專(zhuān)利名稱(chēng)：減少淀粉樣沉積、淀粉樣神經(jīng)毒性和小膠質(zhì)增生的方法
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明涉及治療大腦淀粉樣變?cè)约膊∪绨柎暮Ｄ〉牟±砩韺W(xué)作用。更具體地說(shuō)，本方法涉及給予特異性二氫吡啶拮抗劑鈣通道阻滯劑，尼伐地平，在患有大腦淀粉樣變相關(guān)疾病，如阿爾茨海默病的動(dòng)物或人的大腦中，對(duì)抗這種病理生理學(xué)作用。
現(xiàn)有技術(shù)的描述阿爾茨海默病(AD)是老年人中最常見(jiàn)的神經(jīng)變性疾病，大約1％的超過(guò)65歲的人口患有該疾病。該疾病的特征包括細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)原纖維纏結(jié)細(xì)胞外實(shí)質(zhì)老年斑和腦血管沉積物的進(jìn)行性積聚。老年斑和腦血管沉積物的主要成分是39-43個(gè)氨基酸β-淀粉樣肽(Aβ)，它是以一種跨膜糖蛋白-淀粉樣前體蛋白(APP)蛋白水解得到的。
APP是具有590-680個(gè)氨基酸細(xì)胞外氨基末端區(qū)域和約55個(gè)氨基酸胞質(zhì)尾區(qū)的單一跨膜蛋白。來(lái)自染色體21上APP基因的信使RNA經(jīng)歷選擇性剪切以產(chǎn)生8個(gè)可能的同種型，其中3個(gè)同種型(695、751和770氨基酸同種型)在腦中占優(yōu)勢(shì)。APP通過(guò)3個(gè)酶活性，稱(chēng)為α-、β-和γ-分泌酶經(jīng)歷蛋白酶解加工。α-分泌酶在Aβ域的氨基酸17處切割A(yù)PP，因而釋放用于分泌的大的可溶性氨基末端片段α-APP。因?yàn)棣?分泌酶在Aβ域內(nèi)切割，該切割排除了Aβ的形成?；蛘?，APP可被β-分泌酶切割，確定Aβ氨基末端并產(chǎn)生可溶性氨基末端片段β-APP。接著，γ-分泌酶切割A(yù)PP的細(xì)胞內(nèi)羧基末端域，導(dǎo)致多種肽的產(chǎn)生，兩種最常見(jiàn)的是40-氨基酸Aβ(Aβ40)和42-氨基酸Aβ(Aβ42)。Aβ40包含90-95％的分泌Aβ，是腦脊液中獲得的主要種類(lèi)(Seubert等，Nature，359325-7，1992)。相反，小于10％的分泌Aβ是Aβ42。盡管產(chǎn)生的Aβ42較少，Aβ42是在斑塊中發(fā)現(xiàn)的主要種類(lèi)，最初沉積，或許是由于其比Aβ40能更快地形成不溶性淀粉樣聚集物(Jarrett等，Biochemistry，324693-7，1993)。認(rèn)為腦中Aβ的異常積聚是因?yàn)锳PP的過(guò)度表達(dá)或加工改變。
因此，認(rèn)為Aβ肽在AD的病理學(xué)中起著關(guān)鍵的作用，因?yàn)樗信cAD家族型相關(guān)的突變導(dǎo)致這些來(lái)自APP的肽的加工改變。確實(shí)，腦中Aβ的不溶性沉積物、或聚集物、原纖維是所有形式的AD顯著的神經(jīng)病理特征，不考慮對(duì)象的遺傳傾向。
伴隨著Aβ沉積，在AD腦中存在炎性途徑的強(qiáng)烈激活，包括在Aβ沉積物中及周?chē)a(chǎn)生促炎細(xì)胞因子和急性期反應(yīng)物(McGeer等，J.LeukocyteBiol.，65409-15，1999)。認(rèn)為腦中存在的先天免疫細(xì)胞，小膠質(zhì)細(xì)胞的激活密切涉及該炎癥級(jí)聯(lián)。已證明，反應(yīng)性小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生促炎細(xì)胞因子如炎性蛋白和急性期反應(yīng)物，如α-1-抗胰凝乳蛋白酶、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子、載脂蛋白E和補(bǔ)體因子，已表明，所有這些定位于Aβ斑塊中，并促進(jìn)Aβ斑塊“凝集”或成熟(Nilsson等，J Neurosci.211444-5，2001)，并且，在高濃度時(shí)促進(jìn)神經(jīng)變性。流行病學(xué)研究表明，使用非甾體抗炎藥(NSAIDS)的患者患AD的風(fēng)險(xiǎn)減少多達(dá)50％(Rogers等，Neurobiol.Aging 17681-6，1996)，并且，進(jìn)行NSAID治療的AD患者死后評(píng)價(jià)表明，風(fēng)險(xiǎn)減少與活化小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的減少有關(guān)(Mackenzie等，Neurology 50986-90，1998)。而且，當(dāng)給予Tg APPsw小鼠(一種阿爾茨海默病的小鼠模型)NSAID(布洛芬)時(shí)，這些動(dòng)物顯示與小膠質(zhì)細(xì)胞活性減少相關(guān)的Aβ沉積物減少、星形細(xì)胞增生、營(yíng)養(yǎng)不良性神經(jīng)軸突(Lim等，J.Neurosci.205709-14，2000)。
因此，在AD腦中炎癥過(guò)程的產(chǎn)物可加重AD病理。而且，有證據(jù)表明，AD腦中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞，不是清除Aβ，而是通過(guò)促進(jìn)Aβ原纖維形成并隨之發(fā)生以老年斑形式沉積具有致病性(Wegiel等，Acta Neuropathol.(Berl.)100356-64，2000)。
還提示，AD的發(fā)病機(jī)制是由于Aβ的神經(jīng)毒特性。Aβ的細(xì)胞毒性首先是在嚙齒動(dòng)物的原代細(xì)胞培養(yǎng)和人細(xì)胞培養(yǎng)中建立的。Mattson等的工作(J.Neurosci.，12376-389，1992)表明，在刺激性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸的存在下，Aβ導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣立即病理性增加，認(rèn)為通過(guò)其第二信使活性大大增加而對(duì)細(xì)胞的毒性非常高。
因此，需要預(yù)防成為AD標(biāo)志的腦變性的無(wú)情進(jìn)程，其中，預(yù)防可解決見(jiàn)于AD患者的Aβ沉積、Aβ神經(jīng)毒性、活化的小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥和APP的改變或過(guò)度表達(dá)。
發(fā)明概述為了滿(mǎn)足上述需要，本發(fā)明首次提供在患有大腦淀粉樣原性疾病，如阿爾茨海默病(AD)的動(dòng)物或人中，通過(guò)給予治療有效量的二氫吡啶鈣通道阻滯劑，尼伐地平，減少β-淀粉樣沉積、β-淀粉樣神經(jīng)毒性和小膠質(zhì)增生的方法。
本發(fā)明還提供在動(dòng)物或人中，診斷大腦淀粉樣原性疾病如AD，或確定動(dòng)物或人是否有發(fā)展大腦淀粉樣原性疾病的風(fēng)險(xiǎn)的方法，包括首先測(cè)定動(dòng)物或人的外周循環(huán)中β-淀粉樣蛋白的血漿濃度；給予動(dòng)物或人單位劑量形式的治療有效量的尼伐地平；在隨后的時(shí)間，第二次測(cè)定動(dòng)物或人的外周循環(huán)中β-淀粉樣蛋白的血漿濃度；計(jì)算Aβ血漿濃度的第一次測(cè)定和第二次測(cè)定間的差異。第二次測(cè)定中β-淀粉樣蛋白的血漿濃度與第一次測(cè)定相比的增加表明，在動(dòng)物或人中大腦淀粉樣原性疾病的發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)和/或可能的診斷。
本發(fā)明還提供在患有外傷性腦損傷的動(dòng)物或人中，通過(guò)在頭部損傷后立即給予動(dòng)物或人單位劑量形式的治療有效量的尼伐地平并在其后的處方時(shí)間內(nèi)繼續(xù)尼伐地平治療，減少β-淀粉樣沉積、β-淀粉樣神經(jīng)毒性和小膠質(zhì)增生的風(fēng)險(xiǎn)的方法。
本發(fā)明還提供治療可移植神經(jīng)元干細(xì)胞的方法，其包括在患有大腦淀粉樣原性疾病如AD的動(dòng)物或人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，干細(xì)胞移植之前給予神經(jīng)元干細(xì)胞治療有效量的尼伐地平。
附圖簡(jiǎn)要說(shuō)明

圖1是表示使用4G8免疫染色技術(shù)，長(zhǎng)期給予尼伐地平對(duì)TgAPPsw小鼠腦的不同區(qū)域中的Aβ沉積(Aβ負(fù)荷)的影響的柱狀圖；圖2是表示使用確定CD45+小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量的CD45免疫染色技術(shù)，長(zhǎng)期給予尼伐地平在TgAPPsw小鼠腦的三個(gè)區(qū)中對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響的柱狀圖；圖3是表示在體外用脂多糖(LPS)活化24小時(shí)的N9鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中，尼伐地平對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響的柱狀圖。ELISA測(cè)定TNF-α的產(chǎn)生(pg/ml)，確定的小膠質(zhì)細(xì)胞活性；圖4是表示在用30μM的預(yù)聚集Aβ1-40(AgAβ)處理3天的HPNC中，給予尼伐地平對(duì)Aβ神經(jīng)毒性的影響的柱狀圖。通過(guò)測(cè)定從細(xì)胞釋放的乳酸脫氫酶(LDH)的量來(lái)評(píng)價(jià)神經(jīng)毒性；圖5是表示使用轉(zhuǎn)染APPsw的人成膠質(zhì)瘤細(xì)胞，尼伐地平對(duì)APP加工的影響的柱狀圖。用50nM和250nM尼伐地平處理細(xì)胞24小時(shí)(圖5A)和48小時(shí)(圖5B)。ELISA法測(cè)定培養(yǎng)液中產(chǎn)生的Aβ1-40。
圖6是表示在2歲齡TgPS/APPsw小鼠中，尼伐地平對(duì)血漿Aβ水平的影響的柱狀圖。用尼伐地平(1.5毫克/公斤體重)每天腹膜內(nèi)處理動(dòng)物，持續(xù)三周半。
優(yōu)選實(shí)施方式本發(fā)明首次提供在動(dòng)物和人中通過(guò)給予尼伐地平(異丙基-3-甲基-2-氰-1，4-二氫-6-甲基-4-(間硝基苯基)-3，5-吡啶-二羧酸酯；MW 385.4)，一種二氫吡啶類(lèi)似的鈣通道阻滯劑，是某些大腦淀粉樣原性疾病如阿爾茨海默病(AD)的標(biāo)志的腦變性無(wú)情進(jìn)程的預(yù)防方法。
具體地說(shuō)，本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施例提供了在患有大腦淀粉樣原性疾病或病癥的動(dòng)物或人中，通過(guò)給予單位劑量形式的治療有效量的尼伐地平，減少β-淀粉樣沉積、β-淀粉樣神經(jīng)毒性和小膠質(zhì)增生的方法。因?yàn)榇蠖鄶?shù)大腦淀粉樣原性疾病如AD是慢性、進(jìn)行性、難治的腦癡呆，考慮尼伐地平治療的持續(xù)時(shí)間將延續(xù)長(zhǎng)達(dá)動(dòng)物或人的終生。大腦淀粉樣原性疾病或病癥非限制性地包括阿爾茨海默病、傳染性海綿狀腦病、瘙癢病、外傷性腦損傷、大腦淀粉樣血管病和格-施-沙(Gerstmann-Straussler-Scheinker)綜合征。
在本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施例中，提供了在患有外傷性腦損傷(TBI)的動(dòng)物或人中，通過(guò)在TBI后立即給予動(dòng)物或人單位劑量形式的治療有效量的尼伐地平并在其后的處方時(shí)間內(nèi)繼續(xù)尼伐地平治療，減少β-淀粉樣沉積、β-淀粉樣神經(jīng)毒性和小膠質(zhì)增生的風(fēng)險(xiǎn)的方法。已表明，TBI增加AD發(fā)展的易感性，因而不被理論所約束，認(rèn)為T(mén)BI加速腦Aβ積聚和氧化應(yīng)激，它們可協(xié)同作用，促進(jìn)AD的開(kāi)始或推進(jìn)AD的進(jìn)展。
在那些患有TBI的動(dòng)物或人中，尼伐地平的治療持續(xù)時(shí)間可延續(xù)約1小時(shí)-5年，優(yōu)選與2周-3年，最優(yōu)選約6個(gè)月-12個(gè)月。
在本發(fā)明的又一個(gè)實(shí)施例中，提供了在動(dòng)物或人中，通過(guò)以下方法，診斷或確定產(chǎn)生大腦淀粉樣原性疾病如AD的風(fēng)險(xiǎn)的方法首先測(cè)定動(dòng)物或人的外周循環(huán)中β-淀粉樣蛋白的血漿濃度；給予動(dòng)物或人單位劑量形式的治療有效量的尼伐地平；在隨后的時(shí)間，第二次測(cè)定動(dòng)物或人的外周循環(huán)中β-淀粉樣蛋白的血漿濃度；然后，計(jì)算第一次測(cè)定和第二次測(cè)定間的差異。第二次測(cè)定中β-淀粉樣蛋白血漿濃度與第一次測(cè)定相比增加，提示在該動(dòng)物或人中大腦淀粉樣原性疾病的發(fā)展風(fēng)險(xiǎn)和/或可能的診斷。第一次和第二次測(cè)定血漿Aβ濃度間給予尼伐地平的持續(xù)時(shí)間約為1天-12個(gè)月，優(yōu)選約為1周-6個(gè)月，最優(yōu)選約為2周-4周?？紤]到給予尼伐地平后，血漿Aβ濃度的少量增加有發(fā)展AD的風(fēng)險(xiǎn)和/或診斷為AD開(kāi)始階段的征兆。給予尼伐地平后，血漿Aβ濃度的較大增加則反映，較高濃度的Aβ從腦釋放進(jìn)入外周循環(huán)，因而更有AD的陽(yáng)性診斷的征兆。
根據(jù)本發(fā)明的方法，給予患有大腦淀粉樣原性疾病或患有外傷性腦損傷的動(dòng)物或人單位劑量形式的治療有效量的尼伐地平，以及為了在動(dòng)物或人中確定發(fā)展大腦淀粉樣原性疾病的風(fēng)險(xiǎn)和/或診斷淀粉樣變疾病的目的所給予的治療有效量，可約為0.05毫克-20毫克/天，優(yōu)選約為2毫克-15毫克/天，更優(yōu)選約為4毫克-12毫克/天，最優(yōu)選約為8毫克/天?？擅刻煲詥我粏挝粍┗蚍譃槎?、三或四個(gè)單位劑量，給予日劑量。
在本發(fā)明的又另一個(gè)實(shí)施例中，提供了通過(guò)在患有大腦淀粉樣原性疾病如AD的動(dòng)物或人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中移植細(xì)胞之前，給予神經(jīng)元干細(xì)胞治療有效量的尼伐地平，預(yù)處理可移植人或異種神經(jīng)元干細(xì)胞的方法。假定，神經(jīng)元干細(xì)胞本身沒(méi)有明顯的Aβ沉積。然而，如果神經(jīng)元移植物用于負(fù)荷Aβ的環(huán)境，神經(jīng)元干細(xì)胞的預(yù)處理可通過(guò)減少Aβ濃度及Aβ的毒性，提高移植的神經(jīng)元在其新環(huán)境中存活的能力。用于預(yù)處理神經(jīng)元干細(xì)胞的單位劑量形式給予治療有效量的尼伐地平約為1nM-3uM，優(yōu)選約為10nM-2μM，最優(yōu)選約為100nM-1μM。已知，當(dāng)干細(xì)胞直接分化為具體細(xì)胞類(lèi)型如神經(jīng)元細(xì)胞時(shí)，提供更替細(xì)胞和組織的可更新來(lái)源的可能性，以治療疾病和病癥，如阿爾茨海默病，帕金森病或脊髓損傷。當(dāng)這種細(xì)胞被移植/植入進(jìn)入患者時(shí)，不僅要適當(dāng)?shù)赜媚岱サ仄筋A(yù)處理細(xì)胞，而且還要移植后開(kāi)始用尼伐地平治療患者。
考慮到本發(fā)明方法可用于AD的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，如PDAPP和TgAPPsw小鼠模型，該方法可最終在所述動(dòng)物或人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中用于治療、防止和/或抑制與淀粉樣沉積、β-淀粉樣神經(jīng)毒性、和小膠質(zhì)增生相關(guān)的病癥。因此，本發(fā)明提供AD的轉(zhuǎn)基因動(dòng)物模型，使用本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)方法構(gòu)建該模型，如美國(guó)專(zhuān)利5,487,992、5,464,764、5,387,742、5,360,735、5,347,075、5,298,422、5,288,846、5,221,778、5,175,385、5,175,384、5,175,383和4,736,866所述。
可通過(guò)多種途徑，包括胃腸外、口服或腹膜內(nèi)給予患者尼伐地平。胃腸外給藥包括以下途徑靜脈內(nèi)；肌內(nèi)；間質(zhì)；動(dòng)脈內(nèi)；皮下；眼內(nèi)；顱內(nèi)；心室內(nèi)；滑膜內(nèi)；經(jīng)上皮，包括經(jīng)皮、肺部吸入、眼、舌下和頰；局部，包括眼、皮、眼睛、直腸、或通過(guò)吹入或噴霧的鼻腔吸入。
口服給予的尼伐地平可包載于硬或軟殼明膠膠囊中，或壓制成片劑。尼伐地平也可與賦形劑混合，以可吸收片劑、口含片、糖錠、膠囊、囊劑、錠劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑等形式使用。尼伐地平還可以粉末或顆粒、在水性液體或非水液體中的溶液或懸浮液、水包油或油包水乳劑的形式。
片劑、糖錠、小丸、膠囊等還可包含，例如粘合劑如西黃蓍膠、阿拉伯膠、玉米淀粉；凝膠賦形劑如磷酸二鈣；崩解劑如玉米淀粉、馬鈴薯淀粉、海藻酸等；潤(rùn)滑劑如硬脂酸鎂；甜味劑如蔗糖、乳糖或糖精；或矯味劑。當(dāng)劑量單位形式是膠囊時(shí)，除上述物質(zhì)外，可包含液體載體。多種其它物質(zhì)可作為包衣或用于改進(jìn)劑量單位的物理形式。例如，片劑、小丸或膠囊可用蟲(chóng)膠、糖或兩者包衣。糖漿劑或酏劑可含有尼伐地平，甜味劑蔗糖、防腐劑對(duì)羥基苯甲酸甲酯和對(duì)羥基苯甲酸丙酯，染料和芳香劑。此外，尼伐地平可摻入緩釋制劑和劑型。
尼伐地平可給予CNS，胃腸外或腹膜內(nèi)。可在水與合適的表面活性劑如羥丙基纖維素的混合物中制備作為游離堿或藥學(xué)上可接受的鹽的尼伐地平溶液。也可在甘油、液體聚乙二醇及其混合物中，以及油中制備分散體。在普通儲(chǔ)存和使用條件下，這些制劑可含有防腐劑和/或抗氧劑，以防止微生物的生長(zhǎng)或化學(xué)降解。
將在下面的非限制性實(shí)施例中具體描述本發(fā)明減少Aβ在患有淀粉樣變相關(guān)疾病如AD的動(dòng)物或人中的病理學(xué)作用的方法。
實(shí)施例1長(zhǎng)期給予尼伐地平對(duì)Aβ沉積的影響(淀粉樣蛋白負(fù)荷)在TgAPPsw小鼠的腦的不同區(qū)域，使用4G8抗Aβ單克隆抗體免疫染色技術(shù)，測(cè)定長(zhǎng)期給予尼伐地平對(duì)Aβ沉積(淀粉樣蛋白負(fù)荷)的影響。選擇4G8免疫染色技術(shù)測(cè)定Aβ負(fù)荷，因?yàn)槠鋵?duì)Aβ沉積定量分析的信號(hào)強(qiáng)且結(jié)果較佳。簡(jiǎn)單地說(shuō)，如上所述，對(duì)石蠟切片進(jìn)行免疫組織化學(xué)測(cè)定(Nakagawa，Y等，Exp.Neurol.，163244-252，2000)。在二甲苯中使切片去石蠟化，在一系列乙醇和去離子水中水化，通過(guò)將切片在88％甲酸中浸漬60分鐘進(jìn)行抗原回收步驟，然后對(duì)Aβ進(jìn)行免疫組化測(cè)定。水中清洗切片，用新鮮配制的甲醇(150毫升)加過(guò)氧化氫(33％，30毫升)混合液終止內(nèi)源性過(guò)氧化酶作用。根據(jù)商家說(shuō)明書(shū)(Vector Laboratories，Burlingame，CA)，使用親和素-生物素復(fù)合物法。通過(guò)確定Aβ染色陽(yáng)性的腦區(qū)百分比來(lái)評(píng)價(jià)淀粉樣蛋白負(fù)荷。陰性對(duì)照包括對(duì)切片應(yīng)用相同的免疫組化方案，除了應(yīng)用免疫前血清代替第一抗體。將TgAPPsw小鼠分成接受有效量的尼伐地平的實(shí)驗(yàn)組(n＝7)和接受載體的對(duì)照組(n＝5)。
如圖1所示，用尼伐地平治療減少了Aβ負(fù)荷，在視皮層中與對(duì)照相比減少約62％，在頂葉皮層中與對(duì)照相比減少約65％，在運(yùn)動(dòng)皮層中與對(duì)照相比減少約58％，在梨狀皮層中與對(duì)照相比減少約58％，在海馬的CA1區(qū)中與對(duì)照相比減少約52％，在海馬的CA2-CA3區(qū)中與對(duì)照相比減少約50％。
實(shí)施例2長(zhǎng)期給予尼伐地平對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響使用CD45免疫染色技術(shù)，其中，已確定CD45+小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，在小鼠腦的三個(gè)區(qū)中，測(cè)定長(zhǎng)期給予尼伐地平對(duì)TgAPPsw小鼠的小膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響。
簡(jiǎn)單地說(shuō)，在冷凍腦切片上，對(duì)CD45(一種粒細(xì)胞的特異性標(biāo)識(shí))進(jìn)行免疫組化測(cè)定。通過(guò)與小鼠抗CD45單克隆抗體(Chemicon International)在4℃下孵育過(guò)夜，然后應(yīng)用生物素化的兔抗鼠第二抗體30分鐘，使CD45-陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞免疫定位。用二氨基聯(lián)苯胺色原體底物使CD45-陽(yáng)性小膠質(zhì)細(xì)胞上產(chǎn)生褐色細(xì)胞表面染色，完成CD45的檢測(cè)。
如圖2所示，與對(duì)照相比，以有效劑量給予的尼伐地平治療減少海馬中的小膠質(zhì)細(xì)胞活性約為33％，頂葉皮層中約43％，運(yùn)動(dòng)皮層中約27％。
實(shí)施例3給予尼伐地平對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響在體外用脂多糖(LPS)活化24小時(shí)的N9鼠小膠質(zhì)細(xì)胞中，測(cè)定尼伐地平對(duì)小膠質(zhì)細(xì)胞活性的影響。N9鼠小膠質(zhì)細(xì)胞的特征在于，很好地清除了來(lái)源于胚胎鼠腦的鼠小膠質(zhì)細(xì)胞克隆。ELISA測(cè)定TNF-α的產(chǎn)生(pg/ml)，確定小膠質(zhì)細(xì)胞活化的程度。如圖3所示，不用小膠質(zhì)細(xì)胞活化的LPS(對(duì)照細(xì)胞)產(chǎn)生約40pg/ml的TNF-α。在50nM尼伐地平的存在下，小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生約40pg/ml TNF-α。增加給予尼伐地平10倍(500nM)，不改變TNF-α的產(chǎn)生。在1μg/ml LPS的存在下，小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生約820pg/ml TNF-α，從對(duì)照細(xì)胞和給予尼伐地平的細(xì)胞增加約95％。在1μg/ml LPS加50nM尼伐地平的存在下，小膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生約670pg/ml TNF-α。給予LPS加500nM尼伐地平減少TNF-α產(chǎn)生至約610pg/ml。因此，尼伐地平對(duì)抗LPS-誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活性約20-25％。
實(shí)施例4給予尼伐地平對(duì)Aβ神經(jīng)毒性的影響在用30μM的預(yù)聚集Aβ1-40(AgAβ)處理3天的人神經(jīng)元祖細(xì)胞(HPNC)中，測(cè)定給予尼伐地平(10nM和100nM)對(duì)Aβ神經(jīng)毒性的影響。在用環(huán)AMP處理時(shí)，HPNC細(xì)胞容易分化為神經(jīng)元。將環(huán)AMP(1mM)(Sigma)加入到培養(yǎng)液中，在不含血清條件下，37℃孵育HPNC細(xì)胞48小時(shí)或更長(zhǎng)時(shí)間。該培養(yǎng)液使祖細(xì)胞分化為神經(jīng)元細(xì)胞系，如大多數(shù)具有抗微管相關(guān)蛋白MAP-2的抗體的細(xì)胞的染色所證明。通過(guò)測(cè)定從細(xì)胞釋放的乳酸脫氫酶(LDH；一種所有細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞內(nèi)酶)的量，評(píng)價(jià)神經(jīng)毒性。
如圖4所示，與用尼伐地平處理細(xì)胞相比，用AgAβ處理的細(xì)胞產(chǎn)生LDH釋放增加約44％。當(dāng)加入10nM尼伐地平和AgAβ時(shí)，LDH釋放不變。然而，當(dāng)尼伐地平的劑量增加10倍至100nM時(shí)，LDH釋放量減少約44％。
實(shí)施例5給予尼伐地平對(duì)APP加工的影響使用轉(zhuǎn)染APPsw的人成膠質(zhì)瘤細(xì)胞測(cè)定尼伐地平對(duì)APP加工的影響。用50nM和250nM尼伐地平處理細(xì)胞24和48小時(shí)，使用市售人Aβ1-40ELISA(Biosource，CA)測(cè)定培養(yǎng)液中產(chǎn)生的Aβ1-40。
如圖5A所示，處理24小時(shí)后，50nM的尼伐地平減少Aβ1-40產(chǎn)生約9％，250nM的尼伐地平減少Aβ1-40產(chǎn)生約15％。處理48小時(shí)后(圖5B)，50nM的尼伐地平減少Aβ1-40的產(chǎn)生約18％，250nM的尼伐地平減少Aβ1-40產(chǎn)生約5％。
實(shí)施例6給予尼伐地平對(duì)血漿Aβ水平的影響使用2歲齡TgPS/APPsw小鼠，測(cè)定給予尼伐地平對(duì)血漿Aβ水平(pg/ml)的影響。用尼伐地平(1.5毫克/公斤體重；n＝10)或僅載體(50％DMSO的PBS溶液；n＝12)每天腹膜內(nèi)(I.P.)處理動(dòng)物，持續(xù)三周半。處理后，使用EDTA(4％)作為抗凝血?jiǎng)瑥膭?dòng)物尾靜脈收集100μl血。血樣在4000g下離心1分鐘，收集血漿，稀釋四倍后，使用市售人Aβ1-40ELISA(Biosource，CA)測(cè)定人Aβ1-40。
如圖6所示，I.P.給予TgPS/APPsw小鼠劑量為1.5毫克/公斤體重的尼伐地平，持續(xù)3個(gè)半周，導(dǎo)致Aβ血漿水平(pg/ml)與對(duì)照動(dòng)物相比，增加約42％。
總的結(jié)論長(zhǎng)期給予尼伐地平顯著性減少轉(zhuǎn)基因小鼠的大腦皮層和海馬的不同區(qū)域中存在的Aβ的量，并且顯著性減少小膠質(zhì)細(xì)胞活性。當(dāng)用LPS活化N9鼠小膠質(zhì)細(xì)胞時(shí)，給予尼伐地平顯著性減少LPS-誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細(xì)胞活性。而且，尼伐地平有效地對(duì)抗AgAβ對(duì)人前體神經(jīng)元細(xì)胞系的神經(jīng)毒性作用。雖然尼伐地平治療沒(méi)有明顯減少Aβ1-40的產(chǎn)生，但給予尼伐地平后有減少Aβ1-40產(chǎn)生的趨勢(shì)。這種Aβ1-40的減少潛在地反映出產(chǎn)生的減少，但是其它與Aβ1-40減少有關(guān)的機(jī)制非限制性地包括吞噬作用或其它破壞作用、或防止積聚和檢測(cè)的細(xì)胞作用。然而，不考慮機(jī)制，數(shù)據(jù)提示尼伐地平的存在伴隨著Aβ1-40的減少。最后，2歲齡TgPS/APPsw小鼠I.P.長(zhǎng)期給予尼伐地平顯著地增加Aβ的血漿水平，提示，尼伐地平除了能減少腦中Aβ沉積外，尼伐地平治療還可減少已在患者腦中沉積的Aβ。
鑒于上述數(shù)據(jù)，可推斷，對(duì)患有大腦淀粉樣原性疾病如AD的動(dòng)物或人給予尼伐地平，可顯著地減少特異性富含這種病理學(xué)沉積物的腦的臨界區(qū)域中Aβ的量，并減少已在腦中沉積的Aβ。另外，給予尼伐地平可對(duì)抗Aβ的神經(jīng)毒性作用，認(rèn)為神經(jīng)毒性作用引起AD中所見(jiàn)的廣泛且破壞性神經(jīng)元破裂、以及小膠質(zhì)細(xì)胞活性降低，小膠質(zhì)細(xì)胞活性降低導(dǎo)致AD患者腦中所見(jiàn)的特異性炎癥反應(yīng)。最后，尼伐地平治療可降低在患有大腦淀粉樣原性疾病如AD的動(dòng)物或人的腦中已沉積的Aβ的濃度。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將明白，可對(duì)本發(fā)明方法進(jìn)行各種改進(jìn)和變化而不背離本發(fā)明精神或范圍。因此，本發(fā)明包括在所附權(quán)利要求及其等價(jià)物的范圍內(nèi)的改進(jìn)和變化。
權(quán)利要求
1.一種在患有大腦淀粉樣原性疾病或病癥的動(dòng)物或人中，減少β-淀粉樣沉積、β-淀粉樣神經(jīng)毒性和小膠質(zhì)增生的方法，其包括給予動(dòng)物或人單位劑量形式的治療有效量的尼伐地平。
2.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述淀粉樣原性疾病或病癥選自阿爾茨海默病、傳染性海綿狀腦病、瘙癢病、外傷性腦損傷、傷性腦損傷、大腦淀粉樣血管病和格-施-沙綜合征。
3.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療有效量約為0.05-20毫克/天。
4.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療有效量約為2-15毫克/天。
5.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療有效量約為4-12毫克/天。
6.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療有效量為8毫克/天。
7.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療持續(xù)時(shí)間延續(xù)達(dá)動(dòng)物或人的終生。
8.如權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于，通過(guò)胃腸道外、口服或腹膜內(nèi)給予動(dòng)物或人尼伐地平。
9.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述口服給予的單位劑量形式選自硬或軟殼明膠膠囊、片劑、糖錠、囊劑、錠劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑、粉末劑、顆粒劑、溶液和乳劑。
10.如權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述胃腸外給藥途徑選自靜脈內(nèi)；肌內(nèi)；間質(zhì)；動(dòng)脈內(nèi)；皮下；眼內(nèi)；顱內(nèi)；心室內(nèi)；滑膜內(nèi)；經(jīng)上皮，包括經(jīng)皮、肺部吸入、眼、舌下和頰；局部，包括眼、皮、眼睛、直腸、和通過(guò)吹入或噴霧的鼻腔吸入。
11.如權(quán)利要求10所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的鼻腔給予選自氣霧劑、霧化劑和噴霧劑。
12.一種在動(dòng)物或人中診斷大腦淀粉樣原性疾病的方法，所述方法包括第一次測(cè)定動(dòng)物或人的外周循環(huán)中β-淀粉樣蛋白的血漿濃度；給予動(dòng)物或人單位劑量形式的治療有效量的尼伐地平；第二次測(cè)定動(dòng)物或人的外周循環(huán)中β-淀粉樣蛋白的血漿濃度；和計(jì)算第一次測(cè)定和第二次測(cè)定間的差異，其中，第二次測(cè)定中β-淀粉樣蛋白血漿濃度與第一次測(cè)定相比的增加表明，在所述動(dòng)物或人中大腦淀粉樣原性疾病的可能診斷。
13.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述淀粉樣原性疾病選自阿爾茨海默病、傳染性海綿狀腦病、瘙癢病、外傷性腦損傷、傷性腦損傷、大腦淀粉樣血管病和格-施-沙綜合征。
14.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療有效量約為0.05-20毫克/天。
15.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療有效量約為2-15毫克/天。
16.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療有效量約為4-12毫克/天。
17.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療有效量為8毫克/天。
18.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療持續(xù)時(shí)間延續(xù)1天至12個(gè)月。
19.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療持續(xù)時(shí)間延續(xù)1周至6個(gè)月。
20.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療持續(xù)時(shí)間延續(xù)2周至4周。
21.如權(quán)利要求12所述的方法，其特征在于，通過(guò)胃腸外、口服或腹膜內(nèi)給予動(dòng)物或人尼伐地平。
22.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述口服給予的單位劑量形式選自硬或軟殼明膠膠囊、片劑、糖錠、囊劑、錠劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑、粉末劑、顆粒劑、溶液和乳劑。
23.如權(quán)利要求21所述的方法，其特征在于，所述胃腸外給予途徑選自下組靜脈內(nèi)；肌內(nèi)；間質(zhì)；動(dòng)脈內(nèi)；皮下；眼內(nèi)；顱內(nèi)；心室內(nèi)；滑膜內(nèi)；經(jīng)上皮，包括經(jīng)皮、肺部吸入、眼、舌下和頰；局部，包括眼、皮、眼睛、直腸、和通過(guò)吹入或噴霧的鼻腔吸入。
24.如權(quán)利要求23所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的鼻腔給予選自氣霧劑、霧化劑和噴霧劑。
25.一種在患有外傷性腦損傷的動(dòng)物或人中減少β-淀粉樣沉積、β-淀粉樣神經(jīng)毒性和小膠質(zhì)增生的風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括給予動(dòng)物或人單位劑量形式的治療有效量的尼伐地平，其中，在急性顱腦損傷后立即開(kāi)始給予尼伐地平。
26.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述淀粉樣原性疾病選自阿爾茨海默病、傳染性海綿狀腦病、瘙癢病、外傷性腦損傷、傷性腦損傷、大腦淀粉樣血管病和格-施-沙綜合征。
27.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療有效量約為0.05-20毫克/天。
28.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療有效量約為2-15毫克/天。
29.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療有效量約為4-12毫克/天。
30.如權(quán)利要求251所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療有效量為8毫克/天。
31.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療持續(xù)時(shí)間延續(xù)1小時(shí)至5年。
32.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療持續(xù)時(shí)間延續(xù)2周至3年。
33.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療持續(xù)時(shí)間延續(xù)6個(gè)月至12個(gè)月。
34.如權(quán)利要求25所述的方法，其特征在于，通過(guò)胃腸外、口服或腹膜內(nèi)給予動(dòng)物或人尼伐地平。
35.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述口服給予的單位劑量形式選自硬或軟殼明膠膠囊、片劑、糖錠、囊劑、錠劑、酏劑、混懸劑、糖漿劑、糯米紙囊劑、粉末劑、顆粒劑、溶液和乳劑。
36.如權(quán)利要求34所述的方法，其特征在于，所述胃腸外給予途徑選自靜脈內(nèi)；肌內(nèi)；間質(zhì)；動(dòng)脈內(nèi)；皮下；眼內(nèi)；顱內(nèi)；心室內(nèi)；滑膜內(nèi)；經(jīng)上皮，包括經(jīng)皮、肺部吸入、眼、舌下和頰；局部，包括眼、皮、眼睛、直腸、和通過(guò)吹入或噴霧的鼻腔吸入。
37.如權(quán)利要求36所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的鼻腔給予選自氣霧劑、霧化劑和噴霧劑。
38.一種治療可移植神經(jīng)元干細(xì)胞或胎兒細(xì)胞的方法，所述方法包括在患有大腦淀粉樣原性疾病的動(dòng)物或人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，干細(xì)胞或胎兒細(xì)胞移植前給予神經(jīng)元干細(xì)胞或胎兒細(xì)胞治療有效量的尼伐地平。
39.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述淀粉樣原性疾病選自阿爾茨海默病、傳染性海綿狀腦病、瘙癢病、外傷性腦損傷、傷性腦損傷、大腦淀粉樣血管病和格-施-沙綜合征，其特征還在于，在干細(xì)胞或胎兒細(xì)胞移植后用有效量的尼伐地平治療患者。
40.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療有效量約為1nM-3μM。
41.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療有效量約為10nM-2μM。
42.如權(quán)利要求38所述的方法，其特征在于，所述尼伐地平的治療有效量約為100nM-1μM。
全文摘要
本發(fā)明提供在患有大腦淀粉樣原性疾病，如阿爾茨海默病(AD)的動(dòng)物或人中，通過(guò)給予治療有效量的二氫吡啶鈣通道阻滯劑尼伐地平，減少β－淀粉樣沉積、β－淀粉樣神經(jīng)毒性和小膠質(zhì)增生的方法。本發(fā)明還提供在動(dòng)物或人中，診斷大腦淀粉樣原性疾病的方法。還提供在患有外傷性腦損傷的動(dòng)物或人中，在外傷性腦損傷后立即給予尼伐地平并在其后的處方時(shí)間內(nèi)繼續(xù)治療，減少β－淀粉樣沉積、β－淀粉樣神經(jīng)毒性和小膠質(zhì)增生的風(fēng)險(xiǎn)的方法。最后，提供在患有大腦淀粉樣原性疾病如AD的動(dòng)物或人的中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，通過(guò)在移植前給予神經(jīng)元干細(xì)胞尼伐地平，治療可移植神經(jīng)元干細(xì)胞的方法。
文檔編號(hào)A61KGK1809352SQ200480017197
公開(kāi)日2006年7月26日 申請(qǐng)日期2004年5月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年5月15日
發(fā)明者M·J·馬倫, D·帕里斯 申請(qǐng)人:羅斯坎普研究有限公司