本申請(qǐng)根據(jù)34u.s.c.§119，要求2014年11月14日提交的美國(guó)臨時(shí)申請(qǐng)系列第62/079854號(hào)的優(yōu)先權(quán)，本文以該申請(qǐng)為基礎(chǔ)并將其全文通過(guò)引用結(jié)合于此。

本文一般地涉及用于核酸純化的方法和試劑盒，更具體地，涉及用于含rna樣品在體外轉(zhuǎn)錄之后的純化的基于磁性顆粒的試劑盒和方法。

技術(shù)背景

核酸純化(例如dna或rna的分離)對(duì)于各種生物化學(xué)和診斷過(guò)程會(huì)是重要的步驟。rna可用于許多應(yīng)用，例如，基因表達(dá)研究，分子研究和/或生物化學(xué)研究，例如rna干擾、顯微注射、感染、體外轉(zhuǎn)錄和/或核酸酶保護(hù)測(cè)定程序。轉(zhuǎn)錄是基因表達(dá)中的第一個(gè)步驟，其中，采用rna聚合酶從dna模板合成互補(bǔ)和反平行rna鏈。體外轉(zhuǎn)錄(ivt)可以提供一種從dna中體外轉(zhuǎn)錄具有所需序列或修飾(例如封端或放射標(biāo)簽)的核苷酸的方法。

存在各種設(shè)計(jì)成驅(qū)動(dòng)轉(zhuǎn)錄的ivt試劑盒，例如，t7、t3或sp6促進(jìn)劑。但是，在繼續(xù)開(kāi)展下游應(yīng)用之前，可能需要對(duì)ivt后樣品進(jìn)行純化，以去除一種或多種污染物，例如，鹽、蛋白質(zhì)、酶和寡核苷酸等。存在此類(lèi)污染材料會(huì)阻礙或阻止許多下游工藝。因此，從ivt后混合物有效地分離核酸以確保所需的終端使用功能是至關(guān)重要的。

在一些情況下，選擇的核酸純化方法影響分離產(chǎn)物的各種性質(zhì)，包括核酸樣品的產(chǎn)率、質(zhì)量和/或純度。雖然已經(jīng)建立了許多方法用于核酸純化，但是這些方法可能具有一種或多種缺陷，包括例如，高成本、高復(fù)雜度、緩慢的速度、低產(chǎn)率、低純度、污染、毒性和/或低效?？梢圆捎贸Ｒ?guī)沉淀過(guò)程，例如苯酚/氯仿萃取從ivt混合物分離較高純度的rna；但是，此類(lèi)方法會(huì)是耗時(shí)且復(fù)雜的。

基于固相的方法，例如采用磁性珠、旋轉(zhuǎn)柱和/或過(guò)濾系統(tǒng)的方法，作為替代解決方案而存在。在這些方法中，基于磁性顆粒的純化系統(tǒng)可具有各種優(yōu)勢(shì)，例如，由于缺少離心和/或真空步驟所以增強(qiáng)了簡(jiǎn)單程度。然而，使用磁性顆粒的方法仍受多種缺點(diǎn)的困擾，如低速、高復(fù)雜程度和/或總產(chǎn)率差。

因此，提供如下用于核酸純化的基于磁性顆粒的方法和試劑盒會(huì)是有利的，其可以是更為快速、較不復(fù)雜、較不昂貴和/或在產(chǎn)物純度和/或產(chǎn)率方面得到改善。所得到的經(jīng)純化的核酸可用于各種基因表達(dá)、分子和/或生物化學(xué)應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

在各種實(shí)施方式中，本文涉及對(duì)核酸進(jìn)行純化的方法，該方法包括：(a)將包含至少一種核酸的樣品與結(jié)合緩沖液相組合以形成溶液，所述結(jié)合緩沖液包含至少一種磁性顆粒且具有約為4-10的ph；(b)用結(jié)合緩沖液孵育樣品，持續(xù)的時(shí)間足以使得所述至少一種核酸與所述至少一種磁性顆粒可逆結(jié)合，以形成至少一種經(jīng)修飾的磁性顆粒；(c)從溶液分離所述至少一種經(jīng)修飾的磁性顆粒；(d)用至少一種清洗緩沖液清洗所述至少一種經(jīng)修飾的磁性顆粒；以及(e)使所述至少一種經(jīng)修飾的磁性顆粒與洗脫緩沖液相結(jié)合。

根據(jù)各種實(shí)施方式，結(jié)合緩沖液可以包括至少一種離液劑(存在的濃度范圍約為0.2-6m)、至少一種醇(存在的濃度范圍約為0.1-5m)以及任選的至少一種鹽(存在的濃度范圍約為10-100mm)。在其他實(shí)施方式中，清洗緩沖液可包含至少一種醇和任選的至少一種鹽。根據(jù)其他實(shí)施方式，洗脫緩沖液可以選自水和低鹽溶液，其包含例如約為0.1-10mm的至少一種離子螯合劑和/或約為10-100mm的至少一種緩沖化合物。磁性顆?？蛇x自例如羧基涂覆的磁性顆粒、基于二氧化硅的磁性顆粒，及其組合。本文還揭示了包含這些緩沖液和磁性顆粒的核酸純化試劑盒。

在以下的詳細(xì)描述中提出了本發(fā)明的附加特征和優(yōu)點(diǎn)，其中的部分特征和優(yōu)點(diǎn)對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言根據(jù)所作描述即容易理解，或者通過(guò)實(shí)施包括以下詳細(xì)描述、權(quán)利要求書(shū)以及附圖在內(nèi)的本文所述的本發(fā)明而被認(rèn)識(shí)。

應(yīng)理解，前面的一般性描述和以下的詳細(xì)描述都表示本文的各種實(shí)施方式，用來(lái)提供對(duì)于權(quán)利要求的性質(zhì)和特性的總體理解或框架性理解。包括的附圖提供了對(duì)本文的進(jìn)一步的理解，附圖被結(jié)合在本說(shuō)明書(shū)中并構(gòu)成說(shuō)明書(shū)的一部分。附圖舉例說(shuō)明了本文的各種實(shí)施方式，并與描述一起用來(lái)解釋本發(fā)明的原理和操作。

附圖說(shuō)明

結(jié)合以下附圖閱讀本說(shuō)明書(shū)，便可以最好地理解下文中的發(fā)明詳述，圖中相同的結(jié)構(gòu)用相同的附圖標(biāo)記表示：

圖1的流程圖顯示根據(jù)本文一個(gè)實(shí)施方式的核酸純化方法；

圖2顯示根據(jù)本文各種實(shí)施方式的方法相比于現(xiàn)有技術(shù)方法的rna產(chǎn)率；

圖3顯示采用根據(jù)本文各種實(shí)施方式的方法和采用現(xiàn)有技術(shù)方法純化的rna的瓊脂糖凝膠電泳分析；

圖4顯示根據(jù)本文各種實(shí)施方式的方法相比于現(xiàn)有技術(shù)方法的rna產(chǎn)率；

圖5a-b顯示采用根據(jù)本文各種實(shí)施方式的方法和采用現(xiàn)有技術(shù)方法純化的rna的瓊脂糖凝膠電泳分析；

圖6顯示根據(jù)本文各種實(shí)施方式的方法相比于現(xiàn)有技術(shù)方法的rna產(chǎn)率；

圖7顯示采用根據(jù)本文各種實(shí)施方式的方法和采用現(xiàn)有技術(shù)方法純化的核酸的瓊脂糖凝膠電泳分析；以及

圖8顯示采用根據(jù)本文各種實(shí)施方式的方法和采用現(xiàn)有技術(shù)方法純化的小核酸片段的瓊脂糖凝膠電泳分析。

具體實(shí)施方式

方法

本文揭示了核酸純化的方法，該方法包括：(a)將包含至少一種核酸的樣品與結(jié)合緩沖液相組合以形成溶液，所述結(jié)合緩沖液包含至少一種磁性顆粒且具有約為4-10的ph；(b)用結(jié)合緩沖液孵育樣品，持續(xù)的時(shí)間足以使得所述至少一種核酸與所述至少一種磁性顆?？赡娼Y(jié)合，以形成至少一種經(jīng)修飾的磁性顆粒；(c)從溶液分離所述至少一種經(jīng)修飾的磁性顆粒；(d)用至少一種清洗緩沖液清洗所述至少一種經(jīng)修飾的磁性顆粒；以及(e)使所述至少一種經(jīng)修飾的磁性顆粒與洗脫緩沖液相結(jié)合。

下面將參照?qǐng)D1討論本文的實(shí)施方式，圖1顯示根據(jù)本文非限制性實(shí)施方式的核酸純化方法的流程圖。以下一般性描述旨在提供對(duì)于所要求保護(hù)方法的總覽，本文全文將參照非限制性實(shí)施方式更具體地討論各個(gè)方面，在下文的一般性方法中，這些實(shí)施方式是可相互交換的。

如圖1所示，在步驟ivt中，會(huì)產(chǎn)生含有rna分子110與不需要的污染物105(例如，鹽、蛋白質(zhì)、酶、寡核苷酸、碳水化合物、dna模板和三磷酸核苷酸(ntp))的樣品。在步驟i中，樣品會(huì)與結(jié)合緩沖液組合并孵育，所述結(jié)合緩沖液包含至少一種磁性顆粒115等。在孵育過(guò)程中，樣品中的rna分子110可以與磁性顆粒115的表面可逆地結(jié)合。然后，在步驟s中，可以使用磁體120來(lái)吸引磁性顆粒115并從余下的溶液分離。在步驟w中，可以使用一種或多種清洗緩沖液清洗磁性顆粒115以除去未結(jié)合的污染物105。然后，在步驟e中，可以使用一種或多種洗脫緩沖液將rna110從磁性珠上洗脫解脫下來(lái)。最后，在步驟p中，可以從rna110分離磁性顆粒115，以產(chǎn)生隨后可用于各種應(yīng)用的純化產(chǎn)物。

如本文所用術(shù)語(yǔ)“包含至少一種核酸的樣品”及其變化形式旨在表示可含有至少一種核酸(例如，dna分子、rna分子或dna/rna混合分子)的任意材料。所述至少一種核酸可包括例如基因組dna、染色體dna(cdna)、質(zhì)粒dna(pdna)、總rna、信使rna(mrna)、核糖體rna(rrna)、轉(zhuǎn)移rna(trna)和/或rna/dna雜交體。在各種實(shí)施方式中，樣品可以是包含rna的ivt后的混合物。根據(jù)其他實(shí)施方式，待純化的所述至少一種核酸可以是rna，例如總rna。

根據(jù)本文所揭示的各種方法，包含至少一種核酸的樣品(例如，包含rna的ivt后樣品)可以與結(jié)合緩沖液(b1)組合(參見(jiàn)，例如圖1的步驟b)。結(jié)合緩沖液b1可包含至少一種離液劑(c1)、至少一種醇(a1)、和任選的至少一種鹽(z1)。樣品與結(jié)合緩沖液b1之間的體積比可以是如下范圍，例如，約為1:1.5至1:3，例如約為1:1.8-1:2.5，或者約為1:2-1:2.2，包括其間的所有范圍和子范圍。在某些實(shí)施方式中，樣品與結(jié)合緩沖液b1之間的體積比可以約為1:1.5、1:1.6、1:1.7、1:1.8、1:1.9、1:2、1:2.1、1:2.2、1:2.3、1:2.4、1:2.5、1:2.6、1:2.7、1:2.8、1:2.9、或1:3，包括其間的所有范圍和子范圍。

可以本領(lǐng)域已知的任何方式組合樣品和結(jié)合緩沖液b1，例如，可以將結(jié)合緩沖液b1加入到樣品并混合(例如通過(guò)顛倒進(jìn)行)。在某些實(shí)施方式中，可將混合物顛倒數(shù)次，例如至少五次、至少十次或更多次。樣品可以在結(jié)合緩沖液b1中孵育一段時(shí)間，其足以使得所述至少一種核酸與所述至少一種磁性顆粒結(jié)合。該時(shí)間段的范圍可以是例如約1分鐘至約30分鐘，如約2分鐘至約25分鐘、約3分鐘至約20分鐘、約4分鐘至約15分鐘或約5分鐘至約10分鐘，包括其間的所有范圍和子范圍。

存在于結(jié)合緩沖液b1中的所述至少一種離液劑c1的濃度范圍可以是例如：約為0.2m至約為6m，例如約為0.3m至約為5m，約為0.5m至約為4m，約為0.7m至約為3.5m，約為1m至約為3m，約為1.2m至約為2.5m，或約為1.5m至約為2m，包括其間的所有范圍和子范圍。例如，c1濃度可以約為0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、1.9m、2m、2.1m、2.2m、2.3m、2.4m、2.5m、2.6m、2.7m、2.8m、2.9m、3m、3.1m、3.2m、3.3m、3.4m、3.5m、3.6m、3.7m、3.8m、3.9m、4m、4.1m、4.2m、4.3m、4.4m、4.5m、4.6m、4.7m、4.8m、4.9m、5m、5.1m、5.2m、5.3m、5.4m、5.5m、5.6m、5.7m、5.8m、5.9m、或6m，包括其間的所有范圍和子范圍。根據(jù)各種實(shí)施方式，所述至少一種離液劑c1可以選自：胍鹽(例如，鹽酸鹽(guhcl)和硫氰酸胍(guscn))；鋰鹽(例如，乙酸鋰和高氯酸鋰)；及其組合。在某些非限制性實(shí)施方式中，所述至少一種離液劑c1可選自guhcl和guscn。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種離液劑c1可用于促進(jìn)所述至少一種核酸與所述至少一種磁性顆粒的結(jié)合。

存在于結(jié)合緩沖液b1中的所述至少一種醇a1的濃度范圍可以是例如：約為0.1m至約為5m，例如約為0.3m至約為4.5m，約為0.5m至約為4m，約為0.7m至約為3.5m，約為1m至約為3m，約為1.2m至約為2.5m，或約為1.5m至約為2m，包括其間的所有范圍和子范圍。例如，a1濃度可以約為0.1m、0.2m、0.3m、0.4m、0.5m、0.6m、0.7m、0.8m、0.9m、1m、1.1m、1.2m、1.3m、1.4m、1.5m、1.6m、1.7m、1.8m、1.9m、2m、2.1m、2.2m、2.3m、2.4m、2.5m、2.6m、2.7m、2.8m、2.9m、3m、3.1m、3.2m、3.3m、3.4m、3.5m、3.6m、3.7m、3.8m、3.9m、4m、4.1m、4.2m、4.3m、4.4m、4.5m、4.6m、4.7m、4.8m、4.9m、或5m，包括其間的所有范圍和子范圍。

在非限制性實(shí)施方式中，所述至少一種醇a1可以占據(jù)了結(jié)合緩沖液b1的總體積的約為20-50體積％，例如，約為25-45體積％或者約為30-40體積％，包括其間的所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種醇a1可選自異丙醇、乙醇、甲醇、丁醇，及其組合。在一些實(shí)施方式中，所述至少一種醇a1可以是異丙醇。在各個(gè)實(shí)施方式中，所述至少一種醇a1可以是離液的(chaotropic)，并且可用于使樣品中的蛋白質(zhì)變性。

如果存在的話，在結(jié)合緩沖液b1中存在的所述至少一種鹽z1的濃度可以是例如約為10-100mm，例如約為20-90mm，約為30-80mm，約為40-70mm，或者約為50-60mm，包括其間的所有范圍和子范圍。例如，z1濃度可以約為10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm、或100mm，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種鹽z1可以選自磷酸鹽，例如磷酸二氫鈉(nah2po4)、磷酸氫二鈉(na2hpo4)，及其組合。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，結(jié)合緩沖液b1的ph范圍可以約為4-10，例如約為4.5-9.5，約為5-9，約為5.5-8.5，約為6-8，或者約為6.5-7.5，包括其間的所有范圍和子范圍。例如，結(jié)合緩沖液b1的ph可以約為4、4.1、4.2、4.3、4.4、4.5、4.6、4.7、4.8、4.9、5、5.15.2、5.3、5.4、5.5、5.6、5.7、5.8、5.9、6、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9、7、7.1、7.2、7.3、7.4、7.5、7.6、7.7、7.8、7.9、8、8.1、8.2、8.3、8.4、8.5、8.6、8.7、8.8、8.9、9、9.1、9.2、9.3、9.4、9.5、9.6、9.7、9.8、9.9、或10，包括其間的所有范圍和子范圍。

如本文所用術(shù)語(yǔ)“磁性顆?！奔捌渥兓问街荚诒硎揪哂写判?例如順磁性或超順磁性)芯的顆粒，芯涂覆有至少一種表面可與核酸可逆結(jié)合的材料。合適的磁性顆?？砂ɡ玺然扛驳捻槾判灶w粒以及基于二氧化硅的順磁性顆粒等。在一些實(shí)施方式中，基于二氧化硅的磁性顆粒可以包括涂覆了硅石氧化物的順磁性芯，從而提供了含水硅石氧化物吸附表面(例如，包含硅烷醇基團(tuán)的表面)，核酸可以與其結(jié)合。在其他實(shí)施方式中，磁性顆?？梢越?jīng)表面修飾以產(chǎn)生功能化的表面，例如帶弱或強(qiáng)正電荷、帶弱或強(qiáng)負(fù)電荷或疏水性表面等。

市售可得的磁性顆粒的非限制性例子包括購(gòu)自magqu有限公司的q珠和購(gòu)自w.r.grace&co公司的grace珠等。磁性顆粒可以具有適合與核酸結(jié)合的任意尺寸，包括市售可得的尺寸，例如直徑范圍約為0.3-10μm的直徑，例如，直徑約為0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、或10μm，包括其間的所有范圍和子范圍。例如，q珠的平均直徑范圍可以約為4μm至約5μm，grace珠的平均直徑范圍可以約為5μm至約10μm。

在結(jié)合緩沖液中存在的所述至少一種磁性顆粒的濃度范圍可以是例如，約為0.5μg/μl至約為60μg/μl、例如約為0.75μg/μl至約為55μg/μl、約為1μg/μl至約為50μg/μl、約為2μg/μl至約為45μg/μl、約為3μg/μl至約為40μg/μl、約為4μg/μl至約為35μg/μl、約為5μg/μl至約為30μg/μl、約為6μg/μl至約為25μg/μl、約為7μg/μl至約為20μg/μl、約為8μg/μl至約為15μg/μl、或約為9μg/μl至約為10μg/μl，包括其間的所有范圍和子范圍。作為非限制性實(shí)施方式，所述至少一種磁性顆?？梢赃x自q珠，并且在結(jié)合緩沖液b1中存在的濃度范圍約為0.5-5μg/μl。在替代性實(shí)施方式，所述至少一種磁性顆粒可以選自grace珠，并且在結(jié)合緩沖液b1中存在的濃度范圍約為2-60μg/μl。

不希望受限于理論，相信通過(guò)結(jié)合緩沖液b1引入的較高濃度的離液劑、醇和/或鹽可以增強(qiáng)核酸(例如rna)與磁性顆粒的表面(例如二氧化硅表面)發(fā)生可逆(例如非共價(jià))結(jié)合的能力。隨后，能夠?qū)⑷绱诵揎椀拇判灶w粒(例如包含可逆結(jié)合的核酸)與未結(jié)合的污染物分離(參見(jiàn)例如圖1的步驟s)。例如，可以將磁體放置在靠近經(jīng)修飾的磁性顆粒，并用于將顆粒拉到一起，例如從而形成團(tuán)聚體或球粒。在某些實(shí)施方式中，可以將含有經(jīng)組合的溶液(其包含了經(jīng)修飾的磁性顆粒)的容器(例如，管)放在磁性臺(tái)上，其可以在去除剩余溶液的同時(shí)聚集并略微固定顆粒。

在將核酸與磁性顆粒結(jié)合之后以及采用磁體使得經(jīng)修飾的磁性顆粒分離之后，然后可以用一種或多種清洗緩沖液對(duì)顆粒進(jìn)行結(jié)合、沖洗或清洗(參見(jiàn)例如圖1的步驟w)。清洗緩沖液(w1)可以包括例如至少一種醇(a2)和任選的至少一種鹽(z2)。然后可以用清洗緩沖液w1對(duì)經(jīng)修飾的磁性顆粒沖洗一次或多次，任意額外清洗可以采用相同或不同的組成、濃度和/或體積量。

存在于清洗緩沖液w1中的所述至少一種醇a2的濃度范圍可以是，例如約70％至約100體積％，例如約75-95體積％或約80-90體積％，包括其間的所有范圍和子范圍。例如，a2濃度可以約為70％、75％、80％、85％、90％、95％或100％，包括其間的所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種醇a2可選自異丙醇、甲醇、乙醇、丁醇，及其組合。在某些非限制性實(shí)施方式中，所述至少一種醇a2可以是乙醇。

如果存在的話，在清洗緩沖液w1中存在的所述至少一種鹽z2的濃度可以是例如約為10-100mm，例如約為20-90mm，約為30-80mm，約為40-70mm，或者約為50-60mm，包括其間的所有范圍和子范圍。例如，z2濃度可以是約10mm、15mm、20mm、25mm、30mm、35mm、40mm、45mm、50mm、55mm、60mm、65mm、70mm、75mm、80mm、85mm、90mm、95mm或100mm，包括其間所有范圍和子范圍。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，所述至少一種鹽z2可選自硫酸銨((nh4)2so4)、乙酸銨(nh4ac)、乙酸鋰(liac)、乙酸鉀(kac)、乙酸鈉(naac)、氯化鈉(nacl)，及其組合。在某些非限制性實(shí)施方式中，所述至少一種鹽z2可選自naac和nh4ac。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，清洗緩沖液w1的ph范圍可以是例如約為4-8，例如約為5-7，約為6-6.5，或者約為6.4-6.8，包括其間的所有范圍和子范圍?？赏ㄟ^(guò)改變醇和/或鹽的量來(lái)調(diào)節(jié)清洗緩沖液w1的ph，或者可使用一種或多種本文所述的緩沖化合物(例如冰醋酸或naoh)來(lái)調(diào)節(jié)。

在添加和去除清洗緩沖液w1之后，可以提供表面可逆結(jié)合了核酸的經(jīng)修飾的磁性顆粒，其可以不含或者基本不含污染物(例如，鹽、蛋白質(zhì)、酶等)。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，然后可將如此產(chǎn)生的經(jīng)修飾的磁性顆粒與一種或多種洗脫緩沖液(e1)組合以釋放結(jié)合的核酸并將其與磁性顆粒分離(參見(jiàn)例如圖1中的步驟e)?？蓪⑿揎椀拇判灶w粒與洗脫緩沖液e1孵育足夠長(zhǎng)的一段時(shí)間以釋放核酸，如約30秒至約10分鐘，例如如約45秒至約9分鐘、約1分鐘至約8分鐘、約2分鐘至約7分鐘、約3分鐘至約6分鐘或約4分鐘至約5分鐘，包括其間的所有范圍和子范圍。洗脫緩沖液e1可以包括例如水或較低鹽溶液，其包含例如，約為1-10mm的至少一種緩沖液(例如，tris等)、約1-10mm的至少一種鹽、和/或約0.1-10mm的至少一種離子螯合劑(例如，edta等)。根據(jù)非限制性實(shí)施方式，洗脫緩沖液e1可包含約1mm的edta和約10mm的tris。

然后可以從溶液去除(不再與核酸附著的)磁性顆粒，例如采用磁體分離，得到溶液中的經(jīng)純化的核酸作為最終產(chǎn)物(參見(jiàn)例如圖1的步驟p)。例如，本文所揭示的方法和試劑盒可用于提供經(jīng)純化的rna產(chǎn)品。根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，本文所揭示的方法和試劑盒可用于在短時(shí)間段內(nèi)有效地產(chǎn)生經(jīng)純化的rna。例如，在非限制性實(shí)施方式中，本文公開(kāi)的方法可在小于約30分鐘的時(shí)間段內(nèi)實(shí)施，如小于約20分鐘。在某些實(shí)施方式中，本文所揭示的方法在約20分鐘內(nèi)提供了至少約90％的相對(duì)rna產(chǎn)率。

應(yīng)理解的是，在一些實(shí)施方式中，各種緩沖溶液的組分可互換使用，例如可以是相互相同或不同的。例如，醇a1和a2以及鹽z1和z2可以分別是相同或不同的。類(lèi)似地，這些組分的濃度可以發(fā)生改變，并且在一些情況下，可以是相同或相似的，這取決于所需的應(yīng)用。

還應(yīng)理解的是，本文所揭示的方法還可包括本領(lǐng)域已知的其他步驟，例如，離心和過(guò)濾等。在其他非限制性實(shí)施方式中，本文所揭示的方法不包括任何離心或過(guò)濾步驟，這可增強(qiáng)工藝的自動(dòng)化能力。其他任選步驟可包括空氣干燥，例如在用清洗緩沖液w1清洗經(jīng)修飾的磁性顆粒后，可對(duì)顆粒進(jìn)行空氣干燥約1分鐘至約10分鐘的時(shí)間段，如約2分鐘至約9分鐘、約3分鐘至約8分鐘、約4分鐘至約7分鐘或約5分鐘至約6分鐘，包括其間的所有范圍和子范圍。如果需要或者希望的話，還可在本文公開(kāi)的方法實(shí)施期間將多種樣品、溶液或者樣品或溶液的部分移出和/或轉(zhuǎn)移至新容器(如管)中。

試劑盒

本文還涉及用于核酸純化的試劑盒，該試劑盒包括：結(jié)合緩沖液、清洗緩沖液和洗脫緩沖液。在各個(gè)實(shí)施方式中，緩沖液可對(duì)應(yīng)于上文關(guān)于純化方法所揭示的緩沖液b1、w1和e1。應(yīng)理解，可以任何方式并不受限制地結(jié)合相對(duì)于各緩沖液的上述多種實(shí)施方式以形成本文公開(kāi)的試劑盒。

根據(jù)各個(gè)實(shí)施方式，供給到試劑盒中的每種緩沖液可以具有預(yù)定濃度，從而使得每種組分是即用型的。或者，可提供一種或多種濃縮溶液，待最終用戶(hù)使用合適類(lèi)型和量的溶劑稀釋以產(chǎn)生即用型緩沖液。例如，在某些實(shí)施方式中，可以在試劑盒內(nèi)提供濃縮的結(jié)合緩沖液，用戶(hù)可以用醇(例如異丙醇)將其稀釋至最高達(dá)1:1的體積比。根據(jù)其他實(shí)施方式，可以提供濃縮的清洗緩沖液w1，用于可以用醇(例如乙醇)將其稀釋至大于或等于70％的最終濃度，以乙醇的體積計(jì)。在一些實(shí)施方式中，試劑盒還可包括關(guān)于純化方案和/或任何稀釋指令的最終用戶(hù)的指示。根據(jù)其他實(shí)施方式，試劑盒還可包括各種其他組分或設(shè)備，例如磁性臺(tái)、管、離心機(jī)和/或溶劑。

應(yīng)理解，多個(gè)揭示的實(shí)施方式可涉及與特定實(shí)施方式一起描述的特定特征、元素或步驟。應(yīng)理解的是，雖然結(jié)合一個(gè)具體的實(shí)施方式描述了具體特征、元素或步驟，但是不同實(shí)施方式可以以各種未示出的組合或變換形式相互交換或結(jié)合。

還應(yīng)理解的是，本文所用的冠詞“該”、“一個(gè)”或“一種”表示“至少一個(gè)(一種)”，不應(yīng)局限為“僅一個(gè)(一種)”，除非明確有相反的說(shuō)明。因此，例如，提到的“一個(gè)緩沖液”包括具有兩個(gè)或更多個(gè)這樣的“緩沖液”的例子，除非文中另行明確指明。

本文中，范圍可以表示為從“約”一個(gè)具體值和/或到“約”另一個(gè)具體值的范圍。當(dāng)表述這種范圍時(shí)，例子包括自某一具體值始和/或至另一具體值止。類(lèi)似地，當(dāng)使用先行詞“約”表示數(shù)值為近似值時(shí)，應(yīng)理解，具體數(shù)值構(gòu)成另一個(gè)方面。還應(yīng)理解的是，每個(gè)范圍的端點(diǎn)值在與另一個(gè)端點(diǎn)值有關(guān)和與另一個(gè)端點(diǎn)值無(wú)關(guān)時(shí)，都是有意義的。

除了在實(shí)施例中之外，無(wú)論是否寫(xiě)出來(lái)，本文所述的所有數(shù)值都解釋為包括“約”，除非另有明顯相反表示。然而，還應(yīng)理解，無(wú)論是否表示為“約”某一數(shù)值，列出的各數(shù)值都是精確估計(jì)的。因此，“大于2m的濃度”和“大于約2m的濃度”都包括“大于約2m的濃度”以及“大于2m的濃度”的實(shí)施方式。

除非另有表述，否則都不旨在將本文所述的任意方法理解為需要使其步驟以具體順序進(jìn)行。因此，當(dāng)方法權(quán)利要求實(shí)際上沒(méi)有陳述為其步驟遵循一定的順序或者其沒(méi)有在權(quán)利要求書(shū)或說(shuō)明書(shū)中以任意其他方式具體表示步驟限于具體的順序，都不旨在暗示該任意特定順序。

雖然會(huì)用過(guò)渡語(yǔ)“包括”來(lái)公開(kāi)特定實(shí)施方式的各種特征、元素或步驟，但是應(yīng)理解的是，這暗示了包括可采用過(guò)渡語(yǔ)由“......構(gòu)成”、“基本由......構(gòu)成”描述在內(nèi)的替代實(shí)施方式。因此，例如，對(duì)包含a+b+c的緩沖液的隱含的替代性實(shí)施方式包括緩沖液由a+b+c組成的實(shí)施方式和緩沖液主要由a+b+c組成的實(shí)施方式。

對(duì)本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言，顯而易見(jiàn)的是，可以在不偏離本文的范圍和精神的情況下對(duì)本文進(jìn)行各種修改和變動(dòng)。因?yàn)楸绢I(lǐng)域的技術(shù)人員可以想到所述實(shí)施方式的融合了本公開(kāi)精神和實(shí)質(zhì)的各種改良組合、子項(xiàng)組合和變化，應(yīng)認(rèn)為本文包括所附權(quán)利要求書(shū)范圍內(nèi)的全部?jī)?nèi)容及其等同內(nèi)容。

以下實(shí)施例是非限制性的且僅僅是示意性的，本發(fā)明的范圍由權(quán)利要求書(shū)所限定。

實(shí)施例

示例性純化方案

僅出于討論的目的，下面提供了用于從樣品(例如ivt樣品)對(duì)rna進(jìn)行純化的示例性方案。當(dāng)然，該方案并不旨在限制且不應(yīng)理解為對(duì)所附權(quán)利要求的限制。

a)結(jié)合緩沖液制備：采用1:1的體積比，將濃縮的結(jié)合緩沖液b1重懸浮在醇中；

b)清洗緩沖液制備：將醇添加到濃縮的清洗緩沖液中，至70％的最終體積濃度；

c)rna結(jié)合：對(duì)于x體積的樣品，添加3x體積的結(jié)合緩沖液b1，良好混合，并孵育5分鐘；

d)結(jié)合了rna的磁性顆粒的分離：采用磁性臺(tái)以磁性方式分離具有可逆結(jié)合的rna的磁性顆粒，直到液體是基本透澈的，以及去除透澈液體；

e)對(duì)結(jié)合了rna的磁性顆粒進(jìn)行清洗：用700μl的清洗緩沖液w1對(duì)包含可逆結(jié)合的rna的磁性顆粒清洗一次；

f)去除清洗緩沖液：采用磁性臺(tái)以磁性方式分離具有可逆結(jié)合的rna的磁性顆粒，直到液體是基本透澈的，以及去除透澈液體；

g)重復(fù)步驟e)，400μl的清洗緩沖液w1；

h)重復(fù)步驟f)；

i)干燥：使得具有可逆結(jié)合的rna的磁性顆粒在磁性臺(tái)上進(jìn)行空氣干燥，持續(xù)5-10分鐘；

j)rna的洗脫：從磁性臺(tái)取出管并添加所需體積的洗脫緩沖液e1(或多或少產(chǎn)生所需的樣品濃度)，以及在室溫下孵育至少2分鐘；以及

k)rna的純化：將管放在磁性臺(tái)上以分離磁性顆粒，直到液體是基本透澈的，以及去除和保存透澈液體。

比較例1

采用上文所述方案，用q珠(62.5μg)或grace珠(180、360、1080、3240μg)對(duì)含有rna的樣品進(jìn)行純化。還采用貝克曼庫(kù)爾特公司(beckmancoulter)的rnacleanxp試劑盒對(duì)相同的樣品進(jìn)行純化。量化每種方法的平均總rna產(chǎn)率，參見(jiàn)表2。采用q珠的本發(fā)明方法的相對(duì)總rna產(chǎn)率是88.4％。采用grace珠的本發(fā)明方法的相對(duì)總rna產(chǎn)率是73.3％(3240μg)至82.0％((360μg)。比較例試劑盒產(chǎn)率為81.5％rna。

圖3顯示各種方法的rna樣品的瓊脂糖凝膠電泳分析，顯示通過(guò)每種方法產(chǎn)生的rna的質(zhì)量是相當(dāng)?shù)?。因此，圖2-3證實(shí)本發(fā)明的方法進(jìn)行了約20分鐘，提供了與基準(zhǔn)比較例試劑盒相當(dāng)?shù)膔na產(chǎn)率和質(zhì)量。

比較例2

采用上文所述示例性方案以結(jié)合緩沖液b1在變化的ph(4.3和6.3)和變化的rna濃度((20μgrna溶解在20μl或200μg溶液中)下對(duì)rna進(jìn)行純化。還采用貝克曼庫(kù)爾特公司(beckmancoulter)的rnacleanxp試劑盒對(duì)相同的樣品進(jìn)行純化。量化每種方法的相對(duì)總rna產(chǎn)率，參見(jiàn)表4。相比于采用ph6.3的結(jié)合緩沖液的方法，采用ph4.3的結(jié)合緩沖液的本發(fā)明的方法的相對(duì)總rna產(chǎn)率得到改善。此外，相比于采用20μg/200μlrna的方法，采用20μg/20μlrna的本發(fā)明的方法的相對(duì)總rna產(chǎn)率得到改善。

圖5顯示各種方法的rna樣品的瓊脂糖凝膠電泳分析，顯示相比于采用ph6.3的結(jié)合緩沖液的本發(fā)明的方法，采用ph4.3的結(jié)合緩沖液的本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的rna的質(zhì)量降低。因此，圖4-5證實(shí)本發(fā)明的方法進(jìn)行了約20分鐘，提供了相比于基準(zhǔn)比較例試劑盒得到改善或者相當(dāng)?shù)膔na產(chǎn)率和/或質(zhì)量。

比較例3

采用上文所述示例性方案，以q珠(62.5μg)或grace珠(360μg)，從ivt樣品純化rna。還采用貝克曼庫(kù)爾特公司(beckmancoulter)的rnacleanxp試劑盒對(duì)相同的樣品進(jìn)行純化。對(duì)每種方法的rna產(chǎn)率進(jìn)行量化和記錄于圖6中，結(jié)果相對(duì)于產(chǎn)率進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。采用q珠的本發(fā)明方法的相對(duì)總rna產(chǎn)率是96.0％。采用grace珠的本發(fā)明方法的相對(duì)總rna產(chǎn)率是91.2％。

圖7顯示各種方法的核酸樣品的瓊脂糖凝膠電泳分析，顯示通過(guò)每種方法產(chǎn)生的核酸的質(zhì)量是相當(dāng)?shù)?。圖8顯示寡核苷酸(30nt)的瓊脂糖凝膠電泳分析，顯示相比于比較例方法，本發(fā)明方法與小片段核酸結(jié)合的能力得到了改善。

因此，圖6-8證實(shí)本發(fā)明的方法進(jìn)行了約20分鐘，提供了與基準(zhǔn)比較例試劑盒相當(dāng)?shù)膔na產(chǎn)率和質(zhì)量，同時(shí)還提供了改善的核酸小片段結(jié)合。