相關申請的交叉引用

本申請要求2014年11月25日提交的申請?zhí)枮?2/084,365的美國臨時申請和2015年9月9日提交的申請?zhí)枮?2/215828的美國臨時申請的優(yōu)先權，其各自的公開內(nèi)容通過引用并入本文。

關于聯(lián)邦政府資助研究的聲明

本發(fā)明是在根據(jù)由美國國立衛(wèi)生研究院授予的編號為mh083911和ag045656的合同在政府支持下完成的。政府對本發(fā)明有一定的權利。

本公開大體上涉及與神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕組織相關的病癥的預防和治療，更具體地涉及包含用于將內(nèi)部神經(jīng)膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為用于腦和脊髓修復的功能性神經(jīng)元的小分子的組合物和方法。

背景技術：

神經(jīng)退行性疾病中或神經(jīng)損傷后功能性神經(jīng)元的再生仍然是神經(jīng)修復領域的主要挑戰(zhàn)。目前的努力主要集中在使用源自胚胎干細胞或誘導多能干細胞的外源細胞的細胞替代療法(buhnemann等人，2006；emborg等人，2013；nagai等人，2010；nakamura和okano，2013；oki等人，2012；sahni和kessler，2010)。盡管潛力很大，但這種細胞移植方法在臨床應用中面臨重大障礙，如潛在免疫注射、腫瘤發(fā)生和分化不確定性(lee等人，2013；liu等人，2013b；lukovic等人，2014)。此外，雖然以前的研究已經(jīng)表明，星形膠質(zhì)細胞可以在體外(guo等人，2014；heinrich等人，2010)和體內(nèi)(grande等人，2013；torper等人，2013；guo等人，2014)直接轉(zhuǎn)化成功能性神經(jīng)元，并且在刺傷的小鼠腦(niu等人，2013)或脊髓(su等人，2014)中星形膠質(zhì)細胞可以轉(zhuǎn)化成神經(jīng)母細胞并繼而分化為神經(jīng)元細胞，這些方法具有需要在腦內(nèi)病毒感染的顯著缺點。因此，這些以前的方法需要執(zhí)行復雜的腦外科手術、顱內(nèi)注射病毒顆粒、并且伴隨這些步驟的相當大的風險。因此，對于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)或周圍神經(jīng)系統(tǒng)中再生功能性神經(jīng)元而不需要將外源重編程的細胞或病毒構建體引入人受試者的新組合物和方法，仍然存在不間斷的并且未滿足的需求。

技術實現(xiàn)要素：

本公開提供了將神經(jīng)膠質(zhì)細胞化學重編程為神經(jīng)元的組合物和方法。本公開與以前的方法有很大不同，至少部分是因為它涉及使用化學合成的化合物對神經(jīng)膠質(zhì)細胞進行重新編程。因此，它不包括將外源基因、病毒載體或工程化的細胞引入患者的相關的風險，也不需要操縱培養(yǎng)中的干細胞或其它多能細胞或體細胞如成纖維細胞以將它們分化或反向分化成神經(jīng)元或以其它方式制備用于向受試者施用的細胞。相反地，本公開包括將已經(jīng)存在于個體的神經(jīng)系統(tǒng)中的神經(jīng)膠質(zhì)細胞重編程，從而利用以下更充分描述的小分子的組合將神經(jīng)膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。期望所述組合物和方法提供方便且安全的方法來治療涉及例如反應性神經(jīng)膠質(zhì)細胞或神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的各種神經(jīng)損傷或神經(jīng)退行性疾病。本領域技術人員將認識到，神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕可以由本領域已知的許多原因引起，并且其通常涉及包括腦和脊髓在內(nèi)的中樞神經(jīng)系統(tǒng)和外周神經(jīng)系統(tǒng)中的損傷或疾病過程之后的星形膠質(zhì)細胞增生?；钚孕切文z質(zhì)細胞是神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕的主要細胞組分，其次是ng2神經(jīng)膠質(zhì)細胞和小神經(jīng)膠質(zhì)細胞。因此，在實施方案中，本公開包括通過對星形膠質(zhì)細胞進行化學誘導性重編程以將星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元。但是也可以采用類似的化學重編程方法將ng2神經(jīng)膠質(zhì)細胞或小神經(jīng)膠質(zhì)細胞或圍繞腦血管的其它細胞類型轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。

從本公開呈現(xiàn)的描述、附圖和數(shù)據(jù)可以顯而易見地看出，我們已經(jīng)開發(fā)出體外和體內(nèi)數(shù)據(jù)，其證明預先存在的、經(jīng)過分化的神經(jīng)膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元。特別地，我們的數(shù)據(jù)表明，如本文所述的小分子的順序應用導致大部分人星形膠質(zhì)細胞(～70％)在體外重新編程為神經(jīng)元細胞。此外，這些小分子-重編程的人神經(jīng)元可以在培養(yǎng)中存活超過五個月，并顯示出健壯的突觸活動。此外，將人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元注入小鼠腦中表明，人神經(jīng)元可以整合到局部腦回路中。因此，本公開中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)共同表明，現(xiàn)在可以實現(xiàn)以體內(nèi)方式在損傷或患病大腦中將人星形膠質(zhì)細胞化學重編程為功能性神經(jīng)元，而不需要引入個體培養(yǎng)的細胞或病毒或其它表達載體或外源基因，這是一種從未有過的方法。

本公開包括證明將共同作用于信號包括但不限于轉(zhuǎn)化生長因子β(tgf-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bmp)、糖原合成酶激酶3(gsk-3)和γ-分泌酶/notch通路的化合物結合，可將神經(jīng)膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元。大體上，本公開包括向有需要的個體施用能夠抑制這些通路的化合物。在一個實施方案中，本公開包括施用化合物的組合，這些化合物選自由thiazovivin、ldn193189、sb431542、ttnpb、chir99021、dapt、vpa、sag、2,6,9-三元取代嘌呤或其藥學上可接受的鹽或這些化合物的類似物或具有相同或相似的功能效果使得它們的施用將神經(jīng)膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元的化合物組成的組的化合物的組合和前述化合物的多種組合。在一種方式中，施用于個體的化合物包含選自由核心的四種化合物的至少三種化合物中(其不試圖被任何特定理論約束)，被認為是實現(xiàn)重編程所需要的。這些化合物是sb431542、ldn193189、chir99021和dapt，其也可以使用如下所述的功能類似物取代。在一種方式中，本公開包括使用任意以下組合中：i)ldn193189/chir99021/dap，ii)sb431542/chir99021/dapt；iii)ldn193189/dapt/sb431542，和iv)ldn193189/chir99021/sb431542。在一個實施方案中，使用sb431542/chir99021/dapt的三種藥物組合物。

所述組合物可以以任何組合施用于有需要的個體，并且可以包括至少兩種化合物的組合的同時給藥，并且可以包括任何化合物和組合的順序給藥，下面將更全面的描述具體的實施方案。在某些方式中，將包含ldn193189和sb431542的組合物引入個體，其可以作為初始給藥進行，并且將包含chir99021和dapt的組合物引入個體，其可以在后續(xù)的給藥中進行。

可以采用任何可接受的途徑和制劑施用組合物，包括但不一定限于口服、鼻內(nèi)、靜脈內(nèi)和顱內(nèi)方法。在一個方面，以口服方式施用組合物。

在某些實施方案中，本公開的方法用于治療目的，以誘導由于包含神經(jīng)元缺失和/或膠質(zhì)瘢痕形成的病癥而需要神經(jīng)元的個體中膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元。在某些實施方案中，所述個體是由于中風、缺氧或其他腦外傷的缺血性腦損傷，或已被診斷患有或懷疑患有阿爾茨海默病或其它神經(jīng)退行性病癥而需要所產(chǎn)生的神經(jīng)元。

在另一方面，本公開包括包含thiazovivin、ldn193189、sb431542、ttnpb、chir99021、dapt、vpa、sag、2,6,9-三元取代嘌呤中至少兩種的組合的藥物組合物，其中該組合物用于將膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元。還考慮了包含這些化合物的鹽和類似物以及功能相關化合物(即功能類似物)的藥物組合物。在實施方案中，本公開的藥物組合物包括sb431542、ldn193189、chir99021和dapt，和/或其藥學上可接受的鹽中的至少兩種。在實施方案中，所述藥物組合物包括sb431542、ldn193189、chir99021和dapt中的所有，并且還可以包括另外的化合物。在實施方案中，本公開包括含有作為用于將神經(jīng)膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元的活性劑的組合物，其中一個組：i)ldn193189/chir99021/dapt、ii)sb431542/chir99021/dapt、iii)ldn193189/dapt/sb431542、以及iv)ldn193189/chir99021/sb-431542。在一個實施方案中，包括前述組中的任何三個成員。在一個實施方案中，組合物包含sb431542/chir99021/dapt的三種藥物組合或由sb431542/chir99021/dapt的三種藥物組合組成。

在另一方面，本公開包括包含包裝和至少一個容器的制品，所述容器包含藥物組合物，所述藥物組合物包含選自由thiazovivin、ldn193189、sb431542、ttnpb、chir99021、dapt、vpa、sag、2,6,9-三元取代嘌呤及其藥學上可接受的鹽組成的組中的至少三種化合物的組合，所述包裝包含印刷信息，所述印刷信息提供所述藥物組合物用于治療病癥的指示，其中所述病癥與缺乏功能性神經(jīng)元有關。

附圖說明

圖1、順序暴露于定義的小分子組將人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元細胞。(a)我們使用小分子混合物將培養(yǎng)的人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的策略的示意圖。注意到在不同的重編程階段使用不同的小分子子集。(b、c)對人星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物(ha1800，sciencell)的定量分析。我們的人星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物中的大部分細胞對于星形膠質(zhì)細胞標記物gfap(79.3±4.9％)、星形膠質(zhì)細胞谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白glt-1(82.5±4.3％)和較小程度的s100β(39.3±1.8％)呈免疫陽性。沒有細胞對神經(jīng)元標記物neun、map2或雙皮層素(dcx)呈免疫陽性。hunu，用于人類細胞的人細胞核標記物。n＝3批次。(d)無小分子處理的對照人星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物幾乎沒有對神經(jīng)元標記物dcx(綠色)、β-ⅲ微管蛋白(tuj1，紅色)或map2(青色)呈免疫陽性的細胞。(e)將人星形膠質(zhì)細胞順序暴露于小分子產(chǎn)生大量的神經(jīng)元細胞，這些細胞對dcx(綠色)、tuj1(紅色)和map2(青色)呈免疫陽性。mcm代表主轉(zhuǎn)化分子，包括共同用于重編程的9個小分子。在初次小分子處理后14天進行分析。(f)在初次小分子處理后30天，人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元發(fā)育出廣泛的樹突(map2，綠色)，并且對成熟的神經(jīng)元標記物neun(紅色)呈免疫陽性。(g)小分子轉(zhuǎn)化的人神經(jīng)元在培養(yǎng)中存活4個月，并顯示出健壯的樹突狀樹(map2，綠色)以及廣泛的軸突(smi312，紅色)。(h)用gfap::gfp逆轉(zhuǎn)錄病毒示蹤的星形膠質(zhì)細胞譜系(astrogliallineage)顯示gfp+細胞在小分子處理后對于神經(jīng)元標記物neun(紅色)呈免疫陽性。n＝5批次。(i和j)在暴露于mcm(67.1±0.8％，tuj1+神經(jīng)元/dapi標記的總細胞，n＝4批次)8天后小分子處理達到高轉(zhuǎn)化率。(k)將人中腦星形膠質(zhì)細胞化學重編程為神經(jīng)元。在對人中腦星形膠質(zhì)細胞(sciencell)進行初次小分子處理后1個月，大多數(shù)細胞對于神經(jīng)元標記物neun(紅色)和map2(綠色)呈免疫陽性。(l)在神經(jīng)元分化培養(yǎng)基中1個月的培養(yǎng)下，無小分子處理的對照人中腦星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物幾乎沒有對neun(紅色)或map2(綠色)呈免疫陽性的細胞。(m)定量分析顯示出小分子處理后1個月(199.7±9.2每40x視野)由人中腦星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的大量neun-陽性神經(jīng)元，而對照組只有少量neun+細胞(5.6±1.4每40x視野)。n＝4批次。比例尺：小圖b為50μm；其它圖像為20μm。***p<0.001，t檢驗(student’sttest)。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。

圖2、由小分子處理誘導的人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元的功能分析。(a)長期存活的小分子誘導的人神經(jīng)元(培養(yǎng)5個月)和大量沿著樹突(map2，green)的突觸點(sv2，紅色)。比例尺：20μm。(b-d)顯示了從由小分子誘導的1月齡(b)和2月齡(c)的人神經(jīng)元記錄到的na+和k+電流的代表性蹤跡。小圖d顯示了ttx(2μm)對na+電流的阻斷。(e)對通過小分子從人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的2周齡至3月齡的神經(jīng)元中的na+和k+電流峰值的定量分析。(f)初次藥物處理后75天小分子誘導的人神經(jīng)元中記錄到的重復動作電位的代表性蹤跡。(g和h)顯示了在2月齡的轉(zhuǎn)化的人神經(jīng)元中自發(fā)性突觸活動的代表性蹤跡。鉗制電位＝-70mv。(h)來自(g)的擴展的蹤跡。(i)當鉗制電位保持在0mv(2月齡)時，在人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元中顯示的抑制性gaba能活動。這種活動被gabaa受體拮抗劑荷包牡丹堿(bicuculline)(bic，10μm)阻斷。(j-k)顯示了3月齡的小分子誘導的人神經(jīng)元中自發(fā)性爆發(fā)活動(burstactivities)的代表性蹤跡。hp＝-70mv。(k)是(j)中爆發(fā)的擴展視圖。(l)爆發(fā)活動被ttx(2μm)阻斷。谷氨酸受體拮抗劑dnqx(10μm)阻斷了的大多數(shù)在-70mv的突觸活動，暗示它們是谷氨酸能的活動。(m)雙重全細胞記錄說明小分子轉(zhuǎn)化的人神經(jīng)元形成了強大的突觸網(wǎng)絡并且同步激發(fā)(fired)。(n)ca²⁺比值成像進一步說明了小分子轉(zhuǎn)化的人神經(jīng)元高度連通并表現(xiàn)出同步活動。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。

圖3、由小分子誘導的人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元的表征。(a-c)前-后神經(jīng)元標記物的免疫染色顯示，小分子轉(zhuǎn)化的人神經(jīng)元對前腦標記物foxg1(a)呈陽性，但對后腦和脊髓標記物hoxb4(b)和hoxc9(c)呈陰性。(d-f)皮層神經(jīng)元標記物的免疫染色顯示，小分子誘導的人神經(jīng)元對表層標記物cux1(d)呈陰性，對深層標記物ctip2(e)和otx1(f)呈陽性。(g-h)小分子轉(zhuǎn)化的人神經(jīng)元對于一般的皮層神經(jīng)元標記物tbr1(g)和海馬神經(jīng)元標記物prox1(h)也呈免疫陽性。(i)對小分子誘導人神經(jīng)元的定量分析(foxg1，97.1±1.1％，n＝3批次；cux1，3.1±1.9％，n＝4批次；ctip2，71.4±3％，n＝4批次；otx1，87.4±3.2％，n＝3批次；tbr1，86.4±3.4％，n＝3批次；prox1，73.4±4.4％，n＝4批次)。比例尺：20μm。(j)mcm轉(zhuǎn)化的人神經(jīng)元對vglut1呈免疫陽性。(k)小部分的mcm轉(zhuǎn)化的人神經(jīng)元是gad67陽性的。(l-n)mcm轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元對膽堿能神經(jīng)元標記物囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運體(vesicularacetylcholinetransporter，vacht)(l)、多巴胺能神經(jīng)元標記物酪氨酸羥化酶(th)(m)或脊髓運動神經(jīng)元標記物isl1(n)呈免疫陰性。(o)對小分子轉(zhuǎn)化的人神經(jīng)元的定量分析(vglut1，88.3±4％，n＝4批次；gad67，8.2±1.5％，n＝4批次)。比例尺：20μm。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。

圖4、在使人星形膠質(zhì)細胞化學重編程為神經(jīng)元期間的轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳調(diào)節(jié)。(a-b)pcr陣列顯示出小分子處理后第4天(a)或第8天(b)神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子(ngn1/2、neurod1和ascl1)和未成熟神經(jīng)元基因dcx的大量轉(zhuǎn)錄激活。注意到d8時dcx與對照相比增加超過2000倍。提供了pcr陣列測定中顯示出顯著變化的基因(p<0.05，mann-whitneyt檢驗)。(c-f)通過實時定量pcr分析顯示了在時間進程中的轉(zhuǎn)錄變化。神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子ngn2(c)和neurod1(d)分別在d4和d6顯示轉(zhuǎn)錄峰值；而星形膠質(zhì)細胞基因gfap(e)和aldh1l1(f)顯著下調(diào)。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001；雙因素方差分析，隨后是dunnett檢驗(dunnett’stest)。n＝3批次。(g-i)化學重編程期間gfap啟動子和轉(zhuǎn)錄起始位點的表觀遺傳調(diào)控。medip-seq顯示出小分子處理8天后gfap啟動子區(qū)域(g，盒區(qū)域)的甲基化顯著增加，這被隨后的bs-seq(亞硫酸氫鹽測序)(h)證實。注意到超甲基化位點位于兩個重要的轉(zhuǎn)錄因子結合位點(stat3和ap1)的側(cè)翼區(qū)，這會顯著抑制gfap的轉(zhuǎn)錄。bs-seq還顯示gfap轉(zhuǎn)錄起始位點(tss)和5'utr調(diào)節(jié)區(qū)(i)的甲基化水平顯著增加，進一步表明通過dna甲基化抑制gfap轉(zhuǎn)錄。(j-k)medip-seq和bs-seq顯示出在神經(jīng)元基因nefm(神經(jīng)絲m)的啟動子區(qū)域的甲基化顯著降低，表明在使人星形膠質(zhì)細胞化學重編程為神經(jīng)元期間神經(jīng)元基因的轉(zhuǎn)錄激活。(l-m)chip-qpcr顯示出小分子處理后可能由hdac抑制劑vpa引起的ngn2啟動子區(qū)域中組蛋白乙?；娘@著增加。(n-o)ngn2啟動子區(qū)域(n)中h3k4的甲基化水平顯著升高，而ngn2轉(zhuǎn)錄起始位點的h3k27甲基化顯著降低(o)，表明通過組蛋白修飾的ngn2的表觀遺傳活化。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。

圖5、化學重編程期間神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子的蛋白質(zhì)表達水平的增加。(a-c)代表性圖像說明了小分子處理不同天數(shù)內(nèi)源性神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子ascl1(a)、ngn2(b)和neurod1(c)逐漸活化。(d-e)代表性圖像顯示出從d0到d10的轉(zhuǎn)化過程中神經(jīng)元信號dcx(d)和neun(e)逐漸增加。(f)代表性圖像顯示出從d0到d10星形膠質(zhì)細胞標記物gfap減少。比例尺：20μm。(g-i)對ascl1(g)、ngn2(h)和neurod1(i)的蛋白表達水平的定量分析。注意到ascl1在第2天顯著增加3倍，而ngn2在第4天達到峰值，neurod1在第6天達到峰值。n＝3批次。(j)量化數(shù)據(jù)顯示從第6天到第10天neun顯著增加。n＝3批次。(k)量化數(shù)據(jù)顯示從d0到d10gfap顯著降低。n＝3批次。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。

圖6、對星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元重編程期間每個單獨的小分子的重要作用的評估。(a)用1％dmso處理的人星形膠質(zhì)細胞作為對照。neun，綠色；map2，紅色。(b)9個小分子的定義組合誘導產(chǎn)生大量神經(jīng)元(初次小分子處理后14天，與以下去除實驗相同)。(c-f)從9個小分子庫中單獨去除dapt(c)、chir99021(d)、sb431542(e)或ldn193189(f)顯著減少轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元數(shù)目。(g)一起去除音猬因子激動劑(sonichedgehogagonists)sag和purmo略微減少轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元數(shù)量。(h)去除vpa也略微降低神經(jīng)元數(shù)量。(i-j)去除tzv(i)或ttnpb(j)不影響神經(jīng)元轉(zhuǎn)化。比例尺：20μm。(k)定量分析顯示了dapt是最有效的重編程因子，其次是chir99021、sb431542和ldn193189。*p<0.05；**p<0.01；***p<0.001；單因素方差分析，然后是sidak的多重比較檢驗。n＝3批次。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。

圖7、小分子轉(zhuǎn)化的人神經(jīng)元在小鼠腦中的體內(nèi)存活和整合。(a)示意圖顯示了在將小分子轉(zhuǎn)化的人神經(jīng)元移植到出生后第1天小鼠腦中。(b)在細胞注射后7天(7dpi)，在側(cè)腦室周圍鑒定出gfp陽性細胞。許多gfp陽性細胞對dcx(紅色)也呈陽性，并且所有的gfp陽性細胞對人細胞核(hunu，blue)都呈免疫陽性，表明它們的人細胞特性。n＝6只小鼠。(c)在11dpi時，一些gfp陽性細胞對map2(紅色)呈免疫陽性，表明人神經(jīng)元以體內(nèi)方式在小鼠腦中的存活和生長。n＝6只小鼠。(d)在11dpi時，對neun(紅色)和hunu(青色)呈免疫陽性的一些gfp陽性的人神經(jīng)元遷移到相鄰的紋狀體區(qū)域并延伸出長的突起。(e)由neun(紅色)和hunu(藍色)標記的人神經(jīng)元在小鼠腦內(nèi)存活超過1個月，并被小鼠神經(jīng)元(neun陽性但hunu陰性)包圍。n＝2只小鼠。(f)gfp陽性的人神經(jīng)元受周圍神經(jīng)元的神經(jīng)支配，如沿著gfp陽性神經(jīng)突(插圖)的許多突觸點(sv2，紅色)所示，表明被移植的人神經(jīng)元突觸融合到局部神經(jīng)回路中。n＝2只小鼠。比例尺：20μm。

圖8、培養(yǎng)的人皮層星形膠質(zhì)細胞的表征。(a)在神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)基(gm，10％fbs)或n2培養(yǎng)基(用于重編程，無fbs)中培養(yǎng)的并且用musashi、nestin和sox2免疫染色的人皮層星形細胞(ha1800，sciencell)。注意到在兩種培養(yǎng)基中，沒有神經(jīng)祖細胞。(b)對神經(jīng)干細胞標記物的定量分析顯示出與人神經(jīng)祖細胞(npc)相比培養(yǎng)的人星形膠質(zhì)細胞中musashi、巢蛋白(nestin)和sox2的表達水平較低。***p<0.0001，單因素方差分析，然后是dunnett檢驗。n＝3批次。(c-d)人星形膠質(zhì)細胞(ha1800，sciencell)在補充有bdnf、nt3和ngf的神經(jīng)元分化培養(yǎng)基(ndm)中培養(yǎng)1個月，以確保神經(jīng)分化，如果在星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物中有任何神經(jīng)干細胞。定量分析顯示，大多數(shù)細胞對于星形膠質(zhì)細胞標記物s100β(74.7±1.5％)、gfap(83.6±1.2％)、谷氨酸合成酶(gs)(94.3±0.7％)和glt-1(91.4±1.5％)均呈免疫陽性。少量細胞對dcx(5.18±0.67)和tuj1(8.98±0.75％)呈染色陽性，但沒有對neun和ng2呈陽性的細胞。n＝4批次，比例尺＝20μm。(e-h)培養(yǎng)的人星形膠質(zhì)細胞(ha1800)的功能分析。電生理記錄顯示大的k+電流，但沒有na+電流(e)，相鄰星形膠質(zhì)細胞之間的間隙交界性聯(lián)結(f-g)和谷氨酸(500m)轉(zhuǎn)運體電流(h)。(f)顯示出記錄后局部星形膠質(zhì)細胞域之間的染料聯(lián)結。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。

圖9、在小分子處理期間隨時間推移對星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元轉(zhuǎn)化過程進行成像。(a)由表達gfp(綠色)的cag::gfp逆轉(zhuǎn)錄病毒標記的人星形膠質(zhì)細胞(ha)在使用1％dmso處理作為對照在d8時保持星形膠質(zhì)細胞形態(tài)。每日用尼康2000熒光顯微鏡成像。我們在這個隨時間推移對活細胞進行成像的實驗中使用cag::gfp逆轉(zhuǎn)錄病毒代替gfap::gfp逆轉(zhuǎn)錄病毒，因為gfap啟動子是弱啟動子，因此gfap::gfp感染的細胞中的gfp信號對于活細胞成像來說太弱。(b)代表性圖片顯示出培養(yǎng)21天后，對照組中gfp+細胞對星形膠質(zhì)細胞標記物gfap(紅色)呈免疫陽性。(c)在小分子處理前一天至小分子處理后10天中監(jiān)測兩個gfp標記的人星形膠質(zhì)細胞。從d0星形膠質(zhì)細胞到d9神經(jīng)元樣細胞有明顯的細胞形態(tài)轉(zhuǎn)變。(d)隨時間推移進行成像后，再d21將細胞固定，用神經(jīng)元標記物neun和tuj1進行免疫染色。小分子處理后的gfp標記的細胞(綠色，箭頭)對neun(紅色)和tuj1(青色)呈免疫陽性。比例尺＝20μm。(e-g)用gfap::gfp逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人星形膠質(zhì)細胞以進行譜系示蹤。gfap::gfp感染的細胞均為gfap+(e，紅色)。不經(jīng)過小分子處理，培養(yǎng)18天后gfp+細胞仍然是gfap+星形膠質(zhì)細胞(f，紅色)沒有檢測到神經(jīng)元(g)。n＝3批次。比例尺＝10μm。對小分子處理的組見圖8h。(h-j)感染lcn2::gfp逆轉(zhuǎn)錄病毒的人星形膠質(zhì)細胞對gfap(h，紅色)和lcn2(h，青色)呈免疫陽性。不經(jīng)過小分子處理，培養(yǎng)18天后，gfp+細胞保留星形膠質(zhì)細胞形態(tài)和對gfap(i，紅色)免疫陽性。相比之下，小分子處理后，gfp+細胞對neun(j，紅色)呈免疫陽性。n＝3批次。比例尺＝10μm。

圖10、人星形膠質(zhì)細胞從不同來源到神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化。(a)人中腦星形膠質(zhì)細胞(ha中腦，sciencell)的表征，其對星形膠質(zhì)細胞標記物gfap、s100β、gs和glt1呈免疫陽性，但顯示出神經(jīng)干細胞標記物sox2和巢蛋白的低表達水平。(b)不經(jīng)過小分子處理的對照人中腦星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物幾乎沒有對神經(jīng)元標記物dcx(綠色)或β-ⅲ微管蛋白(tuj1，紅色)呈免疫陽性的細胞。(c)將人中腦星形膠質(zhì)細胞順序暴露于小分子產(chǎn)生了大量的對dcx(綠色)和tuj1(紅色)呈免疫陽性的神經(jīng)元細胞。在初次小分子處理后16天分析。(d-e)在不經(jīng)過小分子處理(d)或經(jīng)過小分子處理(e)的人中腦星形膠質(zhì)細胞的1月齡培養(yǎng)物中下軸突標記物smi312(綠色)的免疫染色圖像。(f)從人中腦星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的長期存活的人神經(jīng)元。大量突觸點(sv2，紅色)沿著樹突(map2，綠色)分布在neun陽性(青色)神經(jīng)元中。(g-h)使用相同的小分子方案也成功地將來自不同來源(gibco)的人腦星形膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元，效率為41.1±3.6％。n＝4批次。(i)免疫染色顯示了從gibco人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的2月齡神經(jīng)元中突觸蛋白(紅色)和map2(綠色)信號。因此，使用相同的小分子策略可以使不同來源的人腦星形膠質(zhì)細胞成功地轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。小圖a和i的比例尺為10μm，其余為20μm。

圖11、人星形膠質(zhì)細胞不經(jīng)過干細胞階段直接轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元。(a-c)代表性圖像顯示出與人npc培養(yǎng)物相比，在小分子處理的不同天數(shù)，低表達水平的神經(jīng)干細胞標記物sox2(a，紅色)、巢蛋白(b，綠色)和pax6(綠色)。(d)代表性圖像顯示出如細胞增殖標記物ki67(紅色)所示，在重新編程期間無顯著細胞擴增。(e-f)brdu確定在小分子介導重編程前后的星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元的出生日期。brdu在小分子處理前1天(e)或小分子處理后10天(f)施用于培養(yǎng)基中。在第30天固定細胞。(e)中的箭頭指向brdu和neun共定位的細胞。(g-i)對化學重編程期間sox2(g)、巢蛋白(h)和pax6(i)的熒光強度的定量分析，將其歸一化為d0時的強度。與d0相比，sox2表達水平在d4-d10略有增加，但遠低于npc細胞(g)。另一方面，與npc細胞相比，巢蛋白表達水平非常低(h)。類似地，與npc細胞(i)相比，pax6+細胞也非常少。(j)對ki67+細胞進行定量分析，以評估化學重編程期間的細胞增殖率。與d0相比，小分子處理后d2-d6細胞增殖明顯減少。人星形膠質(zhì)細胞的總體增殖率明顯低于npc細胞。在存在小分子的情況下降低的增殖速率表明在化學重編程期間不發(fā)生細胞擴增。(k)對e-f中brdu標記的神經(jīng)元的定量分析。當在小分子處理前加入brdu時，大量細胞顯示brdu和neun的共定位(77.3±3.8％)。如果在小分子處理后添加brdu，則幾乎沒有與brdu共定位的neun+細胞(d10至d30，1.75±0.73％)，表明在小分子存在下大部分轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元。n＝3批次。比例尺＝20μm。**p<0.001；***p<0.0001；單因素方差分析，隨后是dunnett的多重比較檢驗。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。

圖12、小分子介導的重編程中的信號傳導通路。(a-b)pcr陣列表明不經(jīng)過小分子處理但用1％dmso處理的對照人星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物(作為溶劑對照)在第4天(a)或第8天(b)沒有顯著的基因表達變化。(c-f)在對照人星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物(1％dmso)中，實時定量pcr還顯示神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子ngn2(c)和neurod1(d)或神經(jīng)膠質(zhì)基因gfap(e)和aldh1l1(f)的轉(zhuǎn)錄變化極小。n＝3批次。(g)代表性圖像顯示出在小分子處理2天后細胞核中磷酸化smad1/5/9(綠色)水平降低。p-smad1/5/9的熒光強度的定量分析表明bmp信號傳導通路被抑制。(h)代表性圖像和定量分析說明了初次小分子處理后d6notch細胞內(nèi)結構域(nicd)(綠色)水平降低，表明notch信號傳導通路被抑制。(i)代表性圖像和定量分析說明了用小分子處理6天后磷酸化gsk3β(綠色)水平升高，表明gsk3β失活。**p<0.001；***p<0.0001；單因素方差分析，隨后是dunnett的多重比較檢驗。n＝3批次。比例尺＝10μm。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。

圖13、在不經(jīng)過小分子處理的對照人星形膠質(zhì)細胞中，內(nèi)源性神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子沒有顯著變化。(a-c)免疫染色顯示出對照人星形膠質(zhì)細胞(1％dmso)中內(nèi)源性神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子ascl1(a)、ngn2(b)和neurod1(c)的蛋白表達水平非常低。(d)neun染色顯示出對照條件下幾乎沒有神經(jīng)元。(e)代表性圖像顯示出對照條件下顯示gfap(紅色)的恒定表達。(f-h)d2-d10培養(yǎng)期間ascl1(f)、ngn2(g)和neurod1(h)的熒光強度的定量分析，其歸一化為d0時的強度。(i)定量分析顯示出d0到d10對照人星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物中幾乎沒有neun陽性細胞。(j)定量分析顯示出對照人星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物中gfap表達從d0至d10仍然很高。n＝3批次。比例尺＝20μm。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。

圖14、注射到小鼠皮層中的小分子在體內(nèi)促進小鼠皮層星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)向神經(jīng)干細胞。(a)單次注射(dpi)包括sb4315420.1nmol、ldn1931890.01nmol、chir990210.03nmol、dapt0.1nmol、sag0.01nmol和ttnpb0.01nmol(以2μl的總體積混合)的小分子后6天小鼠皮層星形膠質(zhì)細胞(gfap，紅色)表現(xiàn)出顯著的形態(tài)學變化并表達高水平的巢蛋白(綠色)。在注射位點周圍觀察到一些表達dcx(青色)的細胞。n＝4只動物。(b)定量分析顯示體內(nèi)小分子處理的小鼠星形膠質(zhì)細胞中巢蛋白表達增加(student'st檢驗，***p<0.0001)。(c)分離出小分子處理的皮層組織并在體外培養(yǎng)。與用含有6％dmso的pbs處理的對照皮層組織相比，有許多更多和更大的原代神經(jīng)球。(d-e)定量分析顯示出小分子處理的皮層組織產(chǎn)生更多神經(jīng)球(d)并且具有更大尺寸(e)。student'st檢驗，***p<0.0001。(f)將原代神經(jīng)球傳代培養(yǎng)并作為單個細胞種板。高度增殖性單個細胞持續(xù)分裂以在種板后3天在懸浮培養(yǎng)中形成次級神經(jīng)球。(g-h)定量顯示出在小分子處理的組中形成的具有較大尺寸(h)的更多次級神經(jīng)球(g)。student'st檢驗，**p<0.001，***p<0.0001。(i)來自次級神經(jīng)球的細胞以單層培養(yǎng)，并對神經(jīng)干細胞標記物sox2(綠色)和巢蛋白(紅色)呈免疫陽性。(j)來自次級神經(jīng)球的細胞在神經(jīng)元分化培養(yǎng)基中分化為神經(jīng)元細胞(tuj1，綠色)，而在神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)基中分化為少突膠質(zhì)細胞(cnpase，紅色)或星形膠質(zhì)細胞(gfap，綠色)。n＝3批次。比例尺：a、i、j＝20μm。c、f＝200μm。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。

圖15、數(shù)據(jù)顯示總共4個小分子可以成功地將人神經(jīng)膠質(zhì)細胞重新編程為神經(jīng)元。(a)將核心藥物，即sb4315425μm、ldn1931890.25μm、chir990211.5μm、dapt5μm，加入人星形膠質(zhì)細胞細胞系ha1800中6天。每兩天更換一次含有藥物的培養(yǎng)基。藥物加入后14天，針對神經(jīng)元標記物neun對細胞進行免疫染色，顯示許多人神經(jīng)膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。(b-c)sb431542被其功能類似物repsox1μm(b)或a-83010.25μm(c)替代。(d)對四組中neun呈免疫陽性的細胞進行定量。將不同的批次歸一化為核心組。sb替換為repsox組的轉(zhuǎn)化率為核心藥物組的88.5±5.0％，而sb替換為a-8301組的轉(zhuǎn)化率為核心藥物組的86.8±5.0％。

圖16、顯示核心藥物功效的數(shù)據(jù)。(a)將核心藥物，即sb4315425μm、ldn1931890.25μm、chir990211.5μm、dapt5μm加入人星形膠質(zhì)細胞細胞系ha1800中6天。每兩天更換一次含有藥物的培養(yǎng)基。藥物加入后14天，針對神經(jīng)元標記物neun對細胞進行免疫染色。(b-c)ldn193189被其功能類似物dorsomorphin1μm(b)和dmh11.5μm(c)替代。(d)對四組中neun呈免疫陽性的細胞進行定量。將不同的批次歸一化為核心組。ldn193189替換為dorsomorphin組與核心組的轉(zhuǎn)化效率相似，而ldn193189替換為dmh1組的轉(zhuǎn)化率為核心組的86.8±4.9％。

圖17、顯示核心藥物功效的數(shù)據(jù)。(a)將核心藥物，即sb4315425μm、ldn1931890.25μm、chir990211.5μm、dapt5μm加入人星形膠質(zhì)細胞細胞系ha1800中6天。每兩天更換一次含有藥物的培養(yǎng)基。藥物加入后14天，針對神經(jīng)元標記物neun對細胞進行免疫染色。(b-c)chir99021被其功能類似物ara0144186μm(b)或sb2167631μm(c)替代。(d)對四組中neun呈免疫陽性的細胞進行定量。將不同的批次歸一化為核心組。chir替換為ara014418組轉(zhuǎn)化率為核心組的56.9±4.3，而chir替換為sb216763的轉(zhuǎn)化率為核心組的76.07±4.2％。

圖18、顯示核心藥物功效的數(shù)據(jù)。a)將核心藥物，即sb4315425μm、ldn1931890.25μm、chir990211.5μm、dapt5μm加入人星形細胞細胞系ha1800中6天。每兩天更換一次含有藥物的培養(yǎng)基。藥物加入后14天，針對神經(jīng)元標記物neun對細胞進行免疫染色。(b-c)dapt被其功能類似物bms9060242μm(b)和ro49290970.5μm(c)替代。(d)對四組中neun呈免疫陽性的細胞進行定量。將不同的批次被歸一化為核心組。dapt替換為ro4929097組實現(xiàn)了與核心組相似的轉(zhuǎn)化率，而dapt替換為bms906024組的轉(zhuǎn)化率為核心組的85.0±6.1％。

圖19、數(shù)據(jù)顯示sb431542、ldn193189、chir99021和dapt中3種藥物的任意組合可以將人神經(jīng)膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元。藥物加入6天，并在藥物處理后14天針對神經(jīng)元標記物neun進行免疫染色。3種藥物組合sb431542/chir99021/dapt似乎比sb431542/ldn193189/chir99021更有效。

具體實施方式

本公開包括設計為將人神經(jīng)膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為功能性神經(jīng)元的組合物和方法。在實施方案中，本公開包括但不一定限于的神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕向神經(jīng)組織的逆轉(zhuǎn)，預期其可用于各種療法，其非限制性實施方案包括腦和脊髓修復。該方法通常包括向有需要的個體施用有效量的包括thiazovivin、ldn193189、sb431542、ttnpb、chir99021、dapt、vpa、sag和2,6,9-三元取代嘌呤和其組合或選自由thiazovivin、ldn193189、sb431542、ttnpb、chir99021、dapt、vpa、sag和2,6,9-三元取代嘌呤和其組合組成的組的化合物的組合，使得個體中的神經(jīng)膠質(zhì)細胞被轉(zhuǎn)化成神經(jīng)元。在實施方案中，使用可選的化合物，其中這些化合物具有與上述化合物相同或相似的作用，并且其中組合的施用導致神經(jīng)膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。

在實施方案中，本公開預期廣泛適用于需要神經(jīng)元產(chǎn)生的任何人類受試者的治療。神經(jīng)元產(chǎn)生的需要增長是影響神經(jīng)元功能和/或減少個體中功能性神經(jīng)元數(shù)量的各種病癥、紊亂或損傷中任何一種的結果。因此，本公開涉及預防和/或治療包括但不一定限于缺血性腦損傷，例如由中風、缺氧或其它腦創(chuàng)傷引起的或由膠質(zhì)瘢痕形成或神經(jīng)退行性疾病引起的的病癥。在實施方案中，本公開涉及治療神經(jīng)退行性紊亂，包括但不限于阿爾茨海默病或表現(xiàn)出癡呆的其它病癥，或慢性創(chuàng)傷性腦病(cte)例如具有急性或復發(fā)性腦創(chuàng)傷(即腦震蕩)病史的運動員，或帕金森病，或亨廷頓舞蹈病，或多發(fā)性硬化癥，或神經(jīng)膠質(zhì)瘤，或脊髓損傷或脊髓性肌萎縮或肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥(als)。

本公開被認為相對于以前的方法是新穎的，因為其不包括將經(jīng)過修飾的細胞或病毒構建體引入受試者。例如，雖然美國專利公開號20130183674公開了使用含有化合物sb431542、ldn1933189、su5402、chir99021和dapt的細胞培養(yǎng)介質(zhì)，用于誘導多能(pluripotent)干細胞或?qū)Ｄ?multipotent)干細胞以形成為傷害感受器細胞(nociceptorcells)，但是限于使用這些化合物用于體外分化這些干細胞，并且重要的是，這種現(xiàn)有技術的方法與我們將神經(jīng)膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元細胞是不同的，因為干細胞可以天然地分化為神經(jīng)元，但是神經(jīng)膠質(zhì)細胞不能變成神經(jīng)元，除非經(jīng)歷重編程過程，例如在本公開中演示的重編程過程。此外，本領域技術人員將認識到，將培養(yǎng)的干細胞或其分化的神經(jīng)元注入人受試者，特別腦，對受試者造成風險(srisk)。同樣，如上所述，已經(jīng)證明星形膠質(zhì)細胞可以在體內(nèi)轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元，但是這些方法涉及將病毒載體或其它外源基因引入受試者中，這也對受試者造成特別的風險。

與先前的方法相反，本公開在各種實施方案中提供了使用完全無細胞和病毒的包括彼此共同起作用以誘導神經(jīng)膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的化學性化合物的藥物制劑，本公開還提供了該過程的體內(nèi)演示。

在實施方案中，本公開包括向有需要的受試者施用有效量的一種或多種組合物，該組合物包含作為活性成分的選自thiazovivin、ldn193189、sb431542、ttnpb、chir99021、dapt、vpa、sag和2,6,9-三元取代嘌呤的化合物的組合。在實施方案中，這些化合物的不同組合依次施用。這些化合物中的每一種在本領域中是已知的并且是可商購獲得的。本公開包括含有這些化合物中的任何三種、四種、五種、六種、七種、八種或全部九種的組合物和方法，并且可以包括本文所述的或本領域技術人員顯而易見的可以給本公開帶來益處的另外的化合物。本公開包括這些化合物的藥學上可接受的鹽、所述化合物和鹽的類似物，以及發(fā)揮與所述化合物相同或相似功能的化合物，條件是將它們的組合施用于個體導致神經(jīng)膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。

在一個實施方案中，本公開包括向個體施用化合物的組合(同時或順序)，其中所述組合包含sb431542、ldn193189、chir99021和dapt中的至少三種或由sb431542、ldn193189、chir99021和dapt中的至少三種組成。不希望受理論束縛，這四種化合物在本文中有時被稱為核心化合物。

對于這些化合物，對本領域技術人員顯而易見的是，sb431542是：-[4-(1,3-苯并二唑-5-基)-5-(2-吡啶基)-1h-咪唑-2-基]苯甲酰胺并具有化學結構：

ldn193189是：4-(6-(4-(哌嗪-1-基)苯基)吡唑并[1,5-a]嘧啶-3-基)喹啉鹽酸鹽并具有化學結構：

chir99021是：6-[[2-[[4-(2,4-二氯苯基)-5-(5-甲基-1h-咪唑-2-基)-2-嘧啶基]氨基]乙基]氨基]-3-腈基吡啶并具有化學結構：

dapt是：n-[(3,5-二氟苯基)乙?；鵠-l-丙氨酰基-2-苯基]甘氨酸-1,1-二甲基乙基酯并具有化學結構：

本領域技術人員將認識到，本公開呈現(xiàn)的化學式和命名中的未明確表明的范圍中，本文所述的每種化合物包括其藥學上可接受的鹽。還將認識到sb-431542是轉(zhuǎn)化生長因子-β超家族i型激活素受體樣激酶(alk)受體alk4、alk5和alk7的抑制劑。ldn-193189是骨形態(tài)發(fā)生蛋白i型受體alk2和alk3的抑制劑。chir99021是糖原合成酶激酶3(gsk-3)的選擇性抑制劑，dapt是γ-分泌酶的抑制劑。因此，具有這些功能的其它化合物(即功能類似物)包括在本公開的范圍內(nèi)。在這方面，本公開提供數(shù)據(jù)證明好使用選自由包含sb431542、ldn193189、chir99021和dapt的四種核心化合物的組的僅三種藥物的組合可以實現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的重編程。此外，本公開提供了這四種核心藥物可以用功能類似物替代并且仍具有相似效果的證據(jù)，即促進人神經(jīng)膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。本文所用的“功能類似物”是指與另一個化合物相比具有相似物理、化學、生物化學或藥理學性質(zhì)的化合物。功能類似物可以具有或可以不具有彼此相似的結構。在本公開中證明了通過轉(zhuǎn)化生長因子β(tgf-β)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白(bmp)、糖原合成酶激酶3(gsk-3)和γ-分泌酶/notch通路而共同作用于信號傳導的組合化合物可將神經(jīng)膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元。這使用藥物組合i)ldn193189/chir99021/dapt、ii)sb431542/chir99021/dapt、iii)ldn193189/dapt/sb431542和iv)ldn193189/chir99021/sb431542進行具體說明(參見實施例9和圖15-19)。此外，證明用功能類似物替代這些化合物可以獲得相同的結果。例如，tgf-β受體抑制劑sb431542可以被其它tgf-β受體抑制劑替代，例如repsox和a8301。同樣地，bmp受體抑制劑ldn193189可以被其功能類似物替代，如使用dorsomorphin和dmh1所證明的。gsk-3抑制劑chir9902可以用諸如ar-a014418和sb216763的功能類似物代替。類似地，γ-分泌酶/notch1信號傳導抑制劑dapt，可以被泛notch(pan-notch)抑制劑bms906024或ro4929097替代。因此，在各種實施方案中，本公開包括通過調(diào)節(jié)tgf-β、bmp、gsk-3和γ-分泌酶/notch信號傳導通路將人神經(jīng)膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元。其它功能類似物描述在表1中。因此，在某些實施方案中，本發(fā)明所涵蓋的sb431542、ldn193189、chir99021和dapt的替代物包括但不一定限于本表中所述的那些：

表1

在實施方案中，施用的組合包括shh激動劑平滑激動劑(sag)，其是音猬因子的激動劑。

因此，從本公開的描述、實施例和附圖中將顯而易見，我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，通過將本文所述的小分子組合能夠?qū)⑷诵切文z質(zhì)細胞直接重編程為功能性神經(jīng)元。在進行這一發(fā)現(xiàn)時，我們測試了許多靶向被認為對激活神經(jīng)發(fā)生的同時抑制神經(jīng)膠質(zhì)發(fā)生重要的信號傳導通路的小分子。我們發(fā)現(xiàn)上述小分子組能夠?qū)⑷诵切文z質(zhì)細胞重編程成神經(jīng)元。更詳細地說，當人星形膠質(zhì)細胞同時暴露于九個小分子共同的庫中時，它們經(jīng)歷嚴重的細胞死亡，并且神經(jīng)元重編程效率低，低于10％。相反，當九個小分子的子集以順序的方式施用時，大多數(shù)人類星形膠質(zhì)細胞(～70％)被重新編程為神經(jīng)元細胞。我們證明這些小分子重編程的人神經(jīng)元可以在培養(yǎng)中存活超過三個月，并顯示出強健的突觸活動。將人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元注入小鼠腦中，顯示這些人神經(jīng)元可以整合到局部腦回路中。這些數(shù)據(jù)共同證明了人星形膠質(zhì)細胞經(jīng)過純化學重編程成為功能性神經(jīng)元的可行性，預期這將導致化學遞送的方便方法，用于治療各種腦損傷和神經(jīng)退行性病癥。此外，我們的結果并不限于體外證明，因為如本文所展示的，將化學重編程的人神經(jīng)元施用于動物產(chǎn)生與在小鼠腦中內(nèi)源性神經(jīng)元的突觸連接。

通常地，本公開的方法包括向受試者施用有效量的本文所述的化合物，使得個體中神經(jīng)元的數(shù)量增加。在實施方案中，將個體中的神經(jīng)膠質(zhì)細胞(例如星形膠質(zhì)細胞)重編程，以使其轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。在實施方案中，新產(chǎn)生的神經(jīng)元主要包含具有少量gaba能神經(jīng)元的谷氨酸能神經(jīng)元。在實施方案中，通過使用本文所描述的方法(必要情況下由本領域技術人員以明顯為本公開帶來益處的方式對該方法做出改變)，預期本公開將促進新皮層前腦神經(jīng)元、或中腦神經(jīng)元、或后腦神經(jīng)元、或脊髓神經(jīng)元或其組合的發(fā)育。在實施方案中，預期本公開的方法將導致轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元的細胞中的內(nèi)源性神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子的增加。在實施方案中，靶細胞表現(xiàn)出ascl1、ngn2、neurod1和組合的表達增加。在實施方案中，經(jīng)過重編程的神經(jīng)元的特征在于表達神經(jīng)元標記物，其包括但不一定限于dcx和neun。在實施方案中，腦中的細胞，例如神經(jīng)膠質(zhì)細胞，被轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。在實施方案中，神經(jīng)元是功能性神經(jīng)元。功能性神經(jīng)元可以表現(xiàn)出包括但不一定限于激發(fā)出重復動作電位、發(fā)育出多個樹枝狀分支和釋放出神經(jīng)遞質(zhì)的性質(zhì)，所述神經(jīng)遞質(zhì)包括但不一定限于谷氨酸(谷氨酸)、多巴胺、乙酰膽堿、5-羥色胺、去甲腎上腺素(去甲腎上腺素)和γ-氨基丁酸(gaba)。

包含本公開化合物的組合物可以在藥物制劑中提供。藥物制劑的形式?jīng)]有特別限制，但通常包含這些活性成分和至少一種非活性成分。在某些實施方案中，合適的藥物組合物可以通過將任何一種化合物或其組合的化合物與藥學上可接受的載體、稀釋劑或賦形劑以及本領域熟知的合適的組分混合來制備。這些載體、稀釋劑和賦形劑的一些實例可以在以下文獻中找到：remington:thescienceandpracticeofpharmacy(2005)21^stedition,philadelphia,pa.lippincottwilliams&wilkins。在實施方案中，藥物制劑適于將活性成分遞送穿過血腦屏障和/或脊髓或中樞神經(jīng)系統(tǒng)的其它部分。這樣的組合物可以包含例如脂質(zhì)制劑或其它基于納米顆粒的遞送系統(tǒng)。

在一個實施方案中，所述藥物制劑適合于口服施用，因此可以以霧化的、液體或固體劑型提供。固體劑型包括但不一定限于片劑、膠囊劑、囊片劑和條劑，用于吞咽或口服溶解，并且可以提供用于快速釋放或延時釋放，或在一段時間內(nèi)以期望的序列釋放不同的化合物。也可以使用包含兩種化合物或任何組合的化合物的分開的藥物組合物。因此，所述藥物制劑可以包含sb431542、ldn193189、chir99021和dapt的任意兩種或任意組合，以及任何其它功能類似物。因此，在某些實施方案中，為了刺激人受試者中神經(jīng)元的重編程的目的，ldn193189、sb431542、chir99021和dapt或這些化合物或它們的功能類似物中的三種的集合可能是必需的。在實施方案中，核心化合物可能對將神經(jīng)膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元可能是需要和充分的。

關于藥物制劑的給藥，給藥途徑可以是任何合適的途徑。在實施方案中，以口服的方式遞送包含所述化合物的組合物。在其它非限制性實施方案中，通過靜脈內(nèi)、非腸道、皮下、腹膜內(nèi)、經(jīng)皮、鼻內(nèi)滴注、通過植入或動脈內(nèi)施用組合物。在實施方案中，可以使用可植入醫(yī)療裝置，例如泵，包括但不限于滲透泵。在實施方案中，經(jīng)顱內(nèi)途徑遞送包含所述化合物的組合物。

鑒于本公開的益處，可以結合本領域技術人員的知識來確定化合物的合適的劑量。在實施方案中，當確定活性成分有效量和給藥方案時，可以考慮個體的體重和年齡、神經(jīng)元損傷或疾病的個人史以及經(jīng)歷相同的神經(jīng)元損傷、或存在神經(jīng)膠質(zhì)瘢痕形成或反應性神經(jīng)膠質(zhì)瘤的風險。在實施方案中，以每天約0.01nmol至約100nmol或更高的量施用化合物，包括本數(shù)并且包括其間的所有整數(shù)和范圍，取決于所使用的遞送方法。在實施方案中，以單次、多次或控制釋放劑量方案提供化合物。在實施方案中，同時或順序施用根據(jù)本公開的sb431542、ldn193189、chir99021和dapt以及其它小分子。

在某些實施方案中，本公開包括被設計為賦予個體與改善的神經(jīng)元健康和/或功能相關的有益效果的營養(yǎng)組合物。在某些實施方案中，本發(fā)明的組合物可用于改善個體的一般健康狀況或個體的認知能力，例如用于改善記憶或維持記憶。在實施方案中，所述組合物可用于改善短期記憶、長期記憶或運動技能的任意或全部，運動技能包括但不一定限于粗略和精細的運動技能。因此，本公開包括使用包含本文所述的小分子的營養(yǎng)補充劑。

在一個實施方案中，本公開包括制品。在某些方面，制品包括封閉或密封的包裝，其包含兩種本文所述的化合物或本文所述的化合物的組合，例如分開的片劑、膠囊劑等。所述包裝可以包括一個或多個容器，例如封閉或密封的小瓶、瓶子、泡罩(blister)(泡狀物(bubble))包裝或用于銷售、分配或藥劑使用的任何其它合適的包裝。因此，所述包裝可以包含藥物組合物，該藥物組合物包括所有sb431542、ldn193189、chir99021和dapt、或這些化合物中僅三種化合物、或功能類似物和/或本文所述的其它化合物?？梢园ㄟ@些化合物中的任意兩種或全部，并且每種可以在相同或不同的劑量制劑中分開單獨提供或與一種或多種其它物質(zhì)組合提供，以使其可以同時或順序遞送。在一個實施方案中，ldn193189或sb431542或其組合與chir99021或dapt或其組合分開提供。

除了藥物組合物之外，包裝可以包含印刷信息。印刷信息可以提供在標簽上或插入的紙上，或打印在包裝材料本身上。印刷信息可以包括識別包裝中的活性劑、非活性成分的量和類型、藥物組合物旨在治療的病癥的指示、和服用藥物組合物的說明書的信息，例如給定時間段服用的劑量數(shù)量，服用組合物的順序等的信息。因此，在各種實施方案中，本公開包括包裝在包裝材料中并以在包裝材料上或包裝材料中印刷而識別的本發(fā)明的藥物組合物，所述組合物用于治療或預防任何與神經(jīng)元惡化、神經(jīng)元不足或神經(jīng)元功能缺陷有關疾病、病癥或紊亂。在另一個實施方案中，除了藥物組合物，本公開包括營養(yǎng)制劑，并且印刷材料提供關于使用這樣的制劑以提高認知功能、記憶、運動功能、總體健康等的信息。

提供以下具體實施例來說明本發(fā)明，但不旨在以任何方式進行限制。在參考圖中的顏色的情況下，標簽被提供為參考顏色的代表性樣品。

實施例1

該實施例證明了成功地通過如上所述小分子將人星形膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元。這些實驗設計用于開發(fā)采用諸如但不限于可容易地被患者服用的口服施用藥物的方法通過小分子將人星形膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元的便捷方法。因此，我們研究了小分子是否可以代替神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子而將神經(jīng)膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元。我們使用用于化學重編程培養(yǎng)中的人皮層星形膠質(zhì)細胞(ha1800，sciencell，sandiego，ca，usa)，用于人腦修復的臨床應用?；趦蓚€主要的選擇標準：一個ct抑制神經(jīng)膠質(zhì)的信號傳導通路，另一個是激活神經(jīng)元的信號傳導通路，我們選擇20種小分子作為我們的起始候選庫。包括一些分子是因為它們可以調(diào)節(jié)dna或組蛋白結構以提高重編程效率。選擇用于我們初始篩選的20種小分子是：sb431542、repsox、ldn193189、dorsomorphin、dapt、bms-299897、chir99021、tws119、thiazovivin、y27632、sag、2,6,9-三元取代嘌呤(purmorphamine)、ttnpb、ra、vpa、毛喉素、bix01294、rg-108、isx9和stattic。

我們主要使用在原代培養(yǎng)中的人皮層星形膠質(zhì)細胞(ha1800，sciencell，sandiego，ca，usa)進行化學重編程。人星形膠質(zhì)細胞被分離、傳代并維持在具有10％胎牛血清(fbs)的培養(yǎng)基中，以減少可能的祖細胞污染，因為fbs刺激祖細胞的分化。對于初始測試，我們將一組小分子共同應用于人星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物，但在藥物治療2天后觀察到大量細胞死亡。為了減少細胞死亡，我們在不同的時間點添加了較少的小分子。每種分子用一系列不同的濃度進行測試，以找出重編程的最佳濃度。在測試了數(shù)百種不同的組合后，我們發(fā)現(xiàn)了當以逐步方式添加9種小分子的組合時，9種小分子的組合能夠?qū)⑷诵切文z質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元(圖1a)。此9種小分子的組以下簡稱為主轉(zhuǎn)化分子(mcm)。具體來說，人星形膠質(zhì)細胞首先用ldn193189(0.25μm)、sb431542(5μm)、ttnpb(0.5μm)和thiazovivin(tzv，0.5μm)處理2天。sb431542是tgfβ/激活受體的抑制劑，其在早期神經(jīng)發(fā)育期間參與抑制神經(jīng)元的去向(fate)并促進神經(jīng)膠質(zhì)細胞的去向。類似地，ldn193189是bmp受體的抑制劑，其是tgfβ受體的成員，對于星形膠質(zhì)細胞分化是重要的。ttnpb是視黃酸受體的激動劑，據(jù)報道其在中樞神經(jīng)系統(tǒng)模式中是至關重要的。我們使用ldn193189、sb431542和ttnpb的組合，以通過抑制神經(jīng)膠質(zhì)信號傳導通路并同時激活神經(jīng)元信號傳導通路來啟動重編程過程。tzv是rho相關激酶(rock)的抑制劑，促進細胞存活，并且據(jù)報道可提高ipsc重編程效率。tzv貫穿包括于重編程期間的8天內(nèi)。在初始兩天的引發(fā)后，我們用包括chir99021(1.5μm)，dapt(5μm)和vpa(0.5mm)的第二組小分子替換了第一組3種小分子(ldn193189、sb431542和ttnpb)。chir99021是糖原合成酶激酶3(gsk3)的抑制劑。gsk3信號傳導促進神經(jīng)祖細胞體內(nèi)平衡和新皮層神經(jīng)誘導。dapt(n-[n-(3,5-二氟苯乙?；?-l-丙氨酰]-s-苯基甘氨酸叔丁酯)，間接抑制notch信號傳導通路的γ-分泌酶抑制劑，有效地誘導祖細胞的神經(jīng)分化。vpa(丙戊酸)是組蛋白脫乙酰酶抑制劑，促進組蛋白乙酰化。vpa僅包含在重編程培養(yǎng)基中2天，因為更長的暴露增加細胞死亡，而chir99021和dapt在第3天至第6天存在。在第7至第8天，我們使用sag(0.1μm)和2,6,9-三元取代嘌呤(purmo，0.1μm)，兩種用于激活音猬因子(shh)信號傳導通路的激動劑，以完成重編程過程。shh信號傳導是cns模式的關鍵決定因素。sag和purmo或shh本身已被用于誘導多能干細胞的神經(jīng)元分化。在第9天，我們除去培養(yǎng)基中的sag和purmo，并用神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf、nt3和igf-1)替代，以促進星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元轉(zhuǎn)化后的神經(jīng)元成熟。這種成功的重編程策略如圖1a所示。

在重編程之前，我們表征了我們的培養(yǎng)物中的人星形膠質(zhì)細胞的特性，并發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細胞對星形膠質(zhì)細胞標記物gfap(79.3±4.9％)和glt1(星形膠質(zhì)細胞特異性谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白，82.5±4.3％)呈免疫陽性，沒有檢測到神經(jīng)元(圖1b-c)。我們發(fā)現(xiàn)人星形細胞培養(yǎng)物中幾乎沒有神經(jīng)干細胞的污染，如通過sox2、musashi和巢蛋白的免疫染色(圖8a-b)所示，可能是由于在我們的培養(yǎng)基中存在10％fbs。在補充有生長因子(bdnf、nt3和ngf)的神經(jīng)分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)人星形膠質(zhì)細胞一個月后，進一步確認：大多數(shù)細胞對星形膠質(zhì)細胞標記物(s100β、gfap、谷氨酰胺合成酶、glt1)呈免疫陽性，但是對神經(jīng)元或ng2細胞很少陽性(圖8c-d)。此外，我們進行了膜片鉗記錄，并證明我們培養(yǎng)的人星形膠質(zhì)細胞是功能性的，具有大的k+電流和谷氨酸轉(zhuǎn)運體電流，但沒有na+電流，并且在星形膠質(zhì)細胞之間形成間隙聯(lián)結(圖8e-h)。在沒有小分子的對照重編程培養(yǎng)基(1％dmso)中，在我們的人皮層星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物中幾乎沒有檢測到神經(jīng)元(圖1d)。相比之下，在順序暴露于小分子后，我們發(fā)現(xiàn)大量的對神經(jīng)元標記物諸如雙皮層素(dcx)、β3-微管蛋白(tuj1)、map2和neun呈免疫陽性的神經(jīng)元樣細胞(圖1e-f)。人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元在我們的培養(yǎng)物中存活4-5個月，并發(fā)育出強健的軸突和樹突(圖1g)。為了使得從星形膠質(zhì)細胞到神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化過程可視化，我們用1μl編碼egfp的逆轉(zhuǎn)錄病毒感染人星形膠質(zhì)細胞，以使得在每個蓋玻片中僅觀察到少量的egfp陽性的星形膠質(zhì)細胞(圖9)。我們進行了隨時間推移的成像來監(jiān)測人星形膠質(zhì)細胞的形態(tài)學變化。在沒有小分子的情況下，人星形膠質(zhì)細胞從第0天到第8天的形態(tài)沒有變化(圖9a)，并且對于神經(jīng)膠質(zhì)細胞標記物gfap呈免疫陽性(圖9b)。相比之下，在小分子處理期間，從第8天到第10天隨著長軸突的延伸存在明顯從星形膠質(zhì)細胞形態(tài)到神經(jīng)元形態(tài)明顯的轉(zhuǎn)變(圖9c)。隨時間推移進行成像后，我們在第21天固定細胞并進行免疫染色。gfp標記的神經(jīng)元樣細胞確實對neun和tuj1呈免疫陽性(圖9d)。我們進一步使用gfap::gfp逆轉(zhuǎn)錄病毒標記星形膠質(zhì)細胞(91±6.7％的gfap::gfp感染細胞為gfap⁺)，并示蹤星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元轉(zhuǎn)化過程(圖9e)。在小分子處理后18天，gfp標記的星形膠質(zhì)細胞有效轉(zhuǎn)化為neun⁺神經(jīng)元(68.7±4.2％，圖1h，n＝5批次)；而沒有經(jīng)過小分子處理的對照組沒有檢測到神經(jīng)元(圖9f-g)。使用lcn2::gfp逆轉(zhuǎn)錄病毒(88.5±3％的lcn2::gfp標記的細胞為gfap⁺)以示蹤星形膠質(zhì)細胞-神經(jīng)元轉(zhuǎn)化(圖9h-j)獲得了相似的結果，54.4±5.3％的lcn2::gfp標記的星形膠質(zhì)細胞在小分子處理后18天(n＝3批次)變成neun⁺神經(jīng)元。通過譜系示蹤實驗獲得的轉(zhuǎn)化效率與小分子處理誘導的整體轉(zhuǎn)化效率相似(圖1i-j；對照組，3.3±0.5％tuj1⁺，n＝4批次；mcm，67.1±0.8％tuj1⁺，n＝4批次；p<0.0001，studentt檢驗)。

為了研究來自不同來源的人星形膠質(zhì)細胞是否可以使用相同的小分子方案重編程為神經(jīng)元，我們進一步測試了來自sciencell的人中腦星形膠質(zhì)細胞和人脊髓星形膠質(zhì)細胞。有趣的是，采用我們的逐步9種小分子策略人中腦星形膠質(zhì)細胞有效地重編程為神經(jīng)元(圖1k-m、圖10a-f)，而采用相同的方案不能使人脊髓星形膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元(數(shù)據(jù)未示出)。這個結果表明我們的化學重編方案更適合于人腦來源的星形膠質(zhì)細胞。為了進一步測試我們的小分子重編程策略是否普遍適用于來自不同來源的人星形膠質(zhì)細胞，我們從gibco購買了人星形膠質(zhì)細胞，并發(fā)現(xiàn)也可以使它們重編程為神經(jīng)元(圖10g-i)。為了確保我們的化學重編程方法不涉及人星形膠質(zhì)細胞重分化為神經(jīng)祖細胞，我們在第0至第10天的化學重編程過程中監(jiān)測了sox2、巢蛋白、pax6和ki67信號，并與神經(jīng)祖細胞進行比較(圖11)。雖然sox2在重編程期間顯示出一些增加，但從未達到神經(jīng)祖細胞的水平(圖11a、g)。巢蛋白和pax6在小分子處理過程中沒有顯著增加(圖11b-c、h-i)。ki67標記的增殖細胞在小分子處理后顯著降低(圖11d、j)，表明沒有可以擴增并且產(chǎn)生神經(jīng)元的祖細胞。此外，當我們在化學處理之前用brdu標記人星形膠質(zhì)細胞時，許多轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元呈brdu陽性(圖11e、k)；然而，當我們在小分子處理后第10天用brdu標記我們的細胞培養(yǎng)物時，基本上所有轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元對brdu呈陰性(圖11f、k)，表明所有的神經(jīng)膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元的轉(zhuǎn)化發(fā)生在小分子存在期間?？偠灾?，我們已經(jīng)開發(fā)了利用定義的小分子組合將人星形膠質(zhì)細胞化學重編程為神經(jīng)元的成功策略。

實施例2

本實施例證明根據(jù)本公開產(chǎn)生的小分子轉(zhuǎn)化的人神經(jīng)元在激發(fā)動作電位和釋放神經(jīng)遞質(zhì)方面是全功能的。特別地，我們發(fā)現(xiàn)小分子轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元存活了很長時間(>5個月)，并且沿樹突顯示出強健的突觸點(圖2a)。類似地，從中腦人星形膠質(zhì)細胞和gibco的人星形膠質(zhì)細胞重新編程的神經(jīng)元也在培養(yǎng)中存活了多于2個月，沿樹突上具有許多突觸點(圖10f、i)。膜片鉗記錄顯示出星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元中明顯的鈉電流和鉀電流，并在神經(jīng)元的成熟期間逐漸增加(圖2b-e；2個月：ina＝1889±197pa，n＝10；ik＝2722±263pa，n＝10)。這些神經(jīng)元能夠激發(fā)重復動作電位(圖2f)。更重要的是，小分子轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元顯示出強健的自發(fā)性突觸活動，包括興奮性突觸后電流(epsc；頻率＝0.66±0.14hz；振幅＝24.8±8.2pa，n＝15)(圖2g-h)和抑制性突觸后電流(ipsc；頻率＝0.48±0.21hz；振幅＝23.3±6.3pa，n＝2)(圖2i)。值得注意的是，在初次小分子處理后3個月，人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元顯示出被ttx或dnqx消除的大的周期性爆發(fā)活動(圖2j-l)，表明這些神經(jīng)元形成功能性網(wǎng)絡并開始一起同步激發(fā)。為了支持這一觀點，我們進行了雙重全細胞記錄，并證明兩個相鄰神經(jīng)元顯示同步爆發(fā)活動(圖2m)。此外，我們采用fura-2ca²⁺比例成像，并記錄化學重編程的神經(jīng)元中的同步ca²⁺尖峰(圖2n)，表明這些神經(jīng)元已經(jīng)在功能上聯(lián)網(wǎng)在一起。因此，人星形膠質(zhì)細胞可以用定義的小分子進行化學重編程為全功能的神經(jīng)元。

實施例3

本實施例證明本文所述的小分子將人星形膠質(zhì)細胞重編程為前腦谷氨酸能神經(jīng)元。為了表征小分子誘導的重編程后的神經(jīng)元特性，我們檢查了從前向到后向神經(jīng)系統(tǒng)表達的神經(jīng)元標記物。我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元對于前腦標記物foxg1呈免疫陽性(97.1±1.1％，圖3a，n＝3批次)，但對后腦和脊髓標記物hoxb4和hoxc9呈陰性(圖3b-c，n＝3批次)。我們接下來用各種皮層神經(jīng)元標記物進行了一系列免疫染色。我們發(fā)現(xiàn)人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元大部分對皮層表層標記物cux1呈免疫陰性(圖3d)，但對于深層標記物ctip2(圖3e，71.4±3％，n＝5批次)和otx1(圖3f)呈免疫陽性。人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元對前腦神經(jīng)元標記物tbr1(圖3g，86.4±3.4％，n＝3批次)以及海馬神經(jīng)元標記物prox1(圖3h)也是免疫陽性的。圖3i顯示了定量結果。因此，我們的經(jīng)過化學重編程的神經(jīng)元主要是前腦深層神經(jīng)元或海馬神經(jīng)元。

我們進一步研究基于它們所含的神經(jīng)遞質(zhì)的神經(jīng)元亞型。我們發(fā)現(xiàn)大多數(shù)小分子重編程的神經(jīng)元對于谷氨酸能神經(jīng)元標記物vglut1呈免疫陽性(圖3j)。小部分的轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元對gaba能神經(jīng)元標記物gad67呈免疫陽性(圖3k)。另一方面，星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元對膽堿能標記物vacht(圖3l)、多巴胺能標記物th(圖3m)或脊髓運動神經(jīng)元標記物isl1(圖3n)主要呈免疫陰性。神經(jīng)元亞型的定量分析如圖3o所示。(vglut1，88.3±4％，n＝4批次；gad67，8.2±1.5％，n＝4批次)。這些結果表明采用我們的小分子重編程方案谷氨酸能神經(jīng)元是主要亞型?？赡苄枰煌男》肿訉⑷诵切文z質(zhì)細胞重編程為其它神經(jīng)元亞型。

實施例4

本實施例證明在化學重編程期間內(nèi)源性神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子的活化。為了了解化學重編程的分子機制，我們首先使用pcr陣列(qiagen)來研究基因譜變化。在小分子處理后的第4天，我們發(fā)現(xiàn)在包括ngn1/2、neurod1和ascl1的幾種神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子的轉(zhuǎn)錄水平以及未成熟的神經(jīng)元標記物dcx中高達300倍的顯著增加(圖4a)。在第8天，轉(zhuǎn)錄水平上最顯著的變化是未成熟神經(jīng)元基因dcx，其顯示出2000倍的增加(圖4b)，表明小分子處理結束時大多數(shù)新轉(zhuǎn)化的細胞是未成熟神經(jīng)元。相比之下，神經(jīng)膠質(zhì)細胞相關基因通常是下調(diào)的(圖4a-b)。然后我們進行實時定量pcr實驗，以檢查化學重編程過程中在時間進程上ngn2、neurod1和星形膠質(zhì)細胞基因gfap和aldh1l1的轉(zhuǎn)錄變化(圖4c-f)。有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在小分子處理期間，ngn2轉(zhuǎn)錄在第4天達高峰(圖4c)，而neurod1在第6天達到高峰(圖4d)，這與早期腦發(fā)育過程中它們的順序表達一致。對于神經(jīng)膠質(zhì)細胞基因，gfap轉(zhuǎn)錄水平在d4顯著降低超過200倍(圖4e)，折與神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子的活化一致(圖4c-d)。類似地，另一種星形細胞基因aldh1l1的轉(zhuǎn)錄水平也下調(diào)(圖4f)。相比之下，沒有經(jīng)過小分子處理的對照實驗顯示出極少的轉(zhuǎn)錄變化(圖12a-f)。因此，我們的小分子處理激活神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子，同時抑制星形膠質(zhì)細胞基因。

實施例5

本實施例提供了關于表觀遺傳調(diào)節(jié)是否參與我們的化學重編程的研究。基因啟動子中的dna甲基化影響轉(zhuǎn)錄因子結合的可及性，因此成為多能干細胞重編程的限速因子。我們進行甲基化dna免疫沉淀，然后進行測序(medip-seq，甲基化dna免疫共沉淀測序)，以檢查小分子處理之前和之后感興趣的基因的甲基化水平。如預期的那樣，在小分子處理(d0)之前，人星形膠質(zhì)細胞中gfap基因的啟動子區(qū)域最初未被甲基化，但在小分子處理8天后檢測到甲基化明顯增加(圖4g)。通過靶向亞硫酸氫鹽測序(bs-seq)進一步證實了這種增加的甲基化(圖4h)。值得注意的是，該gfap啟動子區(qū)域含有已被證明在gfap基因的激活中起關鍵作用的stat3和ap1的轉(zhuǎn)錄因子結合位點。bs-seq數(shù)據(jù)顯示stat3和ap1結合區(qū)域的側(cè)翼位點是高度甲基化的(圖4h)，這可以解釋為什么gfap轉(zhuǎn)錄在小分子處理后顯著下調(diào)(圖4e)。我們的medip-seq還顯示在小分子處理后gfap轉(zhuǎn)錄起始位點(tss)的dna甲基化增加，這也被bs-seq證實(圖4i)。與神經(jīng)膠質(zhì)細胞基因gfap相反，神經(jīng)元基因nefm(對神經(jīng)元特異的中等規(guī)模的神經(jīng)絲基因)在小分子處理后顯示啟動子區(qū)域的甲基化信號降低(圖4j-k)，表明神經(jīng)元基因的激活。我們還研究了參與神經(jīng)元分化的重要基因-轉(zhuǎn)錄因子ngn2的表觀遺傳調(diào)控。medip-seq分析表明，與以前的報道一致(covic等人，2010)，ngn2啟動子區(qū)域的甲基化水平在小分子處理前后相當?shù)?數(shù)據(jù)未顯示)。除了dna甲基化，組蛋白修飾也可以調(diào)節(jié)基因表達。因此，我們進一步研究了ngn2啟動子區(qū)和轉(zhuǎn)錄起始位點的組蛋白修飾(圖4l-o)。與化學重編程過程中hdac抑制劑vpa的應用一致，觀察到組蛋白乙?；赿8顯著增加(圖4m)。有趣的是，h3k4me3水平在啟動子區(qū)域顯著增加(圖4n)，而在d8h3k27me3水平在轉(zhuǎn)錄起始位點顯著降低(圖4o)，這與小分子處理誘導的ngn2的轉(zhuǎn)錄激活一致。綜上，我們的研究結果表明，我們的化學重編程過程涉及轉(zhuǎn)錄調(diào)控和表觀遺傳調(diào)控二者。

為了證實我們的轉(zhuǎn)錄分析和表觀遺傳學分析，我們進一步進行免疫染色以檢查化學重編程過程中的蛋白質(zhì)表達變化(圖5)。我們發(fā)現(xiàn)在用ldn193189、sb431542和ttnpb進行2天處理后ascl1表達水平首次顯示出顯著增加(圖5a和g)。在小分子處理后，ngn2的表達水平在d4顯示峰值(圖5b和h；在chir99021、dapt和vpa存在下)。與ascl1和ngn2相比，neurod1的表達似乎延遲，在小分子處理后d6達到峰值(圖5c和i)，這與我們的轉(zhuǎn)錄研究一致(圖4c-d)。此外，免疫染色實驗還顯示，在neurod1的峰值表達之后，一些細胞在d4-d6開始顯示諸如dcx的神經(jīng)元標記物(圖5d)，并且在d8-d10出現(xiàn)neun+神經(jīng)元(圖5e和j)。與神經(jīng)元標記物的增加相反，星形膠質(zhì)細胞蛋白gfap在小分子處理后表現(xiàn)出顯著降低(圖5f和k)，這與gfap基因的表觀遺傳沉默和轉(zhuǎn)錄下調(diào)一致。在沒有經(jīng)過小分子處理的情況下培養(yǎng)10天的對照星形膠質(zhì)細胞在神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子、神經(jīng)元蛋白neun或星形膠質(zhì)細胞蛋白gfap的表達水平上沒有顯示太大的變化(圖13)。這些實驗表明我們的小分子策略已成功激活內(nèi)源性神經(jīng)轉(zhuǎn)錄因子，這可能在星形膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元中起重要作用。

實施例6

本實施例描述了在化學重新編程期間每種單獨化合物的功能作用的分析。為了剖析每個單個分子對重編程的貢獻，我們通過從我們的雞尾酒庫(cocktailpool)中取消每個單獨的化合物進行了一系列實驗(圖6)。與順序暴露于總共9種分子相比，除去dapt導致轉(zhuǎn)化神經(jīng)元數(shù)量的最顯著降低(圖6a-c)。類似地，除去chir99021或sb431542或ldn193189也顯著降低了重編程效率(圖6d-f)。除去vpa或sag+purmo會稍微降低重編程效率(圖6g-h)。有趣的是，除去tzv或ttnpb對星形膠質(zhì)細-神經(jīng)元重編程沒有顯著影響(圖6i-j)。圖6k說明藥物取消實驗的總結數(shù)據(jù)。雖然tzv因為主要作為細胞存活因子而沒有任何效果并不奇怪，但是出人意料的是，除去ttnpb沒有影響。我們將ttnpb包括在內(nèi)，因為它是被發(fā)現(xiàn)在神經(jīng)分化中起重要作用的視黃酸受體的激動劑。ttnpb貢獻的缺乏表明視黃酸可能不是將星形膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元的必要因素。因此，本公開包括組合物不包括ttnpb的條件。另一方面，抑制notch信號傳導、gsk-3β和bmp/tgfβ信號傳導通路似乎對將星形膠質(zhì)細胞重新編程為神經(jīng)元是重要的。為了確保在我們的小分子處理過程中這些信號傳導通路確實被抑制，我們對磷酸化的smad1/5/9、notch細胞內(nèi)結構域(nicd)和磷酸化的gsk3β(圖12g-1)進行了一系列免疫染色。我們的結果顯示，在小分子處理后，bmp/tgfβ、notch和gsk3β信號傳導通路被顯著抑制(圖12g-i)，這表明這些信號傳導通路的抑制與星形膠質(zhì)細胞向神經(jīng)元轉(zhuǎn)化之間的密切聯(lián)系。

實施例7

本實施例提供了人神經(jīng)元在重編程之后在小鼠腦中的體內(nèi)整合的演示。我們進一步研究人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元是否能夠在小鼠腦中體內(nèi)存活。為了將人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元與腦內(nèi)預先存在的小鼠神經(jīng)元區(qū)分開，我們使用egfp-慢病毒在小分子處理之前感染人類星形膠質(zhì)細胞，以使人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元大部分被egfp標記(圖7a)。在初次小分子處理后14天，我們收獲含有轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元和未轉(zhuǎn)化的星形膠質(zhì)細胞二者的細胞，并將其注入新生小鼠的側(cè)腦室(圖7a)。在細胞注射后7天(dpi)，我們在側(cè)腦室內(nèi)發(fā)現(xiàn)了一簇egfp標記的細胞，其均對人核(hunu，圖7b)呈免疫陽性，這表明這些細胞源自注射的人細胞。重要的是，我們發(fā)現(xiàn)許多egfp標記的人細胞對神經(jīng)元標記物dcx(圖7b)、map2(圖7c)和neun(圖7d)呈免疫陽性，這表明人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元可以在小鼠腦中體內(nèi)存活。甚至在細胞注射后一個月，我們?nèi)匀荒軌蜃R別與側(cè)腦室如丘腦和紋狀體相鄰的腦區(qū)域中的egfp標記的神經(jīng)元簇(圖7e)，這表明人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元可能已遷移出側(cè)腦室并集成到局部神經(jīng)回路中。在支持這一觀念的同時，我們發(fā)現(xiàn)沿著egfp+人神經(jīng)元的樹突上有許多突觸點(圖7f)，這表明這些移植的人神經(jīng)元已經(jīng)與宿主神經(jīng)元建立了突觸連接。總之，這些體內(nèi)實驗證明，我們的小分子重編程的人神經(jīng)元不僅可以在小鼠腦中存活，而且可以整合到局部神經(jīng)回路中。

我們還嘗試采用我們的小分子策略在體外和體內(nèi)將小鼠星形膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元。我們發(fā)現(xiàn)經(jīng)過小分子處理的小鼠星形膠質(zhì)細胞比溶劑對照組在體內(nèi)表達更多的巢蛋白信號(圖14a-b)。因此，我們分離了小分子注射區(qū)域周圍的皮層組織并在體外培養(yǎng)。有趣的是，經(jīng)過小分子處理的皮層組織比溶劑對照組產(chǎn)生更多的神經(jīng)球(圖14c-h)。這些神經(jīng)球可以解離成神經(jīng)干細胞并產(chǎn)生神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和少突膠質(zhì)細胞(圖14i-j)。

實施例8

本實施例提供了用于獲得本公開數(shù)據(jù)的材料和方法的描述。

人類星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)物。人星形膠質(zhì)細胞購自sciencell(ha1800，加利福尼亞)或gibco(n7805-100)。人星形膠質(zhì)細胞是從人胎兒腦組織獲得的原代培養(yǎng)物。將它們分離出來并在10％胎牛血清(fbs)的存在下培養(yǎng)，這基本上會導致任何祖細胞的分化。人星形膠質(zhì)細胞在它們超過90％融合度時被傳代培養(yǎng)。對于傳代培養(yǎng)，通過tryple^tmselect(invitrogen)對細胞進行胰蛋白酶消化，以900rpm離心5分鐘，重新懸浮，并鋪板于由dmem/f12(gibco)、10％胎牛血清(gibco)、青霉素/鏈霉素(gibco)、3.5mm葡萄糖(sigma)組成并補充有b27(gibco)、10ng/ml表皮生長因子(egf，invitrogen)和10ng/ml成纖維細胞生長因子2(fgf2，invitrogen)的培養(yǎng)基中。將細胞培養(yǎng)在37℃含有5％co2的潮濕空氣中。

將人星形膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元。在24孔板(bdbiosciences)中，以每蓋玻片50000個細胞的密度在聚-d-賴氨酸(sigma)包被的蓋玻片(12mm)上培養(yǎng)星形膠質(zhì)細胞。將細胞在人星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)至90％融合度。在重新編程前的第0天，用由dmem/f12(gibco)、青霉素/鏈霉素(gibco)和n2補充劑(gibco)組成的n2培養(yǎng)基替代一半的培養(yǎng)基。接下來的一天(第1天)，培養(yǎng)基全部被補充有小分子的n2培養(yǎng)基或含有1％dmso的n2培養(yǎng)基對照組完全替代。對于使用9個分子進行重編程(mcm處理)的大多數(shù)實驗，使用ttnpb(0.5μm，tocris#0761)、sb431542(5μm，tocris#1614)、ldn193189(0.25μm，sigma#sml0559)和thiazovivin(0.5μm，cayman#14245)持續(xù)處理星形膠質(zhì)細胞2天。在第三天，使用包括chir99021(1.5μm，tocris#4423)、dapt(5μm，sigma#d5942)、vpa(0.5mm，cayman#13033)和thiazovivin(0.5μm)的不同組小分子替代培養(yǎng)基。在第5天，通過替換僅含有chir99021(1.5μm)、dapt(5μm)和thiazovivin(0.5μm)的培養(yǎng)基而撤出vpa。在第7天，使用含有sag(0.1μm，cayman#11914)、2,6,9-三元取代嘌呤(purmo，0.1μm，cayman#10009634)和thiazovivin(0.5μm)的培養(yǎng)基進行替換。在第9天，使用含有dmem/f12(gibco)、0.5％fbs(gibco)、3.5mm葡萄糖(sigma)、青霉素/鏈霉素(gibco)和n2補充劑(gibco)的神經(jīng)元分化培養(yǎng)基(ndm)對培養(yǎng)基進行全部替換。每周將200l的神經(jīng)元分化培養(yǎng)基加入每個孔中以保持滲透壓不變。為了促進轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元的突觸成熟，在第9天將腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(bdnf，20ng/ml，invitrogen)、胰島素樣生長因子1(igf-1，10ng/ml，invitrogen)和神經(jīng)營養(yǎng)蛋白3(nt-3，10ng/ml，invitrogen)添加到神經(jīng)元分化培養(yǎng)基中，并且每四天更新一次直到第30天(song等人，2002)。

為了檢查我們的人星形膠質(zhì)細胞是否含有任何神經(jīng)干細胞，我們在補充有bdnf20ng/ml、nt310ng/ml和ngf10ng/ml的神經(jīng)元分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)人星形膠質(zhì)細胞1個月。生長因子每3-4天更新一次。

衍生自人多能干細胞的人神經(jīng)祖細胞(npc)是來自fredgage博士的禮物。在含有dmem/f12、青霉素/鏈霉素、b27補充劑、n2補充劑和fgf2(20ng/ml)(gibco)的神經(jīng)元增殖培養(yǎng)基的聚-l-鳥氨酸和層粘連蛋白包被的蓋玻片中培養(yǎng)npc。

數(shù)據(jù)和統(tǒng)計分析。細胞計數(shù)是通過對每個蓋玻片上的幾個隨機選擇的視野拍攝圖像并通過imagej軟件進行分析而進行。通過imagej軟件分析熒光強度。數(shù)據(jù)表示為平均值±sem。studentt檢驗用于比較兩組數(shù)據(jù)。單因素方差分析和事后檢驗用于多組數(shù)據(jù)的統(tǒng)計分析。

體內(nèi)小分子轉(zhuǎn)化的人神經(jīng)元的移植。用野生型c57/bl6小鼠進行體內(nèi)實驗。小鼠在12小時光照/黑暗循環(huán)中飼養(yǎng)，并提供足夠的食物和水。實驗方案由賓夕法尼亞州立大學iacuc批準，并與國家衛(wèi)生研究院的指導方針一致。

用10μlfugw-gfp慢病毒懸浮液轉(zhuǎn)導在t25燒瓶中培養(yǎng)的人星形細胞用于高效感染。在病毒轉(zhuǎn)導后一天，用tryple解離細胞，并以每蓋玻片50000個細胞的密度鋪在24孔板中聚-d-賴氨酸包被的蓋玻片上。當細胞達到90％融合度時，約70％的細胞是gfp陽性的。在gfp感染后，根據(jù)上述方案用小分子處理人星形膠質(zhì)細胞。在初次小分子處理后的第14天，用accutase(gibco)將人星形膠質(zhì)細胞和轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元的混合物解離，并用補充有10ng/mlbdnf、10ng/mlnt3和10ng/mligf-1的20μl神經(jīng)元分化培養(yǎng)基重懸浮。將含有2×10⁵個細胞的細胞懸浮液注射到新生小鼠幼仔(出生后第1天，p1)的側(cè)腦室，每個半球注射2μl。使用立體定位裝置(hamilton)，將細胞距離人字縫尖(lambda)前面1.5mm和側(cè)面1.5mm以及深度1mm注射。在注射后7、11、14天和1個月收集腦，以進行分析。

免疫細胞化學。對于腦切片染色，將小鼠用2.5％阿佛丁(avertin)麻醉，然后用冰冷的包括：124mmnacl、26mmnahco3、10mm葡萄糖、1.3mmmgso4、1.25mmnah2po4、2.5mmkcl、2.5mmcacl2的人工腦脊髓液(acsf)灌注。取出大腦并在4℃下在4％多聚甲醛(pfa)中固定過夜。將來自年輕小鼠(<1月齡)的腦用30％蔗糖脫水2天，并用低溫恒溫器(leica)以50μm切片切割。成年小鼠(>1個月齡)的大腦通過振動切片機(leica)以45μm切片切割。將冠狀腦切片在2.5％正常山羊血清、2.5％正常驢血清和0.3％tritonx-100的磷酸鹽緩沖鹽水(pbs，ph7.4)中孵育2小時，然后在一抗中孵育過夜。

對于細胞培養(yǎng)染色，在室溫下將培養(yǎng)物在4％pfa的pbs中固定15分鐘。首先用pbs洗滌細胞三次，然后在2.5％正常山羊血清、2.5％正常驢血清和0.1％tritonx-100的pbs中孵育30分鐘。在4℃下將一抗與腦切片或培養(yǎng)物在3％正常山羊血清、2％正常驢血清和0.1％tritonx-100的pbs中孵育過夜。在pbs中再一次洗滌后，在室溫下將樣品與和alexafluor488、alexa546、alexa647(1:800，分子探針)、fitc、tritc或dylight(1:500，jacksonimmunoresearch)綴合的適當?shù)亩狗跤?h，然后在pbs中進行充分洗滌。最后將蓋片用帶有含dapi(invitrogen)的抗褪色固定溶液固定在載玻片上。用熒光顯微鏡(keyencebz-9000)或共聚焦顯微鏡(olympusfv1000)分析載玻片。使用fv10-asw3.0viewer軟件(olympus)獲取并分析z-stack數(shù)字圖像。

電生理學。對于人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元，利用使用已知技術的multiclamp700a膜片鉗放大器(moleculardevices，paloalto，ca)進行全細胞記錄。使用由128mmnacl、30mm葡萄糖、25mmhepes、5mmkcl、2mmcacl2和1mmmgcl2組成的浴液不斷灌注記錄室。用naoh將浴液ph溶液調(diào)至7.3，滲透壓為315-325mosm/l。將補片移液管從硼硅酸鹽玻璃(4-6mω)中拉出，并填充由10mmkcl、125mm葡萄糖酸鉀、5mm磷酸肌酸鈉、10mmhepes、2mmegta、4mmmgatp和0.5mmna2gtp組成的移液管溶液，用koh調(diào)節(jié)ph7.3。串聯(lián)電阻通常為10-25mω。對于電壓鉗實驗，膜電位通常保持在-70mv，除了在記錄ipsc時牽制電位設置為0mv。通過重力驅(qū)動藥物輸送系統(tǒng)(vc-6，harvardapparatus，hamden，ct)施用藥物。為了監(jiān)測人星形膠質(zhì)細胞間的間隙聯(lián)結，在移液管溶液中加入2mm磺酰羅丹明b(srb)染料(mw＝559da)。

使用pcamp9軟件(moleculardevices，paloalto，ca)獲取數(shù)據(jù)，以10khz采樣并在1khz下過濾。使用pclamp9clampfit軟件分析na+電流和k+電流和動作電位。使用minianalysis軟件(synaptosoft，decatur，ga)分析自發(fā)性突觸活動。所有實驗均在室溫(22-24℃)下進行。

rna提取

在化學處理期間的d0、2、4、6和10，使用rna試劑盒從人皮層星形膠質(zhì)細胞中提取rna。對于24孔板的每個孔加入350μl的裂解緩沖液，并收集細胞裂解物。用rna柱進行rna純化，純化的rna用40μl不含rna酶的h2o洗脫，產(chǎn)生每孔100至300ng/μl的rna濃度。使用nanodrop測量rna濃度并檢查rna質(zhì)量。所有分離的rna的a260/a280比例在2和2.1之間，表明rna純度。分離的rna儲存在-80℃。

cdna合成和定量實時pcr

對于實時定量pcr(qrt-pcr)，使用quantabiosciencesqscripttmcdnasupermix進行cdna合成。對于每個樣品，每20μl總反應體積使用1μgrna。反應混合物在25℃孵育5分鐘，42℃30分鐘，85℃5分鐘，保持在4℃。cdna產(chǎn)物用不含rna酶/dna酶的h2o稀釋5倍。使用appliedbiosystemsprimerexpress軟件設計引物組，并列于表2。rt-qpcr使用quantabiosciencesgreensupermix，rox^tm進行。使用實時循環(huán)儀appliedsteponeplus^tm。最終反應體積為25μl中使用對應于1μg總rna的5μlcdna。進行了95℃15秒和65℃45秒的40個pcr循環(huán)用于擴增。在pcr循環(huán)后進行熔解曲線分析。比較ct方法用于定量和計算基因表達倍數(shù)變化。gapdh用作內(nèi)部對照基因，相對于在第0天對照人類星形膠質(zhì)細胞組的基因表達分析相對基因表達。對每個樣品rt-qpcr數(shù)據(jù)有三次重復pcr反應。

pcr陣列

在小分子處理之前(d0)和之后(d4和d8)，對人星形膠質(zhì)細胞進行rt²分析器pcr陣列(qiagen，pahs-404zc-12)。使用qiagenrt²firststrandkit(qiagen#330401)從分離的rna(利用rna試劑盒)合成cdna。對于每個96孔pcr陣列板，將0.5μg總rna與19.5μl逆轉(zhuǎn)錄混合物混合，并在42℃孵育15分鐘，然后在95℃孵育5分鐘。將20μl的cdna產(chǎn)物用81μl無rna酶的h2o稀釋。對于每個96孔pcr陣列板，將101μl稀釋的cdna與rt²sybrgreenqpcrmastermix(qiagen#330522)混合以達到2700μl的總體積。將25μlqpcr混合物轉(zhuǎn)移到pcr陣列板的每個孔中。實時循環(huán)儀appliedsteponeplus^tm用于pcr反應和數(shù)據(jù)采集。進行40個95℃15秒和60℃1分鐘的循環(huán)，然后進行熔解曲線分析。在同一分析中，對于所有rt²分析器pcrarray運行將基因閾值設定為相同的值。使用qiagenrt²profilerpcrarray數(shù)據(jù)分析軟件3.5版進行定量。將d0的基因表達設置為對照。

病毒生產(chǎn)

pcag::gfp-ires-gfp逆轉(zhuǎn)錄病毒載體是fredgage博士(salkinstitute，ca)的禮物。從hgfap啟動子-cre-mp-1(addgene)中亞克隆出人gfap啟動子基因，并替換cag啟動子以產(chǎn)生pgfap::gfp-ires-gfp逆轉(zhuǎn)錄病毒載體(guo等人，2014)。從小鼠基因組亞克隆出小鼠lcn2啟動子序列并取代cag啟動子以產(chǎn)生plcn2::gfp-ires-gfp逆轉(zhuǎn)錄病毒載體。fugw-egfp慢病毒載體由rogernicoll博士(加州大學舊金山分校，舊金山，美國)慷慨提供。將逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒包裝在gpghelperfreehek(人類胚胎腎)細胞中，以產(chǎn)生如前所述的vsv-g(水泡性口腔炎病毒糖蛋白)-假型逆轉(zhuǎn)錄病毒(guo等人，2014；tashiro等人，2006)。如先前所述，慢病毒顆粒被包裝在hek293t細胞中(naldini等人，1996)。病毒顆粒的滴度在hek細胞轉(zhuǎn)導后測定，約為10⁸個顆粒/ml。

隨時間推移進行成像

用1μlpcag::gfp-ires-gfp逆轉(zhuǎn)錄病毒懸浮液轉(zhuǎn)導t25燒瓶中培養(yǎng)的人星形膠質(zhì)細胞。在病毒轉(zhuǎn)導后2小時，用tryple解離細胞，并以24孔板中每個蓋玻片50000個細胞的密度鋪在聚-d-賴氨酸包被的蓋玻片上。在第0天，每個孔中只能發(fā)現(xiàn)1個或2個gfp陽性細胞簇。在不經(jīng)過或經(jīng)過小分子處理的第0、2、4、6、8天和第10天，在熒光顯微鏡(nikonte-2000-s)下，對一個gfp陽性的簇成像，這與上述相同。為了使通過順序應用9個分子誘導的重編程過程可視化，在改變含有下一組小分子的培養(yǎng)基之前的每個時間點拍攝圖像。

譜系示蹤實驗

將人星形膠質(zhì)細胞在聚-d-賴氨酸包被的蓋玻片中培養(yǎng)并用2μlpgfap::gfp-ires-gfp逆轉(zhuǎn)錄病毒懸浮液過夜感染。為了plcn2::gfp-ires-gfp逆轉(zhuǎn)錄病毒感染，用100ng/ml脂多糖(lps)對培養(yǎng)的人星形膠質(zhì)細胞進行預處理，使其具有反應性并表達lcn2。然后用小分子或1％dmso處理感染逆轉(zhuǎn)錄病毒的細胞。將細胞培養(yǎng)18天，然后固定用于免疫染色。

brdu出生日期測定

在小分子處理前1天，將人皮質(zhì)星形細胞與終濃度為10μm的5-溴-2-脫氧尿苷(brdu)一起孵育12小時。第二天，完全去除含brdu的培養(yǎng)基，并小心向培養(yǎng)物中加入新鮮的人星形膠質(zhì)細胞培養(yǎng)基。約70-80％的人星形膠質(zhì)細胞在d0被brdu標記。用小分子處理標記有brdu的人星形膠質(zhì)細胞，并在初次小分子處理后第30天固定。在另一組中，在小分子處理后的第10天將10μmbrdu加入神經(jīng)分化培養(yǎng)基中，并且每3-4天更新一次直到第30天。在第30天，在室溫下將細胞用4％pfa固定15分鐘，隨后在37℃下用2mhcl處理20分鐘使得dna變性。用pbs洗滌5次后，在室溫下將細胞在封閉緩沖液(pbs中含有2.5％正常驢血清，2.5％正常山羊血清，0.1％triton)中封閉1小時，然后在抗-brdu的一抗(dako，1:500)中4℃過夜孵育。

鈣成像

通過將人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化的神經(jīng)元在含有fura-2am(2μg/ml)的培養(yǎng)基中在培養(yǎng)箱(37℃)中孵育30分鐘，將鈣指示劑fura-2am(lifetechnology)載入細胞。使用nikon20×superfluor物鏡(na0.75)、hamamatsuorca-er數(shù)碼相機(hamamatsu，鹽田市，日本)和用于快速改變激發(fā)波長的sutterdg5光學切換器(sutterinstrument，novato，ca)監(jiān)測血漿中的鈣濃度。使用hamamatsu的simplepci軟件進行數(shù)據(jù)采集和分析。

甲基化dna免疫沉淀(medip)和高通量測序

根據(jù)制造商的方案(activemotif)進行medip實驗。利用qiagendna純化試劑盒純化富集的甲基化dna，以用于根據(jù)制造商的方案使用nebnextchip-seqlibraryprepreagentsetforillumina進行文庫制備。簡言之，使用25ng輸入的基因組dna或?qū)嶒灨患痙na用于每個文庫構建。在連接接頭后，利用ampurexp珠(beckmancoulter)選擇出150-300bp的dna片段。agilent2100bioanalyzer用于定量經(jīng)過擴增的dna，使用qpcr以準確定量文庫濃度。20pm稀釋的文庫用于測序。使用illuminahiseq2000進行50個循環(huán)的單端序列。使用標準illumina內(nèi)部流程(pipeline)進行圖像處理和序列提取。

靶向的bs-seq

根據(jù)供應商的用法說明，將dna樣品應用于epitect亞硫酸氫鹽試劑盒(qiagen)。然后利用ampurexp珠純化pcr擴增子，并洗脫在50μlh2o中。濃度用qubithighsensitivity試劑盒定量，然后每個樣品以相等的摩爾濃度合并。然后按照illumina推薦的標準程序?qū)⒒旌系臄U增子進行文庫制備和miseq深度測序(100×或更深)。使用標準的illumina內(nèi)部流程進行圖像分析和堿基識別。

為了確定gfap轉(zhuǎn)錄起始位點的dna甲基化狀態(tài)，使用ezdnamethylation-gold試劑盒(zymoresearch)根據(jù)制造商的說明書，用亞硫酸氫鈉處理基因組dna。使用巢式pcr擴增亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化的dna。然后將純化的pcr擴增子連接到topo-ta載體(invitrogen)中。純化重建的質(zhì)粒，對各個克隆進行測序。從每個時間點隨機挑選10個克隆。數(shù)據(jù)來自2個獨立實驗。

生物信息學分析

使用已知技術進行medip-seq的生物信息學分析。簡而言之，使用bowtie將fastq序列文件比對到hg19參考基因組。通過chip-seq(macs)軟件的基于模型的分析來鑒定峰。

對于bs-seq，首先使用trimmomatic0.20對雙末端讀段進行預處理，以除去接頭序列以及3'和5'末端的低質(zhì)量序列。然后使用bowtie0.12.9(-m1-130-n0-e90-x550)將經(jīng)過預處理的讀段比對到我們感興趣的位點處的c轉(zhuǎn)換為t和g轉(zhuǎn)化為a的序列。僅保留唯一比對讀段，并使用markduplicates(picardtools1.82)刪除pcr重復。為了避免對由重疊的雙末端讀段覆蓋的參考位置進行計數(shù)，剪切掉重疊區(qū)域，保留具有較高質(zhì)量的重疊區(qū)域。原始經(jīng)計算轉(zhuǎn)換的c和g被恢復，并利用samtoolsmpileup對每個參考胞嘧啶位置的c讀段和t讀段計數(shù)。

染色質(zhì)免疫沉淀(chip)-定量pcr

采用經(jīng)過微小改變的常規(guī)方法進行染色質(zhì)免疫沉淀(chip)實驗。簡言之，將小分子處理前后培養(yǎng)的人星形膠質(zhì)細胞用1％甲醛固定10分鐘，并用0.125m甘氨酸淬滅5分鐘。將染色質(zhì)用bioruptor(diagenodeinc.)超聲處理到300-500個堿基對片段的范圍。在chip程序之后，使用dna清潔和濃縮試劑盒(zymoresearch)純化洗脫的dna樣品。由qpcr確定富集程度，歸一化為總輸入。

立體定向注射小分子到小鼠腦中

在2月齡的野生型c57bl6小鼠上進行腦手術。通過將20ml/kg0.25％avertin(25mg/ml三溴乙醇和25μl/ml叔戊醇的混合物)注射到腹膜中來麻醉小鼠，然后置于立體定向裝置中。使用人造眼軟膏來覆蓋和保護眼睛。對動物進行中線頭皮切口和身體感覺皮層上方頭骨上的鉆孔操作。每只小鼠用2μl注射器和34號針接受小分子混合物或含有6％dmso的pbs的一次注射(坐標：ap1.25mm，ml1.4mm，dv-1.5mm)。注射體積和流速以0.2μl/min控制為2μl。注射后，將針保持至少5分鐘，然后慢慢取出。

體外細胞懸液培養(yǎng)

在小分子注射后6天(dpi)，以暴露于co2的方式處死動物。將腦切開，分離注射位點周圍約1.5mm的皮層腦組織，切成0.1×0.1mm的塊，用0.5％胰蛋白酶(gibco)在37℃下處理30分鐘，然后在900g下離心8分鐘。將細胞沉淀用補充有20ng/mlfgf2和20ng/mlegf的神經(jīng)元增殖培養(yǎng)基重懸浮，并將10ml培養(yǎng)基中的約100個細胞接種在具有超低附著表面的6孔板(corning#3471)中。生長因子每2-3天更新一次。初次接種一周后，觀察神經(jīng)球，并在10倍顯微鏡(尼康)下計數(shù)。為了傳代培養(yǎng)(subculture)，通過在900g下離心3分鐘收集一周齡的原代神經(jīng)球，并使用細胞消化液(gibco)在37℃下孵育5分鐘。細胞沉淀物在900g下離心5分鐘并研磨成單細胞，然后懸浮于神經(jīng)元增殖培養(yǎng)基中。傳代培養(yǎng)后3天，觀察二代神經(jīng)球，并在10×顯微鏡下計數(shù)。為了單層培養(yǎng)，按照上述方案將4日齡的二代神經(jīng)球進行胰蛋白酶化并再懸浮。將單細胞接種在聚-l-鳥氨酸/層粘連蛋白包被的蓋玻片上，并用20ng/mlfgf2和20ng/mlegf的神經(jīng)元增殖培養(yǎng)基培養(yǎng)。當細胞達到60-70％融合度時，用4％pfa固定細胞或用含有dmem/f12、5％fbs、50mg/mlnahco3和青霉素/鏈霉素的神經(jīng)元分化培養(yǎng)基或神經(jīng)膠質(zhì)培養(yǎng)基誘導細胞分化。

在本研究中使用以下一抗：

多克隆抗綠色熒光蛋白(gfp，雞，1：1000，abcam，ab13970)、多克隆抗膠質(zhì)纖維酸性蛋白(gfap，兔，1:1000，abcam，z0334)、多克隆抗神經(jīng)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(gfap，雞，1：1000，millipore，ab5541)、單克隆抗s100β(小鼠，1:800，abcam，ab66028)、多克隆抗囊泡谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白1(vglut1，兔，1:1000，synapticsystems)、多克隆抗囊狀谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白(sv2，小鼠，1:2000，開發(fā)研究雜交瘤庫，愛荷華市)、多克隆抗微管相關蛋白2(map2，雞，1:2000，abcam，ab5392)、多克隆抗t-box，腦，1(polyclonalanti-t-box,brain,1，tbr1,1:300，兔，abcam，ab31940)、多克隆抗prox1(兔，1:1000，reliatechgmbh，102-pa32)、多克隆抗musashi-1(兔，1:500，neuromics，ra14128)、單克隆抗sry(性別決定區(qū)y)-box2(sox-2，小鼠，1:500，abcam，ab79351)、多克隆抗sry(性別決定區(qū)y)-box2(sox-2，兔，1:500，millipore，ab5603)、單克隆抗-biii微管蛋白(tuj1，小鼠，1:1000，covance，mms-435p)、多克隆抗雙皮質(zhì)素(dcx，兔，1:500，abcam，ab18723)、多克隆抗neun(兔，1:1000，millipore，abn78)、單克隆抗ng2(小鼠，1:200，abcam，ab50009)、單克隆抗泛素-軸突神經(jīng)絲標記物(smi312，1:1000，小鼠，covance，smi-312r)、多克隆抗神經(jīng)膠質(zhì)谷氨酸轉(zhuǎn)運蛋白glt-1(eaat2)(glt1，豚鼠，1:2000，millipore，ab1783)、單克隆抗neurod1(小鼠，1:1000，abcam，ab60704)、單克隆抗人核(hunu，小鼠，1:1000，millipore，mab1281)、單克隆抗突觸小泡蛋白(小鼠，1:800，millipore，mab368)、多克隆抗cdp(cux1，兔，1:500，santacruz，sc-13024)、單克隆抗ctip2(大鼠，1:600，abcam，ab18465)、抗otx1(小鼠，1:200，開發(fā)研究雜交瘤庫，愛荷華市，otx-5f5)、抗hoxc9(小鼠，1:200，開發(fā)研究雜交瘤庫，愛荷華市，5b5-2)、抗hoxb4(小鼠，1：200，開發(fā)研究雜交瘤庫，愛荷華市，i12抗hoxb4)、多克隆抗foxg1(山羊，1:1000，abcamab3394)、多克隆抗囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運蛋白(vacht，豚鼠，1:800，millipore，ab1588)、單克隆抗gad67(小鼠，1：1000，millipore，mab5406)、抗isl1(小鼠，1:200，開發(fā)研究雜交瘤庫，愛荷華市，39.4d5)、單克隆抗酪氨酸羥化酶(th，小鼠，1:600，millipore，mab318)、多克隆抗神經(jīng)元質(zhì)蛋白2(neurogenin2)(ngn2，兔，1:600，abcam，ab26190)、單克隆抗neurod1(小鼠，1:800，abcam，ab60704)、多克隆抗mash1/acheatescute同系物1(ascl1，兔，abcam，ab74065)、單克隆抗巢蛋白(小鼠，1:800，neuromics，mo15056)、多克隆抗ki67(兔，1:800，abcam，ab15580)、單克隆抗n200(小鼠，1:1000，sigma，n0142)、單克隆抗brdu(小鼠，1:500，dako，074401-8)、單克隆抗谷氨酰胺合成酶(gs，小鼠，1:800，millipore，mab302)、單克隆抗磷酸化gsk-3β(ser9)(ser9)(5b3)(兔，1:100，cellsignaling，9323)、單克隆抗磷酸化細胞信號轉(zhuǎn)導分子1(smad1)(ser463/465)/胞信號轉(zhuǎn)導分子5(smad5)(ser463/465)/胞信號轉(zhuǎn)導分子9(smad9)(ser465/467)(d5b10)(兔，1:600，cellsignaling，13820)、單克隆抗裂解notch1(val1744)(d3b8)(兔，1:200，cellsignaling，4147)、單克隆抗cnpase(小鼠，1:800，abcam，ab6319)、多克隆抗脂質(zhì)運載蛋白-2/ngal(lcn2，山羊，1:1000，r&d，af1857)。

以下抗體用于在chip測定中的下拉dna：多克隆抗乙?；M蛋白h3(兔，millipore，06-599)；多克隆抗三甲基組蛋白h3(lys27)(h3k27me3，兔，millipore，07-449)；和多克隆抗h3k4me3(兔，activemotif39159)。

實施例9

本實施例延伸了前述公開，并且證明了采用四種藥物和甚至三種藥物足以實現(xiàn)使神經(jīng)膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元。具體地，本實施例證明了采用sb431542(tgf-β抑制劑)、ldn193189(bmp抑制劑)、chir99021(gsk-3抑制劑)和dapt(γ-分泌酶和notch抑制劑)的組合進行重編程可以成功使人神經(jīng)膠質(zhì)細胞重編程為功能性神經(jīng)元。此外，我們還測試了這四種藥物中的每一種與其它具有相似作用的藥物的組合，并證明了它們都可以使人星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化為神經(jīng)元。因此，本公開包括利用作用于以下信號傳導通路的一種或其組合的藥物組合而使神經(jīng)膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元：tgf-β、bmp、gsk-3和γ-分泌酶/notch信號傳導通路。

附圖15-19中呈現(xiàn)的數(shù)據(jù)顯示出可以替換各種具有相似活性的藥物，但仍然發(fā)揮重編程的作用。證明能夠重編程的特別組合包括：i)ldn193189/chir99021/dapt、ii)sb431542/chir99021/dapt、iii)ldn193189/dapt/sb431542、和iv)ldn193189/chir99021/sb431542。此外，我們證明了ldn193189可以被其功能類似物dorsomorphin和dmh1代替；sb431542可以被repsox或a8301代替；chir99021可以被其功能類似物ara014418和sb216763代替；而dapt可以被其功能類似物bms906024和ro4929097代替。因此，本公開證明了來自sb431542、ldn193189、chir99021和dapt的組的任何三種藥物組合可以使人神經(jīng)膠質(zhì)細胞重編程為神經(jīng)元，同時這些組合中任何一種或多種藥物可以被其功能類似物代替卻仍然實現(xiàn)重編程。

盡管已經(jīng)通過具體實施方案對本發(fā)明進行了描述，然而常規(guī)改變對本領域技術人員將是明顯的，并且這種改變旨在在本發(fā)明的范圍內(nèi)。