稀釋物，利用Bio Analyzer、Agilent RNA Pico 6000進(jìn)行。作為對(duì)照，制備未添加酶的反應(yīng)液，實(shí)施同樣的步驟。結(jié)果如圖21所示。確認(rèn)對(duì)于全部靶檢出對(duì)象肺炎菌，通過NASBA法RNA都擴(kuò)增。(各引物間的特異性的驗(yàn)證)實(shí)施本案引物10對(duì)的多重化時(shí)，驗(yàn)證各引物是否與靶菌以外的對(duì)象菌產(chǎn)生非特異反應(yīng)。結(jié)果如圖9所示。本案引物10對(duì)的全部引物中都未發(fā)現(xiàn)非特異反應(yīng)。(通過利用多重引物的NASBA法擴(kuò)增靶RNA)對(duì)于嗜肺軍團(tuán)菌、銅綠假單胞菌、肺炎嗜衣原體、MRSA、流感嗜血桿菌，利用本案引物對(duì)進(jìn)行多重化的研究結(jié)果如圖10所示。此外同樣地，對(duì)于金黃色葡萄桿菌、肺炎鏈球菌、卡他莫拉菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體，利用本案引物對(duì)進(jìn)行多重化的研究結(jié)果如圖11所示。確認(rèn)全部靶檢出對(duì)象肺炎病原菌菌株的RNA都通過NASBA法擴(kuò)增。(NASBA產(chǎn)物的確認(rèn))需要判斷通過NASBA法擴(kuò)增的RNA是否具有靶序列。以作為NASBA反應(yīng)的副產(chǎn)物合成的DNA作為靶，實(shí)施實(shí)時(shí)PCR，測(cè)定NASBA產(chǎn)物和NASBA未反應(yīng)樣品的対照的Ct值，通過比較其差間接地確認(rèn)祀NASBA產(chǎn)物。利用SYBR premixEX Taq Hot start (TaKaRa bio公司制)，根據(jù)協(xié)議,PCR 在 95°C、3min，(95°C、IOsec，65。。、IOsec，72°C、IOsec) X 40 個(gè)循環(huán)的條件下進(jìn)行。在全部菌株中，間接地確認(rèn)通過NASBA法擴(kuò)增的RNA為目的的靶NASBA產(chǎn)物。卡他莫拉菌的例子如圖12所示。[探針對(duì)的確定]嘗試制備對(duì)于成為檢出對(duì)象的各檢出對(duì)象肺炎菌的下表I表示的基因區(qū)域的核酸的靶序列具有互補(bǔ)的序列的含有I對(duì)氨基的的寡核苷酸探針。[表 I]
菌株名基因區(qū)域
月帀炎鏈球(Streptococcus pneumoniaeノLytA
權(quán)利要求
1.一種檢出方法，該檢出方法為以選自肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、金黃色葡萄球菌中的至少3種肺炎菌類作為檢出對(duì)象的肺炎病原菌的檢出方法，其特征在于，該檢出方法具有以下的步驟(a) 步驟(f) 1)由從試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸，利用引物，作為單鏈核酸擴(kuò)增的步驟(a), 2)制備選自與擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的核苷酸序列中的、因各肺炎菌而不同的至少3種探針對(duì)的步驟(b)， 3)使至少3種各肺炎菌的第I探針結(jié)合到標(biāo)記高分子載體上，制備第I探針結(jié)合標(biāo)記高分子載體的步驟(c)， 4)制備使與第I探針成對(duì)的至少3種各肺炎菌的第2探針在各肺炎菌可以識(shí)別的規(guī)定位置固相化而成的第2探針負(fù)載展開支持體的步驟(d)， 5)將所述擴(kuò)增產(chǎn)物雜交到負(fù)載在展開支持體上的第2探針以及結(jié)合在標(biāo)記高分子載體上的第I探針而進(jìn)行檢出的步驟(e)， 6)通過判定檢出圖像來(lái)進(jìn)行評(píng)價(jià)的步驟(f)。
2.根據(jù)權(quán)利要求I所述的檢出方法，其特征在于，引物為選自由序列號(hào)21表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)31表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)22表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)32表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)23表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)33表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)24表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)34表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)25表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)35表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)26表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)36表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)27表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)37表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)28表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)38表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)29表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)39表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)30表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)40表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3種引物對(duì)。
3.根據(jù)權(quán)利要求I或2所述的檢出方法，其特征在于，至少3種的各肺炎菌的第I探針由選自序列號(hào)I 10表示的核苷酸序列中的至少3種DNA構(gòu)成，與第I探針成對(duì)的至少3種的各肺炎菌的第2探針為選自序列號(hào)11 20表示的核苷酸序列中的至少3種DNA。
4.一種試劑盒，該試劑盒為以選自肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、金黃色葡萄球菌中的至少3種肺炎菌類作為檢出對(duì)象的肺炎病原菌的檢出試劑盒，其特征在于，該試劑盒具有選自可以擴(kuò)增由試樣中任意抽提的各肺炎菌特異性的靶核酸的、由序列號(hào)21表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)31表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)22表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)32表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)23表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)33表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)24表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)34表不的核苷酸序列及附加于其5 ’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)25表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)35表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)26表不的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)36表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)27表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)37表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)28表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)38表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)29表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)39表示的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物、由序列號(hào)30表示的核苷酸序列構(gòu)成的正向引物和由序列號(hào)40表不的核苷酸序列及附加于其5’末端側(cè)的RNA聚合酶啟動(dòng)子序列構(gòu)成的反向引物中的因各肺炎菌而不同的至少3種引物對(duì)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的試劑盒，其特征在于，該試劑盒進(jìn)一步具有 1)選自與擴(kuò)增產(chǎn)物互補(bǔ)的核苷酸序列中的、因各肺炎菌而不同的至少3種各肺炎菌的第I探針結(jié)合在標(biāo)記高分子載體而成的第I探針結(jié)合標(biāo)記高分子載體， 2)與第I探針成對(duì)的至少3種各肺炎菌的第2探針在各肺炎菌可以識(shí)別的規(guī)定位置固相化而成的第2探針負(fù)載展開支持體。
6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的試劑盒，其特征在于，至少3種的各肺炎菌的第I探針由選自序列號(hào)I 10表示的核苷酸序列中的至少3種DNA構(gòu)成，與第I探針成對(duì)的至少3種的各肺炎菌的第2探針為選自序列號(hào)11 20表示的核苷酸序列中的至少3種DNA。
全文摘要
本發(fā)明提供肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、肺炎支原體、肺炎嗜衣原體、嗜肺軍團(tuán)菌、肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌、卡他莫拉菌、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)、金黃色葡萄球菌的10種檢出對(duì)象肺炎菌的迅速且正確的檢出方法、檢出試劑盒。設(shè)計(jì)對(duì)于10種各肺炎病原菌的DnaJ基因等中含有的10菌種的各靶區(qū)域的引物對(duì)集，使用上述引物對(duì)集擴(kuò)增基因產(chǎn)物。進(jìn)一步設(shè)計(jì)將上述擴(kuò)增產(chǎn)物雜交到與引物對(duì)集不同的10菌種的各靶區(qū)域內(nèi)的序列的各菌株固有的探針對(duì)集。作為上述探針對(duì)集，使用結(jié)合了多個(gè)肺炎菌的第1探針的第1探針結(jié)合標(biāo)記高分子載體、和固相化的第2探針負(fù)載展開支持體，進(jìn)行核酸色譜法。
文檔編號(hào)C12N15/09GK102822352SQ20118001618
公開日2012年12月12日 申請(qǐng)日期2011年3月30日 優(yōu)先權(quán)日2010年3月31日
發(fā)明者白井睦訓(xùn), 江崎孝行, 林司, 宇治家武史, 我那覇誠(chéng), 山本茂一 申請(qǐng)人:有限會(huì)社山口技術(shù)特許機(jī)構(gòu)