相關(guān)申請的交叉引用本申請要求于2014年12月30日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?2/098,057和于2015年5月19日提交的美國臨時(shí)申請?zhí)?2/163,434的權(quán)益，每個(gè)所述臨時(shí)申請以引用的方式整體并入本文。對通過efs-web以文本文件提交的序列表的引用以名為“37502.0004u3_st25.txt”的文本文件于2015年6月22日提交的序列表(于2015年6月22日創(chuàng)建并具有5,057字節(jié)大小)依據(jù)美國法典第37篇第1.52條(e)款(5)以引用的方式并入本文。發(fā)明背景背景中的敘述不一定意味著認(rèn)可所引用參考文獻(xiàn)中的特征。端粒即真核生物染色體的尖端保護(hù)染色體免于溶核退化、末端-末端融合(end-to-endfusion)和重組。端粒是在染色體末端的結(jié)構(gòu)，其特征為核苷酸序列(5'-ttaggg-3')n的重復(fù)序列。端粒由于正常的細(xì)胞分裂而縮短并且非常短的端粒導(dǎo)致細(xì)胞衰老或細(xì)胞凋亡。過去十年中在人類中的豐富的流行病學(xué)和臨床研究已將短端粒長度與年齡相關(guān)疾病的高風(fēng)險(xiǎn)和全因死亡率聯(lián)系起來(puterman，e.和e.epel，socpersonalpsycholcompass，2012.6(11)807-825；zhu，h.，m.belcher和p.vanderharst，clinsci(lond)，2011.120(10)427-40；以及fyhrquist，f.和o.saijonmaa.annmed，2012.44增刊1s138-42)。遺傳、環(huán)境、生活方式和行為因素共同影響端粒長度。因此，端粒長度已成為總體健康、疾病和死亡風(fēng)險(xiǎn)的指標(biāo)。雖然平均端粒長度在幾乎所有公布的臨床研究中被測量并且已在分層患者疾病和死亡風(fēng)險(xiǎn)方面展示出效用，但是最近在小鼠中的工作也已顯示短端粒群體是衰老或細(xì)胞凋亡的觸發(fā)信號(hemann，m.t.等人cell，2001.107(1)67-77)，并且由此是疾病和死亡風(fēng)險(xiǎn)的觸發(fā)信號。在由hemann等人報(bào)告的研究中，將具有短端粒的第6代端粒酶rna敲出小鼠(mtr-/-g6)與具有長端粒的端粒酶雜合型小鼠(mtr+/-)進(jìn)行雜交。盡管端粒酶缺失后代的端粒中的一半是長的，但是其表型反映mtr-/-母本的表型，這表明短端粒的數(shù)量而非平均端粒長度對于細(xì)胞活力和染色體穩(wěn)定性是關(guān)鍵的。在服用天然產(chǎn)物來源的端粒酶激活劑的人中，在白細(xì)胞中檢測到短(<3或<4kbp)端粒的百分比顯著降低(如通過定量fish技術(shù)測定的；參見(canela，a.等人procnatlacadsciusa，2007.104(13)5300-5)，但是未看到平均端粒長度的變化(harley，c.b.等人，rejuvenationres.2011.14(1)45-56)。因此短端粒豐度百分比的變化被預(yù)期為生活方式和藥物或其他干預(yù)對端粒的影響的更靈敏量度。另一項(xiàng)研究(vera等人,“therateofincreaseofshorttelomerespredictslongevityinmammals”，cellreports(2012)，worldwideweburl：dx.doi.org/10.1016/.celrep.2012.08.023)發(fā)現(xiàn)“短端粒豐度的增加速率是壽命的預(yù)測指標(biāo)”。已開發(fā)用于測量端粒長度的各種方法，包括dna印跡(kimura，m.等人，natureprotocols，2010，5:1596-1607)、q-fish(rufer，n.等人，nat.biotechnol.，1998，16:743-747)、流式fish(baerlocher，g.m.等人，cytometry，2002，47:89-99)、q-fish測定的高通量改良型(htq-fish；參見canela，a.等人，pnas，2007，104：5300-5305)、雙標(biāo)記著絲粒和端粒fish(cen/telfish)(vandergriendd.l等人prostate2009年10月1日；69(14)：1557-64.doi：10.1002/pros.21001)、斑點(diǎn)印跡(kimuram.aviva.2011nar)以及qpcr(cawthon，r.m.，nucleic.acidsres.，2002，30(10):e47；和cawthonrm.nucleicacidsres.2009，37(3):e21)。q-pcr-端粒長度(qpcr-tl)測定了用單拷貝基因歸一化的平均端粒豐度，表達(dá)為t/s比。為了將t/s比轉(zhuǎn)換為bp數(shù)的絕對長度即端粒限制性片段長度(trf)，已報(bào)道了各種方法。例如，先前報(bào)道這種轉(zhuǎn)換可通過dna印跡分析確定并且與t/s比進(jìn)行比較(cawthon，同上)。獲得線性回歸公式并且基于其t/s比使用所述線性回歸公式計(jì)算未知樣品的trf長度。關(guān)于這種轉(zhuǎn)換的一個(gè)重要問題是trf在其著絲粒端部含有非端粒序列的區(qū)域(子端粒序列)。因?yàn)樽佣肆Ｐ蛄械拈L度在個(gè)體之間不同，所以基于trf從t/s比轉(zhuǎn)換的bp僅是近視值。因此，盡管在用于簡便地確定相對端粒長度或豐度的材料和方法方面有所進(jìn)展，但是仍需要用于確定受試者的端粒長度或豐度相比于適當(dāng)?shù)膶φ杖后w的差異的改進(jìn)方法和材料。具體地，仍然需要以高準(zhǔn)確度確定受試者的相對端粒長度或豐度的差異，以便改善那些相同受試者的臨床評估和/或治療方案。本發(fā)明滿足這些需求和其他需求。發(fā)明概要根據(jù)如本文呈現(xiàn)和廣義所述的本發(fā)明目的，在一方面，本發(fā)明涉及用于在針對每種靶核酸序列利用不同的檢測標(biāo)記的單一qpcr多重反應(yīng)中確定至少三種靶核酸序列的平均長度或豐度的方法和組合物。在一方面，三種靶核酸序列中的一種是端粒序列并且另兩種靶核酸序列是已知很少發(fā)生拷貝數(shù)變異的不同的低拷貝數(shù)基因。在另一方面，平均端粒長度或豐度與另兩種核酸序列的平均豐度的平均值的比，即t/s比可以用于使平均端粒長度或豐度與臨床風(fēng)險(xiǎn)或優(yōu)化的治療方案相關(guān)聯(lián)。在再另一方面，低拷貝數(shù)基因是單拷貝基因。公開了用于確定平均端粒長度的方法，所述方法包括：(a)使第一靶核酸與第一引物組接觸、使第二靶核酸與第二組引物組接觸并且使第三靶核酸靶標(biāo)與第三引物組接觸；(i)其中第一引物組包括第一正向引物和第一反向引物；(ii)其中第二引物組包括第二正向引物和第二反向引物；(iii)其中第三引物組包括第三正向引物和第三反向引物；并且(iv)其中第一靶核酸包含端粒重復(fù)序列；(b)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組選擇性地?cái)U(kuò)增第一靶核酸以形成第一擴(kuò)增子、用第二引物組選擇性地?cái)U(kuò)增第二靶核酸以形成第二擴(kuò)增子，并且用第三引物組選擇性地?cái)U(kuò)增第三靶核酸以形成第三擴(kuò)增子；(c)確定聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一個(gè)或多個(gè)循環(huán)過程中的第一擴(kuò)增子、第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的量；(i)其中使用第一檢測標(biāo)記檢測第一擴(kuò)增子；(ii)其中使用第二檢測標(biāo)記檢測第二擴(kuò)增子；并且(iii)其中使用第三檢測標(biāo)記檢測第三擴(kuò)增子；并且(d)確定第一擴(kuò)增子的平均長度或豐度。還公開了用于同種異體移植造血干細(xì)胞供體選擇的方法，所述方法包括：(a)從一名或多名hla匹配的潛在供體受試者獲得樣品；(b)通過所公開的方法確定每名hla匹配的供體受試者的第一擴(kuò)增子的平均長度或豐度；(c)鑒定出具有比年齡匹配的對照高25個(gè)百分位數(shù)的第一擴(kuò)增子平均長度或豐度的一名或多名供體受試者；(d)從鑒定出的供體受試者獲得可移植的造血干細(xì)胞樣品；并且(e)將造血干細(xì)胞樣品移植到受體受試者。還公開了用于再分級心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括：(a)從受試者獲得樣品，其中受試者已被診斷為符合針對低強(qiáng)度他汀類療法的2013acc/aha治療血液膽固醇之指南標(biāo)準(zhǔn)；(b)通過所公開的方法確定樣品中的第一擴(kuò)增子的平均長度或豐度；(c)當(dāng)樣品被確定出具有比年齡匹配的對照低25個(gè)百分位數(shù)的第一擴(kuò)增子平均長度或豐度時(shí)將受試者診斷為處于較高的心血管風(fēng)險(xiǎn)下；并且(d)向被診斷為處于較高的心血管風(fēng)險(xiǎn)下的受試者施用以下項(xiàng)：(i)修改的他汀類療法；和/或(ii)已知用于治療心血管疾病的第二治療劑。雖然可以用特定的法定類別(諸如系統(tǒng)法定類別)對本公開的方面進(jìn)行描述和要求保護(hù)，但這僅是為了方便，并且本領(lǐng)域技術(shù)人員將理解到可以用任何的法定類別對本公開的各方面進(jìn)行描述和要求保護(hù)。除非另外明確說明，否則決不意圖將本文陳述的任何方法或方面解釋為要求以特定順序執(zhí)行其步驟。因此，在方法權(quán)利要求項(xiàng)在權(quán)利要求書或說明書中沒有具體陳述各步驟限于特定順序的情況下，絕非意圖指在任何方面推斷順序。這適用于任何可能的用于解釋的非表達(dá)基礎(chǔ)，包括相對于步驟安排或操作流程的邏輯事項(xiàng)、從語法組織或標(biāo)點(diǎn)符號得到的清晰含義、或者在說明書中描述的方面的數(shù)量或類型。附圖簡述并入本說明書且構(gòu)成其一部分的附圖說明了若干個(gè)方面，并連同描述一起用于解釋本發(fā)明的原理。圖1a-圖1c示出用于擴(kuò)增靶序列的代表性的示意性方案。圖1a示出擴(kuò)增的第一循環(huán)。簡而言之，telg修飾型引物(“telg修飾型”)沿天然端粒結(jié)合在多個(gè)端粒位點(diǎn)，而telc修飾型引物(“telc修飾型”)不能沿天然端粒位點(diǎn)結(jié)合，這是由于telc修飾型引物的3'末端處的失配。因此，telg修飾型延伸產(chǎn)物的豐度與c鏈端粒dna的豐度成正比。圖1b顯示telg修飾型引物和telc修飾型引物不能形成引物二聚體，這是由于特別是在每種引物的3'末端處的失配。來自無模板對照(ntc)的數(shù)據(jù)證實(shí)在不存在端粒dna時(shí)這些引物不擴(kuò)增。圖1c示出擴(kuò)增的第二循環(huán)。簡而言之，在第一擴(kuò)增循環(huán)1中由telg修飾型引物合成的多種延伸產(chǎn)物提供針對telc修飾型引物的結(jié)合位點(diǎn)。結(jié)合的telc修飾型引物可被延伸至來自第一擴(kuò)增循環(huán)通過telg修飾型引物引發(fā)的延伸產(chǎn)物的5'末端。因此，在第3循環(huán)以及后來循環(huán)中，優(yōu)先擴(kuò)增86bp雙鏈體。這種擴(kuò)增子的豐度被設(shè)計(jì)為與基因組dna樣品中的雙鏈端粒dna的豐度成正比。圖2a-圖2f顯示在人基因組靶dna(嵌合型(mosaic)男性基因組dna)存在下使用的b2m-f、b2m-r、rnap-f、rnap-r、telg修飾型和telc修飾型引物的擴(kuò)增的代表性的解鏈曲線數(shù)據(jù)。telg修飾型引物和telc修飾型引物的濃度如圖中所指示那樣變化。b2m-f和b2m-r引物的濃度在300nm處保持恒定，并且b2m探針以100nm的濃度存在。圖3a-圖3c示出針對人基因組靶dna(嵌合型男性基因組dna)、rna酶p基因和β2-微球蛋白基因的交點(diǎn)(“cp”)相對于靶dna的log(濃度)的代表性線性回歸線，所述人基因組靶dna包含針對端粒序列的靶核酸序列。使用rochelc480lightcycler儀器的二階導(dǎo)數(shù)程序計(jì)算cp。圖3a示出針對使用telg修飾型和telc修飾型引物的端粒靶核酸的cp相對于log(濃度)的曲線。圖3b示出針對使用rnap-f和rnap-r引物的rna酶p靶核酸的cp相對于log(濃度)的曲線。圖3c示出針對使用b2m-f和b2m-r引物的β2-微球蛋白靶核酸的cp相對于log(濃度)的曲線。在上述中，log(濃度)措辭中使用的濃度的單位為ng/μl。圖4a-圖4c示出使用人基因組靶dna(嵌合型男性基因組dna)進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)的代表性擴(kuò)增曲線。圖4a示出使用telg修飾型和telc修飾型引物的擴(kuò)增曲線。如圖4a中所示，端粒dna通常在20-25的cp范圍內(nèi)擴(kuò)增產(chǎn)生顯著信號(熒光信號>25單位)，而ntc基本上示出背景噪音(熒光單位低于1，甚至在30個(gè)循環(huán)或更多個(gè)下)。這表明在整個(gè)qpcr擴(kuò)增的相關(guān)循環(huán)中不存在非特異性擴(kuò)增。圖4b示出使用rnap-f和rnap-r引物的擴(kuò)增曲線。圖4c示出使用b2m-f和b2m-r引物的擴(kuò)增曲線。圖5a-圖5c示出來自在人基因組dna不存在下使用進(jìn)行的擴(kuò)增反應(yīng)(即無模板對照反應(yīng))的代表性擴(kuò)增曲線。圖5a示出在靶基因組dna不存下使用telg修飾型和telc修飾型引物的擴(kuò)增曲線。需注意，基本上不存在任何dna的擴(kuò)增，直到第30循環(huán)之后。圖5b示出使用rnap-f和rnap-r引物的擴(kuò)增曲線。圖5c示出使用b2m-f和b2m-r引物的擴(kuò)增曲線。圖6a示出在對來自研究受試者的163個(gè)獨(dú)立樣品進(jìn)行的反應(yīng)中使用b2m-f、b2m-r、rnap-f、rnap-r、telg修飾型和telc修飾型引物的情況下，使用所公開的方法確定的t/s比的代表性直方圖。t/s比通過使來自qpcr反應(yīng)的端粒dna擴(kuò)增子的濃度除以來自qpcr反應(yīng)的rna酶p和β2-微球蛋白擴(kuò)增子的平均濃度來確定，其中所有三種擴(kuò)增子在單一反應(yīng)孔中。圖示出t:s比的對數(shù)正態(tài)分布，如對端粒長度的分布所預(yù)期的。圖6b示出在對來自健康研究參與者的163個(gè)樣品進(jìn)行的反應(yīng)中使用b2m-f、b2m-r、rnap-f、rnap-r、telg修飾型和telc修飾型引物的情況下，使用所公開的方法確定的t/s比相對于年齡的代表性圖。圖7a示出測定間cv值相對于t/s比的代表性圖。在對來自健康研究參與者的163個(gè)樣品進(jìn)行的反應(yīng)中使用b2m-f、b2m-r、rnap-f、rnap-r、telg修飾型和telc修飾型引物的情況下，使用所公開的方法確定的t/s比。數(shù)據(jù)顯示，所公開的三重qpcr測定的針對板間變異的中值cv為約1.5％，其顯著低于舊型式的單色測定或單色多重測定的中值cv(通常在5％范圍內(nèi)或更高)。圖7b顯示針對獲自163個(gè)研究受試者樣品的結(jié)果的測定間cv相對于t:s比的代表性直方圖。在使用b2m-f、b2m-r、rnap-f、rnap-r、telg修飾型和telc修飾型引物的情況下使用所公開的方法獲得用于確定測定間cv的數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)表明測定間cv不是t:s比的函數(shù)，換句話講，測定間cv不隨端粒長度增大或減小。圖8a示出使用9個(gè)研究受試者樣品獲得的針對t/s比的測定內(nèi)cv估計(jì)值，所述受試者樣品由三個(gè)獨(dú)立的操作器在不同的5天中的每一天以每天一式三份進(jìn)行分析用于實(shí)驗(yàn)確定。cv使用隨機(jī)效應(yīng)模型計(jì)算，其中“樣品運(yùn)行”是模型中的隨機(jī)效應(yīng)。在使用b2m-f、b2m-r、rnap-f、rnap-r、telg修飾型和telc修飾型引物的情況下使用所公開的方法確定t/s比。針對t:s比的測定內(nèi)cv(技術(shù)復(fù)制品即理論上相同的樣品之間的變異系數(shù))為2-3％。圖8b示出使用9個(gè)患者樣品獲得的針對t/s比的測定間cv估計(jì)值(即板間變異)，所述患者樣品由三個(gè)獨(dú)立的操作器在不同的5天中的每一天以每天一式三份進(jìn)行分析用于實(shí)驗(yàn)確定。cv使用隨機(jī)效應(yīng)模型計(jì)算，其中“樣品運(yùn)行”是模型中的隨機(jī)效應(yīng)。在使用b2m-f、b2m-r、rnap-f、rnap-r、telg修飾型和telc修飾型引物的情況下使用所公開的方法確定t/s比。數(shù)據(jù)顯示非常低的cv(在不同的5天內(nèi)使用3個(gè)不同的操作器的情況下不同天的樣品輪次變異性為大約0-2.5％)。據(jù)我們所知，這是對于atl曾經(jīng)報(bào)道的最低板間cv。圖8c示出使用相同的9個(gè)患者樣品獲得的針對t/s比的總cv估計(jì)值，所述受試者樣品由三個(gè)獨(dú)立的操作器在不同的5天中的每一天以每天一式三份進(jìn)行分析用于實(shí)驗(yàn)確定。cv使用隨機(jī)效應(yīng)模型計(jì)算，其中“樣品運(yùn)行”是模型中的隨機(jī)效應(yīng)。在使用b2m-f、b2m-r、rnap-f、rnap-r、telg修飾型和telc修飾型引物的情況下使用所公開的方法確定t/s比。數(shù)據(jù)顯示總測定cv在2-4％的范圍內(nèi)。圖9示出8點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，其具有y3-質(zhì)?？寺?含有包含135bp端粒dna的286個(gè)擴(kuò)增子的質(zhì)粒(seqidno：12)，y3克隆)的3倍系列稀釋點(diǎn)。基于標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率的qpcr效率為91.6％+/-6％標(biāo)準(zhǔn)偏差(4個(gè)測量值的平均值)。r2線性大于0.99。圖10示出作為t/s比的函數(shù)的平均端粒長度(千堿基對，“kbp”)曲線，所述平均端粒長度使用作為標(biāo)準(zhǔn)物的y3-質(zhì)?？寺『捅疚乃龅谋竟_的三重qpcr測定來確定?；貧w線的斜率為2.46，表明基于這種方法，一個(gè)t:s單位代表2.46kbp。三個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)來自代表低等端粒長度、中等端粒長度和高等端粒長度的3個(gè)質(zhì)量控制樣品的分析。圖11示出針對來源于單一細(xì)胞系(umuc-3膀胱癌系)的5個(gè)樣品的作為t/s比的函數(shù)的平均端粒長度(kbp)曲線，所述樣品通過用端粒(hter)的rna亞基轉(zhuǎn)染細(xì)胞系而經(jīng)歷端粒延伸。使用本文所述的本公開的三重qpcr測定來確定平均端粒長度。端粒長度從大約2.8kbp的初始值增加至4.6kbp，其中在基線和細(xì)胞培養(yǎng)過程中的4個(gè)另外的點(diǎn)處收集數(shù)據(jù)?；貧w線的斜率為2.59，表明基于這種方法，一個(gè)t:s單位代表2.59kbp。圖12示出作為t:s比的函數(shù)的平均端粒長度(kbp)曲線，所述平均端粒長度使用dna印跡方法測定?；谶@種比較，在回歸線斜率為2.15的情況下，一個(gè)t:s單位代表2.15kbp。用于這種比較的樣品與用于圖11的那些相同。圖13a-13d示出比較了在使用下述引物的情況下使用本文所述的本公開三重qpcr測定對典型端粒重復(fù)序列(ccctaa)15的擴(kuò)增的數(shù)據(jù)：使用tellb和tel2b引物(分別為seqidno：20和21)或使用telg修飾型和telc修飾型引物(分別為seqidno：1和2)。含有tellb和tel2b引物的反應(yīng)在圖中用“tt”指示，并且含有telg修飾型和telc修飾型引物的反應(yīng)在圖中用“atl”指示。圖13a示出針對在含有1xdna(1.67ng/μl)的反應(yīng)中的每種引物獲得的結(jié)果，而圖13b處于相同條件下，不同的是使用7xdna(11.69ng/μl)。圖13c和圖13d示出分別使用圖13a和圖13b中的數(shù)據(jù)計(jì)算的平均端粒濃度。圖14a-14c示出以上針對圖13a-13d所述的實(shí)驗(yàn)類似的實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增反應(yīng)在相同條件下進(jìn)行，不同的是靶模板是富含g的靶序列(ccctca)15。含有tellb和tel2b引物的反應(yīng)在圖中用“tt”指示，并且含有telg修飾型和telc修飾型引物的反應(yīng)在圖中用“atl”指示。圖14a示出針對在含有1xdna(1.67ng/μl)的反應(yīng)中的每種引物獲得的結(jié)果，而圖14b處于相同條件下，不同的是使用7xdna(11.69ng/μl)。圖14c示出使用圖14a和圖14b中的數(shù)據(jù)計(jì)算的平均端粒濃度。圖15a-15c示出與以上針對圖13a-13d所述的實(shí)驗(yàn)類似的實(shí)驗(yàn)。擴(kuò)增反應(yīng)在相同條件下進(jìn)行，不同的是靶模板是富含g的靶序列(ccctga)15。含有tellb和tel2b引物的反應(yīng)在圖中用“tt”指示，并且含有telg修飾型和telc修飾型引物的反應(yīng)在圖中用“atl”指示。圖15a示出針對在含有1xdna(1.67ng/μl)的反應(yīng)中的每種引物獲得的結(jié)果，而圖15b處于相同條件下，不同的是使用7xdna(11.69ng/μl)。圖15c示出使用圖15a和圖15b中的數(shù)據(jù)計(jì)算的平均端粒濃度。圖16示出獲自在cawthon2002測定和本文所述的本公開三重qpcr測定中測試的311個(gè)正常人全血樣品的t/s比數(shù)據(jù)的qq繪圖。在兩次測定中獲得的t/s比之間的關(guān)系的最佳擬合方程為：y＝1.13x-0.06，其中r2＝0.81。本發(fā)明的另外的優(yōu)點(diǎn)將部分陳述在以下描述中，并且部分將從所述描述中看出或者可通過實(shí)踐本發(fā)明來得知。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)將借助所附權(quán)利要求書中具體指出的元件和組合來實(shí)現(xiàn)并達(dá)成。要理解，以上概述和以下詳述都僅是示例性和解釋性的，并且不限制要求保護(hù)的本發(fā)明。具體實(shí)施方案通過參考以下發(fā)明詳述和其中包括的實(shí)施例可以更容易理解本公開。為了公開和描述公布在引用時(shí)所涉及的方法和/或材料，本文中提到的所有公布均以引用方式并入本文。提供本文中討論的公布僅僅是針對它們在本申請的提交日期之前的公開。本文中的任何內(nèi)容都不應(yīng)解釋為承認(rèn)本公開內(nèi)容由于先前的發(fā)明而無權(quán)早于所述公布。此外，本文中提供的公布日期可能不同于實(shí)際的公布日期，它們可能需要單獨(dú)確認(rèn)。如在本說明書和權(quán)利要求書中所用的術(shù)語“包含(comprising)”可以包括“由其組成”和“基本上由其組成”的方面。如本文所用的對于包括有機(jī)化合物的化合物的命名法可使用常見名稱、iupac、iubmb或cas關(guān)于命名法的推薦給出。除非另外定義，否則本文所用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語都具有與本發(fā)明所屬領(lǐng)域中的普通技術(shù)人員通常所理解的相同含義。在本說明書和以下權(quán)利要求書中，將參考將在本文中定義的許多術(shù)語。如在說明書和所附權(quán)利要求書中所用，單數(shù)形式的“一個(gè)”、“一種”(a,an)以及“所述”(the)除非上下文另外清楚地指明，否則包括復(fù)數(shù)對象。因此，例如，關(guān)于“一種細(xì)胞”、“一種核苷酸”或“一種引物”包括兩種或更多種此類細(xì)胞、核苷酸或引物等的混合物。在本文中，范圍可表達(dá)為從“約”一個(gè)具體值和/或到“約”另一個(gè)具體值。當(dāng)表示這樣一個(gè)范圍時(shí)，另外的方面包括從一個(gè)具體值和/或至另一個(gè)具體值。類似地，當(dāng)通過使用先行詞“約”將值表達(dá)為近似值時(shí)，將理解的是特定值形成了另外方面。應(yīng)進(jìn)一步理解，該范圍的每個(gè)端點(diǎn)相對于另一個(gè)端點(diǎn)以及獨(dú)立于另一個(gè)端點(diǎn)都是有意義的。還應(yīng)理解，本文公開了多個(gè)值，并且在本文中每個(gè)值除所述值本身之外也公開為“約”所述特定值。例如，如果公開了值“10”，那么也公開了“約10”。還理解的是還公開了兩個(gè)具體單位之間的每個(gè)單位。例如，如果公開了10和15，則還公開了11、12、13和14。如本文所用的術(shù)語“約”和“在或約”意指所討論的量或值可以是指定近似或約相同的一些其他值的值。一般應(yīng)當(dāng)理解，如本文所用，除非另外指出或推測，否則標(biāo)稱值指示±10％的變化。所述術(shù)語旨在傳達(dá)類似的值促進(jìn)權(quán)利要求書中所敘述的相等結(jié)果或作用。即，應(yīng)了解，量、大小、公式、參數(shù)和其他數(shù)量和特征不是且不必是確切的，而是可以是近似值和/或根據(jù)需要更大或更小，以反映容差、轉(zhuǎn)換因子、四舍五入、測量誤差等和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的其他因素。一般來講，量、大小、公式、參數(shù)或其他數(shù)量或特征為“約”或“近似”，無論是否進(jìn)行此類明確表述。應(yīng)了解，除非另外特別說明，否則當(dāng)“約”用在定量值前時(shí)，所述參數(shù)還包括特定的定量值本身。說明書和最后的權(quán)利要求書中提及的組合物中的特定元素或組分的重量份表示組合物或制品中的所述元素或組分與任何其他元素或組分之間的重量關(guān)系，用重量份表示。因此，在包含2重量份的組分x和5重量份的組分y的化合物中，x和y以2:5的重量比存在，并且以這個(gè)比例存在而不管所述化合物中是否包含另外的組分。除非特意相反地陳述，否則組分的重量百分比(重量％)是基于其中包含所述組分的制劑或組合物的總重量。如本文所用的術(shù)語“任選的”或“任選地”意指隨后描述的事件或情況可以發(fā)生或可以不發(fā)生，并且這種描述包括其中所述事件或情況發(fā)生的實(shí)例和其中不發(fā)生的情況。如本文所用的術(shù)語“有效量”是指足以實(shí)現(xiàn)組合物或方法的物理、化學(xué)或生物特性的所需改變的量。如本文所用，“試劑盒”意指構(gòu)成所述試劑盒的至少兩種組分的集合。所述組分共同構(gòu)成用于給定目的的功能單位。個(gè)別成員組分可以物理方式包裝在一起或分開包裝。例如，包括試劑盒的使用說明書的試劑盒可以物理方式包括或不包括與其他個(gè)別成員組分一起的說明書。相反地，說明書可以作為單獨(dú)的成員組分，以紙張形式或可以提供在計(jì)算機(jī)可讀存儲裝置上或從互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)站下載的電子形式，或作為記錄演示來提供。如本文所用，“說明書”意指描述關(guān)于試劑盒的相關(guān)材料或方法的文件。這些材料可以包括以下項(xiàng)中的任何組合：背景信息、組分列表和其可用性信息(購買信息等)、試劑盒的簡明或詳細(xì)使用方案、問題解決、參考、技術(shù)支持和任何其他相關(guān)文件。說明書可以與試劑盒一起提供或作為單獨(dú)的成員組分，以紙張形式或可以提供在計(jì)算機(jī)可讀存儲裝置上或從互聯(lián)網(wǎng)網(wǎng)站下載的電子形式或作為記錄演示來提供。說明書可以包括一個(gè)或多個(gè)文件，并且意圖包括未來的更新。如本文所用的術(shù)語“受試者”可以是脊椎動(dòng)物(如哺乳動(dòng)物)、魚、鳥、爬行動(dòng)物或兩棲動(dòng)物。因此，本文所公開的方法的受試者可以是人、非人靈長類動(dòng)物、馬、豬、兔、狗、綿羊、山羊、奶牛、貓、豚鼠或嚙齒類動(dòng)物。所述術(shù)語不指示特定年齡或性別。因此，用以包含無論雄性還是雌性的成年和新生的受試者以及胎兒。一方面，受試者是哺乳動(dòng)物?；颊呤侵甘懿?、疾病或病癥折磨的受試者。術(shù)語“患者”包括人類和獸類受試者。在所公開的方法的一些方面中，已經(jīng)診斷出受試者需要治療與端粒長度改變相關(guān)聯(lián)的一種或多種病癥或疾病。例如，患有特定臨床病狀的受試者可含有具有下述染色體的細(xì)胞，所述染色體具有由端粒酶活性的功能障礙所導(dǎo)致的改變的端粒長度。在此類病狀中，端粒酶活性的功能障礙導(dǎo)致非常短的端粒(“端粒疾病”)。本文所用的術(shù)語“治療”是指醫(yī)學(xué)管理患者旨在治愈、改善、穩(wěn)定或預(yù)防疾病、病理病狀或病癥。該術(shù)語包括積極治療，即治療直接具體針對疾病、病理病狀或病癥的改善；以及包括病因治療，即治療針對于去除相關(guān)疾病、病理病狀或病癥的病因。另外，這個(gè)術(shù)語包括舒減治療，即治療設(shè)計(jì)用來減輕癥狀，而不是治愈疾病、病理病狀或病癥；預(yù)防性治療，即治療針對于使相關(guān)疾病、病理病狀或病癥的發(fā)展減到最小或部分或完全抑制相關(guān)疾病、病理病狀或病癥的發(fā)展；和支持治療，即治療用以補(bǔ)充針對改善相關(guān)疾病、病理病狀或病癥的另一特定療法。在各個(gè)方面，所述術(shù)語涵蓋受試者包括哺乳動(dòng)物(例如人)的任何治療，并且包括：(i)預(yù)防疾病在可能易于感染疾病但尚未診斷出患疾病的受試者中發(fā)生；(ii)抑制疾病，即阻止其發(fā)展；或(iii)減輕疾病，即使疾病消退。在一方面，所述受試者為哺乳動(dòng)物，諸如靈長類動(dòng)物，且在另一方面，所述受試者為人類。術(shù)語“受試者”也包括馴養(yǎng)動(dòng)物(例如，貓、狗等)、家畜(例如，牛、馬、豬、綿羊、山羊等)和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物(例如，小鼠、兔、大鼠、豚鼠、果蠅等)。本文所用的術(shù)語“預(yù)防”是指特別是通過預(yù)先措施來排除、避開、避免、防止、阻止或妨礙某事發(fā)生。應(yīng)了解，在本文使用降低、抑制或預(yù)防的情況下，除非另外具體指出，否則也明確公開了使用另外兩個(gè)詞語。本文所用的術(shù)語“施用”是指向受試者提供藥物制劑的任何方法。此類方法對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言是熟知的并且包括但不限于口服、經(jīng)皮施用、經(jīng)吸入施用、鼻施用、局部施用、葉鞘內(nèi)施用、眼科施用、耳內(nèi)施用、腦內(nèi)施用、直腸施用、舌下施用、頰部施用和腸胃外施用，包括可注射施用，諸如靜脈內(nèi)施用、動(dòng)脈內(nèi)施用、肌肉內(nèi)施用和皮下施用。施用可連續(xù)或間歇進(jìn)行。在各種方面，制劑可治療性施用，即，施用用以治療現(xiàn)有疾病或病狀。在其他各種方面，制劑可預(yù)防性施用，即，施用用以預(yù)防疾病或病狀。本文所用的術(shù)語“有效量”和“有效的量”是指足以實(shí)現(xiàn)所需結(jié)果或足以對不想要的病狀起作用的量。例如，“治療有效量”是指足以實(shí)現(xiàn)所需治療結(jié)果或?qū)Σ幌胍陌Y狀起作用、但通常不足以引起不利的負(fù)面作用的量。對于任何特定患者的特定治療有效劑量水平將取決于多種因素，包括正治療的病癥、病癥嚴(yán)重程度；所采用的特定組合物；患者的年齡、體重、總體健康、性別和飲食；施用時(shí)間；施用路徑；所用特定化合物的排泄速率；治療持續(xù)時(shí)間；組合或與所用特定化合物同時(shí)使用的藥物和醫(yī)學(xué)技術(shù)中熟知的類似因素。例如，以低于實(shí)現(xiàn)所需治療作用所需要的水平開始將化合物給藥并逐漸增加劑量直至實(shí)現(xiàn)所需作用完全在本領(lǐng)域的技術(shù)之內(nèi)。如果需要，那么可將有效日劑量分成多劑量以便于施用。因此，單劑量組合物可含有構(gòu)成日劑量的所述量或其約數(shù)。如果有任何禁忌癥，那么劑量可由個(gè)別醫(yī)師調(diào)節(jié)。劑量可變化，并且可以每日一個(gè)或多個(gè)劑量施用來施用，歷時(shí)一天或幾天。關(guān)于給定類別藥物產(chǎn)品的適當(dāng)劑量，指導(dǎo)可發(fā)現(xiàn)于文獻(xiàn)中。在其他各種方面，制劑可以“預(yù)防有效量”施用；即以有效預(yù)防疾病或病狀的量施用。如本文所用，“延伸引物”意指用于進(jìn)行由dna聚合酶進(jìn)行的限時(shí)延伸反應(yīng)步驟的寡核苷酸引物。延伸引物可以包含3'部分和5'部分。例如，3'部分可以在退火條件下與3'突出中的端粒重復(fù)序列雜交，并且5'部分可以具有在退火條件下不與3'突出中的端粒重復(fù)序列雜交的錨定序列。如本文所用，“端粒區(qū)域”意指位于染色體末端處的具有重復(fù)端粒序列(ttaggg:ccctaa重復(fù)序列)的雙鏈dna區(qū)段。如本文所用，“子端粒區(qū)域”意指位于端粒的著絲粒側(cè)處的緊鄰端粒的dna區(qū)段。子端粒區(qū)域常常含有簡并的端粒重復(fù)序列。在人的情況下，tgaggg和tcaggg的重復(fù)序列可以存在于子端粒區(qū)域中。如本文所用，“錨定序列”意指引物內(nèi)的獨(dú)特序列區(qū)段，其不存在于可以用于pcr反應(yīng)中的模板基因組中或存在于預(yù)期擴(kuò)增子的20kb內(nèi)。例如，延伸引物的5'部分可以是錨定序列，所述錨定序列被配置成在退火條件下不與g鏈中的端粒重復(fù)序列(其與延伸引物的3'部分雜交)雜交并且不與20kb端粒重復(fù)序列內(nèi)的模板序列中的任何其他序列雜交。如本文所用，“染色體dna的g鏈”意指具有3'突出的端粒的鏈，并且包含端粒重復(fù)序列5'-ttaggg-3'。例如，“染色體dna的g鏈”可以是指包含人和其他脊椎動(dòng)物中的(ttaggg)n端粒重復(fù)序列的染色體中的dna鏈。如本文所用，“染色體dna的c鏈”意指與染色體dna的g鏈互補(bǔ)的鏈，并且包含人和其他脊椎動(dòng)物中的(ccctaa)n端粒重復(fù)序列。如本文所用，“嵌合組成物基因組dna”意指為包含個(gè)別供體dna樣品的合并樣品的基因組dna。所述池包含獲自至少兩名不相關(guān)的樣品供體的個(gè)別樣品。通常，嵌合組成物基因組dna為包含獲自約50-100名個(gè)別不相關(guān)的樣品供體的單個(gè)基因組dna樣品的合并樣品。在一些情況下，個(gè)別不相關(guān)的樣品供體具有單一性別，例如嵌合組成物基因組dna僅獲自個(gè)別不相關(guān)的男性供體。在其他情況下，個(gè)別不相關(guān)的樣品供體來自兩種性別?！扒逗辖M成物基因組dna”可以與其他術(shù)語“嵌合型模板dna”、“嵌合型基因組dna”、“嵌合型dna”等互換使用。如本文所用，“聚合酶”是指催化核苷酸的聚合的酶。一般來講，酶將在與核酸模板序列退火的引物的3'末端處引發(fā)合成。“dna聚合酶”以序列特異性方式催化脫氧核糖核苷酸的聚合，從而補(bǔ)充與引物退火產(chǎn)生雙鏈dna分子的核酸。已知的dna聚合酶包括例如強(qiáng)烈火球菌(pyrococcusfuriosus)(pfu)dna聚合酶(lundberg等人，(1991)gene108:1)、大腸桿菌dna聚合酶i(lecomte和doubleday(1983)nucleicacidsres.11:7505)、t7dna聚合酶(nordstrom等人(1981)j.biol.chem.256:3112)、嗜熱棲熱菌(thermusthermophilus)(tth)dna聚合酶(myers和gelfand(1991)biochemistry30:7661)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)dna聚合酶(stenesh和mcgowan(1977)biochimbiophysacta475:32)、嗜熱高溫球菌(thermococcuslitoralis)(tli)dna聚合酶(也稱之為ventdna聚合酶，cariello等人(1991)nucleicacidsres19:4193)、海棲熱袍菌(thermotogamaritima)(tma)dna聚合酶(diaz和sabino(1998)brazj.med.res31:1239)，和水生棲熱菌(thermusaquaticus)(taq)dna聚合酶(chien等人，(1976)j.bacteoriol127:1550)。任一上述酶的聚合酶活性可通過本領(lǐng)域熟知的手段來確定。如本文所用，“熱穩(wěn)定的”dna聚合酶活性意指相較于例如dna聚合酶的非熱穩(wěn)定形式，對熱相對穩(wěn)定且在高溫例如45-100℃，優(yōu)選55-100℃、65-100℃、75-100℃、85-100℃或95-100℃下發(fā)揮作用的dna聚合酶活性。如本文所用，“引物”是指在誘導(dǎo)與核酸鏈互補(bǔ)的引物延伸產(chǎn)物的合成的條件下，例如在四種不同的三磷酸核苷和延伸用試劑(例如，dna聚合酶或逆轉(zhuǎn)錄酶)的存在下，在適當(dāng)?shù)木彌_液中和合適的溫度下能夠作為dna合成的起始點(diǎn)的寡核苷酸。引物不必反映模板核酸的確切序列，但是必須充分互補(bǔ)以與模板雜交。適用于擴(kuò)增給定靶序列的引物的設(shè)計(jì)在本領(lǐng)域中是熟知的并且描述于本文所引用的文獻(xiàn)中。如本文所用，術(shù)語“靶標(biāo)、“靶序列”、“靶區(qū)域”和“靶核酸”是同義的并且是指待擴(kuò)增或檢測的核酸的區(qū)域或子序列。如本文所用，術(shù)語“雜交”是指兩個(gè)單鏈核酸由于互補(bǔ)堿基配對而形成雙鏈體結(jié)構(gòu)。雜交可以在完全互補(bǔ)的核酸鏈之間或在含有少數(shù)錯(cuò)配區(qū)域的“大體上互補(bǔ)”的核酸鏈之間發(fā)生。使得只有完全互補(bǔ)的核酸鏈才會雜交的條件被稱作“嚴(yán)格雜交條件條件”或“序列特異性雜交條件”。大體上互補(bǔ)的序列的穩(wěn)定雙鏈體可以在不太嚴(yán)格的雜交條件下實(shí)現(xiàn)；可以通過適當(dāng)?shù)卣{(diào)節(jié)雜交條件來控制可接受的錯(cuò)配度。核酸
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以根據(jù)由本領(lǐng)域所提供的指導(dǎo)憑經(jīng)驗(yàn)確定雙鏈體穩(wěn)定性，這考慮到許多變量包括例如寡核苷酸的長度和堿基對組成、離子強(qiáng)度和錯(cuò)配堿基對的發(fā)生率(參見，例如sambrook等人,(1989)molecularcloning—alaboratorymanual(coldspringharborlaboratory，coldspringharbor，n.y.)；和wetmur(1991)criticalreviewinbiochem.andmol.biol.26(3/4):227-259；兩個(gè)文獻(xiàn)均以引用的方式并入)。術(shù)語“擴(kuò)增反應(yīng)”是導(dǎo)致模板核酸序列的拷貝的增加或?qū)е履０搴怂岬霓D(zhuǎn)錄的任何化學(xué)反應(yīng)，包括酶促反應(yīng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)是允許較長雙鏈dna分子內(nèi)的dna序列的指數(shù)擴(kuò)增的方法。pcr需要使用一對引物，所述一對引物與dna的兩條鏈中的每一條上的限定序列互補(bǔ)，其中一種引物與一條鏈互補(bǔ)，另一種引物與靶序列的另一條鏈互補(bǔ)。這些引物通過dna聚合酶延伸，使得拷貝由指定序列組成。在形成這種拷貝后，可以再次使用相同的引物，不僅形成inputdna鏈的另一個(gè)拷貝，而且形成在第一輪合成中形成的短拷貝(pcr擴(kuò)增子)的拷貝。這導(dǎo)致對數(shù)擴(kuò)增。因?yàn)樾枰诿恳惠喌臄U(kuò)增過程中提高溫度以分離雙鏈dna的兩條鏈，所以一個(gè)重要的進(jìn)步是發(fā)現(xiàn)了從水生棲熱菌(thermusaquaticus)(一種在熱水池中生長的細(xì)菌)分離出的熱穩(wěn)定性dna聚合酶(taq聚合酶)；因此不需要在每一輪擴(kuò)增中加入新的聚合酶。在若干(常常為約20至40)輪擴(kuò)增后，將pcr產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上分析且其豐度足以利用dna嵌入或結(jié)合染料，例如溴化乙錠、green或染料檢測。應(yīng)了解，實(shí)時(shí)pcr(又稱作定量實(shí)時(shí)pcr(qrt-pcr))、定量pcr(q-pcr/qpcr)或動(dòng)態(tài)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)是基于pcr的實(shí)驗(yàn)室技術(shù)，用于擴(kuò)增且同時(shí)定量靶dna分子。qpcr允許檢測和定量dna樣品中的特定序列(作為拷貝的絕對數(shù)或當(dāng)歸一化至dnainput或另外的歸一化基因時(shí)作為相對量)。如本文所用，如果當(dāng)在足夠嚴(yán)格的條件下使用時(shí)引物主要只與靶核酸雜交，則引物對靶序列具有“特異性”。通常，如果引物-靶雙鏈體穩(wěn)定性大于在引物與樣品中發(fā)現(xiàn)的任何其他序列之間形成的雙鏈體的穩(wěn)定性，則引物對靶序列具有特異性。本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識到各種因素諸如鹽條件以及引物的堿基組成和錯(cuò)配的位置將影響引物的特異性，并且在大多數(shù)情況下將需要引物特異性的常規(guī)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)?？梢赃x擇使得引物可以只與靶序列形成穩(wěn)定雙鏈體的雜交條件。因此，在適當(dāng)嚴(yán)格的擴(kuò)增條件下使用靶特異性引物使得能夠進(jìn)行包含靶引物結(jié)合位點(diǎn)的那些靶序列的特異性擴(kuò)增。使用序列特異性擴(kuò)增條件使得包含完全互補(bǔ)的引物結(jié)合位點(diǎn)的那些靶序列的特異性擴(kuò)增。術(shù)語“tm”意指核酸雙鏈體的解鏈溫度或退火溫度，在特定條件下在所述溫度下一半的堿基對發(fā)生解離。核酸
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員可以憑經(jīng)驗(yàn)確定雙鏈體穩(wěn)定性，這考慮到許多變量包括例如寡核苷酸的長度、堿基組成和寡核苷酸的序列、離子強(qiáng)度和錯(cuò)配堿基對的發(fā)生率。如本文所用，“預(yù)測的tm”意指預(yù)測引物和其互補(bǔ)模板序列足以穩(wěn)定來允許通過pcr進(jìn)行雜交和延伸所處于的溫度，并且可使用最小距離算法來確定(von-ahsenn等人(1999)clinicalchemistry，45(12):2094-2101)。用于確定寡核苷酸和引物的預(yù)測的tm的示例性軟件工具提供在銷售寡核苷酸的許多供應(yīng)商(例如integrateddnatechnologies，inc.)的網(wǎng)址上。如本文所用，術(shù)語“探針”是指由于探針中的至少一種與靶區(qū)域中的序列的互補(bǔ)性而與靶核酸中的序列形成雙鏈體結(jié)構(gòu)的標(biāo)記寡核苷酸。探針優(yōu)選不含有與用于引發(fā)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的序列互補(bǔ)的序列。如本文所用，“互補(bǔ)”是指一個(gè)核酸分子可以通過互補(bǔ)核苷或核苷酸之間的傳統(tǒng)的沃森-克里克(watson-crick)堿基配對或其他非傳統(tǒng)類型的配對(例如，霍氏(hoogsteen)或逆向霍氏氫鍵結(jié)合)與另一核酸分子形成氫鍵。如本文所用，“大體上互補(bǔ)”意指可形成的核酸分子與另一核酸之間的互補(bǔ)性足以使得在所需或指定條件下可發(fā)生雜交。因此，兩條核酸鏈不必在兩條鏈的每個(gè)核苷酸處是互補(bǔ)的。當(dāng)術(shù)語“大體上互補(bǔ)”與引物一起使用時(shí)，其意指引物必須具有足夠互補(bǔ)性以與其相應(yīng)鏈雜交。因此，引物序列不必反映模板的確切序列。例如，非互補(bǔ)核苷酸片段可連接至引物的5'末端，其中引物序列的剩余部分與鏈互補(bǔ)。在一些情況中，期望引物具有確切的互補(bǔ)性以獲得最佳檢測結(jié)果。然而，存在其他情況，其中期望引物具有隨機(jī)錯(cuò)配或者特定錯(cuò)配被設(shè)計(jì)到引物中。在本領(lǐng)域中應(yīng)當(dāng)理解，核酸分子不必與可特異性雜交的靶核酸序列100％互補(bǔ)。即，兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子可以小于完全互補(bǔ)并且由可以與第二核酸分子形成氫鍵的核酸分子中的連續(xù)殘基的百分比指示。例如，如果第一核酸分子具有10個(gè)核苷酸并且第二核酸分子具有10個(gè)核苷酸，則第一核酸分子與第二核酸分子之間的5、6、7、8、9或10個(gè)核苷酸的堿基配對分別表示50％、60％、70％、80％、90％和100％的互補(bǔ)性?！巴昝馈被颉巴耆被パa(bǔ)的核酸分子意指其中第一核酸分子的所有連續(xù)殘基將與第二核酸分子中的相同數(shù)量的連續(xù)殘基氫鍵結(jié)合的那些，其中核酸分子均具有相同數(shù)量的核苷酸(即，具有相同長度)或兩個(gè)分子具有不同長度。如本文所用，術(shù)語“非特異性擴(kuò)增”是指非靶序列的核酸序列的擴(kuò)增，這是由于引物與非靶序列的序列雜交并且然后作為引物延伸的底物所致。引物與非靶序列的雜交被稱作“非特異性雜交”并且尤其易于在較低溫度、低嚴(yán)格度的預(yù)擴(kuò)增條件期間出現(xiàn)。如本文所用，術(shù)語“引物二聚體”是指不依賴模板的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，據(jù)信它是由其中另一引物充當(dāng)模板的引物延伸所致。盡管引物二聚體經(jīng)常顯現(xiàn)為兩種引物的串聯(lián)體即二聚體，但是還存在多于兩種引物的串聯(lián)體。術(shù)語“引物二聚體”在本文中被一般地用來包括不依賴于模板的非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物。如本文所用，術(shù)語“反應(yīng)混合物”是指含有進(jìn)行給定反應(yīng)所必需的試劑的溶液?！皵U(kuò)增反應(yīng)混合物”是指含有進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)所必需的試劑的溶液，其通常含有于合適緩沖液中的寡核苷酸引物和dna聚合酶?！皃cr反應(yīng)混合物”通常含有于合適緩沖液中的寡核苷酸引物、dna聚合酶(最典型為熱穩(wěn)定性dna聚合酶)、dntp和二價(jià)金屬陽離子。如果反應(yīng)混合物含有使反應(yīng)能夠進(jìn)行所必需的所有試劑，則稱之為完全反應(yīng)混合物，并且如果它只含有必需試劑的亞組，則稱之為不完全反應(yīng)混合物。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，出于方便、儲存穩(wěn)定性或允許依賴應(yīng)用的組分濃度調(diào)整的原因，反應(yīng)組分常規(guī)地儲存為單獨(dú)的溶液或儲存在“混合母液”中，各自均含有總組分的亞組，并且在反應(yīng)之前將反應(yīng)組分合并以產(chǎn)生完全反應(yīng)混合物。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)理解的是，反應(yīng)組分被單獨(dú)地包裝以用于商業(yè)化并且可用的商業(yè)試劑盒可含有反應(yīng)組分的任何亞組，其中包括本公開的阻滯引物。表1中描述的縮略語和術(shù)語用于整個(gè)本文中。表1.所公開的材料、組合物以及組分可用于所公開的方法和組合物，可與所公開的方法和組合物聯(lián)用，可用來制備所公開的組合物，或者是所公開的方法和組合物的產(chǎn)品。本文公開這些和其他材料，并且應(yīng)了解當(dāng)公開這些材料的組合、子集、相互作用、群組等時(shí)，雖然可未明確公開這些化合物的每個(gè)不同個(gè)別和共同組合以及排列的特定提到，但是其各自在本文中特定涵蓋和描述。因而，若公開了一類分子a、b和c以及一類分子d、e和f，并公開了一個(gè)組合分子實(shí)施例a-d，則即使沒有單獨(dú)列舉每種情況，每種情況都單獨(dú)和整體地包括在本發(fā)明的預(yù)想之中。因此，在這個(gè)實(shí)施例中，a-e、a-f、b-d、b-e、b-f、c-d、c-e和c-f這些組合中的每一個(gè)組合都具體地包括在本發(fā)明預(yù)想之中，應(yīng)視為因a、b、c和d、e、f以及組合實(shí)施例a-d的公開而得到公開。同樣地，這些分子的任何分組或組合也都具體地包括在本發(fā)明的預(yù)想之中并視為得到公開。因此，例如，分組a-e、b-f和c-e具體地包括在本發(fā)明的預(yù)想之中，應(yīng)視為因a、b、c和d、e、f以及組合實(shí)施例a-d的公開而得到公開。這個(gè)概念適用于本公開的所有方面，包括但不限于制造和使用所公開的組合物的方法中的步驟。因此，若有多種額外步驟可進(jìn)行，應(yīng)了解，這些額外步驟中的每一步都可與所公開的方法的任意具體實(shí)施方案或?qū)嵤┓桨傅慕M合一起進(jìn)行，并且這樣的每種組合都具體地包括在本發(fā)明預(yù)想之中，應(yīng)視為得到公開。1.三重qpcr測定方法本公開公開了用于確定染色體群體中的平均端粒長度或豐度的量度和使用這些量度來確定健康或疾病風(fēng)險(xiǎn)的量度或干預(yù)效果，或用于通過向醫(yī)師提供通過基于端粒的指導(dǎo)添加的值來改善醫(yī)學(xué)實(shí)踐的方法和材料，所述干預(yù)增加或減小端粒長度并因此增加或減少健康，或相反地分別減少或增加未來疾病或死亡的風(fēng)險(xiǎn)。所述方法涉及在針對每種靶核酸序列利用不同的檢測標(biāo)記的單一qpcr多重反應(yīng)中確定至少三種靶核酸序列的平均端粒長度或豐度。在一方面，三種靶核酸序列中的一種是端粒序列并且另兩種靶核酸序列是已知很少發(fā)生拷貝數(shù)變異的不同的低拷貝數(shù)基因。在另一方面，低拷貝數(shù)基因是已知很少發(fā)生拷貝數(shù)變異的單拷貝基因。在另一方面，平均端粒長度或豐度與另兩種核酸序列的平均豐度的平均值的比，即t/s比可以用于確定具體的臨床風(fēng)險(xiǎn)，其中“s”是兩種單低拷貝基因的平均值。另選地，t/s比可用于優(yōu)化治療方案。在一方面，本公開涉及用于確定平均端粒長度的方法，所述方法包括：(a)使第一靶核酸與第一引物組接觸、使第二靶核酸與第二組引物組接觸并且使第三靶核酸靶標(biāo)與第三引物組接觸；(i)其中第一引物組包括第一正向引物和第一反向引物；(ii)其中第二引物組包括第二正向引物和第二反向引物；(iii)其中第三引物組包括第三正向引物和第三反向引物；并且(iv)其中第一靶核酸包含端粒重復(fù)序列；(b)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組擴(kuò)增第一靶核酸以形成第一擴(kuò)增子、用第二引物組擴(kuò)增第二靶核酸以形成第二擴(kuò)增子，并且用第三引物組擴(kuò)增第三靶核酸以形成第三擴(kuò)增子；(c)確定聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一個(gè)或多個(gè)循環(huán)過程中的第一擴(kuò)增子、第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的量；(i)其中使用第一檢測標(biāo)記檢測第一擴(kuò)增子；(ii)其中使用第二檢測標(biāo)記檢測第二擴(kuò)增子；并且(iii)其中使用第三檢測標(biāo)記檢測第三擴(kuò)增子；并且(d)確定第一擴(kuò)增子的平均長度或豐度。在各個(gè)方面，確定第一擴(kuò)增子的平均長度或豐度包括以下步驟：(a)通過與對照聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)比較確定第一擴(kuò)增子、第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的濃度；(b)確定第一擴(kuò)增子的濃度與第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的平均或加權(quán)濃度的比；和(c)將來自步驟(b)的比轉(zhuǎn)換為端粒序列的堿基對/基因組。在一方面，本公開涉及用于確定平均端粒長度的方法，所述方法包括：(a)使第一靶核酸與第一引物組接觸、使第二靶核酸與第二組引物組接觸、使第三靶核酸靶標(biāo)與第三引物組接觸；并且使第四靶核苷酸靶標(biāo)與第四引物組接觸；(i)其中第一引物組包括第一正向引物和第一反向引物；(ii)其中第二引物組包括第二正向引物和第二反向引物；(iii)其中第三引物組包括第三正向引物和第三反向引物；(iv)其中第四引物組包括第四正向引物和第四反向引物；并且(v)其中第一靶核酸包含端粒重復(fù)序列；(b)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組擴(kuò)增第一靶核酸以形成第一擴(kuò)增子、用第二引物組擴(kuò)增第二靶核酸以形成第二擴(kuò)增子、用第三引物組擴(kuò)增第三靶核酸以形成第三擴(kuò)增子，并且用第四引物組擴(kuò)增第四靶核酸以形成第四擴(kuò)增子；(c)確定聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一個(gè)或多個(gè)循環(huán)過程中的第一擴(kuò)增子、第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的量；(i)其中使用第一檢測標(biāo)記檢測第一擴(kuò)增子；(ii)其中使用第二檢測標(biāo)記檢測第二擴(kuò)增子；(iii)其中使用第三檢測標(biāo)記檢測第三擴(kuò)增子；并且(iv)其中使用第四檢測標(biāo)記檢測第四擴(kuò)增子；并且(d)確定第一擴(kuò)增子的平均長度或豐度。在各個(gè)方面，確定第一擴(kuò)增子的平均長度或豐度包括以下步驟：(a)通過與對照聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)比較確定第一擴(kuò)增子、第二擴(kuò)增子、第三擴(kuò)增子和第四擴(kuò)增子的濃度；(b)確定第一擴(kuò)增子的濃度與第二擴(kuò)增子、第三擴(kuò)增子和第四擴(kuò)增子的平均或加權(quán)濃度的比；和(c)將來自步驟(b)的比轉(zhuǎn)換為端粒序列的堿基對/基因組。在一方面，本公開涉及用于確定平均端粒長度的方法，所述方法包括：(a)使第一靶核酸與第一引物組接觸、使第二靶核酸與第二組引物組接觸、使第三靶核酸靶標(biāo)與第三引物組接觸、使第四靶核苷酸靶標(biāo)與第四引物組接觸，并且使第五靶核酸靶標(biāo)與第五引物組接觸；(i)其中第一引物組包括第一正向引物和第一反向引物；(ii)其中第二引物組包括第二正向引物和第二反向引物；(iii)其中第三引物組包括第三正向引物和第三反向引物；(iv)其中第四引物組包括第四正向引物和第四反向引物；(v)其中第五引物組包括第五正向引物和第五反向引物，并且(vi)其中第一靶核酸包含端粒重復(fù)序列；(b)通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)用第一引物組擴(kuò)增第一靶核酸以形成第一擴(kuò)增子、用第二引物組擴(kuò)增第二靶核酸以形成第二擴(kuò)增子、用第三引物組擴(kuò)增第三靶核酸以形成第三擴(kuò)增子，用第四引物組擴(kuò)增第四靶核酸以形成第四擴(kuò)增子并且用第五引物組擴(kuò)增第五靶核酸以形成第五擴(kuò)增子；(c)確定聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的一個(gè)或多個(gè)循環(huán)過程中的第一擴(kuò)增子、第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的量；(i)其中使用第一檢測標(biāo)記檢測第一擴(kuò)增子；(ii)其中使用第二檢測標(biāo)記檢測第二擴(kuò)增子；(iii)其中使用第三檢測標(biāo)記檢測第三擴(kuò)增子；(iv)其中使用第四檢測標(biāo)記檢測第四擴(kuò)增子；并且(v)其中使用第五檢測標(biāo)記檢測第五擴(kuò)增子；并且(d)確定第一擴(kuò)增子的平均長度或豐度。在各個(gè)方面，確定第一擴(kuò)增子的平均長度或豐度包括以下步驟：(a)通過與對照聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)比較確定第一擴(kuò)增子、第二擴(kuò)增子、第三擴(kuò)增子和第四擴(kuò)增子的濃度；(b)確定第一擴(kuò)增子的濃度與第二擴(kuò)增子、第三擴(kuò)增子、第四擴(kuò)增子和第五擴(kuò)增子的平均或加權(quán)濃度的比；和(c)將來自步驟(b)的比轉(zhuǎn)換為端粒序列的堿基對/基因組。在各個(gè)方面，第一正向引物和第一反向引物中的每種包含：(a)3'部分，其在退火條件下與端粒重復(fù)序列雜交；和(b)5'部分，其具有不與端粒重復(fù)序列雜交的錨定序列。在另一方面，第一正向引物和第一反向引物的引物3'末端彼此互補(bǔ)。在再另一方面，第一反向引物是包含鄰近或包括引物的3'末端的至少一個(gè)錯(cuò)配核苷酸的錯(cuò)配引物，其中至少一個(gè)錯(cuò)配核苷酸不與靶核酸互補(bǔ)，但是與第一正向引物的3'端核苷酸互補(bǔ)。在又另一方面，第一正向引物的延伸產(chǎn)物能夠與第一反向引物(reverseprime)雜交。甚至在另一方面，第一正向引物的延伸產(chǎn)物能夠與第一反向引物雜交但不形成引物二聚體。在再另一方面，第一正向引物包含seqidno.：1的序列；并且其中第一反向引物包含seqidno.：2的序列。在另一方面，第一反向引物被阻滯引發(fā)第一靶核酸。在再另一方面，第一反向引物通過末端3'錯(cuò)配堿基而被阻滯引發(fā)第一靶核酸。在各個(gè)方面，第二靶核酸在已知拷貝數(shù)的基因內(nèi)。在另一方面，第二靶核酸在低拷貝數(shù)基因內(nèi)。在再另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)。在各個(gè)方面，第二靶核酸在已知很少發(fā)生拷貝數(shù)變異的已知拷貝數(shù)的基因內(nèi)。在另一方面，第二靶核酸在已知很少發(fā)生拷貝數(shù)變異的低拷貝數(shù)基因內(nèi)。在再另一方面，第二靶核酸在已知很少發(fā)生拷貝數(shù)變異的單拷貝數(shù)基因內(nèi)。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)棣?-微球蛋白。在另一方面，第二正向引物包含seqidno.：3。在又另一方面，第二反向引物包含seqidno.：4。在再另一方面，第二正向引物包含與β2-微球蛋白基因中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與β2-微球蛋白基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閜gk。在另一方面，第二正向引物包含與pgk基因中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與pgk基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)間apdh。在另一方面，第二正向引物包含與gapdh基因中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與gapdh基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閔tert。在另一方面，第二正向引物包含與htert基因中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與htert基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閍ctb。在另一方面，第二正向引物包含與actb基因中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與actb基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。在各個(gè)方面，第二靶核酸位于人基因內(nèi)。在各個(gè)方面，第三靶核酸在已知拷貝數(shù)的基因內(nèi)。在另一方面，第三靶核酸在低拷貝數(shù)基因內(nèi)。在再另一方面，第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)。在各個(gè)方面，第三靶核酸在已知很少發(fā)生拷貝數(shù)變異的已知拷貝數(shù)的基因內(nèi)。在另一方面，第三靶核酸在已知很少發(fā)生拷貝數(shù)變異的低拷貝數(shù)基因內(nèi)。在再另一方面，第三靶核酸在已知很少發(fā)生拷貝數(shù)變異的單拷貝數(shù)基因內(nèi)。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)棣?-微球蛋白，并且第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閞na酶p。在另一方面，第二正向引物包含seqidno.：3。在又另一方面，第二反向引物包含seqidno.：4。在再另一方面，第二正向引物包含與β2-微球蛋白基因中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與β2-微球蛋白基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含seqidno.：6。在再另一方面，第三反向引物包含seqidno.：7。在又另一方面，第三正向引物包含seqidno.：9。甚至在另一方面，第三反向引物包含seqidno.：10。在再另一方面，第三正向引物包含與rna酶p中的序列互補(bǔ)的序列，第三反向引物包含與rna酶p中的序列互補(bǔ)的序列，并且第三正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。另選地，針對rna酶p且適用于所公開的方法中的引物和探針序列靶標(biāo)通過fan等人bmcinfectiousdisease(2014)14:541得到描述。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)棣?-微球蛋白，并且第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)間apdh。在另一方面，第二正向引物包含seqidno.：3。在又另一方面，第二反向引物包含seqidno.：4。在再另一方面，第三正向引物包含seqidno.：26。甚至在另一方面，第三反向引物包含seqidno.：27。在再另一方面，第二正向引物包含與β2-微球蛋白基因中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與β2-微球蛋白基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含與gapdh中的序列互補(bǔ)的序列，第三反向引物包含與gapdh中的序列互補(bǔ)的序列，并且第三正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)棣?-微球蛋白，并且第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閜gk。在另一方面，第二正向引物包含seqidno.：3。在又另一方面，第二反向引物包含seqidno.：4。在再另一方面，第三正向引物包含seqidno.：22。甚至在另一方面，第三反向引物包含seqidno.：23。在再另一方面，第二正向引物包含與β2-微球蛋白基因中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與β2-微球蛋白基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含與pgk中的序列互補(bǔ)的序列，第三反向引物包含與pgk中的序列互補(bǔ)的序列，并且第三正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)棣?-微球蛋白，并且第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閔tert。在另一方面，第二正向引物包含seqidno.：3。在又另一方面，第二反向引物包含seqidno.：4。在再另一方面，第二正向引物包含與β2-微球蛋白基因中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與β2-微球蛋白基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含與htert中的序列互補(bǔ)的序列，第三反向引物包含與htert中的序列互補(bǔ)的序列，并且第三正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)棣?-微球蛋白，并且第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閍ctb。在另一方面，第二正向引物包含seqidno.：3。在另一方面，第二反向引物包含seqidno.：4。在再另一方面，第三正向引物包含seqidno.：24。甚至在另一方面，第三反向引物包含seqidno.：25。在再另一方面，第二正向引物包含與β2-微球蛋白基因中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與β2-微球蛋白基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含與actb中的序列互補(bǔ)的序列，第三反向引物包含與actb中的序列互補(bǔ)的序列，并且第三正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閞na酶p，并且第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)間apdh。在另一方面，第二正向引物包含seqidno.：6。在再另一方面，第二反向引物包含seqidno.：7。在又另一方面，第二正向引物包含seqidno.：9。甚至在另一方面，第二反向引物包含seqidno.：10。在再另一方面，第三正向引物包含seqidno.：26。甚至在另一方面，第三反向引物包含seqidno.：27。在再另一方面，第二正向引物包含與rna酶p中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與rna酶p中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。另選地，針對rna酶p且適用于所公開的方法中的引物和探針序列靶標(biāo)通過fan等人bmcinfectiousdisease(2014)14:541得到描述。甚至在另一方面，第三正向引物包含與gapdh中的序列互補(bǔ)的序列，第三反向引物包含與gapdh中的序列互補(bǔ)的序列，并且第三正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閞na酶p，并且第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閜gk。在另一方面，第二正向引物包含seqidno.：6。在再另一方面，第二反向引物包含seqidno.：7。在又另一方面，第二正向引物包含seqidno.：9。甚至在另一方面，第二反向引物包含seqidno.：10。在再另一方面，第三正向引物包含seqidno.：22。甚至在另一方面，第三反向引物包含seqidno.：23。在再另一方面，第二正向引物包含與rna酶p中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與rna酶p中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。另選地，針對rna酶p且適用于所公開的方法中的引物和探針序列靶標(biāo)通過fan等人bmcinfectiousdisease(2014)14:541得到描述。甚至在另一方面，第三正向引物包含與pgk中的序列互補(bǔ)的序列，第三反向引物包含與pgk中的序列互補(bǔ)的序列，并且第三正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閞na酶p，并且第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閔tert。在另一方面，第二正向引物包含seqidno.：6。在再另一方面，第二反向引物包含seqidno.：7。在又另一方面，第二正向引物包含seqidno.：9。甚至在另一方面，第二反向引物包含seqidno.：10。在再另一方面，第二正向引物包含與rna酶p中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與rna酶p中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。另選地，針對rna酶p且適用于所公開的方法中的引物和探針序列靶標(biāo)通過fan等人bmcinfectiousdisease(2014)14:541得到描述。甚至在另一方面，第三正向引物包含與htert中的序列互補(bǔ)的序列，第三反向引物包含與htert中的序列互補(bǔ)的序列，并且第三正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閞na酶p，并且第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閍ctb。在另一方面，第二正向引物包含seqidno.：6。在再另一方面，第二反向引物包含seqidno.：7。在又另一方面，第二正向引物包含seqidno.：9。甚至在另一方面，第二反向引物包含seqidno.：10。在再另一方面，第三正向引物包含seqidno.：24。甚至在另一方面，第三反向引物包含seqidno.：25。在再另一方面，第二正向引物包含與rna酶p中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與rna酶p中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。另選地，針對rna酶p且適用于所公開的方法中的引物和探針序列靶標(biāo)通過fan等人bmcinfectiousdisease(2014)14:541得到描述。甚至在另一方面，第三正向引物包含與actb中的序列互補(bǔ)的序列，第三反向引物包含與actb中的序列互補(bǔ)的序列，并且第三正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)間apdh，并且第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閜gk。在再另一方面，第二正向引物包含seqidno.：26。甚至在另一方面，第二反向引物包含seqidno.：27。在再另一方面，第三正向引物包含seqidno.：22。甚至在另一方面，第三反向引物包含seqidno.：23。在另一方面，第二正向引物包含與gapdh中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與gapdh基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含與pgk中的序列互補(bǔ)的序列，第三反向引物包含與pgk中的序列互補(bǔ)的序列，并且第三正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)間apdh，并且第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閔tert。在另一方面，第二正向引物包含與gapdh中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與gapdh基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含與htert中的序列互補(bǔ)的序列，第三反向引物包含與htert中的序列互補(bǔ)的序列，并且第三正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)間apdh，并且第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閍ctb。在再另一方面，第二正向引物包含seqidno.：26。甚至在另一方面，第二反向引物包含seqidno.：27。在再另一方面，第三正向引物包含seqidno.：24。甚至在另一方面，第三反向引物包含seqidno.：25。在另一方面，第二正向引物包含與gapdh中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與gapdh基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含與actb中的序列互補(bǔ)的序列，第三反向引物包含與actb中的序列互補(bǔ)的序列，并且第三正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閜gk，并且第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閔tert。在再另一方面，第二正向引物包含seqidno.：22。甚至在另一方面，第二反向引物包含seqidno.：23。在另一方面，第二正向引物包含與pgk中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與pgk基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含與htert中的序列互補(bǔ)的序列，第三反向引物包含與htert中的序列互補(bǔ)的序列，并且第三正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閜gk，并且第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閍ctb。在再另一方面，第二正向引物包含seqidno.：22。甚至在另一方面，第二反向引物包含seqidno.：23。在再另一方面，第三正向引物包含seqidno.：24。甚至在另一方面，第三反向引物包含seqidno.：25。在另一方面，第二正向引物包含與pgk中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與pgk基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含與actb中的序列互補(bǔ)的序列，第三反向引物包含與actb中的序列互補(bǔ)的序列，并且第三正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。在另一方面，第二靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閔tert，并且第三靶核酸在單拷貝數(shù)基因內(nèi)，并且單拷貝基因?yàn)閍ctb。在再另一方面，第三正向引物包含seqidno.：24。甚至在另一方面，第三反向引物包含seqidno.：25。在另一方面，第二正向引物包含與htert中的序列互補(bǔ)的序列，第二反向引物包含與htert基因中的序列互補(bǔ)的序列，并且第二正向引物和第二反向引物產(chǎn)生第二擴(kuò)增子。甚至在另一方面，第三正向引物包含與actb中的序列互補(bǔ)的序列，第三反向引物包含與actb中的序列互補(bǔ)的序列，并且第三正向引物和第三反向引物產(chǎn)生第三擴(kuò)增子。在各個(gè)方面，第三靶核酸位于人基因內(nèi)。在另一方面，第一檢測標(biāo)記、第二檢測標(biāo)記和第三檢測標(biāo)記可分別且同時(shí)地檢測。在再另一方面，第一檢測標(biāo)記、第二檢測標(biāo)記和第三檢測標(biāo)記可分別且同時(shí)地檢測，并且第一檢測標(biāo)記、第二檢測標(biāo)記和第三檢測標(biāo)記中的每個(gè)獨(dú)立地包含熒光部分。在另一方面，第一檢測標(biāo)記、第二檢測標(biāo)記、第三檢測標(biāo)記和第四檢測標(biāo)記可分別且同時(shí)地檢測。在再另一方面，第一檢測標(biāo)記、第二檢測標(biāo)記、第三檢測標(biāo)記和第四檢測標(biāo)記可分別且同時(shí)地檢測，并且第一檢測標(biāo)記、第二檢測標(biāo)記、第四檢測標(biāo)記和第四檢測標(biāo)記中的每個(gè)獨(dú)立地包含熒光部分。在另一方面，第一檢測標(biāo)記、第二檢測標(biāo)記、第三檢測標(biāo)記、第四檢測標(biāo)記和第五檢測標(biāo)記可分別且同時(shí)地檢測。在再另一方面，第一檢測標(biāo)記、第二檢測標(biāo)記、第三檢測標(biāo)記、第四檢測標(biāo)記和第五檢測標(biāo)記可分別且同時(shí)地檢測，并且第一檢測標(biāo)記、第二檢測標(biāo)記、第四檢測標(biāo)記、第四檢測標(biāo)記和第五檢測標(biāo)記中的每個(gè)獨(dú)立地包含熒光部分。例如，本文所述方法可使用優(yōu)選結(jié)合pcr反應(yīng)過程中的雙鏈核酸擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光染料，從而提供產(chǎn)物合成的連續(xù)監(jiān)測(參見higuchi，r.等人biotechnology11：1026-1030(1993)；morrison，t.b.等人，biotechniques24：954-962(1998))。在另一方面，第一檢測標(biāo)記還包含dna結(jié)合染料。在另一方面，熒光dna結(jié)合染料為2-甲基-4,6-雙(4-n,n-二甲氨基苯基)吡喃鎓碘化物、n',n'-二甲基-n-[4-[(e)-(3-甲基-l,3-苯并噻唑-2-亞基)甲基]-1-苯基喹啉-1-鎓-2-基]-n-丙基丙烷-1,3-二胺、2-((2-(二乙氨基)-1-苯基-l,8a-二氫喹啉-4-基)甲基)-3-甲基苯并[d]噻唑-3-鎓碘化物、(z)-4-((3',6-噻唑-[2,6'-二苯并[d]噻唑]-2'(3'h)-亞基)甲基)-l-甲基吡啶-l-鎓碘化物或(z)-4-((6-(苯并[d]噁唑-2-基)-3-甲基苯并[d]噻唑-2(3h)-亞基)甲基)-l-甲基喹啉-l-鎓碘化物。在另一方面，第二檢測標(biāo)記還包含寡核苷酸、熒光部分和熒光淬滅部分。在再另一方面，第二檢測標(biāo)記還包含寡核苷酸、連接至寡核苷酸的5'末端的熒光部分和在寡核苷酸探針的3'末端處的熒光淬滅部分。在又另一方面，第二檢測標(biāo)記還包含含有seqidno.：5序列的寡核苷酸。甚至在另一方面，第二檢測標(biāo)記還包含含有seqidno.：8序列的寡核苷酸。在又另一方面，第二檢測標(biāo)記還包含含有seqidno.：11序列的寡核苷酸。甚至在另一方面，第二檢測標(biāo)記還包含熒光部分，并且熒光部分包括花菁染料。在再另一方面，花菁染料為cy5。在又另一方面，熒光淬滅部分為暗淬滅劑(darkquencher)。另外適合的熒光標(biāo)記的實(shí)例包括但不限于sybrgreeni(invitrogen)、異硫氰酸熒光素(fitc)、5,6-羧甲基熒光素、德克薩斯紅、硝基苯-2-氧雜-1,3-二唑-4-基(nbd)、香豆素、丹磺酰氯、羅丹明、氨基-甲基香豆素(amca)、曙紅、藻紅、cascadeoregon芘、麗絲胺(lissamine)、呫噸(xanthenes)、吖啶、噁嗪、藻紅蛋白、鑭系元素離子的大環(huán)螯合劑如量子染料tm、熒光能量轉(zhuǎn)移染料諸如噻唑橙-乙啡啶異源二聚體、以及花青染料cy3、cy3.5、cy5、cy5.5以及cy7。其他特異性熒光標(biāo)記的實(shí)例包括3-羥基芘5,8,10-三磺酸、5-羥基色胺(5-ht)、酸性品紅、茜素絡(luò)合酮(alizarincomplexon)、茜紅(alizarinred)、別藻藍(lán)素(allophycocyanin)、氨基香豆素(aminocoumarin)、蒽基硬脂酸酯、astrazon亮紅4g、astrazon橙r、astrazon紅6b、astrazon黃7gll、阿的平(atabrine)、金胺(auramine)、金膦(aurophosphine)、金膦g、bao9(雙氨基苯基噁二唑)、bcecf、硫酸黃連素、雙苯甲酰胺、blancophorffg溶液、blancophorsv、氟硼熒(bodipy)f1、亮sulphoflavinff、鈣黃綠素藍(lán)(calcienblue)、鈣綠(calciumgreen)、calcofluorrw溶液、calcofluor白、calcophor白abt溶液、calcophor白標(biāo)準(zhǔn)溶液、carbostyryl、cascade黃、兒茶酚胺、奎納克林(chinacrine)、coriphosphineo、香豆素-鬼筆環(huán)肽(phalloidin)、cy3.18、cy5.18、cy7、dans(1-二甲基氨基萘5磺酸)、dansa(二氨基萘基磺酸)、丹酰nh-ch3、二氨基苯基噁二唑(dao)、二甲基氨基-5-磺酸、二吡咯亞甲基二氟化硼、二苯基亮黃素7gff、多巴胺、藻紅itc、吖啶橙、fif(甲醛誘導(dǎo)的熒光)、flazo橙、fluo3、熒光胺、fura-2、genacryl亮紅b、genacryl亮黃10gf、genacryl粉3g、genacryl黃5gf、乙醛酸(gloxalicacid)、粒狀藍(lán)、血卟啉(haematoporphyrin)、indo-1、intrawhitecf液體、leucophorpaf、leucophorsf、leucophorws、麗絲胺羅丹明b200(rd200)、熒光黃ch、熒光黃vs、萘紅(magdalared)、marina藍(lán)、maxilon亮黃素10gff、maxilon亮黃素8gff、mps(甲基綠派若寧二苯乙烯)、光輝霉素(mithramycin)、nbd胺、硝基苯并噁二唑(nitrobenzoxadidole)、去甲腎上腺素、核固紅、核黃、nylosan亮黃素e8g、噁二唑、太平洋藍(lán)(pacificblue)、堿性副品紅(pararosaniline)(feulgen)、phorwitear溶液、phorwitebkl、phorwiterev、phorwiterpa、phosphine3r、酞菁染料、藻紅蛋白r、polyazaindacenepontochrome藍(lán)黑、卟啉(porphyrin)、櫻草靈(primuline)、普施安黃(procionyellow)、派若寧、派若寧b、pyrozal亮黃素7gf、氮芥喹吖因(quinacrinemustard)、羅丹明123、羅丹明5gld、羅丹明6g、羅丹明b、羅丹明b200、羅丹明bextra、羅丹明bb、羅丹明bg、羅丹明wt、血清素、sevron亮紅2b、sevron亮紅4g、sevron亮紅b、sevron橙、sevron黃l、sits(櫻草靈)、sits(二苯乙烯異硫磺酸)、二苯乙烯、snarf1、磺基羅丹明bcanc、磺基羅丹明gextra、四環(huán)素、噻嗪紅r、硫磺素s、硫磺素tcn、硫磺素5、thiolyte、thiozol橙、tinopolcbs、真藍(lán)、ultralite、熒光素鈉(uranine)b、uvitexsfc、二甲苯橙以及xritc。熒光標(biāo)記可從多種商業(yè)來源獲得，包括invitrogen，carlsbad，ca；amershampharmaciabiotech，piscataway，nj；molecularprobes，eugene，or；以及researchorganics，cleveland，ohio。在另一方面，第三檢測標(biāo)記還包含寡核苷酸、熒光部分和熒光淬滅部分。在再另一方面，第三檢測標(biāo)記還包含寡核苷酸、連接至寡核苷酸的5'末端的熒光部分和在寡核苷酸探針的3'末端處的熒光淬滅部分。在又另一方面，第三檢測標(biāo)記還包含含有seqidno.：8序列的寡核苷酸。在再另一方面，第三檢測標(biāo)記還包含含有seqidno.：11序列的寡核苷酸。甚至在另一方面，熒光部分包括vic。在又另一方面，熒光淬滅部分為暗淬滅劑。甚至在另一方面，熒光淬滅部分為暗淬滅劑，并且暗淬滅劑為tamra。在另一方面，第四檢測標(biāo)記還包含寡核苷酸、熒光部分和熒光淬滅部分。在再另一方面，第四檢測標(biāo)記還包含寡核苷酸、連接至寡核苷酸的5'末端的熒光部分和在寡核苷酸探針的3'末端處的熒光淬滅部分。在另一方面，第五檢測標(biāo)記還包含寡核苷酸、熒光部分和熒光淬滅部分。在再另一方面，第五檢測標(biāo)記還包含寡核苷酸、連接至寡核苷酸的5'末端的熒光部分和在寡核苷酸探針的3'末端處的熒光淬滅部分。在另一方面，第二擴(kuò)增子的長度大于或等于約50bp。在再另一方面，第二擴(kuò)增子的長度小于或等于約250bp。在又另一方面，第二擴(kuò)增子的長度為約50至約60bp。甚至在另一方面，第二擴(kuò)增子的長度為約50至約70bp。在再另一方面，第二擴(kuò)增子的長度為約50至約80bp。在又另一方面，第二擴(kuò)增子的長度為約50至約90bp。甚至在另一方面，第二擴(kuò)增子的長度為約50至約100bp。在再另一方面，第二擴(kuò)增子的長度為約50至約125bp。在又另一方面，第二擴(kuò)增子的長度為約50至約150bp。甚至在另一方面，第二擴(kuò)增子的長度為約50至約175bp。在再另一方面，第二擴(kuò)增子的長度為約50至約200bp。在又另一方面，第二擴(kuò)增子的長度為約50至約250bp。在另一方面，第三擴(kuò)增子的長度大于或等于約50bp。在再另一方面，第三擴(kuò)增子的長度小于或等于約250bp。在又另一方面，第三擴(kuò)增子的長度為約50至約60bp。甚至在另一方面，第三擴(kuò)增子的長度為約50至約70bp。在再另一方面，第三擴(kuò)增子的長度為約50至約80bp。在又另一方面，第三擴(kuò)增子的長度為約50至約90bp。甚至在另一方面，第三擴(kuò)增子的長度為約50至約100bp。在再另一方面，第三擴(kuò)增子的長度為約50至約125bp。在又另一方面，第三擴(kuò)增子的長度為約50至約150bp。甚至在另一方面，第三擴(kuò)增子的長度為約50至約175bp。在再另一方面，第三擴(kuò)增子的長度為約50至約200bp。在又另一方面，第三擴(kuò)增子的長度為約50至約250bp。在各個(gè)方面，通過與對照靶dna比較來確定第一擴(kuò)增子、第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的濃度。在另一方面，通過與對照靶dna比較來確定第一擴(kuò)增子、第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的濃度，其中對照靶dna為控制合成的靶dna。在再另一方面，控制合成的靶dna包含(ttaggg)m，其中m為15至34的整數(shù)。在又另一方面，控制合成的靶dna包含(ccctaa)m，其中m為15至34的整數(shù)。甚至在另一方面，控制合成的靶dna為seqidno.：12。在另一方面，控制合成的靶dna的長度為至少90個(gè)堿基對。在再另一方面，控制合成的靶dna的長度為至少100個(gè)堿基對。在又另一方面，控制合成的靶dna的長度為至少110個(gè)堿基對。甚至在另一方面，控制合成的靶dna的長度為至少120個(gè)堿基對。在再另一方面，控制合成的靶dna的長度為至少130個(gè)堿基對。在又另一方面，控制合成的靶dna的長度為至少140個(gè)堿基對。甚至在另一方面，控制合成的靶dna的長度為至少150個(gè)堿基對。在再另一方面，控制合成的靶dna的長度為至少160個(gè)堿基對。在又另一方面，控制合成的靶dna的長度為至少170個(gè)堿基對。甚至在另一方面，控制合成的靶dna的長度為至少180個(gè)堿基對。在另一方面，控制合成的靶dna的長度為約90個(gè)堿基對至約200個(gè)堿基對。在又另一方面，控制合成的靶dna為seqidno.：12。在再另一方面，控制合成的靶dna的長度為約100個(gè)堿基對至約200個(gè)堿基對。在又另一方面，控制合成的靶dna的長度為約110個(gè)堿基對至約200個(gè)堿基對。甚至在另一方面，控制合成的靶dna的長度為約120個(gè)堿基對至約200個(gè)堿基對。在再另一方面，控制合成的靶dna的長度為約130個(gè)堿基對至約200個(gè)堿基對。在又另一方面，控制合成的靶dna的長度為約140個(gè)堿基對至約200個(gè)堿基對。甚至在另一方面，控制合成的靶dna的長度為約150個(gè)堿基對至約200個(gè)堿基對。甚至在另一方面，控制合成的靶dna的長度為約175個(gè)堿基對至約200個(gè)堿基對。甚至在另一方面，控制合成的靶dna的長度為約90個(gè)堿基對至約150個(gè)堿基對。在再另一方面，控制合成的靶dna的長度為約90個(gè)堿基對至約125個(gè)堿基對。在又另一方面，控制合成的靶dna的長度為約90個(gè)堿基對至約110個(gè)堿基對。甚至在另一方面，控制合成的靶dna的長度為約90個(gè)堿基對至約175個(gè)堿基對。在另一方面，通過與對照靶dna比較來確定第一擴(kuò)增子、第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的濃度，其中為人基因組dna。在又另一方面，人基因組dna包含獲自男性或女性供體的dna。甚至在另一方面，人基因組dna為男性和女性供體合起來的嵌合組成物，或?yàn)閮H男性或僅女性供體的嵌合組成物。根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。用于pcr的程序廣泛地得以使用和描述(參見，例如美國專利號4,683,195和4,683,202)。簡單地說，雙鏈靶核酸一般是通過在高到足以使鏈變性的溫度下孵育而變性，然后在過量引物的存在下孵育，所述引物與單鏈靶核酸雜交(退火)。dna聚合酶延伸雜交的引物，從而產(chǎn)生靶核酸的新拷貝。使所得雙鏈體變性，并且重復(fù)雜交和延伸步驟。通過在用于互補(bǔ)靶鏈的第二引物的存在下反復(fù)進(jìn)行變性、退火和延伸的步驟，被兩種引物包圍的靶核酸以指數(shù)方式擴(kuò)增。引物延伸步驟的時(shí)間和溫度將取決于聚合酶、被擴(kuò)增的靶核酸的長度和序列組成以及用于擴(kuò)增的引物序列。充分?jǐn)U增靶核酸所需的反復(fù)步驟的數(shù)量將取決于擴(kuò)增的效率。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本公開不受擴(kuò)增過程中所應(yīng)用的時(shí)間、溫度、緩沖條件和擴(kuò)增周期的變化所限制。變性步驟通常是pcr的重復(fù)循環(huán)中的第一步驟并且包括使反應(yīng)加熱至90-98℃，例如91、92、93、94、95、96、97或98℃的變性溫度，持續(xù)1-35秒，優(yōu)選15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34或35秒。變性步驟通過破壞互補(bǔ)堿基之間的氫鍵來解鏈(melt)dna模板，從而產(chǎn)生單鏈dna。退火步驟通常是pcr的重復(fù)循環(huán)中的第二步驟并且包括使溫度降低至45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69或70℃的退火溫度，持續(xù)1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44或45秒，從而使引物組中的引物退火以與靶核酸雜交。退火溫度可以比使用的引物的雙鏈體解鏈溫度tm低約0、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或高至15℃。當(dāng)引物序列非常接近地匹配或在引物的3'末端處與模板序列的補(bǔ)體的一部分相同時(shí)形成穩(wěn)定的dna-dna氫鍵。聚合酶結(jié)合引物-模板雜交體并且開始dna合成。延伸/延長步驟是核酸聚合酶通過以下方式合成與靶核酸鏈互補(bǔ)的新核酸鏈的步驟：添加沿5'至3'方向與靶核酸互補(bǔ)的dntp，使dntp的5'-磷酸基與初期(延伸的)靶核酸鏈的末端處的3'-羥基縮合。延伸時(shí)間取決于使用的核酸聚合酶和待擴(kuò)增的靶核酸的長度。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)規(guī)則(rule-of-thumb)，在其最佳溫度下，核酸聚合酶將聚合高達(dá)成千個(gè)堿基/分鐘。在最佳條件下，即，如果沒有歸因于有限基底或試劑的限制，在每個(gè)延伸步驟下，靶核酸的量是加倍的，從而導(dǎo)致特定靶核酸的指數(shù)級(幾何學(xué))擴(kuò)增。此步驟下的延長溫度取決于使用的核酸聚合酶。例如，taq聚合酶具有其75-80℃下的最佳活性溫度，并且通常對這種酶使用72℃的溫度pcr還可包括最終的延長步驟。在最后pcr循環(huán)之后，可以在68、69、70、71、72、73、74或75℃的最終延長溫度下進(jìn)行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15分鐘的最終延伸，以確保任何剩余的單鏈dna被完全拷貝以形成雙鏈dna產(chǎn)物。pcr還可包括信號采集步驟，其中可以確定檢測標(biāo)記的量。信號采集步驟可以在擴(kuò)增靶序列的過程中進(jìn)行。在一些方面，信號采集步驟緊隨變性步驟、退火步驟和延長步驟。信號采集步驟在信號采集溫度下進(jìn)行。信號采集溫度可以為任何溫度并且可在pcr期間的一個(gè)或多個(gè)時(shí)間處進(jìn)行。當(dāng)兩個(gè)或更多個(gè)靶核酸的拷貝數(shù)如本文所述那樣確定時(shí)，信號采集溫度應(yīng)當(dāng)是不同的，以便檢測每種擴(kuò)增子的檢測標(biāo)記。例如，對于兩個(gè)或更多個(gè)信號采集溫度，應(yīng)當(dāng)選擇溫度使得第一信號采集溫度低于第一擴(kuò)增子的tm并且第二信號采集溫度高于所述第一tm并且低于第二擴(kuò)增子的tm。兩個(gè)或更多個(gè)信號采集溫度之間的差異可以為3、4、5、6、7、8、9或10℃。信號采集步驟可以在采集溫度下進(jìn)行1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15秒。pcr還可包括最終的保溫(hold)步驟。最終的保溫步驟可以在約4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15℃的最終的保持溫度下持續(xù)不定時(shí)間?？梢圆捎米罱K的保溫步驟以短期儲存反應(yīng)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)還可包括連續(xù)循環(huán)步驟。每個(gè)連續(xù)循環(huán)步驟可包括如上所述的一個(gè)或多個(gè)pcr步驟。每個(gè)連續(xù)循環(huán)步驟還可稱之為pcr的“循環(huán)”。對于pcr的每個(gè)循環(huán)，每個(gè)連續(xù)循環(huán)步驟可以在相同或不同的溫度下進(jìn)行。pcr可以在改變pcr的一個(gè)或多個(gè)循環(huán)的退火溫度的情況下運(yùn)行。例如，pcr可以運(yùn)行總共40個(gè)循環(huán)，其中第一循環(huán)步驟的退火溫度是相同的，然后第二循環(huán)步驟的退火溫度是升高的并且第三循環(huán)步驟的退火溫度是降低的。本文所述的方法允許通過針對每種擴(kuò)增子的離散信號，即多重信號檢測，定量一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中的多種擴(kuò)增子。在各個(gè)方面，收集來自每個(gè)循環(huán)中的多種擴(kuò)增子的信號包括使用多種熒光團(tuán)，所述熒光團(tuán)通過pcr儀器的光學(xué)系統(tǒng)在不同波長下被檢測到。在另外的方面，所公開的方法利用雙鏈dna結(jié)合或嵌入染料，例如溴化乙錠、green或染料，和針對第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子(和第四擴(kuò)增子、第五擴(kuò)增子等，如果待擴(kuò)增的是三種以上的擴(kuò)增子的話)的探針。探針是具有報(bào)告染料和淬滅染料的寡核苷酸，所述報(bào)告染料共價(jià)連接至寡核苷酸的一端，所述淬滅染料共價(jià)連接至寡核苷酸的另一端。在各個(gè)方面，探針是具有連接至5'末端的報(bào)告染料和連接至3'末端的淬滅染料的寡核苷酸。在另一方面，反應(yīng)中的所有擴(kuò)增子可與dna結(jié)合或嵌入染料產(chǎn)生信號，因此，第一擴(kuò)增子應(yīng)當(dāng)在第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子(和第四擴(kuò)增子、第五擴(kuò)增子等，如果待擴(kuò)增的是三種以上的擴(kuò)增子的話)達(dá)到循環(huán)閾值的前至少五個(gè)擴(kuò)增達(dá)到循環(huán)閾值。本文所述的方法還可使用用于通過針對每種擴(kuò)增子的分散信號定量每個(gè)擴(kuò)增循環(huán)中的多種擴(kuò)增子的其他方法進(jìn)行。在另一方面，針對每種擴(kuò)增子的第三引物可以連接至淬滅染料，并且淬滅劑在延伸反應(yīng)過程中通過反應(yīng)中的聚合酶裂解(即q-pcr探針)。在再另一方面，熒光團(tuán)可連接至與擴(kuò)增子雜交的寡核苷酸并且當(dāng)與dna鏈雜交時(shí)不淬滅(即分子信標(biāo))，并且可針對每種擴(kuò)增子使用不同的分子信標(biāo)。在又另一方面，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)可包含dna結(jié)合或嵌入熒光染料。當(dāng)延伸循環(huán)結(jié)束所有擴(kuò)增子是雙鏈時(shí)收集dna結(jié)合或嵌入熒光染料的信號。在各個(gè)方面，本文所述方法呈現(xiàn)允許單獨(dú)收集來自多種擴(kuò)增子的信號的策略。在另一方面，第一循環(huán)的循環(huán)閾值(ct)在來自第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的信號還處于基線時(shí)的較早循環(huán)處收集。第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子(和第四擴(kuò)增子、第五擴(kuò)增子等，如果待擴(kuò)增的是三種以上的擴(kuò)增子的話)的ct在大大高于第一擴(kuò)增子的解鏈溫度(tm)的溫度下收集，使得第一擴(kuò)增子為單鏈的并使其信號成為基線。引物被設(shè)計(jì)使得兩種擴(kuò)增子較小，并且第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子可以是富gc的，從而升高其tm。以高豐度和低豐度物質(zhì)出現(xiàn)在生物樣品中并且拷貝數(shù)范圍沒有重疊的模板對是用于這種方法的天然靶標(biāo)通過本領(lǐng)域中熟知的方法檢測和分析擴(kuò)增產(chǎn)物。擴(kuò)增的產(chǎn)物可以在產(chǎn)物分離和/或純化之后進(jìn)行分析，或通過直接測定擴(kuò)增反應(yīng)中形成的產(chǎn)物進(jìn)行分析。對于檢測，產(chǎn)物可以使用熒光化合物，例如溴化乙錠、green或或通過與標(biāo)記核酸探針雜交來間接地鑒定。另選地，在擴(kuò)增反應(yīng)中使用標(biāo)記的引物或標(biāo)記的核苷酸來標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物。標(biāo)記包括任何可檢測的部分，包括熒光標(biāo)記、放射性標(biāo)記、電子標(biāo)記以及間接標(biāo)記諸如生物素或地高辛(digoxigenin)。適于進(jìn)行本公開的qpcr反應(yīng)的儀器可獲自許多商業(yè)來源(abiprism7700，appliedbiosystems，carlsbad，ca；lightcycler480，rocheappliedscience，indianapolis，in；ecoreal-timepcrsystem，illumina，inc.，sandiego，ca；robocycler40，stratagene，cedarcreek，tx)。當(dāng)使用實(shí)時(shí)定量pcr來檢測和測量擴(kuò)增產(chǎn)物時(shí)，各種算法被用來計(jì)算樣本中的靶端粒的數(shù)目。(例如，參見abiprism7700軟件版本1.7；lightcycler軟件版本3)。定量可以涉及使用具有已知拷貝數(shù)的端粒核酸的標(biāo)準(zhǔn)樣品以及從標(biāo)準(zhǔn)物的對數(shù)和循環(huán)閾值(ct)生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線。一般來說，ct是pcr循環(huán)或部分pcr循環(huán)，其中由擴(kuò)增產(chǎn)物產(chǎn)生的熒光是基線熒光之上的若干個(gè)偏差。2.靶樣品靶樣品可來源于具有或疑似具有靶分子的任何來源。靶樣品可含有例如靶分子諸如核酸。靶樣品可以是靶核酸的來源。靶樣品可包含天然靶核酸、化學(xué)合成的靶核酸或兩者。靶樣品可以是例如來自一種或多種細(xì)胞、組織或體液(諸如血液、尿液、精液、淋巴液、腦脊液或羊水)或其他生物樣品(諸如組織培養(yǎng)細(xì)胞、口腔拭子、漱口液、糞便、組織切片、抽吸式活檢和考古用樣品諸如骨或木乃伊化的組織)的樣品?？墒褂玫陌袠悠返念愋桶ㄑ簶悠?、尿液樣品、精液樣品、淋巴液樣品、腦脊液樣品、羊水樣品、生物活檢樣品、針吸活檢樣品、癌癥樣品、腫瘤樣品、組織樣品、細(xì)胞樣品、細(xì)胞裂解液樣品、粗制細(xì)胞裂解液樣品、法醫(yī)用樣品、考古用樣品、感染樣品、醫(yī)院內(nèi)感染樣品、生產(chǎn)樣品、藥物制劑樣品、生物分子生產(chǎn)樣品、蛋白質(zhì)制劑樣品、脂質(zhì)制劑樣品和/或碳水化合物制劑樣品。3.靶核酸核酸樣品可來源于具有或疑似具有靶核酸的任何來源。核酸樣品是核酸分子和核酸序列諸如靶核酸的來源。核酸樣品可含有rna或dna或兩者。靶核酸還可以是cdna。此外，mrna可反轉(zhuǎn)錄形成cdna，所述cdna然后可用作用于本文所述的方法中的靶核酸。例如，天然雙鏈狀態(tài)下的染色體dna可以從如以上本文所述的靶樣品中獲得?？梢允褂卯a(chǎn)生高分子量基因組dna(大于20kb)的任何dna純化方法包括苯酚/氯仿萃取、氯化銫梯度和使用硅膠膜結(jié)合技術(shù)的商品試劑盒、選擇性洗滌劑介導(dǎo)的dna沉淀方法來獲得染色體dna。dna純化商品試劑盒的實(shí)例包括agencourtdnadvance和agencourtgenfind(beckmancoulter)、qiaamp試劑盒(q1agen，valencia，california)、qiaamp血液試劑盒(q1agen)、qiaampffpe組織試劑盒q1agen)、ahprep試劑盒(qtagen)、puregene試劑盒(qtagen)、purelinkandgenecatcher(fnvitrogen)和wizard(promega)?！鞍泻怂帷被颉鞍行蛄小币庵冈陔p鏈或單鏈核酸上的核酸序列?！昂怂帷被颉肮押塑账帷被蛟诒疚闹械恼Z法等同物意指共價(jià)連接在一起的至少兩個(gè)核苷酸。本發(fā)明的核酸通常含有磷酸二酯鍵，但是在一些情況下，包括的核酸類似物可以具有替代骨架，包括例如磷酰胺(beaucage，s.l.等人，tetrahedron49：1925-63(1993)和其中的參考文獻(xiàn)；letsinger，r.l.等人，j.org.chem.35：3800-03(1970)；sprinzl，m.等人，eur.j.biochem.81：579-89(1977)；letsinger，r.l.等人，nucleicacidsres.14:3487-99(1986)；sawai等人，chem.lett.805(1984)；letsinger，r.l.等人，j.am.chem.soc.110：4470(1988)；以及pauwels等人，chemicascripta26:141-49(1986))、硫代磷酸酯(mag，m.等人，nucleicacidsres.19:1437-41(1991)；和美國專利號5,644,048)、二硫代磷酸酯((briu等人，j.am.chem.soc.111:2321(1989))、o-甲基亞磷酰胺鍵合(參見eckstein，oligonucleotidesandanalogues：apracticalapproach，oxforduniversitypress，1991)和肽核酸骨架和鍵合(egholm，m.，am.chem.soc.114:1895-97(1992)；meier等人，chem.int.ed.engl.31:1008(1992)；egholm，m.，nature365：566-68(1993)；carlsson，c.等人，nature380：207(1996)，所有文獻(xiàn)以引用的方式并入)。其他類似核酸包括具有下述骨架的那些：正性骨架(dempcy，r.o.等人，proc.natl.acad.sci.usa92:6097-101(1995))；非離子骨架(美國專利號5,386,023；5,637,684；5,602,240；5,216,141；和4,469,863；kiedrowshi等人，angew.chem.intl.ed.english30:423(1991)；letsinger，r.l.等人，j.am.chem.soc.110：4470(1988)；letsinger，r.l.等人，nucleoside&nucleotide13：1597(1994)；第2和3章，ascsymposiumseries580，"carbohydratemodificationsinantisenseresearch"，y.s.sanghui和p.dancook編；mesmaeker等人，bioorganic&medicinalchem.lett.4：395(1994)；jeffs等人，j.biomolecularnmr34:17(1994))和非核糖骨架，包括描述于美國專利號5,235,033和5,034,506，和第6和7章，ascsymposiumseries580，"carbohydratemodificationsinantisenseresearch"，y.s.sanghui和p.dancook編中所述的那些核酸。含有一個(gè)或多個(gè)碳環(huán)糖的核酸也包括于核酸的一個(gè)定義內(nèi)(參見jenkins等人，chem.soc.rev.169-176(1995))，所有文獻(xiàn)均以引用的方式并入本文。力求測定、鑒定、檢測的或力求確定其拷貝數(shù)的任何核酸序列可用作靶核酸序列。在本文所述的方法中，可存在多于一種的靶核酸序列。在存在兩種靶核酸序列的事件中，將它們分別稱為第一靶核酸序列和第二靶核酸序列。在存在三種靶核酸序列的事件中，將它們分別稱為第一靶核酸序列、第二靶核酸序列和第三靶核酸序列，以此類推。本文所述的方法中描述的靶核酸可具有相同、類似或不同的拷貝數(shù)。例如，第一靶核酸是多個(gè)拷貝數(shù)的核酸序列并且第二靶核酸是單拷貝基因。例如，第一靶核酸可以是端粒重復(fù)序列、mtdna、rdna或alu重復(fù)dna。例如，第一靶核酸可以是從高拷貝數(shù)mrna反轉(zhuǎn)錄的cdna，而第二靶核酸可以是從低拷貝數(shù)mrna反轉(zhuǎn)錄的cdna。單拷貝基因是每個(gè)單倍體基因組有單個(gè)拷貝的基因。因此單拷貝基因在每一細(xì)胞中有兩個(gè)拷貝。單拷貝基因包括但不限于rna酶p基因、β2-微球蛋白基因、白蛋白基因、甘油醛3-磷酸脫氫酶(gapdh)基因、人端粒酶反轉(zhuǎn)錄酶、β-肌動(dòng)蛋白(actb)基因和β-球蛋白基因。端粒是在真核生物的線性染色體的末端發(fā)現(xiàn)的特化結(jié)構(gòu)。端粒通常由短的串聯(lián)重復(fù)序列組成，帶有對這種生物體特有的端粒酶特異的重復(fù)序列單元。多種生物體的端粒重復(fù)序列是已知的。對于脊椎動(dòng)物、植物、某些類型的霉菌以及一些原生動(dòng)物而言，所述序列是完全的重復(fù)序列。例如，在人序列ttaggg(seqidno.：13)中，出現(xiàn)的序列重復(fù)單元是(ttaggg)n，其中n可以在1-1000或更多的范圍內(nèi)。在其他生物體中，重復(fù)序列是不規(guī)則的，諸如釀酒酵母菌(saccharomycescerevisiae)的重復(fù)序列，其中所述序列是可變的g1-3t/c1-3a。在一些真核生物體中，端粒不含短的串聯(lián)重復(fù)序列，但具有用作端粒的序列元件。例如，在黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)中，端粒是逆轉(zhuǎn)錄轉(zhuǎn)座子元件het-a和tart的復(fù)合物，而在岡比亞按蚊(mosquitoanophelesgambiae)中，端粒是一系列復(fù)雜串聯(lián)重復(fù)序列。出于本發(fā)明的目的，不同結(jié)構(gòu)的端粒被涵蓋在本發(fā)明的范圍內(nèi)。除所述重復(fù)序列之外，一些端粒的3'末端包含單鏈區(qū)，對于人類所述單鏈區(qū)定位于富含g的鏈上。單鏈由(ttaggg)n重復(fù)序列組成，其中n為約50，但n可以明顯小于或多于50。如本文所用，3'單鏈區(qū)的長度也可與死亡率或疾病風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)聯(lián)。通常，dna復(fù)制機(jī)制以5'至3'方向作用，并且通過使用在鏈合成后分解的短rna引物，后隨鏈的合成不連續(xù)地發(fā)生。因?yàn)閷ο惹氨籸na引物占有的區(qū)域的完整合成不能獲得線性dna的3'末端處序列，因此線性染色體的3'端區(qū)不被復(fù)制。這種“末端復(fù)制問題”通過端粒酶，一種端粒特異性核糖核蛋白反轉(zhuǎn)錄酶，的作用得以解決。端粒酶具有充當(dāng)延伸端粒的3'末端的模板的不可或缺的rna組分。通過端粒酶活性引起的反復(fù)延伸導(dǎo)致從端粒酶結(jié)合的rna模板復(fù)制的端粒重復(fù)序列的產(chǎn)生。在由端粒酶引起的延長后，由dna聚合酶引起的后隨鏈合成完成雙鏈端粒結(jié)構(gòu)的形成。在正常的人體細(xì)胞中，端粒酶不表達(dá)或者低水平表達(dá)。因此，每次細(xì)胞分裂端?？s短約50-200bp，直到該細(xì)胞達(dá)到復(fù)制性衰老，在復(fù)制性衰老時(shí)細(xì)胞失去增殖能力。細(xì)胞復(fù)制的有限能力通常被稱為hayflick限制，并且可以為細(xì)胞提供一種對細(xì)胞分裂進(jìn)行計(jì)數(shù)和調(diào)節(jié)細(xì)胞發(fā)育的計(jì)數(shù)機(jī)制，即有絲分裂鐘。相應(yīng)地，在缺乏端粒酶活性的細(xì)胞中端粒酶的活化，例如通過由組成型逆轉(zhuǎn)錄病毒啟動(dòng)子表達(dá)端粒酶，或內(nèi)源性聚合酶的活化，使細(xì)胞保持增殖能力并且導(dǎo)致細(xì)胞無限增殖。有趣地，具有非常短的端粒的細(xì)胞常常被延伸。這個(gè)現(xiàn)象表明，端粒酶防止短端粒進(jìn)一步縮短，同時(shí)延長已經(jīng)降到某一閾值長度下的端粒。因此，當(dāng)端粒在某個(gè)長度時(shí)，端粒酶活性的存在似乎不是必要的，但是當(dāng)長度降到臨界極限下時(shí)，端粒酶活性對維持端粒完整性變得至關(guān)重要。在本文所述的方法中，可以確定細(xì)胞中的單條染色體的端粒的豐度或平均長度。在一方面，測定單個(gè)細(xì)胞的端粒的平均拷貝數(shù)或平均端粒拷貝數(shù)。在另一實(shí)施方案中，測定細(xì)胞群體的端粒的平均拷貝數(shù)或平均端?？截悢?shù)。端粒拷貝數(shù)的變化是端?？截悢?shù)的增加或減少，尤其是平均端?？截悢?shù)的增加或減少。該變化可以與具體的時(shí)間點(diǎn)相關(guān)，即將生物體在時(shí)間t1的端?？截悢?shù)與在稍晚的時(shí)間(t2)的端粒長度比較。也可以將端?？截悢?shù)的變化或差異與具體細(xì)胞群體或生物群體的平均端?？截悢?shù)相比較。在一些方面，也可以將端?？截悢?shù)的變化或差異與未罹患疾病病狀的群體的平均端?？截悢?shù)相比較。在某些實(shí)施方案中，對不同時(shí)間段下存在的群體來測定端粒拷貝數(shù)的變化。盡管，可以確定所有真核生物的端粒拷貝數(shù)，但是在一方面，確定的是脊椎動(dòng)物的端粒拷貝數(shù)，所述脊椎動(dòng)物包括但不限于兩棲動(dòng)物、鳥類和哺乳動(dòng)物例如嚙齒類動(dòng)物、有蹄類動(dòng)物和靈長類動(dòng)物，尤其是人類。也可以確定壽命具有期望特質(zhì)或壽命和疾病的易感性與端粒長度相關(guān)聯(lián)的生物體的端粒拷貝數(shù)。在另一方面，為了評估與這些生物體中改變的端粒完整性相關(guān)聯(lián)的短期或長期死亡風(fēng)險(xiǎn)的概率或疾病易感性，可以測定克隆生物體的端粒。端粒核酸序列(諸如上述那些)可用作靶序列。端粒核酸序列或任何其他重復(fù)或非重復(fù)靶核酸可以是任何長度，應(yīng)理解越長的序列特異性越高。在一些實(shí)施方案中，可能希望將樣品核酸分裂或裂解成100-10,000個(gè)堿基對的片段。在一方面，可以使用大致上500bp的片段。可以任意種本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的方式進(jìn)行分裂或裂解，所述方法包括機(jī)械、化學(xué)和酶促方法。因此，可使核酸經(jīng)歷超聲、弗氏壓碎器(frenchpress)、剪切或用核酸酶(例如dna酶、限制性內(nèi)切酶、rna酶等)或化學(xué)裂解劑(例如，酸/哌啶、胼/哌啶、鐵-edta復(fù)合物、1,10-菲咯啉-銅復(fù)合物等)處理。dna的分裂可減少可阻礙準(zhǔn)確測量靶序列長度或豐度的二級結(jié)構(gòu)形成。在各個(gè)方面，所公開的方法還包括在使第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸分別與第一引物組、第二引物組和第三引物組接觸之前獲得染色體dna樣品的步驟；并且其中染色體dna樣品含有或包含第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸的至少一部分。在另一方面，染色體dna獲自固體、液體、半固體或氣體樣品。在再另一方面，染色體dna獲自液體樣品；并且其中液體樣品來自血液、唾液、尿液、血漿、血清、腦脊液(“csf”)、痰或支氣管肺泡灌洗液。在又另一方面，液體樣品來自血液、血清或血漿。甚至在另一方面，染色體dna獲自固體樣品；并且其中固體樣品來自組織樣品。在再另一方面，組織樣品為組織生物活檢。在又另一方面，組織生物活檢來自肺、肌肉或皮膚。甚至在另一方面，染色體dna獲自骨髓。在再另一方面，染色體dna獲自脊椎動(dòng)物。在又另一方面，脊椎動(dòng)物為哺乳動(dòng)物。甚至在另一方面，哺乳動(dòng)物為靈長類動(dòng)物。在再另一方面，靈長類動(dòng)物為人。在其他方面，染色體dna可來自非脊椎動(dòng)物，例如來自植物。在各個(gè)方面，所公開的方法還包括在使第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸分別與第一引物組、第二引物組和第三引物組接觸之前獲得染色體dna樣品的步驟；并且其中染色體dna樣品包含第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸。在另一方面，所公開的方法還包括在使第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸分別與第一引物組、第二引物組和第三引物組接觸之前從血液、唾液、尿液、血漿、血清、腦脊液(“csf”)、痰或支氣管肺泡灌洗液獲得染色體dna樣品的步驟；并且其中染色體dna樣品包含第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸；并且其中獲得了染色體dna。在另一方面，所公開的方法還包括在使第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸分別與第一引物組、第二引物組和第三引物組接觸之前從分離自血液、唾液、尿液、血漿、血清、腦脊液(“csf”)、痰或支氣管肺泡灌洗液的一種或多種細(xì)胞類型獲得染色體dna樣品的步驟；其中染色體dna樣品包含第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸；并且其中獲得染色體dna；并且其中分離的細(xì)胞類型包括循環(huán)腫瘤細(xì)胞、循環(huán)干細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、粒細(xì)胞、骨髓細(xì)胞、嗜中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和白細(xì)胞。在另一方面，所公開的方法還包括在使第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸分別與第一引物組、第二引物組和第三引物組接觸之前從血液分離循環(huán)dna片段樣品的步驟；并且其中循環(huán)dna片段樣品包含第一靶核酸、第二靶核酸和第三靶核酸；所公開的方法的端粒產(chǎn)物可以由單端粒、單染色體、來自單一細(xì)胞的染色體群體或來自多個(gè)細(xì)胞的染色體群體產(chǎn)生。4.聚合酶在本文所述的方法中，需要擴(kuò)增酶。例如，在使引物與靶核酸接觸之后，可以用擴(kuò)增酶處理反應(yīng)。擴(kuò)增酶通常是聚合酶，諸如dna聚合酶。本領(lǐng)域中熟知多種合適的聚合酶，包括但不限于taqdna聚合酶、klentaq、tfl聚合酶、dynazyme等。通常，所有聚合酶均適用于本發(fā)明。在一方面，因?yàn)槭褂镁哂袕?qiáng)3'至5'核酸外切酶活性的聚合酶傾向于去除錯(cuò)配的3'端核苷酸，但在一些應(yīng)用中需要所述錯(cuò)配的3'端核苷酸阻止或延緩引物二聚體擴(kuò)增，并且在其他應(yīng)用中需要所述錯(cuò)配的3'端核苷酸進(jìn)行等位基因特異擴(kuò)增，因此聚合酶是缺少3'至5'核酸外切酶活性的熱穩(wěn)定聚合酶或被工程化為具有減弱或無功能性的3'至5'核酸外切酶活性的聚合酶(例如，pfu(exo-)、vent(exo-)、pyra(exo-)等)?？捎糜谧罴训匮由祀s交引物的聚合酶混合物也可適用。在另一方面，對本發(fā)明有用的聚合酶被制成僅在適合擴(kuò)增的溫度下變得有活性。在擴(kuò)增溫度下失去活性的聚合酶抑制抗體的存在或?qū)⑺雒父綦x為使其不可用直到達(dá)到擴(kuò)增溫度時(shí)的形式都是合適的。這些聚合酶制劑使得可在單個(gè)反應(yīng)容器中混合所有組分而防止引發(fā)非靶核酸序列。此外，本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，各種試劑可以被添加到反應(yīng)以增加聚合酶的持續(xù)合成能力、穩(wěn)定聚合酶從而避免失活、減少引物的非特異性雜交或增加復(fù)制效率。此類添加劑包括但不限于二甲基亞砜、甲酰胺、乙酰胺、甘油、聚乙二醇或蛋白制劑諸如大腸桿菌單鏈dna結(jié)合蛋白、t4基因32蛋白、牛血清白蛋白、明膠等。在另一方面，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以使用多種核苷酸類似物進(jìn)行特定類型序列的擴(kuò)增，例如富含gc的序列或重復(fù)序列。這些類似物包括但不限于c7-dgtp、羥甲基-dutp、ditp、7-deaza-dgtp等。5.引物在一些方面，可以設(shè)計(jì)引物以除了一個(gè)構(gòu)型之外的所有構(gòu)型阻滯引物引發(fā)靶核酸延伸。例如，可以將引物組中的引物之一設(shè)計(jì)成通過在引物的3'末端創(chuàng)建錯(cuò)配堿基而阻滯引物引發(fā)靶核酸延伸。通過設(shè)計(jì)和利用這種引物，所述引物仍然能與其互補(bǔ)序列雜交；然而，其將僅以單一構(gòu)型引發(fā)dna合成，因此，可預(yù)測擴(kuò)增子大小并且因此可預(yù)測擴(kuò)增子的tm。例如，本文公開了這樣的引物和引物組，其中，第一引物組的一種引物包含與引物的3'末端相鄰的至少一個(gè)核苷酸，其中所述核苷酸與靶核酸是錯(cuò)配的、不互補(bǔ)的，但與引物組中另一種引物的3'末端的核苷酸互補(bǔ)。本文還公開了這樣的引物和引物組，其中，第一引物組的一種引物包含與引物的3'末端相鄰的至少一個(gè)核苷酸，其中所述核苷酸與靶核酸是錯(cuò)配的、不互補(bǔ)的，但與引物組中另一種引物的3'端核苷酸互補(bǔ)，其中所述引物組的含有錯(cuò)配的引物的延伸產(chǎn)物可以與所述引物組中的另一種引物雜交，使得所述另一種引物可引發(fā)沿所述延伸產(chǎn)物的dna合成。在一些方面，可使用所述方法來評估雙鏈體dna的具體鏈(例如染色體的“c”鏈或“g”鏈)上的端粒長度或豐度。為了確保阻滯引物將僅以單一、特異性構(gòu)型引發(fā)，可以對包括阻滯引物的引物組進(jìn)行設(shè)計(jì)以使得所述引物組的引物在阻滯引物中存在的錯(cuò)配堿基的區(qū)域上以完全互補(bǔ)方式重疊?？梢赃M(jìn)行這種設(shè)計(jì)以便阻止引物二聚體形成并且使兩種引物彼此引發(fā)的能力最小化。當(dāng)靶核酸序列是包含多個(gè)重復(fù)序列的序列諸如在端粒中發(fā)現(xiàn)的重復(fù)序列(端粒序列)時(shí)，可以利用這種設(shè)計(jì)。本文他處描述了這種方法的實(shí)例，包括下文的實(shí)施例。如本文所述，用于直接擴(kuò)增端粒重復(fù)序列的引物可以包含與靶核酸的第一單鏈雜交的第一引物，以及與靶核酸的第二單鏈雜交的第二引物，其中第一鏈和第二鏈?zhǔn)谴篌w上互補(bǔ)的。當(dāng)引物與它們各自的鏈雜交時(shí)，引物能夠通過聚合酶進(jìn)行引物延伸。即，與靶核酸雜交的引物具有與靶核酸上的核苷酸殘基互補(bǔ)的3'端核苷酸殘基，使得引物可通過聚合酶延伸。選擇的引物是與重復(fù)區(qū)域的重復(fù)單元互補(bǔ)的。例如，可以改變至少一種引物的至少一個(gè)核苷酸殘基以與所述引物雜交的至少一個(gè)重復(fù)單元的核苷酸殘基產(chǎn)生錯(cuò)配，其中當(dāng)引物彼此雜交時(shí)，所改變的核苷酸殘基還與其他引物的3'端核苷酸殘基產(chǎn)生錯(cuò)配。錯(cuò)配的包含阻止或限制了引物延伸以及引物-引物雜交體(引物二聚體)。用于直接擴(kuò)增端粒重復(fù)序列的引物組可以包括這樣的引物組，其中改變第一引物的至少一個(gè)核苷酸殘基以在改變的殘基與所述引物雜交的第一鏈的至少一個(gè)重復(fù)單元的核苷酸殘基之間產(chǎn)生錯(cuò)配，其中當(dāng)?shù)谝灰锖偷诙锉舜穗s交時(shí)，所改變的核苷酸殘基還與第二引物的3'端核苷酸殘基產(chǎn)生錯(cuò)配。所改變的核苷酸殘基可以是3'端核苷酸的一個(gè)或多個(gè)核苷酸殘基，以使得當(dāng)所改變的引物與靶核酸雜交時(shí)，聚合酶進(jìn)行有效的延伸。例如，所改變的核苷酸殘基可以是3'端核苷酸的至少1個(gè)核苷酸殘基、至少2個(gè)核苷酸殘基或至少3個(gè)核苷酸殘基，以使得當(dāng)所改變的引物與靶核酸雜交時(shí)，聚合酶進(jìn)行有效的延伸。如在本文他處討論的，可以將引物組的引物設(shè)計(jì)成具有類似的解鏈溫度(“tm”)以限制不需要的擴(kuò)增產(chǎn)物的產(chǎn)生并允許在單個(gè)反應(yīng)體積中擴(kuò)增和檢測若干個(gè)靶核酸。此外，由于各種生物體的端粒具有不同的重復(fù)單元序列，因此擴(kuò)增特定生物體的端粒將采用對每個(gè)不同生物體的重復(fù)單元特異的引物。人端粒序列在本文用于舉例說明本發(fā)明用于直接擴(kuò)增并定量串聯(lián)重復(fù)的核酸序列的實(shí)施，但本發(fā)明不限于所公開的具體實(shí)施方案。還公開了使所得擴(kuò)增子的解鏈溫度(tm)提高至本文所述的方法的其他擴(kuò)增子的解鏈溫度之上的引物。這些引物可以被稱作包含“gc-鉗”的引物。“gc-鉗”通常是指在引物3’末端的最后5個(gè)堿基內(nèi)g或c堿基的存在，其由于g和c堿基更強(qiáng)的結(jié)合，而有助于促進(jìn)在3’末端處的特異性結(jié)合。通常，在引物3’末端的最后5個(gè)堿基中應(yīng)當(dāng)避免多于3個(gè)g'或c'。然而，在本文所述的方法中，包含“gc-鉗”的引物是包含5’標(biāo)簽序列(gc-鉗)的引物，所述5’標(biāo)簽序列賦予所得pcr產(chǎn)物(擴(kuò)增子)比在沒有g(shù)c-鉗的情況下的解鏈溫度更高的解鏈溫度。包含“gc-鉗”的引物的5’標(biāo)簽序列在引物序列的5’末端上包含gc-鉗，所述gc-鉗與靶核酸序列的任何部分都不互補(bǔ)。“gc-鉗”是可連接到引物的5’末端以提高擴(kuò)增子的解鏈溫度的一連串g和c核苷酸。gc鉗可以是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30個(gè)或更多個(gè)核苷酸長。gc鉗也可以稱為富含gc的區(qū)域或富含gc的標(biāo)簽。在本文所述的方法中可以使用gc-鉗來提高一種擴(kuò)增子的tm。通過提高擴(kuò)增子的tm，可在高至足以使其他擴(kuò)增子完全解鏈的溫度下采集熒光信號，因此使得可在兩個(gè)或更多個(gè)不同的溫度下采集兩個(gè)或更多個(gè)不同擴(kuò)增子的熒光信號?？蓪c-鉗引物進(jìn)行設(shè)計(jì)以用于同一個(gè)擴(kuò)增反應(yīng)中，由此使得不同引物上的gc-鉗彼此是不相同的，以便防止能導(dǎo)致擴(kuò)增反應(yīng)停止的發(fā)夾形成或引物二聚體。由于與靶核酸雜交的引物必須能夠進(jìn)行引物延伸，因此對第一引物和第二引物的改變必須是在重復(fù)單元的非互補(bǔ)核苷酸上。因此，在一方面，當(dāng)?shù)谝灰锖偷诙锒及淖兊臍埢鶗r(shí)，所述改變在與重復(fù)單元相鄰的核苷酸位置處。在另一方面，所述改變位于不與重復(fù)單元相鄰的核苷酸位置上。一般來講，在相鄰核苷酸位置處的錯(cuò)配提供所改變的核苷酸與3'端核苷酸之間最大數(shù)量的配對堿基或互補(bǔ)殘基，這可能對有效地?cái)U(kuò)增短的重復(fù)序列(即3-6bp重復(fù)序列)是重要的。引物可以被設(shè)計(jì)成與重復(fù)序列大體上互補(bǔ)。在一些方面，第一引物可含有與重復(fù)靶序列互補(bǔ)的三個(gè)重復(fù)序列并且可以相應(yīng)地將多個(gè)錯(cuò)配引入到第一引物中。在另一方面，第二引物還可被設(shè)計(jì)成含有關(guān)于重復(fù)序列的錯(cuò)配，但是其被設(shè)計(jì)成使得不存在與第一引物的前幾個(gè)核苷酸(例如5-7個(gè)核苷酸)的錯(cuò)配。因此，可使用上述的第一引物和第二引物擴(kuò)增限定長度的擴(kuò)增子。因此，產(chǎn)生的擴(kuò)增子將是引物1加引物2減去2種引物之間的重疊的長度總和。這種策略排除了原始設(shè)計(jì)中產(chǎn)生的多種擴(kuò)增子長度(cawthonr.m.(2002).nucleicacidsres.30，e47.doi:10.1093/nar/30.10.e47)，引物與靶核酸的互補(bǔ)性不需要是完全的。在各個(gè)方面，可使用非完全互補(bǔ)序列來避免引物二聚體。因此，所謂的“互補(bǔ)”或“大體上互補(bǔ)”在本文中意指探針與靶序列足夠互補(bǔ)以在正常反應(yīng)條件下雜交，但不產(chǎn)生假陽性信號諸如引物二聚體。只要與完全互補(bǔ)的差異不足以完全阻止雜交，那么這種差異就是可允許的。然而，如果改變或突變的數(shù)量足以使得在最低嚴(yán)格度雜交條件(如下文所定義的)下都不發(fā)生雜交，那么所述序列就與靶序列不互補(bǔ)。盡管引物通常是單鏈的，但是本文描述的核酸可以是單鏈或雙鏈(如所指明的)，或包含雙鏈或單鏈序列的部分。核酸可以是dna、rna或雜交體，在所述雜交體中核酸包含脫氧核糖核苷酸和核糖核苷酸的任意組合以及堿基(包括尿嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶、胞嘧啶、鳥嘌呤、黃嘌呤、次黃嘌呤、異胞嘧啶、異鳥嘌呤、肌苷等)的任意組合。如本文所用，術(shù)語“核苷”包括核苷酸以及核苷和核苷酸類似物，和修飾核苷諸如氨基修飾核苷。另外，“核苷”包括非天然存在的類似結(jié)構(gòu)。因此，例如，各自含有堿基的肽核酸的各個(gè)單元在本文中稱為核苷。引物核酸的大小可以變化，如本領(lǐng)域技術(shù)人員會理解的，長度通常在5至500個(gè)核苷酸范圍內(nèi)變化。例如，根據(jù)用途、所需的特異性以及擴(kuò)增技術(shù)，可以使用在10與100個(gè)核苷酸之間、在12與75個(gè)核苷酸之間和15至50個(gè)核苷酸的引物。對于任何引物對，引物彼此雜交的能力可以通過將第一引物的序列與第二引物的序列比對來進(jìn)行檢查。雜交體的穩(wěn)定性，尤其熱解鏈溫度(tm)，可以通過下述方法以及本領(lǐng)域中熟知的方法來確定。這些方法包括但不限于，最近鄰域熱力學(xué)計(jì)算(breslauer，t.等人，proc.natl.acad.sci.usa83:8893-97(1986)；wetmur，j.g.，crit.rev.biochem.mol.biol.26:227-59(1991)；rychlik，w.等人，j.nihres.6:78(1994))、wallace規(guī)則估算(suggs，s.v.等人"useofsyntheticoligodeoxribonucleotidesfortheisolationofspecificcloneddnasequences,"developmentalbiologyusingpurifiedgenes，d.b.brown編，第683-693頁，academicpress，newyork(1981)，和基于bolton和mccarthy的tm估算(參見baldino，f.j.等人，methodsenzymol.168：761-77(1989)；sambrook，j.等人，molecularcloning：alaboratorymanual，第10章，coldspringharborlaboratorypress，coldspringharbor，n.y.，(2001))。所有參考文獻(xiàn)以引用的方式明確地并入本文。當(dāng)評估雜交體穩(wěn)定性時(shí)，要考慮到各個(gè)參數(shù)的影響，所述參數(shù)包括但不限于離子強(qiáng)度、探針長度、g/c含量和錯(cuò)配。這些因素的考慮對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是熟知的(參見例如，sambrook，j.，同上)。可以在本文所述的方法中使用的引物可以用于擴(kuò)增各種靶核酸。單一引物組，例如一個(gè)引物對，可以用于擴(kuò)增單一靶核酸。在另一個(gè)實(shí)施方案中，多個(gè)引物組可以用于擴(kuò)增多個(gè)靶核酸。擴(kuò)增可以對每個(gè)獨(dú)特引物組分別進(jìn)行或使用引物組的組合在單一反應(yīng)容器中進(jìn)行(在本領(lǐng)域中通常稱為多路復(fù)用)。當(dāng)在單一反應(yīng)中使用多個(gè)引物組時(shí)，對引物進(jìn)行設(shè)計(jì)以限制不需要的產(chǎn)物形成以及限制每個(gè)引物組的引物之間的干擾。一般的pcr擴(kuò)增反應(yīng)可以根據(jù)本領(lǐng)域中熟知的程序進(jìn)行，如上所述(參見，例如美國專利號4,683,195和4,683,202)。引物延伸步驟的時(shí)間和溫度將取決于聚合酶、被擴(kuò)增的靶核酸的長度和用于擴(kuò)增的引物序列。充分?jǐn)U增靶核酸所需的反復(fù)步驟的數(shù)量將取決于每個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增效率和靶核酸的起始拷貝數(shù)。如本領(lǐng)域所熟知的，這些參數(shù)可由技術(shù)人員進(jìn)行調(diào)整以實(shí)現(xiàn)需要的擴(kuò)增水平。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，本發(fā)明不受擴(kuò)增過程中所應(yīng)用的時(shí)間、溫度、緩沖條件和擴(kuò)增周期的變化所限制。在使引物與靶核酸雜交中以及在所公開的擴(kuò)增反應(yīng)中，測定通常在嚴(yán)格條件下進(jìn)行，所述嚴(yán)格條件允許在靶核酸存在的情況下形成雜交體。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以改變溫度、鹽濃度、ph、有機(jī)溶劑、離液劑或其他變量的參數(shù)，以控制雜交嚴(yán)格度并且使引物與非特異性靶標(biāo)的雜交最小化(即，通過使用“熱啟動(dòng)”pcr或“降落”pcr)。在一些方面，引物可包含可檢測標(biāo)記。在一些方面，引物對或引物組的一種引物或兩種引物可包含可檢測標(biāo)記。本文還公開了可用于實(shí)施本文所述方法的試劑盒。例如，本文公開了包括一種或多種本文描述的引物組的試劑盒。在一些方面，試劑盒可包括第一正向引物和第一反向引物，其中第一正向引物包含在退火條件下與端粒重復(fù)序列雜交的3'部分；并且其中第一反向引物包含具有不與端粒重復(fù)序列雜交的錨定序列的5'部分。試劑盒還可包括緩沖劑、酶和用于進(jìn)行擴(kuò)增和擴(kuò)增產(chǎn)物的分析的容器。在一些方面，試劑盒可包括檢測標(biāo)記、聚合酶或本文所述的靶核酸中的一種或多種。另外，本文所述的試劑盒可包括用于進(jìn)行本文所述方法的任何產(chǎn)品和試劑以及說明書。6.端粒長度與臨床病狀或最佳治療方案的相關(guān)性從基因組dna確定的平均端粒長度/染色體末端是總端粒豐度的量度，并且已顯示所述量度與若干個(gè)重要的生物學(xué)指標(biāo)相關(guān)聯(lián)。這些指標(biāo)包括例如各種疾病病狀的風(fēng)險(xiǎn)，例如心血管危險(xiǎn)、癌癥風(fēng)險(xiǎn)、肺纖維化風(fēng)險(xiǎn)、感染性疾病風(fēng)險(xiǎn)和死亡風(fēng)險(xiǎn)。端粒豐度還與實(shí)足年齡、體質(zhì)指數(shù)、臀部/重量比和知覺應(yīng)激相關(guān)聯(lián)。平均端粒長度或豐度的一個(gè)量度是端粒/單拷貝(“t/s”)比。給定群體中的此類比率可以分成分位數(shù)，例如三分位數(shù)或四分位數(shù)。已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，由t/s比表示的端粒豐度在較低兩個(gè)三分位數(shù)中的個(gè)體比在端粒長度的最高三分位數(shù)中的那些個(gè)體處于顯著更高的心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)下。在所公開方法中，t/s比中的“s”表示至少兩個(gè)低拷貝數(shù)基因的平均長度或豐度的平均值。在另一方面，t/s比中的“s”表示至少兩個(gè)單拷貝基因的平均長度或豐度的平均值。在再另一方面，t/s比中的“s”表示兩個(gè)低拷貝數(shù)基因的平均長度或豐度的平均值。在再另一方面，t/s比中的“s”表示兩個(gè)單拷貝基因的平均長度或豐度的平均值。一般來說，在群體中的平均端粒長度或豐度的量度(例如表示為參考群體的百分比的t/s值)的百分位數(shù)值(通常為端粒長度的最高三分位數(shù)或四分位數(shù))與疾病風(fēng)險(xiǎn)負(fù)相關(guān)，即增加的平均端粒長度或豐度與較低疾病或死亡風(fēng)險(xiǎn)或改善的健康量度相關(guān)聯(lián)，而較低的百分位數(shù)得分通常與降低的健康量度和增加的死亡和疾病風(fēng)險(xiǎn)(包括“端粒疾病”的存在)相關(guān)聯(lián)，其中端粒由于基因中消極影響端?；钚曰蚬δ艿耐蛔兓蚋淖兌谶z傳上較短。在群體中，端粒長度通常隨著年齡而減小。因此，個(gè)體的平均端粒長度或豐度的量度可以與群體中相同年齡范圍內(nèi)的個(gè)人(即年齡匹配的群體)的量度相比較。例如，30歲的個(gè)人的端粒豐度的量度可能約等于30歲的群體平均值，或等于20歲或40歲的群體平均值。當(dāng)與年齡和性別匹配的群體的量度相比較時(shí)，平均端粒長度或豐度的量度與健康量度的相關(guān)性可能更加有用。年齡匹配的群體的范圍可以是例如1歲、2歲、3歲、4歲、5歲、7歲或10歲或高至80歲或更大年齡。通過本公開的方法從受試者樣品中測定的改變的平均端粒長度或豐度可以與健康量度相關(guān)聯(lián)。特別受關(guān)注的是涉及知覺應(yīng)激的健康量度。明顯的端?？s短可以由遺傳和環(huán)境因素來加速，所述因素包括多種形式的應(yīng)激諸如氧化損傷、生化應(yīng)激源、慢性發(fā)炎和病毒感染(epel，e.s.等人，proanatl.acad.sci.usa，2004，49:17312-15)。一般健康狀況的方便量度是由johnware開發(fā)的健康調(diào)查(參見例如萬維網(wǎng)urlsf-36.org/tools/sf36.shtml)。sf-36是多目的、短型的健康調(diào)查，其中優(yōu)選地由經(jīng)過培訓(xùn)的個(gè)體向患者僅僅提出36個(gè)問題。所述健康調(diào)查提供了功能性健康和幸福感得分的8等級概況以及基于心理測量學(xué)的身心健康綜合量度和基于偏好的健康效用指數(shù)。sf-36調(diào)查被用來估計(jì)疾病負(fù)擔(dān)并且比較疾病特異性基準(zhǔn)與一般群體標(biāo)準(zhǔn)。最頻繁研究的疾病和病狀包括關(guān)節(jié)炎、背痛、癌癥、心血管疾病、慢性阻塞性肺病、抑郁、糖尿病、胃腸病、偏頭痛、hiv/艾滋病、高血壓、腸道易激綜合征、腎病、下背痛、多發(fā)性硬化、肌肉骨骼病狀、神經(jīng)肌肉病狀、骨關(guān)節(jié)炎、精神病診斷、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、睡眠障礙、脊髓損傷、中風(fēng)、物質(zhì)濫用、手術(shù)程序、移植和創(chuàng)傷(turner-bowker等人，healthsurvey&“sf”bibliography：thirdedition(1988-2000)，qualitymetricincorporated，lincoln，ri，2002)。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)了解，一般健康狀況的其他調(diào)查方法例如rand-36可以在本公開中得到應(yīng)用。在本公開的一個(gè)方面，隨時(shí)間的推移收集受試者樣品，并且從這些樣品中確定改變的平均端粒長度或豐度的量度。用于收集多個(gè)樣品的適當(dāng)時(shí)間段包括但不限于1個(gè)月、3個(gè)月、6個(gè)月、1年、2年、5年和10年(例如，最早的樣品與最后的樣品之間的時(shí)間可以是大約這些時(shí)間段)。這種方法允許監(jiān)測患者為了改善其一般健康狀況和/或監(jiān)測其健康狀況和/或疾病風(fēng)險(xiǎn)所作的努力。因?yàn)榭s短的端?？梢l(fā)細(xì)胞死亡或可有助于癌癥誘導(dǎo)或進(jìn)展的基因組不穩(wěn)定性，所以縮短的端粒長度的百分比在個(gè)體內(nèi)隨時(shí)間降低或維持的發(fā)現(xiàn)指示健康改善，而縮短的端粒的百分比隨時(shí)間增加表示健康減退或惡化。測量端粒的重復(fù)單元數(shù)在醫(yī)療診斷(例如關(guān)于疾病風(fēng)險(xiǎn)的診斷)、疾病預(yù)后和治療學(xué)中具有多種應(yīng)用。具體來說，端粒長度的測量在評估導(dǎo)致疾病風(fēng)險(xiǎn)的病理病狀中得到應(yīng)用。在本公開的一個(gè)方面，疾病是與老齡化相關(guān)聯(lián)的疾病，例如但不限于心血管疾病、糖尿病、癌癥、肝纖維化和抑郁。在一方面，本公開涉及用于同種異體移植造血干細(xì)胞供體選擇的方法，所述方法包括：(a)從一名或多名hla匹配的潛在供體受試者獲得樣品；(b)通過所公開的方法確定每名hla匹配的供體受試者的第一擴(kuò)增子的平均端粒長度或豐度；(c)鑒定出具有比年齡匹配的對照高25個(gè)百分位數(shù)、高50個(gè)百分位數(shù)或高75個(gè)百分位數(shù)的平均端粒長度或豐度的一名或多名供體受試者；(d)從鑒定出的供體受試者獲得可移植的造血干細(xì)胞樣品；并且(e)將造血干細(xì)胞樣品移植到受體受試者。在一方面，本公開涉及用于同種異體移植造血干細(xì)胞供體選擇的方法，所述方法包括：(a)從一名或多名hla匹配的潛在供體受試者獲得樣品；(b)通過所公開的方法確定每名hla匹配的供體受試者的第一擴(kuò)增子的平均端粒長度或豐度；(c)鑒定出具有比年齡匹配的對照高25個(gè)百分位數(shù)的平均端粒長度或豐度的一名或多名供體受試者；(d)從鑒定出的供體受試者獲得可移植的造血干細(xì)胞樣品；并且(e)將造血干細(xì)胞樣品移植到受體受試者。在一方面，本公開涉及用于同種異體移植造血干細(xì)胞供體選擇的方法，所述方法包括：(a)從一名或多名hla匹配的潛在供體受試者獲得樣品；(b)通過所公開的方法確定每名hla匹配的供體受試者的第一擴(kuò)增子的平均端粒長度或豐度；(c)鑒定出具有比年齡匹配的對照高50個(gè)百分位數(shù)的平均端粒長度或豐度的一名或多名供體受試者；(d)從鑒定出的供體受試者獲得可移植的造血干細(xì)胞樣品；并且(e)將造血干細(xì)胞樣品移植到受體受試者。在一方面，本公開涉及用于同種異體移植造血干細(xì)胞供體選擇的方法，所述方法包括：(a)從一名或多名hla匹配的潛在供體受試者獲得樣品；(b)通過所公開的方法確定每名hla匹配的供體受試者的第一擴(kuò)增子的平均端粒長度或豐度；(c)鑒定出具有比年齡匹配的對照高75個(gè)百分位數(shù)的平均端粒長度或豐度的一名或多名供體受試者；(d)從鑒定出的供體受試者獲得可移植的造血干細(xì)胞樣品；并且(e)將造血干細(xì)胞樣品移植到受體受試者。在另一方面，受體受試者已被診斷為患有癌癥、心血管疾病或具有骨髓移植的需要。在另一方面，受體受試者已被診斷為患有癌癥。在再另一方面，癌癥為白血病或淋巴瘤。在又另一方面，癌癥為成神經(jīng)細(xì)胞瘤。甚至在另一方面，癌癥為多發(fā)性骨髓瘤。在另一方面，受體受試者已接受放射療法和/或化學(xué)療法治療。在再另一方面，受體受試者處于緩解期。在另一方面，造血干細(xì)胞樣品包括獲自鑒定出的供體受試者的骨髓。在再另一方面，造血干細(xì)胞樣品包括獲自鑒定出的供體受試者的外周血干細(xì)胞。在一方面，本公開在評估和監(jiān)測心血管疾病中得到應(yīng)用。已經(jīng)顯示，如通過血管造影術(shù)所確定，白血球中的端粒長度在患有嚴(yán)重三支冠狀動(dòng)脈疾病的患者中比其在具有正常冠狀動(dòng)脈的個(gè)體中更短(samani，n.j.等人，lancet，2001，358:472-73)，并且在50歲之前經(jīng)歷過早心肌梗塞的患者中的端粒長度與沒有這種病史的年齡和性別匹配的個(gè)體相比也更短(brouilettes.等人，arterioscler.thromb.vase.biol.，2003，23:842-46)。brouilette等人(lancet,2007，369:107-14)已經(jīng)提出，在易患冠心病的人中較短的白細(xì)胞端?？梢灾甘酒渌难茱L(fēng)險(xiǎn)因子對端粒長度的累積影響。增加的氧化應(yīng)激也造成動(dòng)脈粥樣硬化，并且已經(jīng)顯示增加的氧化劑應(yīng)激增加體外的端粒耗損速率(harrison，d.，can.j.cardiol.，1998，14(增刊d):30d-32d；vonzglinicki，t.，ann.n.y.acad.sci.，2000，908:99-110)。在橫向研究中，也已經(jīng)報(bào)道了吸煙、體質(zhì)指數(shù)和1型糖尿病與較短的白細(xì)胞端粒長度相關(guān)聯(lián)(valdes,a.等人，lancet，2005，366:662-64；jeanclos，e.等人，diabetes，1998，47:482-86)。已經(jīng)顯示增加的生活應(yīng)激(一種已知增加冠心病風(fēng)險(xiǎn)的因素)與較短的端粒相關(guān)聯(lián)，這可能是由于增加的氧化應(yīng)激(epel，2004，同上)。因此，具有高體質(zhì)指數(shù)、糖尿病和/或增加的生活應(yīng)激的吸煙者和患者將全部受益于根據(jù)本公開的方法對其端粒豐度進(jìn)行的確定和連續(xù)監(jiān)測。2型糖尿病的特征為較短的端粒(salpea，k.和humphries，s.e.，atherosclerosis，2010，209(l):35-38)。較短的端粒在1型糖尿病患者中也已經(jīng)被觀察到(uzielo.等人，exper.gerontology，2007，42:971-978)。1型糖尿病中的疾病病原學(xué)與2型糖尿病中的略有不同，但是在這兩種情況下，β細(xì)胞衰竭是全面爆發(fā)的疾病的最終觸發(fā)因子。端粒長度因此是糖尿病的有用標(biāo)記物，因?yàn)槠渑c疾病的進(jìn)展相關(guān)聯(lián)。adaikalakoteswari等人(.atherosclerosis，2007，195:83-89)已經(jīng)顯示，在具有糖尿病前期葡萄糖耐受性受損的患者中的端粒與對照相比更短。此外，端粒縮短已經(jīng)與糖尿病并發(fā)癥諸如糖尿病性腎病(verzolad.等人，am.j.physiol.，2008，295:f1563-1573)、微量白蛋白尿(tentolouris，n.等人，diabetescare，2007，30:2909-2915)和上皮癌(sampson，m.j.等人，diabetologia，2006，49:1726-1731)有關(guān)聯(lián)，而端粒縮短似乎在糖尿病得到良好控制的患者中有所減弱(uziel，2007，同上)。本公開的方法特別適用于監(jiān)測糖尿病前期和糖尿病患者的狀況，以提供這些并發(fā)癥和其他疾病的早期警告。本公開適用于確定各種類型的癌細(xì)胞的端粒長度，因?yàn)槎肆Ｃ富钚缘幕罨c細(xì)胞的永生化相關(guān)聯(lián)。雖然正常人體細(xì)胞不表達(dá)或僅短暫表達(dá)端粒酶且因此隨著每次細(xì)胞分裂縮短其端粒，但大多數(shù)人癌細(xì)胞通常表達(dá)高水平的端粒酶并且顯示出不受限制的細(xì)胞增殖。高端粒酶表達(dá)使得細(xì)胞長期增殖并擴(kuò)張并且因此支持腫瘤生長(roth，a.等人,insmallmoleculesinoncology，recentresultsincancerresearch，u.m.martens(編)，springerverlag，2010，第221-234頁)。較短的端粒與癌癥風(fēng)險(xiǎn)顯著相關(guān)聯(lián)，尤其是膀胱癌和肺癌、與吸煙有關(guān)的癌癥、消化系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)的癌癥。過度的端?？s短可能在加速腫瘤發(fā)作和進(jìn)展方面起作用(mah.等人，plosone，2011，6(6)：e20466.doi:10.1371/journal.pone.0020466)。研究已經(jīng)進(jìn)一步顯示，縮短的端粒對乳腺癌風(fēng)險(xiǎn)的影響對于某些群體子組諸如絕經(jīng)前女性和具有較差抗氧化能力的女性來說是顯著的(shenj.等人，int.j.cancer，2009，124:1637-1643)。除了一般地評估和監(jiān)測癌癥以外，如果利用源自唾液樣品的基因組dna，則本公開特別適用于監(jiān)測口腔癌。肝硬化的特征為器官的纖維化漸增，其常常與顯著的炎性浸潤相關(guān)聯(lián)。wiemann等人(fasebjournal,2002，16(9):935-982)已經(jīng)顯示，端?？s短是人肝硬化的與疾病和年齡無關(guān)的征象。端?？s短存在于由病毒性肝炎(慢性肝炎a和b)、毒性肝損傷(酒精中毒)、自體免疫和膽汁郁積(pbc和psc)誘發(fā)的硬化中；端粒在與患者年齡無關(guān)的硬化中一律很短。端粒縮短和衰老特異性地影響硬化的肝中的肝細(xì)胞，并且所述兩個(gè)參數(shù)與硬化期間的纖維化的進(jìn)展強(qiáng)烈相關(guān)聯(lián)。因此，本公開的方法在診斷和監(jiān)測肝纖維化方面得到應(yīng)用。抑郁已經(jīng)被比作“加速老齡化”的狀態(tài)，并且抑郁的個(gè)體具有各種老齡化疾病諸如心血管和腦血管疾病、代謝綜合征和癡呆的較高發(fā)病率?；加袕?fù)發(fā)性抑郁的人或暴露于慢性應(yīng)激的人表現(xiàn)出白血球中的較短端粒。較短的端粒長度與復(fù)發(fā)性抑郁和指示暴露于慢性應(yīng)激的皮質(zhì)醇水平相關(guān)聯(lián)(wikgren，m.等人，biol.psych.，2011，doi：10.1016/j.biopsych.2011.09.015)。然而，并不是所有抑郁的個(gè)體都顯示同等縮短的端粒，因?yàn)橐钟舭l(fā)作在一生中有很大變化。長期遭受抑郁的人當(dāng)與對照群體相比時(shí)具有顯著更短的端粒，這是由于較長時(shí)間暴露于氧化應(yīng)激和由心理應(yīng)激誘發(fā)的炎癥(wolkowitz等人，plosone，2011，6(3):e17837)。因此，本公開的方法可以在監(jiān)測抑郁方面得到應(yīng)用。異常端粒長度與慢性感染相關(guān)聯(lián)，所述慢性感染包括hiv(effrosrb等人，aids.1996年7月；10(8):f17-22；pommier等人virology.1997，231(1)：148-54)；以及hbv、hcv和cmv(telomere/telomerasedynamicswithinthehumanimmunesystem：effectofchronicinfectionandstress.(effrosrb，expgerontol.2011年2月-3月；46(2-3)：135-40。rejuvenationres.2011年2月；14(1):45-56.doi:10.1089rej.2010.1085.epub2010年9月7日。)inharley等人(“anaturalproducttelomeraseactivatoraspartofahealthmaintenanceprogram”，harleycb、liuw，blascom，verae，andrewswh，briggsla,raffaelejm，rejuvenationres.2011年2月；14(l):45-56)中，發(fā)現(xiàn)了cmv血清反應(yīng)陽性的個(gè)體相比于cmv血清反應(yīng)陰性的個(gè)體具有更短的端粒，而且，在降低衰老cd8+/cd28-細(xì)胞的豐度方面，cmv陽性受試者更可能響應(yīng)于ta-65的營養(yǎng)補(bǔ)充方案(由天然產(chǎn)物衍生的端粒酶激活劑連同其他補(bǔ)充物)，這表明了結(jié)合施用產(chǎn)生較長端粒的端粒酶激活劑或其他藥劑用于測量短端粒的平均端粒長度或豐度的伴隨診斷應(yīng)用。平均端粒長度的測量可以被用作預(yù)后疾病進(jìn)展和治療結(jié)果的指標(biāo)。一項(xiàng)研究報(bào)道，在患有慢性hcv感染的患者中，cd4+細(xì)胞中的端粒長度與炎癥等級、纖維化階段、實(shí)驗(yàn)室嚴(yán)重度指數(shù)、隨后的肝功能代償不全和治療結(jié)果有關(guān)(hoare等人，j.hepatol.，2010，53(2):252-260)。在另一個(gè)報(bào)道中，較長的白細(xì)胞端粒長度預(yù)測乙型肝炎病毒相關(guān)性肝細(xì)胞癌的風(fēng)險(xiǎn)增加(liu等人，2011,117(18):4247-56。)在hiv的情況下，端?？s短是由病毒性感染引起。此外，用于治療hiv的核苷類似物逆轉(zhuǎn)錄酶抑制劑是端粒酶抑制劑(strahl和blackburn，molcellbiol.，1996，16(l):53-65；hukezalie等人，plosone，2012，7(11):e47505)。短端粒豐度的測量可能有助于確定haart治療的副作用和功效。本公開還在診斷與老齡化的早發(fā)有關(guān)的疾病方面得到了應(yīng)用。例如，患有哈欽森-吉爾福特早衰癥(hutchinson-gilfordprogeria)疾病的個(gè)體顯示出過早老齡化以及與端粒長度損失相關(guān)聯(lián)的成纖維細(xì)胞的增殖潛力下降(allsopp,r.c.等人，proc.natl.acad.sci.usa，1992，89:10114-10118)。根據(jù)本公開的方法對端粒重復(fù)序列數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增和定量可用于確定疾病風(fēng)險(xiǎn)或預(yù)后并采取如上所述的適當(dāng)干預(yù)步驟。在本公開的一個(gè)方面，端粒特異性疾病的存在和進(jìn)展都可以使用樣品來確定。端粒疾病與端粒的異?；蜻^早縮短相關(guān)聯(lián)，這可以例如起因于端粒酶活性的缺陷。端粒酶是真核細(xì)胞中端粒dna的復(fù)制和保護(hù)所需要的核糖核蛋白復(fù)合物。缺乏端粒酶的細(xì)胞經(jīng)歷端粒dna的漸進(jìn)性損失，這導(dǎo)致活力損失并伴隨有基因組不穩(wěn)定性的增加。這些疾病可能是遺傳的并且包括某些形式的先天性再生障礙性貧血，其中骨髓干細(xì)胞的細(xì)胞分裂不足導(dǎo)致嚴(yán)重貧血。皮膚和肺的某些遺傳性疾病也是由端粒酶缺陷引起。對于端粒疾病來說，針對t/s<0.5的閾值適于一些病狀。另外，常用的度量是針對年齡調(diào)整的百分位數(shù)端粒得分相對于正常群體小于<10％或優(yōu)選<1％。先天性角化不良(dkc)，又稱為津-恩-科三氏綜合征(zinsser-engman-colesyndrome)，是一種罕見的進(jìn)行性骨髓衰竭綜合征，其特征為粘膜皮膚異常：網(wǎng)狀皮膚色素沉著過度、指甲營養(yǎng)不良和口腔粘膜白斑病(jjyonouchis.等人，pediatr.allergyimmunol.，2011，22(3):313-9；besslerm.等人，haematologica，2007，92(8)：1009-12)。有證據(jù)表明這種病癥中存在端粒酶功能障礙、核糖體缺乏和蛋白質(zhì)合成功能障礙。早期死亡常常與骨髓衰竭、感染、致命性肺并發(fā)癥或惡性腫瘤相關(guān)聯(lián)。這種疾病在以下三種類型之一中是遺傳的：常染色體顯性、常染色體隱性或最常見形式x連鎖隱性(其中負(fù)責(zé)dc的基因由x染色體攜帶)。使用本公開的方法對疾病進(jìn)展進(jìn)行早期診斷和測量對于具有這些遺傳特征的家族而言非常有益，從而使得利用合成代謝類固醇或骨髓刺激藥物進(jìn)行早期治療可以有助于防止骨髓衰竭。本公開的非侵入性、對患者友好的唾液測試方法特別適用于dkc，因?yàn)閶雰汉托『⑿枰獪y試和連續(xù)監(jiān)測。特發(fā)性間質(zhì)性肺炎的特征為纖維化和炎癥的組合對肺實(shí)質(zhì)的損傷。特發(fā)性肺纖維化(ipf)是這些疾病的一個(gè)實(shí)例，其導(dǎo)致肺的漸進(jìn)性瘢痕形成。纖維性瘢痕組織在肺中隨著時(shí)間而累積，影響了其向身體提供足夠氧的能力。端粒酶基因tert和terc的編碼區(qū)中的雜合子突變已經(jīng)在特發(fā)性間質(zhì)性肺炎的家族性和散發(fā)性病例中被發(fā)現(xiàn)。帶有突變的所有受影響患者都具有短端粒?；加衖pf的個(gè)體中的大部分具有短的端粒長度，這無法由端粒酶中的編碼突變來解釋(cronkhite，j.t.等人，am.j.resp.crit.caremed.，2008，178:729-737)。因此，端?？s短可以被用作對這種年齡相關(guān)疾病的傾向增加的標(biāo)志(alder，j.k.等人，proc.natl.acad.sci.usa，2008，105(35)：13051-13056)。此外，ipf的過程因人而異。對于一些人來說，所述疾病可以歷經(jīng)多年緩慢和逐漸地進(jìn)展，而對于其他人來說，其可以快速地進(jìn)展。本發(fā)明的方法可以方便地用于監(jiān)測肺纖維化的過程并且采取如上所述的適當(dāng)干預(yù)步驟。再生障礙性貧血是其中骨髓停止為身體制造足夠的紅血球、白血球和血小板的疾病。骨髓所制造的任何血細(xì)胞是正常的，但是并不足夠。再生障礙性貧血可以是中度、嚴(yán)重或極度嚴(yán)重的。患有嚴(yán)重或極度嚴(yán)重的再生障礙性貧血的人處于威脅生命的感染或出血的風(fēng)險(xiǎn)下。患有再生障礙性貧血、具有短端?；驍y帶端粒酶突變的患者發(fā)展脊髓發(fā)育不良的風(fēng)險(xiǎn)和導(dǎo)致染色體異常和癌癥的基因組不穩(wěn)定增加(calado等人leukemia(2011)，1-8)。端粒酶缺乏可以引起造血干細(xì)胞中不同程度的端?？s短并且導(dǎo)致染色體不穩(wěn)定和惡性轉(zhuǎn)化(calado，r.t.和young，n.s.，thehematologist，2010萬維網(wǎng)urlhematology.org/publications/hematologist/2010/4849.aspx)。具有較短端粒的再生障礙性貧血患者具有較低生存率，并且在免疫療法后比具有較長端粒的那些患者復(fù)發(fā)的可能性大得多。scheinberg等人(jama，2010，304(12):1358-1364)發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)率隨著端粒長度的增加而下降。具有最短端粒的患者組還處于轉(zhuǎn)變成骨髓癌的較高風(fēng)險(xiǎn)下，并且具有最低的總體生存率。本公開的方法可以用于再生障礙性貧血患者中以監(jiān)測發(fā)展主要并發(fā)癥的風(fēng)險(xiǎn)，使得可以相應(yīng)地調(diào)整個(gè)體的臨床管理。在另一方面，本公開可用于監(jiān)測治療劑的有效或篩選影響端粒長度或端粒酶活性的候選藥物。監(jiān)測端粒特征的能力可以提供用于檢查特定療法和藥理學(xué)藥劑的有效性的窗口。個(gè)體中的疾病狀態(tài)對特定療法的藥物響應(yīng)性可以通過本公開的方法來確定。例如，因?yàn)榧?xì)胞的增殖潛力與端粒完整性的維持相關(guān)，所以本公開在監(jiān)測癌癥療法的有效性方面得到應(yīng)用。如上所述，雖然正常人體細(xì)胞不表達(dá)或僅短暫表達(dá)端粒酶且因此隨著每次細(xì)胞分裂縮短其端粒，但大多數(shù)人癌細(xì)胞通常表達(dá)高水平的端粒酶并且顯示出不受限制的細(xì)胞增殖。roth等人(同上，2010)已經(jīng)提出，在腫瘤中具有極短端粒(其中大多數(shù)細(xì)胞中的最短端粒接近于端粒功能障礙)且具有高端粒酶活性的癌癥個(gè)體可能最得益于抗癌端粒酶抑制藥物。因?yàn)槎肆Ｃ冈诖蠖鄶?shù)正常細(xì)胞中不被表達(dá)或被短暫表達(dá)并且處于極低水平下，所以端粒酶抑制療法相比常規(guī)的化學(xué)療法可能對正常細(xì)胞的毒性更小。此類藥物的一個(gè)實(shí)例是基于短寡核苷酸的端粒酶抑制劑伊美司他(imetelstat)(先前名為grn163l)。伊美司他是第一代寡核苷酸grn163的新型基于脂質(zhì)的綴合物(asai，a.等人，cancerres.，2003，63:3931-3939)。然而，在正常血細(xì)胞(特別是粒細(xì)胞)中具有極短端粒的癌癥患者處于伊美司他對增生組織諸如骨髓產(chǎn)生不良影響的較高風(fēng)險(xiǎn)下。rattain等人(2008)發(fā)現(xiàn)，具有短粒細(xì)胞端粒長度的此類受試者更可能患上骨髓衰竭綜合癥，諸如中性粒細(xì)胞減少癥或血小板減少癥。在這種情況下，醫(yī)生可能開出較低劑量的伊美司他、不同的藥物，或更頻繁地監(jiān)測骨髓問題。在其他方面，藥物功效在于治療老齡化疾病，例如但不限于心血管疾病、糖尿病、肺纖維化、肝纖維化、間質(zhì)性肺炎和抑郁。在心血管疾病的情況下，brouilette等人報(bào)告，相比對照組具有更短端粒長度的中年男性最得益于使用普伐他汀(pravastatin)的降脂療法(brouilette，s.w.等人，lancet，2007，369:107-114)。satoh等人(clin.sci.，2009，116:827-835)指示，當(dāng)與經(jīng)溫和普伐他汀療法治療的患者相比時(shí)，在經(jīng)阿托伐他汀(atorvastatin)療法的患者中集中降脂療法更好地保護(hù)端粒免遭侵蝕。本公開的方法可以用于監(jiān)測他汀類在經(jīng)治療的患者中的功效，其中較短的端粒長度與較好的藥物功效相關(guān)聯(lián)。因?yàn)榫哂凶铋L端粒的受試者平均來說未得益于預(yù)防性他汀類，所以醫(yī)生可能建議患者要尤其順應(yīng)良好的生活方式習(xí)慣以作為其治療方案的一部分。相反地，擔(dān)心長期使用他汀類的副作用的具有短端粒的患者可能基于其得益于他汀類的較高可能性而被說服服用他汀類?？梢允褂玫乃☆惖膶?shí)例包括煙酸(advicor、simcor)、洛伐他汀(lovastatin)(altoprev、mevacor)、氨氯地平(amolopidine)(caduet)、羅蘇伐他汀(rosuvastatin)(crestor)、西他列汀(sitagliptin)/辛伐他汀(simvastatin)(juvisync)、氟伐他汀(fluvastatin)(lescol)、普伐他汀(pravachol)、阿托伐他汀(lipitor)、匹伐他汀(pitavastatin)(livalo)和依澤替米貝(ezetimibe)/辛伐他汀(vytorin)。在一方面，本公開涉及用于再分級心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括：(a)從受試者獲得樣品，其中受試者已被診斷為符合針對低強(qiáng)度他汀類療法的2013acc/aha治療血液膽固醇之指南標(biāo)準(zhǔn)；(b)通過所公開的方法確定樣品中的相對于第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的平均豐度的第一擴(kuò)增子的平均長度或豐度；(c)當(dāng)樣品被確定出具有比年齡匹配的對照低25個(gè)百分位數(shù)、50個(gè)百分位數(shù)或75個(gè)百分位數(shù)的相對于第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的平均豐度的第一擴(kuò)增子平均長度或豐度時(shí)將受試者診斷為處于較高的心血管風(fēng)險(xiǎn)下；并且(d)向被診斷為處于較高的心血管風(fēng)險(xiǎn)下的受試者施用以下項(xiàng)：(i)修改的他汀類療法；和/或(ii)已知用于治療心血管疾病的第二治療劑。在一方面，本公開涉及用于再分級心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括：(a)從受試者獲得樣品，其中受試者已被診斷為符合針對低強(qiáng)度他汀類療法的2013acc/aha治療血液膽固醇之指南標(biāo)準(zhǔn)；(b)通過所公開的方法確定樣品中的相對于第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的平均豐度的第一擴(kuò)增子的平均長度或豐度；(c)當(dāng)樣品被確定出具有比年齡匹配的對照低25個(gè)百分位數(shù)的相對于第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的平均豐度的第一擴(kuò)增子平均長度或豐度時(shí)將受試者診斷為處于較高的心血管風(fēng)險(xiǎn)下；并且(d)向被診斷為處于較高的心血管風(fēng)險(xiǎn)下的受試者施用以下項(xiàng)：(i)修改的他汀類療法；和/或(ii)已知用于治療心血管疾病的第二治療劑。在一方面，本公開涉及用于再分級心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括：(a)從受試者獲得樣品，其中受試者已被診斷為符合針對低強(qiáng)度他汀類療法的2013acc/aha治療血液膽固醇之指南標(biāo)準(zhǔn)；(b)通過所公開的方法確定樣品中的相對于第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的平均豐度的第一擴(kuò)增子的平均長度或豐度；(c)當(dāng)樣品被確定出具有比年齡匹配的對照低50個(gè)百分位數(shù)的相對于第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的平均豐度的第一擴(kuò)增子平均長度或豐度時(shí)將受試者診斷為處于較高的心血管風(fēng)險(xiǎn)下；并且(d)向被診斷為處于較高的心血管風(fēng)險(xiǎn)下的受試者施用以下項(xiàng)：(i)修改的他汀類療法；和/或(ii)已知用于治療心血管疾病的第二治療劑。在一方面，本公開涉及用于再分級心血管疾病風(fēng)險(xiǎn)的方法，所述方法包括：(a)從受試者獲得樣品，其中受試者已被診斷為符合針對低強(qiáng)度他汀類療法的2013acc/aha治療血液膽固醇之指南標(biāo)準(zhǔn)；(b)通過所公開的方法確定樣品中的相對于第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的平均豐度的第一擴(kuò)增子的平均長度或豐度；(c)當(dāng)樣品被確定出具有比年齡匹配的對照低75個(gè)百分位數(shù)的相對于第二擴(kuò)增子和第三擴(kuò)增子的平均豐度的第一擴(kuò)增子平均長度或豐度時(shí)將受試者診斷為處于較高的心血管風(fēng)險(xiǎn)下；并且(d)向被診斷為處于較高的心血管風(fēng)險(xiǎn)下的受試者施用以下項(xiàng)：(i)修改的他汀類療法；和/或(ii)已知用于治療心血管疾病的第二治療劑。在其他方面，可以測定在端粒疾病(例如但不限于先天性角化不良、肺纖維化和再生障礙性貧血)治療中的藥物有效性。例如，先天性角化不良和肺纖維化都用高劑量的類固醇來治療，眾所周知，所述類固醇具有眾多有害的副作用。因此非常期望使用最低可能的類固醇劑量，這使得本公開的方法成為用于監(jiān)測這些患者的有價(jià)值工具。在另一方面，本公開被用作篩選影響調(diào)節(jié)端粒長度(諸如端粒酶活性)的生物途徑的候選藥物、膳食補(bǔ)充劑和其他干預(yù)(包括生活方式改變)的一般方法。以定量方式快速和特異性地?cái)U(kuò)增端粒重復(fù)序列的能力提供了一種用于鑒定影響細(xì)胞中的端粒動(dòng)力學(xué)的小分子、候選核酸和肽劑及其他產(chǎn)品或干預(yù)的高通量篩選法。對正常細(xì)胞具有正向端粒延長作用的候選藥物或其他候選產(chǎn)品在治療退行性病狀或細(xì)胞衰老相關(guān)病狀方面將優(yōu)于具有端?？s短(或端粒酶抑制)作用而其他方面都等同的那些藥物或產(chǎn)品。在治療癌癥的情況下，尤其在癌細(xì)胞中具有負(fù)向的端?？s短作用的藥物將是優(yōu)選的。實(shí)施例實(shí)施例1-三重qpcr測定每個(gè)pcr反應(yīng)在標(biāo)準(zhǔn)384孔測定板的10μl總體積/孔中進(jìn)行。標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)混合物含有以下組分：5ng靶dna、1.0μm染料(biotium，hayward，california)、300nmtelg修飾型引物、300nmtelc修飾型引物、300nmb2m-f引物、300nmb2m-r引物、100nmb2m探針、1xrna酶p混合物(拷貝數(shù)參考測定rna酶p，thermofisherscientific，inc.)、1xquantifast探針pcr主混合物(qiagen，inc.，germantown，maryland)。下表2提供了各種引物序列。表2.*b2m-p探針寡核苷酸具有共價(jià)連接至引物序列的5'端的cy5基團(tuán)和共價(jià)連接至引物序列的3'端的iowarq部分。用于所公開的三重qpcr測定的標(biāo)準(zhǔn)循環(huán)條件是示出在表3中的那些。表3.*在這個(gè)步驟中進(jìn)行信號數(shù)據(jù)采集。用于所公開的三重qpcr測定中的引物、靶核酸和各種擴(kuò)增子的檢測通道在下表4中給出。利用二階導(dǎo)數(shù)法使用rochelc480中的絕對定量方法定量每種靶標(biāo)。利用嵌合型男性基因組dna的8點(diǎn)、2倍稀釋液來生成標(biāo)準(zhǔn)曲線，從所述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算針對每個(gè)樣品的三個(gè)靶標(biāo)中的每個(gè)的濃度。使用下述基因組dna濃度的8點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線在表4中示出。使用t、b和r的濃度計(jì)算平均端粒長度。表4.實(shí)施例2-評估telg修飾型和telc修飾型引物濃度的影響使用上述的標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)條件，不同的是改變了telg修飾型和telc修飾型的濃度。檢查了下列濃度：400nmtelg修飾型和400nmtelc修飾型；300nmtelg修飾型和100nmtelc修飾型；600nmtelg修飾型和100nmtelc修飾型；300nmtelg修飾型和300nmtelc修飾型；和600nmtelg修飾型和300nmtelc修飾型。在前述telg修飾型/telc修飾型濃度條件下的反應(yīng)的解鏈曲線示出在圖2a-圖2f中。數(shù)據(jù)顯示，當(dāng)反應(yīng)在300nmtelg修飾型和300nmtelc修飾型條件下進(jìn)行時(shí)，所有三個(gè)靶標(biāo)具有類似的擴(kuò)增幅度，這表明所有三個(gè)pcr反應(yīng)產(chǎn)生大約類似量的產(chǎn)物并且測定達(dá)到三個(gè)靶標(biāo)的所需平衡。當(dāng)pcr反應(yīng)結(jié)束達(dá)到平衡時(shí)的三種擴(kuò)增子的相當(dāng)量是pcr試劑(酶、核苷酸、引物)均未限制三個(gè)pcr產(chǎn)物中的任一種的指示。實(shí)施例3-擴(kuò)增效率利用嵌合型男性基因組dna的8點(diǎn)、2倍系列稀釋液來計(jì)算pcr效率。針對每點(diǎn)的最終pcr反應(yīng)中的dna濃度示出在表5中。針對所測試的每種引物組合的每種靶標(biāo)的pcr效率用rochelc480程序中的絕對定量方法獲得并且匯總在表6中。表5.標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)pcr中的最終濃度(ng/μl)stdl5std22.5std31.25std40.625std50.3125std60.1563std70.0781std80.0391表6.實(shí)施例4-擴(kuò)增效率在各種靶dna(嵌合型mdna)濃度下進(jìn)行所公開的三重qpcr測定。交點(diǎn)(cp)(根據(jù)二階導(dǎo)數(shù)法通過rochelc480程序計(jì)算的)相對于端粒、rna酶p和β2-微球蛋白的inputdna的log(濃度)的線性回歸線和數(shù)據(jù)示出在圖3a-圖3c中。針對三個(gè)靶標(biāo)中的每個(gè)在0.0391ng/μl至5ng/μl靶dna，即128倍范圍下實(shí)現(xiàn)r2>0.999。因?yàn)樵?0μlpcr反應(yīng)中使用3μl靶dna，所以這對應(yīng)于在添加至反應(yīng)的3μl體積中的0.13ng/μl至16.7ng/μl靶dna的范圍。因此，所述測定可檢測并定量至少低至0.13ng/μl的靶dna，但是可能的是更低濃度的靶dna可以在所公開的三重qpcr測定的條件下檢測。在這個(gè)研究中使用的最高基因組dna最終反應(yīng)濃度為5ng/μl。據(jù)觀察，rna酶p和β2-微球蛋白靶標(biāo)的擴(kuò)增曲線的基線高于使用的最高基因組dna濃度(嵌合型mdna)下的標(biāo)準(zhǔn)曲線點(diǎn)的剩余部分(參見圖4a-圖4c)。實(shí)施例5-在無模板對照條件下進(jìn)行的測定使用九個(gè)無模板對照(“ntc”)樣品進(jìn)行所公開的三重qpcr測定。在單一測定板中使用九個(gè)ntc樣品進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。端粒與rna酶p靶標(biāo)的ntccp全部大于35；而對于b2m的9個(gè)孔中的三個(gè)具有5的偽像ntccpcalling，并且其他6個(gè)孔不具有cpcalling。應(yīng)當(dāng)指出的是，盡管b2m孔具有5的偽像cpcalling，但是圖5c示出的數(shù)據(jù)顯示從擴(kuò)增數(shù)據(jù)中觀察到最小的擴(kuò)增。這些數(shù)據(jù)表明在所公開的三重qpcr測定的條件下，幾乎不存在ntc信號干擾樣品cp值的計(jì)算的風(fēng)險(xiǎn)。實(shí)施例6-pcr效率三個(gè)質(zhì)量控制dna樣品、男性嵌合型參考dna和四個(gè)患者dna樣品的pcr效率通過進(jìn)行針對每個(gè)樣品使用8點(diǎn)、2倍系列稀釋的所公開的三重qpcr測定獲得，其中最終pcr反應(yīng)中的最高濃度為3ng/μl(參見表7)。稀釋的dna樣品運(yùn)行兩次并且pcr效率匯總在表8中。當(dāng)比較兩次運(yùn)行時(shí)，pcr效率存在顯著量的變化。盡管pcr效率存在差異，但是當(dāng)比較兩次運(yùn)行時(shí)獲得針對rna酶p的3.4％和針對b2m的3.1％的平均cv。表8示出了針對rna酶p獲得的cv值，并且表9示出了針對β2-微球蛋白靶標(biāo)獲得的cv值。表8和表9中的數(shù)據(jù)顯示cv在較低濃度的靶dna下較高。當(dāng)去除最低濃度點(diǎn)時(shí)，平均cv對于rna酶p降低至2.9％并且對于β2-微球蛋白降低至2.5％?；讦?-微球蛋白的cv值，最終pcr反應(yīng)中的最佳濃度可以是0.5ng/μl(在標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)3與標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)4之間)。因此，患者樣品的歸一化源dna最佳應(yīng)當(dāng)為約1.7ng/μl。表7.標(biāo)準(zhǔn)點(diǎn)反應(yīng)中的最終濃度(ng/μl)stdl3std21.5std30.75std40.375std50.1875std60.09375std70.04688std80.02344表8.*t1和t2表示使用telg修飾型和telc修飾型引物進(jìn)行的兩個(gè)獨(dú)立反應(yīng)；r1和r2表示使用rna酶p引物進(jìn)行的兩個(gè)獨(dú)立反應(yīng)；并且b1和b2表示使用β2-微球蛋白引物進(jìn)行的兩個(gè)獨(dú)立反應(yīng)。表9.表10.qc1qc2qc3pt1pt2pt3pt4stdl0.8％1.5％1.6％2.5％1.3％1.0％0.6％std21.8％1.4％1.6％1.7％2.3％0.9％1.4％std31.6％2.1％1.4％1.2％2.9％2.7％0.9％std41.7％1.4％1.5％1.3％2.1％1.6％2.6％std52.5％4.4％3.6％2.2％4.2％1.9％4.1％std61.9％2.8％1.9％2.6％5.4％1.0％2.8％std75.0％3.2％9.4％3.7％2.5％7.9％4.2％std811.3％4.4％10.3％5.0％6.0％7.7％4.9％實(shí)施例7-使用所公開的三重qpcr測定方法在患者群體中進(jìn)行t/s確定如本文所述的所公開的三重qpcr測定方法使用來自無癥狀群體的163個(gè)患者dna樣品。dna樣品從獲自每名患者的血液提取。結(jié)果建立了(圖6a)中的0.61-1.55的t/s比范圍。檢查的患者群體具有21-78歲的年齡范圍(平均51歲)，其中性別分布為82名女性和81名男性。觀察到t/s比與年齡之間的強(qiáng)相關(guān)性(r2＝0.36，參見圖6b)。所公開的三重qpcr方法顯示出非常低的測定間cv值(參見圖7a和圖7b)。例如，甚至在pcr測定板手動(dòng)地由單一個(gè)體移取出時(shí)，這163個(gè)樣品的平均測定間cv為1.9％。相比之下，應(yīng)當(dāng)指出的是，當(dāng)如由cawthon(cawthon，r.m.，nucleic.acidsres.，2002，30(10):e47)所述那樣進(jìn)行測定時(shí)，典型的板間和操作器間變異性(cv值)在5-10％范圍內(nèi)。在由martin-ruiz等人(int.j.epidemiol.(2014)doi：10.1093/ije/dyul91)的最近公布中，作者報(bào)道在單個(gè)實(shí)驗(yàn)室cv內(nèi)qpcr的批間和批內(nèi)cv值在2.3％至28％”范圍內(nèi)。與先前所述的開發(fā)用于端粒長度測定的qpcr方法，例如，cawthon的方法(cawthon，r.m.，nucleic.acidsres.，2002，30(10):e47)相比，使用本發(fā)明的方法獲得的數(shù)據(jù)證明所公開的三重qpcr測定提供大許多的精確度。此外，與由martin-ruiz等人針對批間變異性報(bào)道的平均cv值(int.j.epidemiol.(2014)doi：10.1093/ije/dyu191)相比，由本文所述的數(shù)據(jù)提供顯著改善的cv值。實(shí)施例8-所公開的三重qpcr測定方法中的總變異性在單一測定中一式三份地測定9個(gè)患者樣品中的每個(gè)，所述單一測定在單一96孔板中由三個(gè)操作器進(jìn)行。每個(gè)測定中患者樣品的樣品位置如表11中所示。對于三個(gè)復(fù)制品中的每個(gè)計(jì)算t/s比，提供“輪次內(nèi)”變異性的估計(jì)值。然后在五個(gè)單獨(dú)的天重復(fù)板布置，早晨一次，晚上一次，使用3個(gè)不同的操作器，每個(gè)方案總共10個(gè)板復(fù)制品，示出在表12中。十個(gè)板中有九個(gè)通過qc并且用于分析。表11.123456789101112aapr_7apr_7apr_7bapr1apr8apr1apr8apr1capr2apr9apr2apr8dapr3apr9apr2apr9eapr4apr3apr3fapr5apr4apr4gapr6apr5apr5hapr6apr6表12.第1天第2天第3天第4天第5天am操作器1操作器3操作器3操作器1操作器1pm操作器2操作器2操作器2操作器3操作器2來自如上所述進(jìn)行的多次測定的樣品數(shù)據(jù)使用其中“運(yùn)行”為隨機(jī)效應(yīng)的隨機(jī)效應(yīng)模型分析。獲得輪次內(nèi)變異性、輪次間變異性和總輪次變異性的估計(jì)值。研究設(shè)計(jì)和數(shù)據(jù)分析符合評價(jià)定量測定的精確性能的指南，所述指南概述在clsi(先前稱為nccls)指南中。在由9個(gè)樣品覆蓋的t/s范圍內(nèi)，測定內(nèi)cv、測定間cv和總cv是優(yōu)選的(圖8a-圖8c)。測定內(nèi)cv和測定間cv在接近于0至2.9％的范圍內(nèi)，而總cv在-2.2％至3.5％的范圍內(nèi)。實(shí)施例9-具有端粒序列的大腸桿菌克隆通過擴(kuò)增來自獲自膀胱癌細(xì)胞系umuc-3的基因組dna的靶序列來制備pcr產(chǎn)物。pcr反應(yīng)使用引物tel-4rp(seqidno.：14；獲自integrateddnatechnologies，inc.，coralville，ia，“idt”)和susseqidno.：15；獲自idt；hplc純化的)。在以下條件下進(jìn)行反應(yīng)：40ngumuc-3基因組dna、1.5mmmgcl2、500nmsus引物、500nmtel-4rp、300μmdntp(biorad，目錄號170-8874)、0.125u/μl鉑taq(invitrogen)，于50μl反應(yīng)中。pcr循環(huán)情況如下：94℃下1個(gè)循環(huán)，2min；94℃下35個(gè)循環(huán)，15s；65℃，30s；72℃，5min；以及72℃下1個(gè)循環(huán)，20min。使用0.8％e-凝膠(目錄號g5018-08；thermofisherscientificcorporation，carlsbad，ca)通過凝膠電泳純化pcr產(chǎn)物，并且使用genecleanturbo試劑盒(目錄號1102-200；mpbiomedicals，llc，santaana，ca)從凝膠中分離0.8-1.2kb大小范圍的產(chǎn)物。然后，將pcr產(chǎn)物克隆到ta克隆載體(用于亞克隆的ta試劑盒；目錄號k4510-20；thermofisherscientificcorporation，carlsbad，ca)中。將具有克隆的pcr產(chǎn)物的載體轉(zhuǎn)化到轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞中，并且在生長過夜之后，從轉(zhuǎn)化瓊脂板中挑揀處所選擇的菌落。對于所選擇菌落測定克隆到質(zhì)粒中的dna序列。一個(gè)克隆y3(seqidno.：12)含有135bp端粒序列片段。選擇這種克隆為絕對端粒長度參考源。實(shí)例10-制備絕對端粒參考使用獲自上述y3克隆的滾環(huán)擴(kuò)增(“rca”)的dna作為pcr擴(kuò)增的模板。使用兩輪pcr擴(kuò)增獲得絕對端粒參考。在第一輪pcr擴(kuò)增中，在具有1μlrca產(chǎn)物材料的反應(yīng)中使用m13正向引物(seqidno.：16)和m13反向引物(seqidno.：17)。用qiaquickpcr純化試劑盒(目錄號28104；qiageninc.，valencia，ca)純化pcr擴(kuò)增產(chǎn)物y3-m13pcr產(chǎn)物，然后通過nanodropuv-vis分光光度計(jì)(nanodrop8000，thermofisherscientific)定量。在第二輪pcr擴(kuò)增中，將m13正向引物(seqidno.：16)和teloanchor引物(seqidno.：18)與5ng先前純化的y3-m13pcr產(chǎn)物一起使用。第二輪pcr擴(kuò)增的產(chǎn)物y3-telotailpcr產(chǎn)物通過qiaquickpcr純化試劑盒純化并且通過picogreen測定(quant-ittmdsdna試劑，目錄號p11495，thermofisherscientific，inc.)定量。使用y3-telotailpcr產(chǎn)物作為絕對端粒參考dna。實(shí)施例11-dna印跡分析根據(jù)進(jìn)行稍微修改的已公布協(xié)議(masayukik.等人natureprotocols5，1596-1607(2010)進(jìn)行dna印跡分析。簡而言之，從獲自史丹佛血液中心(stanfordbloodcenter)處的匿名供體的非選擇血液樣品提取基因組dna并且分離出高分子量dna。通過在40μl的反應(yīng)體積中與20uhphi(目錄號r0158s，newenglandbiolabsinc.，ipswich，ma)和20umnli(目錄號r0163s，newenglandbiolabsinc.)一起在37℃下孵育6小時(shí)或過夜(≥16h)來消化基因組dna(3-5μg)。在0.5xtbe存在下使用0.5％瓊脂糖凝膠通過瓊脂糖凝膠電泳分離消化的基因組dna，其中電泳在bioradsub-cellgt凝膠裝置中在40vdc下進(jìn)行16小時(shí)。使用了dig標(biāo)記的尺寸標(biāo)記iii(目錄號11218603910，rocheappliedscience，indianapolis，in)和vii(目錄號11669940910，rocheappliedscience)。將凝膠中的dna脫嘌呤化(0.25mhcl)、變性(0.5mnaoh，1.5mnacl)并且轉(zhuǎn)移至turboblottertm系統(tǒng)(目錄號10416316，gehealthcarebio-sciencescorp.，piscataway，nj)。在20xssc轉(zhuǎn)移緩沖液存在下轉(zhuǎn)移到nytranspc膜上，并且進(jìn)行4小時(shí)至過夜(約16小時(shí))。通過在stratagene交聯(lián)劑中在120mjcm-2下用dna兩次處理膜將dna交聯(lián)至膜，并且在digeasyhyb(目錄號11603558001，rocheappliedscience)中在37℃下預(yù)先雜交2小時(shí)，接著與2.5pmoldig標(biāo)記的teloprobe(seqidno.：19；獲自idt和hplc純化的)/mleasyhyb溶液(使用總共30pmol探針或針對12ml使用6.6μl)在37℃下雜交過夜。通過抗地高辛-ap(目錄號1109327491，rocheappliedscience)檢測信號并且使用bioradchemidoc成像儀捕捉圖像。實(shí)施例12-端粒限制性片段長度定量利用imagej軟件使用以下程序定量trf(參見http://imagej.nih.gov/ij/)。生成將移動(dòng)性轉(zhuǎn)換為分子量的標(biāo)準(zhǔn)曲線。在imagej程序中，從孔的頂部至底部劃出一條直線，然后選擇菜單選項(xiàng)：選擇分析(analyze)->繪制譜圖(plotprofile)、選擇“列表(list)”,然后在新窗口中，“文件(file)->另存為(saveas)”并且保存分子梯的譜圖。在excel中打開譜圖，用圖表表示距離相對于強(qiáng)度的關(guān)系。人工找出對應(yīng)于每個(gè)峰的距離/強(qiáng)度。用圖表表示針對峰的距離相對于log(分子量)的散點(diǎn)圖并且生成線性公式log(mw)＝a*距離+b。每個(gè)泳道的端粒限制性片段(trf)的生成。如上所述，在imagej中，針對每個(gè)泳道生成譜圖并且通過應(yīng)用上述公式針對每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)使用excel將距離轉(zhuǎn)化為log(mw)，并且將log(mw)數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)化為mw數(shù)據(jù)。我們?nèi)缓笸ㄟ^將強(qiáng)度(來自imagej譜圖)數(shù)據(jù)除以mw數(shù)據(jù)獲得強(qiáng)度/mw數(shù)據(jù)。20kb和1kb位置基于mw數(shù)據(jù)組被識別出并且被用于使用20kb至1kb的數(shù)據(jù)點(diǎn)通過下述公式計(jì)算trf長度(kbp)：trf＝sum(強(qiáng)度)/sum(i強(qiáng)度/mw)。實(shí)施例13-atl標(biāo)準(zhǔn)曲線的pcr效率通過將純化的y3-telotailpcr產(chǎn)物稀釋在dna懸浮緩沖液(10mmtris·hcl，0.1mmedta)中制備y3-telotailpcr產(chǎn)物的1ng/μl儲備溶液(通過picogreen方法測定的)并且將所述儲備溶液以20μl等分試樣儲存在-20℃下。用dna懸浮緩沖液進(jìn)行1:50稀釋以制備20pg/μl的y3-telotailpcr產(chǎn)物。進(jìn)一步進(jìn)行3倍系列稀釋液以創(chuàng)建8點(diǎn)標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中20pg/μl為最高濃度。使用先前所述的cawthon(cawthon，r.m.，nucleic.acidsres.，2002，30(10):e47)的qpcr測定確定y3-telotailpcr產(chǎn)物的8點(diǎn)系列稀釋液的t/s比。利用絕對定量法和二階導(dǎo)數(shù)法使用rochelc480軟件計(jì)算pcr效率。平均效率為91.6％(stdev＝6％)。這稍微高于參考標(biāo)準(zhǔn)嵌合型男性基因組dna的pcr效率(平均值88.4％)。所有四次運(yùn)行具有大于0.99的線性r2(表13)。典型的標(biāo)準(zhǔn)曲線示出在圖9中。表13.實(shí)施例14-測試樣品中atl的計(jì)算a.將y3-telotailpcrdna濃度轉(zhuǎn)換為端粒序列濃度。y3-telotailpcr產(chǎn)物為268bp長的雙鏈擴(kuò)增子，其中135bp的擴(kuò)增子是完全的端粒重復(fù)序列(ttaggg:ccctaa)。這種擴(kuò)增子的分子量(“mw”)為165477.2，并且一分子的擴(kuò)增子的重量為mw除以阿佛加德羅常數(shù)(avogadro'snumber)。因此，y3-telotailpcr產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)物的重量為：165477.2/6.02x1023＝2.74879x10-19g。pcr反應(yīng)中使用的標(biāo)準(zhǔn)物(std1)的最高濃度為基于picogreen測定的2pg/μldna。因此，提供std1中的dna分子數(shù)/μl的計(jì)算如下：2x10-12/2.74879x10-19＝7275929。因此，使上述值乘以135得出下述結(jié)果，在std1中存在982250kb完全的端粒序列/μl。將使用y3克隆標(biāo)準(zhǔn)物計(jì)算的端粒濃度轉(zhuǎn)換為完全的端粒序列濃度(kb/μl)的公式：b.使用人β球蛋白濃度計(jì)算基因組拷貝數(shù)濃度。單倍體人基因組分子的重量為3.59x10-3ng。人β球蛋白濃度為人基因組中的單拷貝基因的一個(gè)量度。然后，對于單拷貝基因諸如β球蛋白，每單倍體基因組拷貝數(shù)濃度(拷貝數(shù)/μl)可以如下計(jì)算：濃度(ng/ul)/(0.00359x2)(值b)。c.絕對端粒長度的計(jì)算絕對端粒序列/基因組(kb/基因組)等于完全的端粒序列濃度/基因組拷貝數(shù)濃度，其進(jìn)而等于下述計(jì)算結(jié)果：值a/值b，其中值如以上本文所述那樣計(jì)算。因此，染色體的每個(gè)末端上的atl(kb)計(jì)算如下：(值a/值b)/92。實(shí)施例15-t/s值與atl的相關(guān)性使用本文所述的方法確定t/s比并且將所述t/s比與使用以上本文所述的計(jì)算導(dǎo)出的atl值進(jìn)行比較。三個(gè)qc樣品的比較顯示，所述值是高度相關(guān)的，具有0.99998的r2(圖10)。基于這些數(shù)據(jù)，推導(dǎo)出以下公式：kbp＝2.4555*(t/s)+0.005此外，使用來源于用端粒酶hter的rna組分的基因感染的umuc-3膀胱癌細(xì)胞系的一系列基因組dna來比較t/s比和atl。獲得類似的結(jié)果并且針對這些數(shù)據(jù)推導(dǎo)出以下公式：kbp＝2.589*(t/s)-0.074使用剛制備的y3標(biāo)準(zhǔn)物，來自兩個(gè)獨(dú)立運(yùn)行的qc樣品的t/s和atl相關(guān)性示出在下表14中。表14.實(shí)施例16-t/s和atl與umuc3-hter系列的相關(guān)性使用用端粒酶的rna組分(ter)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細(xì)胞系(umuc3)進(jìn)一步評估端粒長度(kbp)與t/s比之間的關(guān)系(即確定kbp/t/s單位)，從而增加端粒酶活性并且將ttaggg重復(fù)序列添加至染色體的末端。對這種細(xì)胞系進(jìn)行命名(umuc3-ter)。umuc3-ter中端粒的長度因細(xì)胞在培養(yǎng)中擴(kuò)增而隨時(shí)間增加。使用通過cawthon(cawthon，r.m.，nucleic.acidsres.，2002，30(10):e47)描述的測定確定t/s。對于圖11中的每個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)，y軸表示如本文所述那樣測定的平均末端限制性片段長度(trf)(kbp)，并且x軸表示所測定的dna樣品的t/s比。因?yàn)槎肆Ｃ竷H將端粒dna添加至染色體的末端，所以曲線斜率是端粒dna/t/s單位的直接量度：其從這個(gè)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生2.45kbp/t/s單位。實(shí)施例17-通過dna印跡分析對t/s與trf進(jìn)行比較作為驗(yàn)證決定端粒長度計(jì)算的第三獨(dú)立方法，相同umuc3-hter系列的端粒長度使用dna印跡分析測定。將基因組dna用hphi和mnli消化，在0.5％凝膠上運(yùn)行，并且用包含四個(gè)端粒重復(fù)序列的寡核苷酸探測。為了計(jì)算端粒限制性片段，使用了由harley等人(nature(1990)345(6274):458-60)最初提出的公式。這個(gè)公式還由cawthon等人用于比較t/s比與trf(cawthon，r.m.，nucleic.acidsres.，2002，30(10):e47)。將使用由cawthon(cawthon，r.m.，nucleic.acidsres.，2002，30(10):e47)描述的測定得出的t/s比與trf結(jié)果比較得到以下公式：trf＝2.1518*(t/s)+1.4257(r2＝0.97283)。這個(gè)公式中的y截距表示子端粒區(qū)域的平均長度(cawthon，r.m.，nucleic.acidsres.，2002，30(10):e47),并且斜率代表用于將t/s比轉(zhuǎn)換為bp的因子。因此，在這個(gè)測定中：kbp＝2.1518*(t/s)，其提供了2.15kbp/t/s單位的轉(zhuǎn)換因子。對來源于人肺成纖維細(xì)胞imr90的基因組dna的樣品使用類似的方法。farzaneh-farr等人(參見farazaneh-far，r.等人(2010)plosone5(1)：e8612.doi:10.1371/)journal.pone.0008612)報(bào)道：trf＝2.413*(t/s)+3.274。因此，使用以上公式，存在2.41kbp/t/s單位，即：kbp＝2.413*(t/s)。這非常類似于上述的轉(zhuǎn)換因子。不希望受特定理論的束縛，可能的是y截距(子端粒區(qū)域長度)的差異是由于在lin等人中，使用rsai和hinfi消化基因組dna的事實(shí)。已知hphi和mnli(在這個(gè)報(bào)道中使用的)與rsai和hinfi相比更靠近于端粒區(qū)域進(jìn)行切割。此外，不希望受特定理論的束縛，在本文所述的研究中和在farzaneh-farr等人(參見farazaneh-far，r.等人，(2010)plosone5(1)：e8612.doi:10.1371/journal.pone.0008612)中使用了兩種不同的細(xì)胞系。因此，可能的是這些細(xì)胞系具有不同的子端粒長度。實(shí)施例18-聚集型atl轉(zhuǎn)換因子概括地說，使用了表15中的將t/s比轉(zhuǎn)換為bp的聚集型端粒長度轉(zhuǎn)換因子數(shù)據(jù)。來自表15中的四個(gè)結(jié)果值(來自四種不同的方法)的轉(zhuǎn)換因子平均值為2.4kbp/t/s單位，對于4個(gè)估計(jì)值具有0.19的標(biāo)準(zhǔn)偏差。表15.*使用如本文所述的三個(gè)qc樣品比較t/s比和atl。**使用如本文所述的umuc3-hter樣品比較t/s比和atl?；趤碜詂awthon，r.m.，nucleicacidsres.，2009，37(3):e21的數(shù)據(jù)。基于來自farzaneh-farr等人(參見farazaneh-far，r.等人(2010)plosone5(1)：e8612.doi:10.1371/joumal.pone.0008612)的數(shù)據(jù)。實(shí)施例19-對定量典型端粒序列的引物影響“變異序列”是一術(shù)語，所述術(shù)語是指常常見于dna的子端粒區(qū)域內(nèi)但不被認(rèn)為是真正的端粒序列的dna序列。真正的端粒重復(fù)序列由ccctaa:ttaggg單元組成，而變異序列可含有“簡并”的類似端粒的序列。端粒長度測定的任何方法的一個(gè)挑戰(zhàn)是區(qū)分“真正的”或典型的端粒和因與典型端粒序列的小數(shù)目堿基對，例如1-3個(gè)堿基對差異而與典型重復(fù)序列不同的一系列重復(fù)序列。這種變體或簡并序列的具體實(shí)例包括tgaggg、tcaggg、ttgggg、ttcggg等。進(jìn)行實(shí)驗(yàn)以比較代表長度為90個(gè)核苷酸(合成的“ultramer”)的典型或簡并的靶序列重復(fù)序列的三個(gè)不同模板的擴(kuò)增。使用三個(gè)不同模板的等摩爾濃度進(jìn)行研究，以便提供下述數(shù)據(jù)，所述數(shù)據(jù)顯示與常常使用的先前標(biāo)準(zhǔn)物，即由cawthon(cawthon，r.m.，nucleic.acidsres.，2002，30(10):e47)描述的引物相比所公開的引物對典型端粒重復(fù)序列的特異性增強(qiáng)。使用的合成的ultramer示出在下表16中。表16.seqidno.ultramer序列28tel-重復(fù)序列/端粒(ccctaa)1529富含g的變體/簡并1(ccctca)1530富含c的變體/簡并2(ccctga)15使用下述引物使用以上本文所述的所公開的三重qpcr測定進(jìn)行測定(參見實(shí)施例1)：使用cawthon引物、telotesttel1b和tel2b引物(分別為seqidno：20和21)或使用telg修飾型和telc修飾型引物(分別為seqidno：1和2)。在圖中，這些測定條件分別稱之為“三重tt”或“atlt”。在第一組實(shí)驗(yàn)中，使用代表“真正的”端粒模板的tel-重復(fù)序列/端粒ultramer(seqidno：28)。如上文所示，其典型由15個(gè)重復(fù)的典型ccctaa端粒序列組成。使用所公開的三重qpcr測定對九個(gè)復(fù)制品的評價(jià)顯示‘t’濃度一致地大于cawthon2002測定中看到的‘t’濃度(參見圖13a)。應(yīng)當(dāng)指出的是，計(jì)算最初的(1x)ultramerdna濃度(1.67ng/μl)以模擬3kb的平均基因組端粒長度。當(dāng)使用高七倍的濃度的模板時(shí)，差異被放大((11.69ng/μl；參見圖13b)。在最初的ultramerdna濃度下，使用所公開的三重qpcr測定在以上本文所述的所公開的條件下確定九個(gè)tel-重復(fù)序列復(fù)制品的平均t濃度，所述平均t濃度使用所述測定確定為0.15ng/μl(參見圖13c)。相比之下，在cawthon2002測定的條件下，使用1x模板濃度將t濃度確定為0.11ng/μl(圖13c)。然而，當(dāng)將ultramerdna濃度增加至7x時(shí)，對于所公開的三重qpcr測定和cawthon2002測定，平均t濃度分別為8.40ng/μl和1.83ng/μl(參見圖13d)。這些數(shù)據(jù)表明，與telotest引物相比，telg修飾型和telc修飾型引物對典型端粒重復(fù)序列具有更大的特異性。實(shí)施例20-對定量富含g的類似端粒的序列的引物影響為了代表位于緊鄰典型端粒重復(fù)序列的端粒相關(guān)區(qū)域中的一種最常見的變體重復(fù)序列中，使用了富含g的變體/簡并ultramer(seqidno：29)。如上所述，這種ultramer序列由15個(gè)重復(fù)的ccctca序列組成。在1x(參見圖14a)和7x(參見圖14b)模板濃度下，與使用telg修飾型和telc修飾型引物相比，在所公開的三重qpcr測定中使用cawthon2002引物產(chǎn)生十倍過量擴(kuò)增的富含g的模板。1x和7x模板濃度(分別為1.67和11.69ng/μl)具有與前一個(gè)實(shí)施例中所述相同的意義。在cawthon2002測定條件下九個(gè)富含g的變體復(fù)制品的平均t濃度為4.30x10-3ng/μl，相比之下，使用所公開的三重qpcr測定產(chǎn)生3.06x10-4ng/μl的t濃度(參見圖14c)。當(dāng)模板濃度增加至7x，即對于cawthon2002測定和所公開的三重qpcr測定分別為4.90x10-3ng/μl和5.34x10-4ng/μl時(shí)，看到類似的值(參見圖14c)。這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的telg修飾型和telc修飾型引物不使用富含g的變體重復(fù)序列tgaggg作為擴(kuò)增模板。另外，這些數(shù)據(jù)與前述實(shí)施例中的數(shù)據(jù)一起表明，本發(fā)明的telg修飾型和telc修飾型引物對典型端粒重復(fù)序列具有更大的特異性。實(shí)施例21-對定量富含c的類似端粒的序列的引物影響端粒相關(guān)區(qū)域中的另一種常見的變體重復(fù)序列為富含c的變體，其由ccctga序列組成，通過富含c的變體/簡并2ultramer(seqidno：30)表示。與使用富含g的變體作為模板產(chǎn)生的數(shù)據(jù)類似，在1x(參見圖15a)和7x(參見圖15b)模板濃度下，與所公開的三重qpcr測定相比，cawthon2002測定產(chǎn)生10倍過量擴(kuò)增的富含c的模板。使用cawthon2002測定的九個(gè)富含c的變體復(fù)制品的平均t濃度為3.99x10-3ng/μl，相比之下，所公開的三重qpcr測定提供了3.06x10-4ng/μl的t濃度(參見圖15c)。當(dāng)模板濃度增加至7x，即對于cawthon2002測定和所公開的三重qpcr測定分別為4.69x10-3ng/μl和6.18x10-4ng/μl時(shí)，看到類似的值(參見圖15c)。這些數(shù)據(jù)表明，本發(fā)明的telg修飾型和telc修飾型引物不使用富含c的變體重復(fù)序列tcaggg作為擴(kuò)增模板。這些數(shù)據(jù)進(jìn)一步證明本發(fā)明的telg修飾型和telc修飾型引物對典型端粒重復(fù)序列具有更大的特異性。基于這個(gè)實(shí)施例和前兩個(gè)實(shí)施例中生成的數(shù)據(jù)，可以推斷出tel1b和tel2b引物以比本發(fā)明的telg修飾型和telc修飾型引物高許多的水平擴(kuò)增典型的端粒變體重復(fù)序列。此外，這些數(shù)據(jù)表明變體重復(fù)序列很可能有助于由cawthon2002測定報(bào)道的較高t/s比。總的來說，這些數(shù)據(jù)意想不到地顯示，本發(fā)明的elg修飾型和telc修飾型引物更特異性地?cái)U(kuò)增典型端粒重復(fù)序列。實(shí)施例22-再現(xiàn)性和精確性進(jìn)行了評價(jià)用于測定端粒長度的本發(fā)明所公開的三重qpcr測定的總變異性的多天、多操作器研究。具體地，由單一操作器在單一運(yùn)行上一式三份地測定40個(gè)全血供體樣品中的每個(gè)。對于3個(gè)復(fù)制品中的每個(gè)計(jì)算t/s比，提供輪次內(nèi)變異性的估計(jì)值。然后在20天內(nèi)重復(fù)相同測定/板布置，早晨一次，晚上一次，使用3個(gè)不同的操作器，總共24個(gè)板復(fù)制品。進(jìn)行二十四(24)個(gè)平均端粒長度(“atl”)測定，針對樣品1-20的12個(gè)atl測定和針對樣品21-40的12個(gè)atl測定。來自多次運(yùn)行的每個(gè)樣品的測定值使用其中“運(yùn)行”為隨機(jī)效應(yīng)的隨機(jī)效應(yīng)模型分析。獲得輪次內(nèi)變異性、輪次間變異性和總輪次變異性的估計(jì)值并且將結(jié)果在下表17中給出。表17.*使用tel1b和tel2b引物的cawthon2002測定。**使用telc修飾型和telg修飾型引物和rna酶p和b2m引物以及如以上本文所述的探針的本發(fā)明測定。前述結(jié)果證明了所公開的三重qpcr測定用于臨床環(huán)境中的優(yōu)異性。例如，在定量t/s比，例如用于評估t/s與給定疾病的相關(guān)性的任何臨床用途中，將存在特定t/s比下截止的閾值以辨別健康個(gè)體或個(gè)體群體與‘患病’個(gè)體或個(gè)體群體之間，或需要不同治療(例如施用不同藥物或治療劑、治療或劑量水平)的受試者或群體之間的差異。因此，測定方法關(guān)于這個(gè)截止值的再現(xiàn)性限定了將可靠地落入健康群體或處于風(fēng)險(xiǎn)下的群體中或需要特定治療的個(gè)體或群體。應(yīng)當(dāng)理解，給定測試方法的cv/總誤差越低，則使用所述方法報(bào)道的結(jié)果越具有再現(xiàn)性。在前述中，所公開的三重qpcr測定觀察到的6％總誤差/再現(xiàn)性為6/11，或者對cawthon2002測定的再現(xiàn)性增強(qiáng)大約二倍。因此，所公開的三重qpcr測定的臨床效用將由于窄的“不確定”區(qū)而被增強(qiáng)大約這個(gè)相同量，并且因此，更多患者將被確定地報(bào)告為健康或患病樣品或需要特定治療。實(shí)施例23-改善的擴(kuò)增效率擴(kuò)增效率是指模板擴(kuò)增與理論最大值(100％)的接近度如何，理論最大值是在每個(gè)qpcr循環(huán)期間擴(kuò)增子模板濃度的準(zhǔn)確加倍。在cawthon2002(telotest測定)的情況下，端粒和單拷貝基因擴(kuò)增子的擴(kuò)增效率通常分別在70-80％和85-95％范圍內(nèi)。相比之下，在所公開的三重qpcr測定的情況下，所有三種擴(kuò)增子(即端粒擴(kuò)增子和兩種不同的單拷貝基因擴(kuò)增子)的qpcr效率通常在95-110％范圍內(nèi)，并且常常在98-101％范圍內(nèi)(參見表5和8)。這表示關(guān)于telotest測定在定量端粒長度或端粒豐度方面的顯著且意料不到的改善。實(shí)施例24-使用正常受試者群體進(jìn)行方法的比較在如以上本文所述的cawthon2002測定和所公開的三重qpcr測定中測試311個(gè)正常人全血樣品。對每次測定觀察到的t/s比進(jìn)行繪圖并且數(shù)據(jù)示出在圖16中。對于兩次測定的t/s比結(jié)果之間的關(guān)系的最佳擬合方程為：y＝1.13x-0.06r2＝0.81。最佳擬合方程產(chǎn)生合理的r2和截距值，但是1.13斜率顯示，cawthon2002測定報(bào)道了比更特異性所公開的三重qpcr測定更高的t/s結(jié)果。這與上文所述的關(guān)于引物特異性觀察到的結(jié)果是一致的。觀察到的平均t/s比之間的差異具有統(tǒng)計(jì)意義上的顯著性，其中t/s的偏移為0.066，并且p＝4x10-6，這表明測定中的差異具有高度顯著性。進(jìn)行313個(gè)正常血液樣品結(jié)果的另外分析以評估在兩種方法中的每種的情況下t/s比結(jié)果在統(tǒng)計(jì)學(xué)上的‘正態(tài)’分布如何。使用shapiro-wild正態(tài)性檢驗(yàn)評估分布，其中較高的ρ值反映出更‘正態(tài)’分布。針對兩種測定方法中的每種所確定的ρ值示出在下表18中，并且意想不到地，它們顯示出所公開的三重qpcr測定的明顯改善的正態(tài)分布。表18.*使用tel1b和tel2b引物的cawthon2002測定。**使用telc修飾型和telg修飾型引物和rna酶p和b2m引物以及如以上本文所述的探針的本發(fā)明測定。本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易知可產(chǎn)生本公開的各種修改和變化而不背離本發(fā)明的范圍或精神。在考慮到本發(fā)明的說明書和實(shí)踐的情況下，本發(fā)明的其他實(shí)施方案對于本領(lǐng)域技術(shù)人員而言將是顯而易見的。意圖僅將本說明書和實(shí)施例理解為示例性的，其中本發(fā)明的真實(shí)范圍和精神由所附權(quán)利要求書來指示。序列各種核苷酸序列、其名字和相關(guān)seqidno提供在下表16中。表16.序列表<110>telomerediagnostics,inc.harley,calvinlin,jueguegler,karl<120>多重定量pcr<130>37502.0004u3-<150>62/098,057<151>2014-12-30<150>62/163,434<151>2015-05-19<160>30<170>patentin3.5版<210>1<211>45<212>dna<213>合成的<400>1acacctcctccatggtttgggtttgggtttgggtttgggttagtg45<210>2<211>43<212>dna<213>合成的<400>2tgttagcgacgcgatatccctatccctatccctatccctaaca43<210>3<211>22<212>dna<213>合成的<400>3ccagcagagaatggaaagtcaa22<210>4<211>28<212>dna<213>合成的<400>4tctctctccattcttcagtaagtcaact28<210>5<211>27<212>dna<213>合成的<400>5atgtgtctgggtttcatccatccgaca27<210>6<211>21<212>dna<213>合成的<400>6gttctctgggaactcacctcc21<210>7<211>20<212>dna<213>合成的<400>7atgtcccttgggaaggtctg20<210>8<211>21<212>dna<213>合成的<400>8cctaacagggctctccctgag21<210>9<211>20<212>dna<213>合成的<400>9tggccctagtctcagacctt20<210>10<211>20<212>dna<213>合成的<400>10cggagggaagctcatcagtg20<210>11<211>18<212>dna<213>合成的<400>11ctgagtgcgtcctgtcac18<210>12<211>140<212>dna<213>合成的<400>12cctaacctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaacc60ctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaacc120ctaaccctaaccctaaccct140<210>13<211>12<212>dna<213>合成的<400>13ttagggttaggg12<210>14<211>45<212>dna<213>合成的<400>14tgctcggccgatctggcatccctaaccctaaccctaaccctaacc45<210>15<211>27<212>dna<213>合成的<400>15gatggatcctgagggtgagggtgaggg27<210>16<211>20<212>dna<213>合成的<400>16gttgtaaaacgacggccagt20<210>17<211>21<212>dna<213>合成的<400>17tcacacaggaaacagctatga21<210>18<211>20<212>dna<213>合成的<400>18tgctcggccgatctggcatc20<210>19<211>24<212>dna<213>合成的<400>19ccctaaccctaaccctaaccctaa24<210>20<211>39<212>dna<213>合成的<400>20cggtttgtttgggtttgggtttgggtttgggtttgggtt39<210>21<211>39<212>dna<213>合成的<400>21ggcttgccttacccttacccttacccttacccttaccct39<210>22<211>20<212>dna<213>合成的<400>22aagggaagcgggtcgttatg20<210>23<211>21<212>dna<213>合成的<400>23gcagaatttgatgcttgggac21<210>24<211>19<212>dna<213>合成的<400>24tcaccattggcaatgagcg19<210>25<211>22<212>dna<213>合成的<400>25tggagttgaaggtagtttcgtg22<210>26<211>17<212>dna<213>合成的<400>26tggacctgacctgccgt17<210>27<211>18<212>dna<213>合成的<400>27tggaggagtgggtgtcgc18<210>28<211>90<212>dna<213>合成的<400>28ccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaaccctaa60ccctaaccctaaccctaaccctaaccctaa90<210>29<211>90<212>dna<213>合成的<400>29ccctcaccctcaccctcaccctcaccctcaccctcaccctcaccctcaccctcaccctca60ccctcaccctcaccctcaccctcaccctca90<210>30<211>90<212>dna<213>合成的<400>30ccctgaccctgaccctgaccctgaccctgaccctgaccctgaccctgaccctgaccctga60ccctgaccctgaccctgaccctgaccctga90當(dāng)前第1頁12