專利名稱：：純化方法和試劑盒的制作方法純化方法和試劑盒本發(fā)明涉及新穎的純化方法以及可用于該方法中的試劑和試劑盒，所述方法可用于多種測定。多種測定方法已應用于診斷或4企測。對分析物(例如在各種固相支持體上的蛋白)的檢測在本領(lǐng)域為人所熟知。許多這樣的檢驗以"試紙條(dipstick)"測定的形式進行，所述測定依靠包含所述分析物的液體樣品沿膜的側(cè)流，在所述膜上所述分析物依次遇到標記、標記的結(jié)合配偶體(bindingpartner)和/或固定化結(jié)合配偶體，借此在該膜上產(chǎn)生可檢測的可見信號。這種方法的優(yōu)勢在于它們提供快速測定結(jié)果，而且可以在幾乎任何地方由非專業(yè)的人員使用。例如，它們可用于農(nóng)業(yè)以檢測農(nóng)作物上特定的害蟲或病原體，例如真菌抗原或病毒感染。在某些情況下，所需要的只是指示分析物存在與否的簡單的陽性或陰性結(jié)果。例如，這樣的測定通常用于妊娠檢驗，而且僅需存在特定的激素，例如HCG，即可表明所述受試者已懷孕。然而，在許多情況下，這種類型的檢驗僅可給出可能存在的問題或病癥的初步診斷。對于許多微生物而言，例如，存在特定蛋白可表明存在特定種類的生物體，例如現(xiàn)存的普通細菌、真菌或病毒，但是通過這種方法不能檢測出所述生物體的準確的菌抹/毒株。因為在確定任何特殊情況的危險性的準確水平時，準確的菌抹/毒抹常常是關(guān)鍵，因此需要進一步的研究。例如，某種特定細菌(例如大腸桿菌)或病毒(例如流感病毒)有許多的菌株/毒林，但是僅有特定的菌林/毒林會造成重大健康危害，例如大腸桿菌0157或禽流感H5N1毒林。對這些菌株/毒株準確的診斷可能是困難的，因為用于診斷技術(shù)的抗體可與源自多種菌抹/毒抹的蛋白反應或交叉反應?？商娲腲r測或診斷方法在核酸水平起作用。在這些方法中，在樣品中^r測特定核酸序列例如DNA序列或RNA序列，并且所述結(jié)果指示特定生物體的存在情況。這些技術(shù)非常靈敏，而且通過選擇合適的特征性靶核酸，可檢測準確的菌林/毒抹或甚至準確的特定基因的等位基因形式或基因組形式，所述菌抹/毒抹或所述形式可能是基因組疾病(genomicdisease)特有的或?qū)μ囟膊顟B(tài)的誘因。擴增技術(shù)例如聚合酶鏈反應(PCR)或逆轉(zhuǎn)錄酶-聚合酶鏈反應(RT-PCR)意味著即使測定中存在或可能存在的核酸量非常少，仍可使用上述技術(shù)。因此，在檢測和診斷領(lǐng)域，所述技術(shù)是強有力的工具。然而，所述技術(shù)普遍需要一些重要的樣品制備方法。為了除去樣品中可能妨礙核酸檢測方法或掩蓋結(jié)果的部分，通常需要進行大量的樣品純化或制備，所述樣品是例如來自植物或動物組織等的組織或者血液或尿等樣品的粗提取物。所以，常常難以在實驗室環(huán)境之外進行所述檢驗，故而必須運送所取的樣品用于進一步的分析。含有遺傳物質(zhì)的液體樣品可能難于運送，要求對采集的所述樣品滅菌和/或冷凍樣品。已知暫時儲存干燥于固相支持體、特別膜(例如濾紙等)上核酸的含遺傳物質(zhì)的樣品，例如的血液。然而，通常認為這類儲存的物質(zhì)的穩(wěn)定性可能存在問題，而已提出用于改進所述問題的方法，所述方法包括用包括弱堿和螯合劑在內(nèi)的各種化學試劑中浸漬所述固相支持體(參見例如美國專利第5，756，126號)。用于進行某些初步樣品制備步驟諸如細胞溶解和蛋白變性的儲存卡(Storagecard)和可用于后續(xù)分析的可能添加的試劑如PCR引物等也公開于美國專利第5,756,126號中，并且所述產(chǎn)品有Whatman的FTA卡。所述產(chǎn)品載有例如螯合劑、堿和離子型去污劑的特定試劑以增進儲存能力。業(yè)已嘗試使用復雜的裝置和系統(tǒng)直接在膜上檢測核酸，所述裝置和系統(tǒng)利用針對特定核酸、半抗原和/或標記部分的結(jié)合劑來產(chǎn)生信號，與用于常規(guī)蛋白分析物的類似(參見例如WO00/29112和Dinerva等,J.ofClin.Microbiol.(2005)p4015-4021)。通常在這些情況下，為了得到足夠的樣品中的靶DNA以提供可檢測的信號，需要進行擴增，例如使用聚合酶鏈反應進行擴增。然而，本申請人發(fā)現(xiàn)，用于例如試紙條型免疫測定的常^見液體根據(jù)本發(fā)明，提供了用于從液體樣品分離核酸的方法，所述方法包括下述步驟使包含或疑似包含所述核酸的液體樣品沿吸水膜流動，以使核酸沿所述膜的縱向分布。本申請人發(fā)現(xiàn)當沿吸水膜流動時(包括在液流裝置所用的條件下)，核酸與所述膜(特別是用于這些裝置的纖維素膜或硝化纖維素膜)結(jié)合。似乎通過使液體樣品沿吸水膜流動，任何存在的核酸都被優(yōu)先地保留在所述膜上，因此可與樣品中的其它成分分離。在這些情況下，所述核酸以穩(wěn)定的形式沿所述膜的縱向分布，特別是沿所述膜的幾乎全部的和適當?shù)拈L度分布。無需在所述膜上提供特定的結(jié)合劑以確保所述核酸被保留或集中在特定區(qū)域、或防止所述核酸從所述膜上完全洗脫。這可使所述裝置的制造更簡單和更經(jīng)濟。可使用任何常規(guī)的檢測方法來檢測所述膜上核酸的存在情況。隨后可檢測在所述膜上核酸的存在情況，或隨后可從所述膜上回收核酸，所述4企測或回收在所述膜被干燥的前后均可。因此，這些膜提供易于得到且易于使用的純化方法，該方法可用于多種應用中?？蓱盟龇椒ǖ念I(lǐng)域包括食品和農(nóng)業(yè)4企驗、診斷學(包括人類、動物診斷學)、環(huán)境監(jiān)測(包括水和土壤監(jiān)測)、法醫(yī)學、轉(zhuǎn)基因?qū)W、輸血醫(yī)學(transfusionmedicine)、質(zhì)粒篩選、藥物研發(fā)、基因組學、植物或動物鑒別或分類、藥物遺傳學、STR分析和分子生物學研究。何形式或遺傳分析(例如SNP分型、DNA指紋測定或核酸測序)以及特定核酸檢測的預備步驟。一旦將所述核酸在所述膜上分離，則可對該核酸進行進一步的原位分析，或者如有需要，可使用合適的緩沖液將核酸從所述膜洗脫或4是取，并對所述洗出液或提取物進行分析。所述膜可用于替代常規(guī)的純化柱，提供了更加經(jīng)濟和易用的選擇。本申請人還發(fā)現(xiàn)，在已被干燥的膜上所述核酸可更長時間地(包括多年)保持其位置并且保持穩(wěn)定。因此，在分析前可更長時間的儲存樣品或甚至將其存檔。所述膜適合作為常規(guī)的液流裝置的部件。當用于本文時，術(shù)語"液流裝置，，是指包含液體樣品和試劑(在某些情況下包括標記試劑)可通過的多孔膜或吸水膜的裝置。這些裝置可包括公知的側(cè)流裝置(LFD)。被回收或被檢測的核酸可為例如特定生物體(例如病毒、真菌或細菌等病原生物體)特有的的核酸，或更適合為特定病原菌抹/毒抹或這種生物體種特有的核酸?；蛘?，為了診斷目的，所述核酸可包括植物或動物(包括人)遺傳疾病或病癥特有的的特定核酸序列、或遺傳疾病或病癥之"i秀因特有的的特定核酸序列，在所述情況下，可能需要檢測更多的核酸序列或所述序列中的更多多態(tài)性或變異的存在情況。如上所述，用于分析目的的核酸分離廣泛地用于許多領(lǐng)域，而本發(fā)明可用于任何的所述領(lǐng)域?？稍谒瞿ど蠙z測或從所述膜中回收多種核酸序列。根據(jù)檢驗目的，這些核酸序列可以來自于相同或不同的來源。例如，如果尋求鑒定樣品中感染性生物體的存在情況，那么可能希望不僅檢測所述生物體特有的的核酸，而且還一企測宿主生物體特有的的核酸，以便證實所述樣品的真實性。這可例如通過如下方式進行在所述膜的特定樣品上4企測不止1種核酸(例如使用多重PCR)，或?qū)λ瞿さ牟煌瑯悠愤M行不同的檢測反應。當用于本文時，術(shù)語"膜"是指通常是平坦且多孔的固體基質(zhì)。合適的基質(zhì)或膜可包括基于纖維素的材料，例如纖維素、硝化纖維素或羧曱基纖維素；親水性聚合物，包括合成親水性聚合物，例如聚酯、聚酰胺、碳水化合物聚合物；疏水性聚合物，例如卣代聚合物，例如聚四氟乙烯；玻璃纖維；或多孔陶瓷。特別合適的膜包括纖維膜，特別是硝化纖維素膜，所述膜可被層壓，例如可從Millipore得到的膜。這些膜可支持在基材上，例如塑料襯底膜，例如聚酯(Mylar⑧)或PET村底纖維素膜上。所述膜的孔徑可大范圍變化。本申請人發(fā)現(xiàn)，孔徑似乎對于核酸的保留或其它作用并不關(guān)4建?？傻玫皆?5-240秒范圍、宜在65-180秒范圍內(nèi)通過4cm長度的側(cè)流流速的膜，在本發(fā)明的方法中所述膜有效。所述流速通常與孔徑和/或所述膜材料(例如硝基纖維素)的配方相關(guān)，這在本領(lǐng)域中可以理解。所述裝置可采用多種形式，但是通常，所述裝置包括樣品接收部分，該部分或者為所述膜本身的部分或者為吸收墊，該部分與所述膜存在液體接觸。膜本身適于為長條狀的形式，儲存在樣品接收部分的液體能夠沿著所述膜移動。為了吸收過量的樣品、也為了有效地吸引液體樣品沿所述膜流動，吸收墊可位于所述膜中遠離樣品4妄收部分的末端。所述膜至少適于安置在固體罩(例如塑料罩)中，當用于常規(guī)免疫測定程序中時，所述罩可配備1個以上用于樣品傳輸和/或用于讀取結(jié)杲的開口或窗口?；蛘?，可將所述樣品接收部分安置于所述罩外部。然而，在某些情況下，特別是對于實驗室應用，可優(yōu)選無罩的試紙條結(jié)構(gòu)，特別是當層壓以獲得支持和保護時。在一個實施方式中，所述方法可在用于^r測液體樣品中特定核酸存在情況的測定中使用。所加載的樣品適于為任何包含或疑似包含核酸序列的液體樣品。因此，樣品包括已經(jīng)溶解、懸浮、混合或以其它方式含有核酸(包括DNA和/或RNA)、或者含有DNA和/或RNA的細胞、細胞成分或細胞提取液的液體。這種性質(zhì)的樣品可由很多種來源獲得。這包括例如生理、病理或臨床體液，例如人類或動物的分泌物、排泄物、溢泌物和滲出液；以及細胞懸液，例如取自包括人類在內(nèi)的動物的血液、血清、淋巴、滑液、精液、唾液(特別是含有口腔細胞的唾液)、皮膚屑和毛根細胞。其它的樣品包括植物的生理或病理液體或細胞懸液；液體制品，例如細菌、真菌、質(zhì)粒或病毒等的提取物或懸液；和例如蠕蟲、原生動物、螺旋體的寄生物的液體制品、提取液或懸液。還可形成通過形成組織4是取液(例如植物或動物組織)而得到的液體樣品。然而，樣品還可包含源自DNA或RNA合成的介質(zhì)、或化學或生物合成的DNA或RNA的混合物。特別是，樣品包括生理或臨床樣品，例如血液、尿、乳或唾液以及血清，或所述樣品可包括組織提取液，例如植物組織提取液(例如葉、莖、樹皮或塊莖提取液)、或動物組織(包括血液、骨、肝、腎等)或排泄物的提取液。所述樣品優(yōu)選包含來自例如植物或動物的生物體的組織提取液，所述生物體可例如祐J1生物(特別是病原微生物)感染，或為了分類或其它目的，需要對所述生物體進行遺傳分析。適于通過將所述樣品提取入合適的緩沖溶液以制備提取液。本申請人發(fā)現(xiàn)，用于提取免疫測定所用蛋白樣品的緩沖液還可提取出核酸，因此所述緩沖液可用于本方法中。在任何特定情況下所使用的準確緩沖溶液將取決于所檢驗的樣品的性質(zhì)。但是，對于從植物或動物樣品中提取核酸而言，合適的緩沖液可包含易于得到的緩沖液，例如磷酸緩沖鹽水(PBS)或Tris緩沖鹽水(TBS)。緩沖液可適于包含防腐劑，例如疊氮鈉、福爾馬林或辟b柳汞。在任何情況下所加入的防腐劑的量取決于所使用的特定防腐劑以及相關(guān)的緩沖液的類型和體積，但是以疊氮鈉為例，可將其適宜地以0.2-1.5%重量的量、例如約0.5%重量加入。適于將待檢驗的組織樣品與提取緩沖液混合均勻，任選使用機械破碎方法。例如，已經(jīng)通過如下方法制備用于免疫測定程序的組織樣品、特別是植物組織樣品將所述組織置于包含提取緩沖液和滾珠的小瓶并且劇烈搖動所述小瓶，以使?jié)L珠沖擊樣品并促進細胞結(jié)構(gòu)的破壞?？蓪M織或或其它樣品進行不同的處理，但是本領(lǐng)域的技術(shù)人員可確定將核酸提取入提取物的準確方法。一旦在樣品接收區(qū)將樣品加載于所述膜上，則由于吸水性流動所述樣品會沿所述膜移動。根據(jù)所述樣品和所述膜的性質(zhì)，該過程可迅速發(fā)生并且僅需最小限度的操作技術(shù)和干預。此后，在例如實驗室環(huán)境中將所述膜或更適于將所述膜的一部分(例如從所述膜提取的條帶或圓片)取出，并用于進一步的分析。所述分析可包括如上所述的遺傳分析，例如SNP分型或DNA指紋測定，以及核酸4全測測定?？蓮乃瞿さ娜我獠糠秩〉盟霾糠?，但是可優(yōu)選從與樣品接收部分隔離的區(qū)域提取樣品。這在樣品包含例如特別大的蛋白或分子的情況下尤其重要，所述蛋白或分子不能沿所述膜被很好地洗出的，因此它們可在樣品接收部分聚集并且妨礙任何后續(xù)的檢測方法，例如PCR。可能這樣受影響的具體樣品包括植物提取物，其中大分子例如葉綠素傾向于在所述裝置上膜的樣品接收部分聚集。如有需要，可標記所述膜以顯示合適部分的尺寸和位置。用于提取膜樣品的具體部位可在常規(guī)免疫測定LFD的檢測區(qū)和對照區(qū)的區(qū)域中。在測定過程中形成的對照線，特別是通過免疫測定技術(shù)形成的對照線(controllines,whicharedevelopedinthecourseoftheassay,inparticularbyimmunoassytechniques,inwhichlabelled)可用于在其所標記的膜中為樣品提取部分劃界。這提供了進一步的優(yōu)點，即證實所述測定已適當?shù)剡M行。如果需要核酸定量，則用于檢驗的所述膜的所述部分的尺寸特別重要。可通過任何常規(guī)的技術(shù)實現(xiàn)核酸檢測或分析。如有必要或有需要，可首先用水從膜上洗下儲存或保留在膜上的核酸，或者如有必要，可使用常^見的洗脫緩沖液洗脫，并且分析清洗液或洗出液。在從室溫至例如高達100。C的升高的溫度范圍內(nèi)清洗10min，通常可使核酸從所述膜上釋放。然而，優(yōu)選在所述膜的一部分上直接進行分析。如果預先知道將采用何種形式的核酸分析，則可方便法地在使用前，向所述膜、例如干燥形式的膜中加入1種以上的可用于該分析的試劑。這些試劑可以或者沿所述膜的縱向定位，或者，如果它們可以在所述膜中移動但是又至少在一定程度上保留于膜上，則它們可以可擴散的方式定位于所述膜上的樣品接收部分或墊上，它們與液體樣品一起沿所述膜的縱向運送。例如，為了檢測所述膜上特定核酸的存在情況，將所述膜或膜的部分浸漬于PCR混合物中。在本領(lǐng)域中，PCR混合物為人所熟知。所述混合物適于包含諸如核酸、聚合酶和一組PCR引物的試序列。PCR反應物可進一步包含緩沖液、鎂鹽等。如有需要，可將1種以上進行PCR所必需的試劑"預先加載"于所述膜上，或者沿該膜的縱向或者以擴散的方式加載于所述膜的樣品接收部分或墊上。在后一種情況下，可將對1種以上所述試劑特異性的合適"捕獲"試劑(例如抗體或抗體的結(jié)合片段)固定于所述膜中待用于后續(xù)分析的部分，以便將這些試劑濃縮于該部分，為后續(xù)使用做準備。當所述試劑是多肽或蛋白例如聚合酶時，所述情況特別的可取且方^_。以這種方式包含的特別合適的試劑包括進行擴增或檢測特定核酸可能需要的任何引物或探針。通過將這種類型的特定試劑加入所述膜，有可能將預混合的擴增混合物或部分(例如準備好的PCR珠(PCRreadybead))用于所述分斗斤。在所述膜上存在核酸的情況下，PCR混合物一經(jīng)形成，就對所述混合物進行多個熱循環(huán)，在每個循環(huán)中，使樣品中存在的核酸變性，讓引物退火至反應混合物中存在的任何靶序列上，隨后通過聚合酶延伸。在一個特定實施方式中，以定量方式進行PCR反應。為此，可在PCR反應中包括標記試劑，例如標記纟果針和/或DNA結(jié)合劑例如嵌入染料。特定定量測定類型是TAQMANTM測定，在所述測定中探針用通過FET或FRET彼此相互作用的2種熒光部分標記。在所述PCR過程中，探針與所擴增的序列雜交，隨后所述聚合酶的5'-3'外切核酸酶活性消化所述探針，從而將所述兩種熒光部分分離，一旦所述部分之間的物理距離增加，所述部分就會產(chǎn)生不同的熒光并因此也不再產(chǎn)生所述相互作用。熒光的變化可易于檢測并且因此可監(jiān)測到所擴增的核酸序列量的增加。通過在擴增循環(huán)中監(jiān)測所述變化，可確定所述樣品中的核酸量。為了將所述膜上存在的核酸量與所述樣品中包含的核酸量相互關(guān)聯(lián)，可能需要或有必要確定最初加載于所述膜上的精確的或測量過的樣品量，并且小心地控制所述膜中用于該分析的任何部分的尺寸?？傻玫狡渌亩縋CR方法，例如在歐洲專利第1049802B號中所描述的方法(通過參考將其內(nèi)容引入本文中)，以及通過使用ScorpionTM探針(http:〃www.dxsgenotyping.com/technology.htm)和使用環(huán)介導的等溫擴增方法(LAMP)QitW/loopamp.eiken.co.b/e/index.html)的方法。在特定實施方式中，本發(fā)明提供用于檢測樣品中靶核酸存在情況的測定方法，所述方法包括下述步驟使疑似包含所述核酸的液體樣品沿膜(例如液流裝置的膜)流動，并且在所述膜上4企測所述靶核酸的存在情況。似乎通過在寬廣的區(qū)域有效地的"展開"所述核酸，所述核酸可與樣品中的其它成分充分地分離，使得可以使用常規(guī)的核酸檢測方法(例如PCR)對所述核酸的檢測，比例如使用所述方法對樣品本身進行分析的情況迅速和容易得多。實際上，似乎核酸被保留在所述膜結(jié)構(gòu)中，且所述情況具有純化效果。如上所述，這代表了用于在任何分析中進行簡單的純化步驟的高成本效率的有效方法，尤其是對于涉及可在膜材料存在下進行而不被明顯抑制的核酸擴增例如聚合酶鏈反應(PCR)而言。上述方法的進一步的優(yōu)點是可"現(xiàn)場"進行所述純化步驟，例如在野外或使用可在家庭使用或可在診所(包括醫(yī)療診所和獸醫(yī)診所)使用的試劑盒。僅需將所述膜或包含所述膜的裝置而非液體樣品送至實驗室進行分析，因此幾乎消除了實驗室儀器和人員的污染危險。然而，可在現(xiàn)場進行核酸分析的便攜裝置還可用于進行整個分析過程而無需運送樣品。所述裝置正逐漸可以獲得，但迄今為止的問題是對復雜樣品制備程序的需要限制了其可用性和便攜性。如有需要，在所述裝置中可包含所述膜或適合保存膜的可為一次性的盒、小柱等。這允許在"野外"情況下在進行現(xiàn)場分析之前進行快速和簡易的純化。如上所述4企測的核酸可為任何所需的靶核酸。然而，在一個實施方式中，通常要求4企測植物或動物的特定病原生物體(例如細菌、病毒或真菌)特有的的核酸，特別是可對所述生物體進行菌抹/毒抹分型或血清分型的核酸。如上所述，所述方法可用于為任何目的而純化核酸，所述目的包括測序或包括基因分型或SNP分析的遺傳分析。許多所述技術(shù)使用擴增反應，例如PCR,并且上述方法可與任何所述^R術(shù):f關(guān)用。在一個特別優(yōu)選的實施方式中，用于上述方法或測定的所述膜是液流裝置的部件，所述裝置可對不同分析物進行測定，例如對特定多肽分析物(例如蛋白或肽分析物)的免疫測定，但是在所述情況下，其它分析物例如殺蟲劑或殺蟲劑殘基的化學藥物可包含所述不同分析物。所述不同分析物可為也可指示被檢驗的特定病原體或病癥的分析物。驟。若免疫測定步驟的結(jié)果為陰性，則可能不需在進行更復雜的核酸檢測步驟。然而，若所述結(jié)果為陽性，例如表明存在特定生物體類型，則第二個步驟檢測作為所述生物體特征的核酸，可確認所述結(jié)果，并且根據(jù)靶核酸序列的性質(zhì)還可進一步澄清所述生物體的性質(zhì)、物種或菌抹/毒抹。然而，并不需要不同分析物以及所述核酸或每種核酸均源自相同的來源或生物體。例如，可取的是所述分析物或核酸中的1個是特定感染性生物體特有的，而其它是所述生物體的宿主特有的。特別是當所述分析物是感染性生物體特有的時，檢測在宿主基因中發(fā)現(xiàn)的、影響宿主對所述生物體的易感性或抗性的核酸可能是有用的。例如，當不同的分析物是例如殺蟲劑或殺蟲劑殘基時，檢測在宿主植物中發(fā)現(xiàn)的、影響宿主對殺蟲劑抗性的基因是有用的。其它的分析物可包括例如針對對特定病原體并且由宿主生物體產(chǎn)生的抗體。然而，尋找病原生物體本身特有的或減毒疫苗株或亞單位疫苗特有的的核酸，包括例如標志序列，隨后^全測所述核酸，這樣的核酸分析可提供有關(guān)動物是否已暴露于疾病或已接種疫苗的提供關(guān)于動物的疫苗接種狀態(tài)的信息。這在需要追蹤已接種動物的疾病(例如TB或狂犬病)的情況下特別重要?？墒褂帽景l(fā)明的方法檢驗的植物病原體的例子包括疫霉CP/^top/zAoraspp.)或PVY，所述疫霉可能是例如杜鵑花屬(Rhododendrum)植物的特定病害，可專門感染葉，而PVY是煙葉特有的問題，但是本發(fā)明還有許多其它的應用。在動物健康領(lǐng)域，可使用本方法方便地;險測例如口蹄疫、豬霍亂和禽流感的動物疫病。至于人類健康方面，可使用本方法診斷細菌感染(例如大腸桿菌或沙門氏菌感染)和病毒感染(例如流感，特別是禽流感)。所述方法可用于檢測感染性生物體的特定菌林/毒抹，而且當不同的菌抹/毒抹的致病性變化非常大且預后或治療結(jié)果因此而變化時，這一點可非常重要。因此，在進一步的實施方式中，本發(fā)明提供用于檢測液體樣品中分析物和任選的核酸的存在情況的兩步測定法，所述方法包括如下步驟(i)使疑似包含所述分析物和核酸的液體樣品沿液流裝置的膜流動，其中所述裝置能進行檢測所述進一步的分析物的存在情況的測定，例如免疫測定，和(ii)根據(jù)步驟(i)的結(jié)果檢測所述膜上所述核酸的存在情況。當以所述方式使用時，所述液流裝置的膜可適于進一步包含以可擴散的方式分布在膜上的標記結(jié)合劑。所述標記結(jié)合劑適于位于樣品接收區(qū)或該區(qū)的部分，因此所述結(jié)合劑可與液體樣品一起沿所述膜移動。例如，所述標記結(jié)合劑可加載于位于樣品接收區(qū)且與所述膜有液體接觸的吸收墊，例如玻璃纖維墊。所述標記結(jié)合劑例如包括乳膠標記的抗體或乳膠標記的分析物類似物，適于在含有強封閉劑(例如下文所述的蛋白封閉劑)的緩沖液中加載于所述墊。緩沖液可包含其它常規(guī)試劑，例如蛋白穩(wěn)定劑、粘度調(diào)節(jié)劑或防腐劑，特別例如下文所述的試劑的例子。如上所述，所述墊還可容納1種以上用于后續(xù)核酸分析的試劑，例如引物、探針或聚合酶。另外，所述膜可配備有第二特異性結(jié)合劑，所述第二特異性結(jié)合劑固定于膜上樣品接收區(qū)下游的檢測區(qū)。當樣品沿所述膜流動時，所存在的任何分析物都會與標記結(jié)合劑和/或第二特異性結(jié)合劑反應，因而導致在檢測區(qū)中產(chǎn)生表明樣品中是否存在分析物的信號(或缺乏信號)。標記結(jié)合劑和固定化的第二結(jié)合劑可遵循已建立的免疫測定原理與分析物特異性結(jié)合或相互特異性結(jié)合。例如，在所謂的"夾心測定，，中，標記結(jié)合劑可與樣品中的任何分析物特異性結(jié)合，形成標記復合體。第二結(jié)合劑也特異性地結(jié)合所述分析物，因此標記復合體濃縮于檢測區(qū)，造成可見信號產(chǎn)生。這有時被稱為"檢驗線(testline)"。在竟爭測定中，標記結(jié)合劑或者為所述分析物的結(jié)合配偶體，或者為所述分析物的標記類似物。在這種情況下，在檢測區(qū)內(nèi)第二結(jié)合劑和分析物竟爭性地與所述標記結(jié)合劑特異性結(jié)合。因此，例如當標記結(jié)合劑是所述分析物的標記結(jié)合配偶體時，將靶分析物的類似物固定于檢測區(qū)。當所述樣品通過檢測區(qū)時，任何游離的標記結(jié)合劑(即未與分析物結(jié)合的)將與固定化的結(jié)合劑結(jié)合并且產(chǎn)生可見信號。然而，若分析物存在于樣品中，則所述分析物在到達檢測區(qū)前，會與標記結(jié)合配偶體結(jié)合，從而阻止上述結(jié)合。因此，檢測區(qū)中信號的缺失表明分析物存在于樣品中。類似的，當標記結(jié)合劑是所述分析物的標記類似物時，固定化的第二結(jié)合劑為所述分析物的結(jié)合配偶體和所述分析物的標記類似物。在這種情況下，分析物和標記類似物都會竟爭檢測區(qū)中的結(jié)合位點。僅當標記類似物結(jié)合時會產(chǎn)生信號，因此在這種情況下，所存在的分析物越多，在檢測區(qū)所累積的信號就越少。當用于本文時，"分析物的類似物"的表述是指在測定系統(tǒng)中與分析物具有相似行為的部分。因此，所述類似物可包括分析物本身、或可如同所述分析物一樣與用于測定所用的特異性結(jié)合劑相互作用的所述分析物的變體或片段，例如表位片段。本申請人業(yè)已發(fā)現(xiàn)液流裝置不僅可提供迅速且簡便的檢測樣品中特定蛋白的方法，而且樣品所經(jīng)受的條件似乎是捕獲核酸有用的方法，且所述核酸呈可例如使用核酸擴增方法例如聚合酶鏈反應或"PCR"而被容易地檢測的形式。通過組合這2種技術(shù)，可產(chǎn)生明顯的優(yōu)勢。標記結(jié)合劑上所用的標記優(yōu)選為可見標記，所述標記可用于產(chǎn)生或者用肉眼或者用反射讀出器、更優(yōu)選便攜式或臺式反射讀出器可讀出的信號。所述標記的例子有顆粒標記，例如乳膠、金和二氧化硅?？墒褂闷渌目梢姌擞?，例如可分別使用熒光計或發(fā)光計檢測的熒光標記或化學發(fā)光標記?；蛘?，所述標記可包括可使用放射檢測器檢測的放射性標記。然而，如上所述，本發(fā)明的方法可在無任何用于核酸分析或檢測的可見檢測儀器的情況下使用。適用于上述方法的膜，例如用于液流裝置的膜、特別是硝化纖維素膜，是天然疏水性的，產(chǎn)生必需的芯吸作用。然而，在所述膜用于常規(guī)的免疫測定程序的情況下，所述疏水性可產(chǎn)生問題，因為。用于所述裝置的所述膜宜用常規(guī)封閉劑封閉。封閉劑是可減少樣品中任何蛋白和所述膜之間的非特異性相互作用或增加所述樣品的芯吸速度的試劑。它們通常在加載固定化結(jié)合劑之后加載，通常選自包括蛋白、表面活性劑和合成聚合物的3種試劑?？勺鳛榉忾]劑使用的蛋白的具體例子包括牛血清白蛋白(BSA)或脫脂奶粉成分，例如酪蛋白?？勺鳛榉忾]劑使用的表面活性劑包括非離子型表面活性劑，例如以商品名Tween20(吐溫20)出售的聚氧乙烯失水山梨糖醇單月桂酸酯和例如由Dow出售的TritonXTM系列的辛基酚乙氧基化合物，例如TritonX-100。用作封閉劑的合適的合成聚合物包括聚乙烯醇(PVA)、聚乙烯吡咯啉(PVP)、聚乙二醇(PEG)和聚氧乙烯脂肪醚，例如從月桂醇、鯨蠟醇、硬脂醇和油醇衍生的聚氧乙烯脂肪醚以及以商品名BrijTM(布里杰)出售的聚氧乙烯脂肪醚。所述聚合物的分子量可根據(jù)所用聚合物的性質(zhì)而改變，^f旦是通常在5-50kDa的范圍內(nèi)，例如8-15kDa。通常認為，可特別使用2種以上的所述類型或類別的封閉劑的混合物，例如包括如上所述的表面活性劑和合成聚合物的混合物。本申請人注意到，某些封閉劑例如上述封閉劑的存在似乎并不妨礙核酸的純化。本申請人已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，上述的常規(guī)封閉膜也適用于核酸的非特異性結(jié)合。因此，可制備免疫測定用膜并且保留本發(fā)明的優(yōu)點。通常以緩沖液的形式將封閉劑加載于所述膜，在使用前將該膜干燥。本申請人發(fā)現(xiàn)，合適的緩沖液具有的pH值在8-9范圍內(nèi)，優(yōu)選8.5。具有這種性質(zhì)的多種緩沖液對于技術(shù)人員而言是顯而易見的。可以包括常規(guī)的緩沖液，例如基于Tris、磷酸鹽、鄰苯二曱酸氫鉀、硼氬化鈉或碳酸氫鉀或碳酸氫鈉的緩沖液，所述緩沖液可以逸宜地為酸性或^威性，而且它們似乎不減弱對核酸的保留。另外或可替代的，封閉劑可與標記試劑組合，以確保它們可沿所述膜擴散。用于將所述封閉劑加載于所述膜或?qū)擞浽噭┘虞d于樣品傳送區(qū)的緩沖液可適于另外包含蛋白穩(wěn)定劑，例如蔗糖或海藻糖。這些試劑還可調(diào)整所述緩沖液的粘度，使封閉劑通過簡單的浸漬就足以結(jié)合于所述膜上。包含于緩沖液中的穩(wěn)定劑的量隨緩沖液的性質(zhì)和穩(wěn)定劑或粘度調(diào)節(jié)劑的準確性質(zhì)而變。如有需要，可再次將防腐劑如上述用于所述提取緩沖液的防腐劑加入包含封閉劑的緩沖液。如有需要，所述免疫測定可包含本領(lǐng)域中可了解的另外的試劑或成分。例如，可以有固定于"對照"區(qū)的針對標記結(jié)合劑的結(jié)合配偶體，"對照"區(qū)適于位于檢測區(qū)的下游。任何殘留的標記結(jié)合劑將結(jié)合于這種第二區(qū)域，適于產(chǎn)生表明標記結(jié)合劑流動良好的"對照線，，?；蛘?，可將特定的標記對照試劑以可擴散的方式加在所述膜上，例如與第一標記結(jié)合劑混合，而針對標記對照試劑的特異性結(jié)合劑固定于對照區(qū)中，以產(chǎn)生對照線，乂人而可確定免疫測定的進展良好。如有需要，所述免疫測定可使用例如在WO2006003394中所描述的定量或半定量方法，在此通過參考將該文獻的內(nèi)容引入本文。制定了一項研究，以確定是否可以用PCR從LFD條帶上的陽性檢測線擴增信號。預期為了通過切下檢驗線并在實驗室進行PCR而確證陽性LFD結(jié)果，具有所述能力是有用的。進一步預期，這一技術(shù)可使區(qū)別存在于樣品中的目標菌抹/毒抹或種成為可能，而LFD檢驗不能進行所述區(qū)別，例如在疫霉測定或禽流感測定的情況下。下文所報道的具體研究的結(jié)果表明，確實能通過PCR確證得自檢測線的結(jié)果。所述結(jié)果進一步表明，能對取自使用過的LFD條帶上任意區(qū)域的DNA進行陽性PCR分析(positivePCRanalysis)。成功地檢測了檢測線上游和下游的區(qū)域。而且，對來自LFD膜的DNA的PCR分析所得的Ct值與使用標準復雜純化和/或存儲方法的分析所得到的結(jié)果相當。這表明用于LFD分析的提取緩沖液和/或膜處理系統(tǒng)對于DNA的純化和污染物/抑制劑的去除與標準方法同樣有效。如上所述，將現(xiàn)有技術(shù)和專業(yè)知識用于研制基于標準夾心測定模式的側(cè)流裝置(LFD)，其原理在于在硝化纖維素膜上的靶特異抗體的固定化線(檢驗線)和有色膠乳-抗體綴合物(抗靶小鼠抗體)之間捕獲耙，顯示靶存在的可見確證。將抗小鼠抗體線加入所述裝置，提供乳膠流(對照線)的可見驗證，產(chǎn)生作為表明陽性檢測的2條線和陰性結(jié)果的信號線。將乳膠綴合物加載于玻璃纖維釋放墊，產(chǎn)生穩(wěn)定的粒子貯庫，并且與所述膜和吸收墊一起被組裝到保護性塑料罩中。向樣品孔加入75^1(約2_3滴)的樣品纟是取液，在所述膜上釋放出乳膠綴合物，所述提取液開始向吸收墊流動。若靶抗原存在于樣品提取液中，則發(fā)生抗體結(jié)合從而產(chǎn)生乳膠-抗體復合體，隨后所述復合體被檢驗線捕獲；因此產(chǎn)生可見的沉積乳膠線?？剐∈罂贵w捕獲任何過量的乳膠綴合物，產(chǎn)生乳膠流的可見確證。通過實時PCR測定沿所述膜縱向?qū)δぶ袠悠返暮罄m(xù)分析表明，霉(尸/^top/z/zoraramowm))的特征性核酸。對所述膜的進一步分析揭示所述樣品還包含源自宿主杜鵑花的COXDNA。如上所述，可以想象一般而言，在使用中，所述檢驗的任何免疫測定部件均可在野外情況下使用，而且所述液流裝置一經(jīng)使用，則可提供將核酸運送到實驗室環(huán)境進行進一步分析的便利工具。然而，可制備試劑盒用于進行所述測定。因此在另一方面，本發(fā)明提供用于進行本發(fā)明任一前述權(quán)利要求的測定的試劑盒，所述試劑盒包含吸水膜(例如形成液流裝置的部件的吸水膜)和至少1種用于核酸檢測的試劑。適用于核酸檢測的試劑包括1種以上適用于擴增靶核酸序列的引物，但是其它試劑可包括探針，特別是熒光標記探針，例如用于TAQMANTM測定的探針，所述探針對靶核酸是特異性的；以及酶(例如DNA聚合酶)、緩沖液和鹽等。適當?shù)匕仓盟鲆毫餮b置，以進行免疫測定來檢測分析物，特別是來源于與靶核酸相同物種的多肽分析物。如上所述，所述測定可以采用夾心測定或竟爭測定模式。本發(fā)明將通過實施例進行具體描述，同時參考隨附的示意圖，在所述圖中圖l圖示了可用于本發(fā)明方法的液流裝置；圖2例示了可用于本發(fā)明方法的膜取樣方案；圖3例示了在本發(fā)明的實施方式中進行的PCR反應的結(jié)果；圖4是顯示對所提取的枝干疫霉DNA的系列稀釋液進行TaqManTM擴增的Ct值與在LFD的膜上進行的TaqManTM擴增的Ct值比較的圖，其中沿所述LFD的膜已經(jīng)展開了枝干疫霉感染的杜鵑花(rhododendronsp.)的粗提液樣品；圖5是顯示與圖4所相關(guān)的測定相同的測定的Ct值圖，但在粗處理的LFD膜在其制備后直接進行測定(裝置)；圖6是顯示類似于圖6中對Ct值進行比較的圖，所述比較使用的是相同的粗提液和膜，但所述測定在粗提液和膜在室溫下存儲了7個月之后進行；圖7是圖6所示結(jié)果的TaqMan擴增圖8是對普通小鼠血清中的18SrRNA進行TaqManTM檢測的TaqMan擴增圖；陰性對照=水；圖9顯示對接種的煙草中的PVY進行TaqManTM檢測的擴增圖10顯示對接種的煙草中的PVX進行TaqManTM檢測的擴增圖11顯示由對枝干疫霉進行常規(guī)PCR反應后獲得的凝膠。實施例1枝干疫需檢測用手術(shù)刀片將枝干疫霉感染的杜鵑花葉(l-2cm、的樣品切為小片，置于含有提取緩沖液的LFD試劑盒的LFD提取瓶中，所述試劑盒得自PocketDiagnostics(CSL,York,UK)。將所述瓶振搖約2min,隨后將2滴樣品傳送至試劑盒中所含有的疫霉LFD的樣品孔中。在此情況下，所述LFD包含如圖1所示的常規(guī)夾心測定模式。所述樣品一經(jīng)吸收，則將所述膜從塑料罩取下，并沿所述膜的縱向切成8條1-2mm寬的條帶(圖2)。將每個條帶對半切開，且將每半條帶置于96孔板的單獨的孔中，所述孔中含有用于對枝干疫霉和COX進行多重實時PCR(Taqman)的25(il主混合物(master-mix)(1xPCR緩沖液(50mMKC1,10mMTris-HCl，0.001%明膠)，0.025U/plHotTaq，0.2mM各種dNTP，5.5mMMgCl2，1xROX非活性對照染料(passivereferencedye)，300nM各種枝干疫霉引物，200nM各種COX引物和100nM各種枝干疫霉和COX探針)。在ABI7900HT上進行實時PCR,循環(huán)條件為在95。C進行10min,隨后進行40個2步循環(huán)，每個2步循環(huán)為95。C15s和60。C1min。結(jié)果每個條帶的枝千疫霉和COX的Ct值顯示于圖3(誤差棒顯示重復反應(每個條帶的2半)的標準差)。使用PVYLFD得到了非常相近的Ct值(數(shù)據(jù)未顯示)。所述Ct值表明，從LFD膜上既可鑒定出宿主DNA(COX),又可鑒定出靶DNA(枝干疫霉)，而不必考慮樣品位置。使用PVYLFD上的枝干疫霉樣品的結(jié)果非常類似，表明LFD的特異性(即特異單克隆抗體)對于核酸提取不重要。實施例2PVY分析除了使用對PVY抗原特異性的抗體外，如上述實施例1制備馬鈴薯Y病毒(PVY)LFD，所述LFD已經(jīng)接觸了受PVY感染的植物(馬鈴薯)提取液(且因此顯示陽性結(jié)果)，在密封的塑料袋中在室溫下存儲該LFD超過6年。將所述膜從所述LFD取下并切成若千1-2mm寬的條帶。將每個條帶對半切開，且將每半條帶置于96孔板的單獨的孔中，所述孔中含有用于對PVY進行多重實時PCR(Taqman)的25)il主混合物(lxPCR緩沖液(50mMKC1,10mMTris-HCl，0.001%明膠)，0.02U/plM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶,0.025U/|xlHotTaq,0.2mM各種dNTP,5.5mMMgCl2,lxROX無活性對照染料，300nM各種PVY引物和100nMPVY探針)，或?qū)χ参锛毎匮趸?COX)基因的實時PCR(Taqman)的25pi主混合物(lxPCR緩沖液，0.025U/|alHotTaq,0.2mM各種dNTP,5.5mMMgCl2，lxROX無活性對照染料，300nM各種COX引物和100nMCOX探針)。在ABI7900HT上進行實時PCR,循環(huán)條件為在48。C進行30min,隨后在95。C進行10min，然后進行40個2步循環(huán)，每個2步循環(huán)為95°C15s和60°C1min。結(jié)果分別使用RT-PCR和PCR成功地檢測出PVY和COX。在表1中顯示PVY和COX的Ct值。<table>tableseeoriginaldocumentpage25</column></row><table>這一結(jié)果表明，側(cè)流裝置或LFD以穩(wěn)定的方式較長時間保存了核酸。同樣對新鮮的PVY樣品以及對PVX使用實時測定也獲得了類似的良好結(jié)果(分別參見圖9和圖10)。實施例3膜/LFD的效果使用接種了枝干疫霉的杜鵑花的提取液作為樣品和如下的一系列不同的市售膜，重復實施例1描述的試驗對枝干疫霉進行^r測1MilliporeCorp.HiFlow1802MilliporeCorp.HiFlow1353MilliporeCorp.HiFlow1204MilliporeCorp.HiFlow905MilliporeCorp.HiFlow756MilliporeCorp.HiFlow657Schleicher&SchuellPrima40使用LFD制造中所用的常規(guī)封閉溶液處理各種膜，并且4吏用或不使用用于應用常規(guī)LFD的乳膠標記系統(tǒng)的常規(guī)緩沖液。在隨后的試驗中，還使用未經(jīng)處理的MilliporeCorp.HiFlow75和MilliporeCorp.HiFlow180膜樣品。對許多市售LFD進行如實施例1所述的處理。這些LFD包括"Clearblue"妊娠4企驗試劑盒、Tesco家庭妊娠4企驗試劑盒、用于檢測禽流感病毒的得自Anigen的市售試劑盒和Agdia生產(chǎn)的黃瓜花葉病毒(CMV)檢測ImmunoStrip。部分所述試劑盒使用金標記作為蛋白信號機制，而其它試劑盒使用乳膠。無論何種孔徑或所述膜的預處理方案存在與否或該方法的性質(zhì)如何，在從上述列出所有膜和LFD取得的樣品中均成功地檢測到枝干疫霉的核酸。實施例4與純DNA檢測對比如實施例1所述，對純枝干疫霉DNA樣品和對也如實施例1所述的用健康杜鵑花(healthyrhododendrontowhichP.ramorum)的^4是液處理的LFD的膜進行TaqManTM測定，以檢測枝干疫霉。隨后在進行TaqManTM之前，向所述樣品摻加等量的枝干疫霉DNA。將所述結(jié)果在表1中顯示并在圖4中例示。表1<table>tableseeoriginaldocumentpage27</column></row><table>(效率使用標準曲線的斜率以(io(-w"-1)計算得到)。從所述結(jié)果可見所述膜的存在對擴增反應效率的影響可忽略不計。而且，杜鵑花DNA的存在對所述測定的效率沒有任何抑制。實施例5存儲試驗在制備后，直接對如實施例3所述的粗提液進行如實施例1所述的TaqMan測定。還將所述粗提液如實施例1所述的加載于LFD，并且在所述粗提液展開后立刻對取自所述裝置的膜進行類似的測定。結(jié)果(圖5)顯示在制備后立刻進行測定時，這2種樣品均給出陽性結(jié)果。隨后將所述粗提液和所述膜都存儲在室溫下7個月并且重復分析。結(jié)果顯示于圖6和圖7，圖7是圖6所示結(jié)果的TaqMan擴增圖。所述結(jié)果顯示，所述膜充當了有效的核酸存儲裝置。實施例6其它樣品類型的核酸檢測將小鼠血清加入LFD,并沿該裝置展開。所述樣品一經(jīng)吸收，就將所述膜從塑料罩中取出，并進行TaqMan實時PCR測定，用于4企測真核生物18Sr認A基因。這是可得自AppliedBiosystems的預先展開的(pre-developed)內(nèi)源對照測定。還將陰性對照(水)加載于第二個LFD。所述結(jié)果顯示于圖8。血清顯然是用于與本方法結(jié)合使用的樣品類型。(所述18SrRNA基因在所有真核生物都存在，這種情況也許可解釋所述陰性對照中的輕度污染)。實施例7不同的檢測方法進行了一系列的不同的測定，其中樣品如實施例1所述的沿LFD裝置的所述膜展開，隨后用實時PCR(特別是TaqMan測定)或常規(guī)PCR以及LAMP測定來檢測存在于所述樣品中的核酸。TaqManPCR反應通常包含lxAppliedBiosystems緩沖液A(50mMKCl，10mMTris-HClpH8.3，carboxy-X-羅丹明(ROX)無活性對照染料)，0.025U/plAppliedBiosystemsAmpHTaqGold,0.2mM各種dNTP,5.5mMMgCl2，300nM各種引物和100nMTaqMan探針。用于檢觀'J認A病毒的TaqMan逆轉(zhuǎn)錄PCR(RT-PCR)還包含0.02U/(ilM-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶。循環(huán)條件為在95。C進行10min，隨后進行40個95°C15s和60°C1min的2步循環(huán)。對于RT-PCR,在所述步驟之前還需在48。C進行30min的逆轉(zhuǎn)錄步,驟。在ABI7900HT上進行實時PCR。結(jié)果以Ct值解釋，Ct值即當熒光超過闊值時的循環(huán)數(shù)。LAMP反應包含0.32U/|ilBstDNA聚合酶(NewEnglandBiolabs,Ipswich,MA),lxThermopol緩沖液，1.4mM各種dNTP，6mMMgCl2(在Thermopol緩沖液中包含2mM)，1.2M甜菜堿，200nM各種外部引物(F3和B3),2各種內(nèi)部引物(FIP和BIP)和1各種環(huán)引物(F環(huán)和B環(huán))。在65。C溫育反應物40min,隨后在80。C溫育5min,以失活Bst聚合酶。通過加入2Quant-iTPicoGreendsDNA試劑(Invitrogen,Carlsbad,CA)并觀察顏色變化(,人橙變黃)而使擴增產(chǎn)物顯色。PCR反應包含lxFermentasPCR緩沖液(IOmMTris-HCl(在25。C時pH8.8)，50mMKC1，0,08%(v/v)NonidetP40)，0.025U/plFermentasTaq聚合酶，0.2mM各種dNTP，2mMMgCl2，500nM各種引物。循環(huán)條件為在95。C進行2min，隨后進行30個3步循環(huán)，每個所述循環(huán)為95°C30s、57°C30s和72°C30s。通過凝月交電泳(1.2%瓊脂糖凝膠)并隨后用溴化乙錠染色將產(chǎn)物顯色(圖11)。在所有情況下，發(fā)現(xiàn)在所述膜上成功地檢測到核酸。所述測定和所述擴增子尺寸總結(jié)于表2。表2<table>tableseeoriginaldocumentpage29</column></row><table>在所述膜上檢測到各種各樣的不同擴增子尺寸，表明對于確定所述核酸是否被保留在所述膜上而言，所述核酸的尺寸并不重要。實施例8通過將DNA提取至LFD和WhatmanFTA卡以及后續(xù)的實時PCR檢驗東非玫瑰材料中是否存在冠癭病原體-根瘤土壤桿菌最近在整個東非的玫瑰作物受到了稱為冠癭的疾病的嚴重影響。這種疾病由細菌根瘤土壤桿菌的菌株引起，所述菌抹具有被稱為Ti質(zhì)粒的小環(huán)狀DNA片段。由于這些質(zhì)粒包含于所述細菌內(nèi)部，并且還由于自然界中存在許多無毒土壤桿菌屬菌林，所以檢測所述病原體的唯一方法是通過分離細菌DNA、隨后檢驗所述DNA中是否存在Ti質(zhì)粒。最近旅行去了肯尼亞玫瑰養(yǎng)殖場。從受感染的玫瑰植物取得了樣品并且將所述樣品加載于基于MilliporeHiflow75膜的LFD，也加載于WhatmanFTA卡。隨后將這些裝置送到英國，使用稱為T-DNA測定的Ti質(zhì)粒特異性實時PCR測定或COX才直物DNA實時PCR測定來檢驗，其中前一種測定檢測土壤桿菌屬病原體，而后一種測定用作內(nèi)部對照，以確保DNA提取方法生效。膜處理(a)LFD裝置。使用HarrisUnicore打孔器從各個接種的LFD膜取得2x1.25mm直徑的圓片。將這些圓片直接置于96孔PCR板的1個孔中。對所有膜取樣完畢后，向每個含有圓片的孔加入25的實時PCR主混合物。將PCR^!短暫離心以確保圓片和主混合物均位于各孔的底部。將所述板直接置于實時PCR儀器中，開始循環(huán)反應。(b)WhatmanFTA卡。使用HarrisUnicore打孔器從各個接種的FTA卡取得2x1.25mm直徑的圓片。將這些圓片直接置于96孔PCR板的1個孔中。對所有膜取樣完畢后，向每個孔加入200(iLWhatman純化緩沖液，并將所述板在室溫下溫育5min。5min后，從各孔中將所述緩沖液移除，小心確保圓片保留在孔中。再重復所述純化步驟2次。在第3次純化步驟后，將200的lxTE緩沖液加入各孔并將所述板在室溫下溫育5min。5min后，從各孔中將所述緩沖液移除，小心確保圓片保留在孔中。再重復該步驟1次。在從孔中移除最后等份的lxTE緩沖液后，使用PCR儀加熱塊在56。C干燥所述板20min。所述圓片一經(jīng)干燥就向各包含圓片的孔加入25|iL的實時PCR主混合物。將PCR板短暫離心以確保圓片和主混合物均位于各孔的底部。將所述板直接置于實時PCR儀器中，開始循環(huán)反應。結(jié)果從玫瑰植物的各個不同部位取得樣品。發(fā)現(xiàn)莖部、特別是開花品種與根狀莖品種融合的嫁接部是最可能檢測到冠癭病原體的部位，這是因為由嫁接造成的創(chuàng)口吸引致病性土壤桿菌(Jgro6""en'MW因此所述病原體在所述部位聚集。下文給出的結(jié)果來自使用2minuteDNA試劑盒的瓶中提供的緩沖液浸漬并加載于所述2種裝置的]0個不同的1-2cm莖切片。這些樣品中有4個是在嫁接部釆集的。表3.對10個玫瑰莖切片的T-DNA和COX實時PCR測定的結(jié)果樣品實時PCR結(jié)果和Ct值LFD試劑盒樣品WhatmanFTA卡樣品T-DNAPCRCOX-PCRT-DNAPCRCOX-PCR莖1陰性+ve(25.62)陰性+ve(24.47)莖2陰性陰性陰性陰性莖3陰性+ve(25.82)陰性+ve(32.86)莖4陰性陰性陰性+ve(30.44)莖5陰性+ve(27.56)陰性陰性莖6陰性+ve(27.63)陰性+ve(27.10)莖7+ve(34.75)+ve(26.74)+ve(37.11)+ve(27.98)(GU)1莖8+ve(39.51)+ve(27.35)陰性+ve(27.09),莖9+ve(39.81)+ve(26.82)+ve(39.63)+ve(26.40)莖10陰性+ve(25.46)陰性+ve(26.58)GU-包含嫁接部的莖切片上表顯示可由本發(fā)明方法得到的結(jié)果即便不比使用WhatmanFTA卡得到的結(jié)果好，也至少一樣好。但由所述方案可知，本方法的操作簡單得多。而且，LFD的使用提供了另外的好處，即可同時進行初步的蛋白診斷測定。權(quán)利要求1.用于從液體樣品中分離核酸的方法，所述方法包括下述步驟使包含或疑似包含所述核酸的液體樣品沿吸水膜流動，使所述核酸沿所述膜的縱向分布。2.權(quán)利要求1的方法，其中在后續(xù)的步驟中檢測所述膜上核酸的存在情況或從所述膜上回收核酸。3.權(quán)利要求1的方法，其中在所述液體沿該膜流動后將所述膜干燥或讓所述膜干燥。4.權(quán)利要求3的方法，其中保存所述干燥膜，并在后續(xù)的步驟中檢測所述膜上核酸的存在情況或從所述膜上回收核酸。5.上述權(quán)利要求中任一項的方法，其中對所分離的核酸進行進一步分析。6.權(quán)利要求5的方法，其中使用所述膜的樣品進行所述進一步分析。7.權(quán)利要求5的方法，其中在所述進一步分析之前從所述膜上洗脫核酸。8.權(quán)利要求5-7中任一項的方法，其中所述進一步分析包括SNP分型、DNA指紋測定或測序。9.權(quán)利要求5-8中任一項的方法，其中檢測特定靶核酸。10.上述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述膜是硝化纖維素膜。11.上述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述膜是液流裝置的部件。12.權(quán)利要求11的方法，其中所述液流裝置包括樣品接收部分和位于所述膜上的遠離所述樣品接收部分的吸收部分。13.上述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述膜安置于固體罩中，或?qū)訅核瞿ぁ?4.上述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述膜經(jīng)過處理，以增強對沿該膜流動的液體的芯吸作用。15.上述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述樣品是生理或臨床樣品、或組織提取物。16.權(quán)利要求12的方法，其中所述樣品是植物或動物組織的提取物。17.權(quán)利要求12的方法，其中所述樣品是血液、血清、尿、乳或唾液或排泄物提取物。18.權(quán)利要求1-14中任一項的方法，其中所述樣品是環(huán)境樣口Co19.權(quán)利要求18的方法，其中所述樣品是水樣或土壤提取物。20.權(quán)利要求1的方法，所述方法用于檢測樣品中靶核S臾存在情況的測定，所述方法包括以下步驟使疑似包含所述核酸的液體樣品沿液流裝置的膜流動，并檢測所述膜特定核酸的存在情況。21.上述權(quán)利要求中任一項的方法，其中讓樣品沿所述膜展開后取下該膜的一部分，并在所述部分上檢測核酸的存在情況。22.權(quán)利要求21的方法，其中使用核酸擴增反應檢測所述核酸。23.權(quán)利要求22的方法，其中在樣品沿所述膜流動后，可用于所述核酸擴增反應的試劑存在于該膜中。24.權(quán)利要求23的方法，其中在加載所述樣品之前，所述試劑已存在于所述膜中。25.權(quán)利要求23的方法，其中所述試劑存在于樣品接收部分，并與所述樣品一起沿所述膜移動。26.權(quán)利要求23-25中任一項的方法，其中所述試劑是擴增引物。27.權(quán)利要求22-26中任一項的方法，其中所述擴增反應是聚合酶鏈反應(PCR)。28.權(quán)利要求27的方法，其中對PCR的進程進行實時監(jiān)測。29.權(quán)利要求28的方法，其中已知加載于所述膜的樣品量，并將監(jiān)測結(jié)果用于對存在的核酸量進行定量。30.上述權(quán)利要求中任一項的方法，其中檢測所述膜上不止l種核酸的存在情況。31.權(quán)利要求30的方法，其中使用所述膜的相同或不同的樣品進行多個PCR反應。32.權(quán)利要求30的方法，其中進行多重PCR反應，以在單個PCR中4企測不止1種核酸。33.權(quán)利要求1-29中任一項的方法，其中從所述膜上回收不止1種核酸。34.上述權(quán)利要求中任一項的方法，其中所述膜是液流裝置的部分，所述裝置用于對另外的分析物進行測定。35.權(quán)利要求34的方法，其中所述測定是免疫測定。36.用于^f企測液體樣品中分析物存在情況的兩步測定，所述測定還任選檢測液體樣品中核酸的存在情況，所述方法包括如下步驟(i)使疑似包含所述分析物和核酸的液體樣品沿液流裝置的膜流動，所述裝置能進行檢測所述另外的分析物的存在情況的測定和，(ii)根據(jù)步驟(i)的結(jié)果檢測所述膜上所述核酸的存在情況。37.權(quán)利要求36的測定，其中步驟(i)的測定是免疫測定。38.權(quán)利要求36或37的測定，其中所述分析物和核酸來源于相同的生物體、或所述生物體的特定種或基因型。39.權(quán)利要求38的測定，其中所述分析物是一種類型生物體特有的，而所述核酸是所述生物體的特定種特有的。40.權(quán)利要求36或37的測定，其中所述分析物或核酸之一是特定感染性生物體特有的，而另一個是所述生物體的宿主特有的。41.權(quán)利要求40的測定，其中所述分析物是感染性生物體特有的，而所述核酸存在于影響宿主對所述生物體的易感性和抗性的宿主基因中。42.權(quán)利要求36或37的測定，其中所述分析物是可用于植物的殺蟲劑，而所述核酸存在于所述植物的基因中。43.用于進行權(quán)利要求1-35中任一項的方法或權(quán)利要求36-42中任一項的測定的試劑盒，所述試劑盒包含吸水膜和至少1種用于;險測核酸的試劑。44.權(quán)利要求43的試劑盒，其中當樣品沿所述膜流動后，所述試劑存在于該膜中。45.權(quán)利要求44的試劑盒，其中在加載所述樣品之前，所述試劑已存在于所述膜中。46.權(quán)利要求44的試劑盒，其中所述試劑存在于樣品接收部分，并與所述樣品一起沿所述膜移動。47.權(quán)利要求43-46中任一項的試劑盒，其中所述至少1種試劑包括適于擴增靶核酸序列的引物。48.權(quán)利要求43或權(quán)利要求47中任一項的試劑盒，其中所述吸水膜是液流裝置的部件。49.權(quán)利要求48的試劑盒，其中所述液流裝置用于進行檢測另外的分析物的測定。50.權(quán)利要求49的試劑盒，其中所述另外的分析物是多肽，并且所述測定是免疫測定。51.參考實施例并基本上如上文所述的用于從液體樣品分離核酸的方法。全文摘要用于從液體樣品中分離核酸的方法，所述方法包括使包含或疑似包含所述核酸的液體樣品沿吸水膜、例如常規(guī)側(cè)流裝置的吸水膜流動，使得核酸沿所述膜的縱向分布的步驟?？稍谒瞿ど蠙z測所述核酸。文檔編號G01N33/50GK101443456SQ200780017119公開日2009年5月27日申請日期2007年3月12日優(yōu)先權(quán)日2006年3月11日發(fā)明者C·丹克斯,N·布恩漢申請人:英國環(huán)境食物及農(nóng)村事務(wù)部中央科學實驗室