交叉引用

本申請(qǐng)要求2014年11月20日提交的第62/082,534號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)、2014年11月20日提交的第62/082,538號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)和2014年11月20日提交的第62/082,541號(hào)美國(guó)臨時(shí)專利申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，這些申請(qǐng)均通過(guò)引用以其全文并入本文以用于所有目的。

背景技術(shù)：

核酸擴(kuò)增方法允許擴(kuò)增樣品如生物樣品中的核酸分子。核酸分子可以經(jīng)由例如基于熱循環(huán)的方法(例如，聚合酶鏈反應(yīng)(pcr))或經(jīng)由等溫方法來(lái)擴(kuò)增。核酸分子擴(kuò)增后，可以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物并由最終用戶解釋檢測(cè)的結(jié)果。核酸擴(kuò)增還可以用于制備核酸分子以供與核酸分析相關(guān)的許多應(yīng)用中的后續(xù)分析，這些應(yīng)用例如是檢測(cè)靶核酸序列、單核苷酸多態(tài)性(snp)、序列突變(例如，缺失、插入)，檢測(cè)樣品中的罕見(jiàn)核酸分子/序列和/或制備用于測(cè)序反應(yīng)的核酸分子。因此，由于核酸擴(kuò)增對(duì)于廣泛應(yīng)用的適用性，對(duì)于可用于擴(kuò)增核酸分子和/或可用于分析由核酸擴(kuò)增生成的擴(kuò)增的核酸分子的組合物、試劑盒、方法和系統(tǒng)存在需要。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本公開內(nèi)容提供了用于核酸的擴(kuò)增和分析的組合物、試劑盒、方法和系統(tǒng)。此外，本公開內(nèi)容提供了用于生成和分析包含顆粒和核酸的復(fù)合體的組合物、試劑盒、方法和系統(tǒng)。本文公開的方法和組合物在例如研究、環(huán)境測(cè)試、法醫(yī)鑒定和臨床診斷中得到廣泛應(yīng)用。

本公開內(nèi)容的一方面提供了用于核酸擴(kuò)增的顆粒組。該顆粒組可包含第一顆粒，該第一顆粒包含具有5’端和3’端的第一引物，其中第一引物經(jīng)由該第一引物的5’端與第一顆粒連接，并且其中第一引物在靶核酸鏈的5’端顯示出與靶核酸鏈的序列同源性。該顆粒組還可包含第二顆粒，該第二顆粒包含具有5’端和3’端的第二引物，其中第二引物經(jīng)由該第二引物的5’端與第二顆粒連接，并且其中第二引物在靶核酸鏈的互補(bǔ)核酸鏈的5’端顯示出與該互補(bǔ)核酸鏈的序列同源性。此外，第一引物與之顯示出同源性的靶核酸鏈上的序列可不同于第二引物與之顯示出同源性的互補(bǔ)核酸鏈上的序列。

在一些實(shí)施方案中，第一顆粒和/或第二顆?？杀话诜謪^(qū)(partition)中，該分區(qū)可以是例如乳液中的小滴、孔或容器。在該分區(qū)為孔的情況下，該孔可以是孔陣列中的孔。在一些實(shí)施方案中，第一引物的3’端可適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成靶核酸鏈或其一部分的拷貝。在一些實(shí)施方案中，第二引物的3’端可適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成互補(bǔ)核酸鏈或其一部分。在一些實(shí)施方案中，第一顆?？砂辽賰蓚€(gè)第一引物和/或第二顆?？砂辽賰蓚€(gè)第二引物。在一些實(shí)施方案中，該顆粒組可進(jìn)一步包含第三顆粒，該第三顆?？砂谝灰锖?或第二引物。

在一些實(shí)施方案中，第一和/或第二顆?？蛇x自固體顆粒、多孔顆粒、納米顆粒、珠粒、微粒、金屬顆粒、磁性顆粒、半導(dǎo)體顆粒、聚合物顆粒和核酸顆粒。在一些實(shí)施方案中，第一或第二引物可與第一和第二顆粒中相應(yīng)的一個(gè)直接連接。在一些實(shí)施方案中，第一或第二引物可通過(guò)至少一個(gè)連接體與第一和第二顆粒中相應(yīng)的一個(gè)連接。該連接體可以選自核酸、磷酸部分、氨基酸、肽、烴鏈、聚乙二醇(peg)、多糖及其組合。在一些實(shí)施方案中，第一和/或第二顆?？砂x自金、銀、銅、鉑、鈀、金屬氧化物、聚合物、碳及其組合的材料。在一些實(shí)施方案中，第一顆粒和/或第二顆粒可具有約0.5nm至約100nm的尺寸。在一些實(shí)施方案中，第一顆粒和/或第二顆粒可具有約1nm至約20nm的尺寸。

本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于核酸擴(kuò)增的顆粒組。該顆粒組可包含第一顆粒，該第一顆粒包含具有5’端和3’端的第一引物，其中第一引物經(jīng)由該第一引物的5’端與第一顆粒連接，并且其中第一引物在靶核酸鏈的5’端顯示出與該靶核酸鏈的序列同源性。該顆粒組還可包含第二顆粒，該第二顆粒包含具有5’端和3’端的第二引物，其中第二引物經(jīng)由該第二引物的5’端與第二顆粒連接，并且其中第二引物在靶核酸鏈的互補(bǔ)核酸鏈的5’端顯示出與該互補(bǔ)核酸鏈的序列同源性。此外，第一引物與之顯示出同源性的靶核酸鏈的序列可以與第二引物與之顯示出互補(bǔ)性的靶核酸鏈的序列相隔至少約10個(gè)核苷酸。

在一些實(shí)施方案中，第一引物與之顯示出同源性的靶核酸鏈上的序列可以與第二引物與之顯示出互補(bǔ)性的靶核酸鏈上的序列相隔至少約25個(gè)核苷酸、至少約50個(gè)核苷酸或至少約100個(gè)核苷酸。在一些實(shí)施方案中，第一顆粒和/或第二顆粒可被包含在分區(qū)中，例如乳液中的小滴、孔或容器中。在該分區(qū)為孔的情況下，該孔可以在孔陣列中。

在一些實(shí)施方案中，第一顆粒可包含至少兩個(gè)第一引物和/或第二顆?？砂辽賰蓚€(gè)第二引物。在一些實(shí)施方案中，第一和/或第二顆粒可選自固體顆粒、多孔顆粒、納米顆粒、珠粒、微粒、金屬顆粒、磁性顆粒、半導(dǎo)體顆粒、聚合物顆粒和核酸顆粒。在一些實(shí)施方案中，第一和/或第二顆?？砂x自金、銀、銅、鉑、鈀、金屬氧化物、聚合物、碳及其組合的材料。在一些實(shí)施方案中，第一顆粒和/或第二顆?？删哂屑s0.5nm至約100nm的尺寸。在一些實(shí)施方案中，第一顆粒和/或第二顆?？删哂屑s1nm至約20nm的尺寸。

本公開內(nèi)容的附加方面提供了分離的核酸復(fù)合體。該分離的核酸復(fù)合體可包含具有至少第一鏈和至少部分互補(bǔ)于該第一鏈的第二鏈的雙鏈核酸分子。該第一鏈可在該第一鏈的5’端與第一顆粒偶聯(lián)，并且該第二鏈可在該第二鏈的5’端與單獨(dú)的第二顆粒偶聯(lián)。

在一些實(shí)施方案中，所述雙鏈核酸分子可包含第一端序列和第二端序列，其中第一端序列經(jīng)由與第一顆粒連接的第一捕獲序列而與第一顆粒復(fù)合。第二端序列可經(jīng)由與第二顆粒連接的第二捕獲序列而與第二顆粒復(fù)合。此外，第一捕獲序列可至少部分互補(bǔ)于第一端序列，并且第二捕獲序列可至少部分互補(bǔ)于第二端序列。

在一些實(shí)施方案中，第一捕獲序列可在該第一捕獲序列的3’端與第一顆粒連接和/或第二捕獲序列可在該第二捕獲序列的3’端與第二顆粒連接。在一些實(shí)施方案中，第一鏈可在該第一鏈的5’端與第一顆粒共價(jià)連接和/或第二鏈可在該第二鏈的5’端與第二顆粒共價(jià)連接。在一些實(shí)施方案中，所述核酸復(fù)合體可以不固定于支持物上。

在一些實(shí)施方案中，所述分離的核酸復(fù)合體可進(jìn)一步包含至少三個(gè)顆粒、至少五個(gè)顆?；蛑辽偈畟€(gè)顆粒，所述顆粒中的每一個(gè)可通過(guò)與該雙鏈核酸分子基本相同的附加雙鏈核酸分子而與另一顆粒連接。在一些實(shí)施方案中，第一顆粒和/或第二顆?？砂s0.5納米(nm)至約100納米的尺寸。在一些實(shí)施方案中，第一顆粒和/或第二顆?？砂s1nm至約20nm的尺寸。

在一些實(shí)施方案中，所述核酸復(fù)合體可被包含在分區(qū)中，例如乳液中的小滴、孔或容器中。在該分區(qū)為孔的情況下，該孔可以是孔陣列中的孔。在一些實(shí)施方案中，第一和/或第二顆?？蛇x自固體顆粒、多孔顆粒、納米顆粒、珠粒、微粒、金屬顆粒、磁性顆粒、半導(dǎo)體顆粒、聚合物顆粒和核酸顆粒。在一些實(shí)施方案中，第一和/或第二顆?？砂x自金、銀、銅、鉑、鈀、金屬氧化物、聚合物、碳及其組合的材料。

本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于測(cè)定在具有或懷疑具有靶核酸鏈的樣品中存在或不存在靶核酸鏈的試劑盒。該試劑盒可包含第一顆粒和第二顆粒。第一顆粒可包含具有與靶核酸鏈的一部分顯示出序列同源性的第一核酸序列的第一引物，并且第二顆粒可包含具有與靶核酸鏈的互補(bǔ)核酸鏈的一部分顯示出序列同源性的第二核酸序列的第二引物。此外，第一核酸序列可不同于第二核酸序列。該試劑盒還可包含關(guān)于使用第一和第二顆粒經(jīng)由引物延伸反應(yīng)來(lái)鑒定樣品中靶核酸鏈的存在或不存在的說(shuō)明書。

在一些實(shí)施方案中，第一和/或第二顆?？杀话谌萜髦小Ｔ谝恍?shí)施方案中，第一和/或第二顆粒可選自固體顆粒、多孔顆粒、納米顆粒、珠粒、微粒、金屬顆粒、磁性顆粒、半導(dǎo)體顆粒、聚合物顆粒和核酸顆粒。在一些實(shí)施方案中，第一和/或第二顆?？砂x自金、銀、銅、鉑、鈀、金屬氧化物、聚合物、碳及其組合的材料。

在一些實(shí)施方案中，該試劑盒可進(jìn)一步包含適合于生成油包水乳液的一種或多種試劑。此類試劑包括，例如，緩沖液、油和表面活性劑。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒可進(jìn)一步包含允許鑒定靶核酸鏈的可檢測(cè)物質(zhì)。該可檢測(cè)物質(zhì)可以是，例如，光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒可進(jìn)一步包含進(jìn)行該引物延伸反應(yīng)所需的試劑。此類試劑包括，例如，聚合酶和核苷酸。

本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于測(cè)定在具有或懷疑具有靶核酸分子的樣品中靶核酸分子的存在與否的方法。該方法可包括在產(chǎn)生與至少第一顆粒和第二顆粒連接的擴(kuò)增的靶核酸分子的條件下使樣品在反應(yīng)混合物中經(jīng)歷核酸擴(kuò)增反應(yīng)，該擴(kuò)增的靶核酸分子包含靶核酸分子的序列的至少一部分。該反應(yīng)混合物可包含具有帶有5’端和3’端的第一引物的第一顆粒。第一引物可經(jīng)由該第一引物的5’端與第一顆粒連接，并且第一引物可在靶核酸分子鏈的5’端顯示出與靶核酸分子鏈的序列同源性。該反應(yīng)混合物還可包含具有帶有5’端和3’端的第二引物的第二顆粒。第二引物可經(jīng)由該第二引物的5’端與第二顆粒連接，并且第二引物可在靶核酸分子鏈的互補(bǔ)鏈的5’端顯示出與該互補(bǔ)鏈的序列同源性。第一引物與之顯示出同源性的靶核酸分子鏈上的序列可不同于第二引物與之顯示出同源性的互補(bǔ)鏈的序列。此外，第一引物和第二引物可適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成靶核酸分子或其一部分的拷貝。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物可進(jìn)一步包含聚合酶。這樣的聚合酶可在引物延伸反應(yīng)中延伸第一引物的3’端以形成靶核酸鏈或其一部分的拷貝。此外，這樣的聚合酶可在引物延伸反應(yīng)中延伸第二引物的3’端以形成互補(bǔ)鏈或其一部分。在一些實(shí)施方案中，該反應(yīng)混合物可進(jìn)一步包含光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì)，例如染料或熒光蛋白。在一些實(shí)施方案中，該反應(yīng)混合物可被包含在分區(qū)中，例如乳液中的小滴、孔或容器中。在該分區(qū)為孔的情況下，該孔可以是孔陣列中的孔。

在一些實(shí)施方案中，所述方法可進(jìn)一步包括檢測(cè)與第一顆粒和第二顆粒連接的擴(kuò)增的靶核酸分子。例如，可光學(xué)地、電學(xué)地、物理地、光譜學(xué)地、電化學(xué)地或靜電學(xué)地檢測(cè)該擴(kuò)增的靶核酸分子。在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)到多個(gè)擴(kuò)增的靶核酸分子。在一些實(shí)施方案中，該靶核酸分子可以是單鏈的。

本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于生成包含靶核酸分子的核酸復(fù)合體的方法。該方法可包括在產(chǎn)生該核酸復(fù)合體的條件下在反應(yīng)混合物中用正向引物和反向引物擴(kuò)增靶核酸分子。該核酸復(fù)合體可包含擴(kuò)增的靶核酸分子，其中該擴(kuò)增的靶核酸分子包含第一鏈和至少部分互補(bǔ)于該第一鏈的第二鏈。第一鏈可在該第一鏈的5’端與第一顆粒偶聯(lián)，并且第二鏈可在該第二鏈的5’端與第二顆粒偶聯(lián)。

在一些實(shí)施方案中，所述正向引物可與第一顆粒連接且所述反向引物可與第二顆粒連接。在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物可包含該第一顆粒和該第二顆粒。在一些實(shí)施方案中，所述方法可進(jìn)一步包括采用在其上連接有該正向引物或反向引物的第三顆粒來(lái)擴(kuò)增靶核酸分子以產(chǎn)生該核酸復(fù)合體。該核酸復(fù)合體可進(jìn)一步包含經(jīng)由附加的擴(kuò)增的靶核酸分子與第一顆粒和/或第二顆粒偶聯(lián)的第三顆粒。

在一些實(shí)施方案中，所述方法可進(jìn)一步包括檢測(cè)核酸復(fù)合體。例如，可光學(xué)地、光譜學(xué)地、物理地、電學(xué)地、電化學(xué)地或靜電學(xué)地檢測(cè)該核酸復(fù)合體。在一些實(shí)施方案中，第一顆粒和第二顆粒可以是金屬顆粒，并且該核酸復(fù)合體的檢測(cè)可通過(guò)目視檢查來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，該方法可進(jìn)一步包括借助于光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì)來(lái)檢測(cè)該核酸復(fù)合體。

在一些實(shí)施方案中，所述方法可進(jìn)一步包括通過(guò)核酸復(fù)合體的離心、磁分離、沉降、過(guò)濾、色譜法、毛細(xì)管作用或親和捕獲來(lái)分離所述核酸復(fù)合體。在一些實(shí)施方案中，該方法可進(jìn)一步包括通過(guò)將該核酸復(fù)合體親和捕獲于支持物之上來(lái)分離該核酸復(fù)合體。在一些實(shí)施方案中，該反應(yīng)混合物可被包含在分區(qū)中，例如乳液中的小滴或孔中。在一些實(shí)施方案中，該方法可進(jìn)一步包括將該核酸復(fù)合體從該分區(qū)釋放并檢測(cè)所釋放的核酸復(fù)合體。

本公開內(nèi)容的另一方面提供了用于鑒定樣品中靶核酸分子的存在或不存在的方法。該方法可包括提供懷疑含有靶核酸分子的溶液。該靶核酸分子可包含與第一顆粒連接的第一核酸鏈和與第二顆粒連接的第二核酸鏈。第二鏈可經(jīng)由序列互補(bǔ)性與第一鏈雜交以產(chǎn)生核酸復(fù)合體。該方法可進(jìn)一步包括檢測(cè)指示在溶液中存在或不存在該核酸復(fù)合體的信號(hào)，從而鑒定靶核酸分子的存在。

在一些實(shí)施方案中，提供溶液可包括向檢測(cè)器提供該溶液，并且該檢測(cè)器可檢測(cè)指示在該溶液中存在或不存在靶核酸復(fù)合體的信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，該信號(hào)可指示核酸復(fù)合體的光學(xué)性質(zhì)、物理性質(zhì)、電性質(zhì)、靜電性質(zhì)或電化學(xué)性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，第一顆粒和第二顆?？梢允墙饘兕w粒，并且可通過(guò)目視檢查檢測(cè)該信號(hào)。在一些實(shí)施方案中，該信號(hào)可由光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì)例如染料或熒光蛋白的活動(dòng)生成。染料的實(shí)例包括sybr綠i、sybr綠ii、sybr金、溴化乙錠、亞甲藍(lán)、pyroniny、dapi、吖啶橙、blueview或藻紅蛋白。

在一些實(shí)施方案中，所述溶液可被包含在分區(qū)內(nèi)，例如乳液中的小滴或孔(例如，孔陣列中的孔)中。在一些實(shí)施方案中，該溶液可包含多個(gè)含有兩個(gè)或更多個(gè)顆粒的核酸復(fù)合體。在一些實(shí)施方案中，該核酸復(fù)合體可以不附著于支持物上。

本公開內(nèi)容的另一方面提供了用于測(cè)定樣品中靶核酸序列的存在或不存在的方法。該方法可包括接受測(cè)定樣品中靶核酸序列的存在或不存在的請(qǐng)求。該方法可進(jìn)一步包括通過(guò)檢測(cè)包含與至少第一顆粒和第二顆粒連接的雙鏈核酸分子的至少一個(gè)核酸復(fù)合體來(lái)測(cè)定樣品中靶核酸序列的存在或不存在。該雙鏈核酸分子可包含第一單鏈核酸分子和互補(bǔ)于該第一單鏈核酸分子的第二單鏈核酸分子。第一單鏈核酸分子和第二單鏈核酸分子中的至少一個(gè)可包含靶核酸序列。此外，該方法可進(jìn)一步包括生成指示在該樣品中存在或不存在靶核酸序列的報(bào)告。

在一些實(shí)施方案中，測(cè)定樣品中靶核酸序列的存在或不存在可包括檢測(cè)指示存在或不存在所述核酸復(fù)合體的信號(hào)。例如，該信號(hào)可指示該核酸復(fù)合體的光學(xué)性質(zhì)、物理性質(zhì)、電性質(zhì)、光譜性質(zhì)、靜電性質(zhì)或電化學(xué)性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，該信號(hào)可由光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì)例如染料的活動(dòng)生成。染料的實(shí)例包括sybr綠i、sybr綠ii、sybr金、溴化乙錠、亞甲藍(lán)、pyroniny、dapi、吖啶橙、blueview或藻紅蛋白。

在一些實(shí)施方案中，所述核酸復(fù)合體可在分區(qū)，例如乳液中的小滴或孔(例如，孔陣列中的孔)中被檢測(cè)到。在一些實(shí)施方案中，該核酸復(fù)合體可包含多個(gè)與超過(guò)兩個(gè)顆粒連接的雙鏈核酸分子。在一些實(shí)施方案中，所述報(bào)告是可呈現(xiàn)在電子設(shè)備的電子顯示器的用戶界面上的電子報(bào)告。

本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于生成包含靶核酸分子的核酸復(fù)合體的方法。該方法可包括在反應(yīng)混合物中用正向引物和反向引物擴(kuò)增靶核酸分子以產(chǎn)生擴(kuò)增的靶核酸分子。該正向引物和該反向引物可各自包含能夠在引物延伸反應(yīng)中延伸的3’端和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。該擴(kuò)增的靶核酸分子可包含在該擴(kuò)增的靶核酸分子的一端含有第一突出端序列的第一鏈，以及在該擴(kuò)增的靶核酸分子的另一端含有第二突出端序列的第二鏈。此外，該方法可進(jìn)一步包括使該擴(kuò)增的靶核酸分子與第一顆粒和第二顆粒接觸以產(chǎn)生核酸復(fù)合體。該核酸復(fù)合體可包含擴(kuò)增的靶核酸分子，該擴(kuò)增的靶核酸分子經(jīng)由第一突出端序列與連接第一顆粒的第一捕獲序列之間的序列互補(bǔ)性而與第一顆粒復(fù)合；以及經(jīng)由第二突出端序列與連接第二顆粒的第二捕獲序列之間的序列互補(bǔ)性而與第二顆粒復(fù)合。

在一些實(shí)施方案中，所述正向引物和反向引物可進(jìn)一步包含不能經(jīng)由引物延伸反應(yīng)拷貝的間隔區(qū)。這樣的間隔區(qū)可選自c3間隔區(qū)、脫堿基位點(diǎn)、碳質(zhì)連接體、聚乙二醇(peg)及其組合。在一些實(shí)施方案中，該方法可進(jìn)一步包括將第一鏈與第二捕獲序列連接和/或?qū)⒌诙溑c第一捕獲序列連接。

本公開內(nèi)容的另一方面提供了用于核酸擴(kuò)增的方法。該方法可包括將與第一顆粒連接的正向引物與核酸鏈退火，以及將與第二顆粒連接的反向引物與該核酸鏈的互補(bǔ)鏈退火。該方法可進(jìn)一步包括以模板指導(dǎo)的方式延伸該正向引物和反向引物以產(chǎn)生與第一顆粒連接的第一雙鏈核酸分子和與第二顆粒連接的第二雙鏈核酸分子。該方法可進(jìn)一步包括使第一雙鏈核酸分子和第二雙鏈核酸分子變性以生成與第一顆粒連接的第一單鏈分子和與第二顆粒連接的第二單鏈分子。該方法可進(jìn)一步包括重復(fù)如上所述的退火、延伸和變性，其可通過(guò)將正向引物與第二單鏈分子退火和將反向引物與第一單鏈分子退火來(lái)重復(fù)，以產(chǎn)生包含擴(kuò)增的雙鏈核酸分子的核酸復(fù)合體。該擴(kuò)增的雙鏈核酸分子可在一端與第一顆粒連接且在其另一端與第二顆粒連接。

在一些實(shí)施方案中，所述方法在分區(qū)中進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，該方法可進(jìn)一步包括采用在其上連接有正向引物或反向引物的第三顆粒來(lái)擴(kuò)增核酸鏈以產(chǎn)生核酸復(fù)合體，該核酸復(fù)合體進(jìn)一步包含經(jīng)由附加的擴(kuò)增的雙鏈核酸分子與第一顆粒和/或第二顆粒偶聯(lián)的第三顆粒。在一些實(shí)施方案中，該方法可進(jìn)一步包括光學(xué)地、光譜學(xué)地、物理地、電學(xué)地、電化學(xué)地或靜電學(xué)地檢測(cè)該核酸復(fù)合體。

本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于分析溶液的內(nèi)含物的系統(tǒng)。該系統(tǒng)可包含適合于包含或引導(dǎo)含有核酸復(fù)合體的溶液的檢測(cè)池，該核酸復(fù)合體包含與至少第一顆粒和第二顆粒連接的雙鏈核酸分子。該雙鏈核酸分子可包含第一單鏈核酸分子和與該第一單鏈核酸分子的至少一部分互補(bǔ)的第二單鏈核酸分子。該系統(tǒng)可進(jìn)一步包含檢測(cè)器，它可與該檢測(cè)池連接并檢測(cè)指示在溶液中存在或不存在核酸復(fù)合體的信號(hào)。此外，該系統(tǒng)可進(jìn)一步包含可與該檢測(cè)器連接并且被編程為接收來(lái)自該檢測(cè)器的信號(hào)的計(jì)算機(jī)處理器，該信號(hào)指示存在或不存在該核酸復(fù)合體。該計(jì)算機(jī)處理器還可被編程為根據(jù)所檢測(cè)到的信號(hào)來(lái)確定在該溶液中存在或不存在該核酸復(fù)合體。

在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)池可包含容器或孔陣列。在一些實(shí)施方案中，該檢測(cè)池可包含支持物。在一些實(shí)施方案中，該檢測(cè)池可包含可以是例如微流體通道的流體流動(dòng)路徑。在一些實(shí)施方案中，該檢測(cè)器可選自光學(xué)檢測(cè)器、光譜檢測(cè)器和電化學(xué)檢測(cè)器。

在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)池可進(jìn)一步包含溶液。在一些實(shí)施方案中，該溶液可被包含在分區(qū)內(nèi)，例如孔(例如，孔陣列中的孔)或乳液中的小滴內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，所述核酸復(fù)合體可包含多個(gè)與超過(guò)兩個(gè)顆粒連接的雙鏈核酸分子。

通過(guò)以下僅示出并描述了本公開內(nèi)容的說(shuō)明性實(shí)施方案的詳細(xì)描述，本公開內(nèi)容的附加方面和優(yōu)勢(shì)對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。應(yīng)當(dāng)認(rèn)識(shí)到，本公開內(nèi)容能夠具有其他且不同的實(shí)施方案，并且在均不脫離本公開內(nèi)容的情況下其若干細(xì)節(jié)能夠在各個(gè)明顯方面進(jìn)行修改。因此，附圖和說(shuō)明書在本質(zhì)上應(yīng)被視為說(shuō)明性的，而非限制性的。

援引并入

本說(shuō)明書中提及的所有出版物、專利和專利申請(qǐng)均通過(guò)引用并入本文，其程度如同具體地且單獨(dú)地指出每一個(gè)單獨(dú)的出版物、專利或?qū)＠暾?qǐng)通過(guò)引用并入。

附圖說(shuō)明

本發(fā)明的新穎特征在所附權(quán)利要求中具體地描述。通過(guò)參考以下對(duì)利用本發(fā)明原理的說(shuō)明性實(shí)施方案加以闡述的詳細(xì)描述以及附圖(本文也稱為“圖”)將會(huì)獲得對(duì)本發(fā)明的特征和優(yōu)點(diǎn)的更好的理解，在附圖中：

圖1是分離和檢測(cè)核酸復(fù)合體和/或核酸復(fù)合體的核酸分子的示例方法的示意性描述；

圖2是分離和檢測(cè)核酸復(fù)合體和/或核酸復(fù)合體的核酸分子的示例方法的示意性描述；

圖3a和圖3b是用于核酸擴(kuò)增的示例引物的示意性描述；

圖3c是在核酸擴(kuò)增中使用示例引物的示例方法的示意性描述；

圖4是用于核酸擴(kuò)增以產(chǎn)生核酸復(fù)合體的示例方法的示意性描述；

圖5是用于核酸擴(kuò)增以產(chǎn)生核酸復(fù)合體的示例方法的示意性描述；

圖6是用于核酸擴(kuò)增以產(chǎn)生核酸復(fù)合體以及該核酸復(fù)合體的分離的示例方法的示意性描述；

圖7是用于多重核酸擴(kuò)增的示例方法的示意性描述；

圖8是用于多重核酸擴(kuò)增的示例方法的示意性描述；

圖9是用于處理核酸復(fù)合體以供完成測(cè)序反應(yīng)的示例方法的示意性描述；以及

圖10是包含計(jì)算機(jī)處理器的示例計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的示意性描述。

具體實(shí)施方式

雖然本文已示出并描述了本發(fā)明的各種實(shí)施方案，但此類實(shí)施方案僅通過(guò)實(shí)例的方式予以提供對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員是顯而易見(jiàn)的。在不脫離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員可想到許多變化、改變和替換。應(yīng)當(dāng)理解，可以采用本文描述的本發(fā)明的實(shí)施方案的各種替代方案。

除非上下文另有明確規(guī)定，如本文所用的單數(shù)形式“一個(gè)”、“一種”和“該”包括復(fù)數(shù)指代物。例如，術(shù)語(yǔ)“一個(gè)核酸分子”包括多個(gè)核酸分子，包括其混合物。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“擴(kuò)增(amplify)”和“擴(kuò)增(amplication)”可互換使用且通常是指產(chǎn)生核酸的一個(gè)或多個(gè)拷貝。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“退火”通常是指一個(gè)核酸分子(例如，引物)經(jīng)由核酸分子之間的互補(bǔ)性與另一個(gè)核酸分子(例如，模板核酸分子)的結(jié)合。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“捕獲序列”通常是指這樣一種核酸序列，它與支持物結(jié)合并且能夠經(jīng)由序列互補(bǔ)性與核酸分子偶聯(lián)(例如，雜交)，使得該核酸分子與該捕獲序列的偶聯(lián)將該核酸分子固定于該支持物上。

“互補(bǔ)性”或“互補(bǔ)的”通常是指核酸分子通過(guò)watson-crick或其他類型的堿基配對(duì)與另一個(gè)核酸分子形成氫鍵的能力。“部分互補(bǔ)”通常意指第一核酸序列的一部分將與第二核酸序列的一部分進(jìn)行氫鍵鍵合。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“變性(denaturing)”和“變性(denaturation)”可互換使用且通常是指雙鏈核酸的螺旋結(jié)構(gòu)的全部或部分解旋，并且在一些實(shí)施方案中是指單鏈核酸的二級(jí)結(jié)構(gòu)的解旋。

如本文所用，“可檢測(cè)物質(zhì)”通常是指產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的組合物，其存在或不存在可用來(lái)檢測(cè)核酸和/或核酸的拷貝的存在與否。在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)物質(zhì)可以是光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì)。如本文所用，術(shù)語(yǔ)“光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì)”通常是指在電磁輻射例如光的存在(或不存在)下產(chǎn)生可檢測(cè)信號(hào)的可檢測(cè)物質(zhì)。本文別處提供了可檢測(cè)部分的實(shí)例。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“連接”和“偶聯(lián)”可互換使用且通常是指兩種物質(zhì)的締合。兩種物質(zhì)可以以任何合適的方式連接或偶聯(lián)，其包括直接連接或偶聯(lián)(例如，物質(zhì)之間的直接附接)、間接連接或偶聯(lián)(例如，經(jīng)由與兩種物質(zhì)偶聯(lián)的連接體附接)、共價(jià)附接或非共價(jià)附接(例如，核酸分子之間的雜交、親和結(jié)合對(duì)的成員的結(jié)合、離子相互作用、疏水相互作用、范德華力等)及其組合。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“解鏈溫度”(tm)通常是指雜交并形成雙鏈分子的兩個(gè)單鏈核酸分子彼此解離時(shí)的溫度。在一些實(shí)施方案中，解鏈溫度可指一群相同的雙鏈核酸分子的約5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、99％或更多的相同核酸鏈與它們的互補(bǔ)鏈解離時(shí)的溫度。例如，引物的解鏈溫度可指一群與核酸分子雜交的相同引物中約一半的引物分子與它們各自的核酸分子上它們的互補(bǔ)序列解離時(shí)的溫度。在一些實(shí)施方案中，引物的解鏈溫度可以為約20℃至約80℃。在一些實(shí)施方案中，引物的解鏈溫度可以為約25℃至約75℃。在一些實(shí)施方案中，引物的解鏈溫度可以為約25℃至約60℃。在一些實(shí)施方案中，引物的解鏈溫度可以為約20℃、21℃、22℃、23℃、24℃、25℃、26℃、27℃、28℃、29℃、30℃、31℃、32℃、33℃、34℃、35℃、36℃、37℃、38℃、39℃、40℃、41℃、42℃、43℃、44℃、45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃或更高。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核酸”和“核酸分子”可互換使用且通常是指任何長(zhǎng)度的聚合物形式的核苷酸——脫氧核糖核苷酸(dntp)或核糖核苷酸(rntp)或其類似物。核酸可具有任何三維結(jié)構(gòu)，并且可行使任何已知或未知的功能。核酸的非限制性實(shí)例包括脫氧核糖核酸(dna)、核糖核酸(rna)、肽核酸(pna)、基因或基因片段的編碼區(qū)或非編碼區(qū)、由連鎖分析定義的基因座(多個(gè)基因座)、外顯子、內(nèi)含子、信使rna(mrna)、轉(zhuǎn)移rna、核糖體rna、短干擾rna(sirna)、短發(fā)夾rna(shrna)、微rna(mirna)、核酶、cdna、重組核酸、支鏈核酸、質(zhì)粒、載體、分離的任何序列的dna、分離的任何序列的rna、核酸探針和引物。核酸可以包含一個(gè)或多個(gè)修飾的核苷酸如甲基化核苷酸和核苷酸類似物，例如鎖定核酸(lna)、氟化核酸(fna)、橋連核酸和硫代核苷酸。如果存在的話，可在核酸的組裝之前或之后進(jìn)行核苷酸結(jié)構(gòu)的修飾。核酸的核苷酸的序列可被非核苷酸組分例如連接體或其他類型的間隔區(qū)中斷。核酸可以在聚合反應(yīng)之后例如通過(guò)與可檢測(cè)物質(zhì)的綴合或結(jié)合進(jìn)一步修飾。在一些實(shí)施方案中，核酸可以為在一些實(shí)施方案中可用來(lái)擴(kuò)增另一個(gè)核酸分子的引物。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“核酸復(fù)合體”通常是指包含經(jīng)由一個(gè)或多個(gè)雙鏈核酸分子連接在一起的多個(gè)顆粒的復(fù)合體。核酸復(fù)合體可包含與1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個(gè)或更多個(gè)雙鏈核酸分子締合的至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個(gè)或更多個(gè)顆粒。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“引物”通常是指能夠與模板核酸分子雜交且能夠經(jīng)由該模板核酸分子以模板指導(dǎo)的方式延伸的核酸分子。

“引物延伸反應(yīng)”通常是指引物與核酸鏈的結(jié)合(例如，“退火”)，然后使用核酸鏈作為模板將核苷酸隨該引物摻入(例如，該引物的“延伸”或“延伸”該引物)。引物延伸反應(yīng)可借助于例如聚合酶的酶來(lái)完成。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“反應(yīng)混合物”通常是指包含完成雙鏈核酸分子的變性、引物與核酸鏈的退火、在引物延伸反應(yīng)中引物的延伸和/或核酸擴(kuò)增所需的一種或多種試劑的組合物，此類試劑的非限制性實(shí)例包括對(duì)于靶核酸具有特異性的一種或多種引物、聚合酶、合適的緩沖液、輔因子(例如，二價(jià)和單價(jià)陽(yáng)離子)、核苷酸(例如，脫氧核糖核苷酸(dntp))、任何其他的酶、表面活性劑以及可調(diào)節(jié)核酸雜交的添加劑。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物還可以包含一種或多種可檢測(cè)物質(zhì)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“序列同源性”通常是指兩個(gè)或更多個(gè)核酸分子之間序列一致的程度。例如，當(dāng)與一個(gè)或多個(gè)核酸分子最佳比對(duì)時(shí)，核酸分子可顯示出與一個(gè)或多個(gè)其他核酸分子至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同源性。序列同源性可出現(xiàn)在多個(gè)核酸分子的5’端(例如，兩個(gè)核酸分子可在各自核酸分子的5’端各自具有共同的核酸序列)，出現(xiàn)在多個(gè)核酸分子的3’端(例如，兩個(gè)核酸分子可在各自核酸分子的3’端各自具有共同的核酸序列)；或可出現(xiàn)在不同核酸分子的不同位置(例如，一個(gè)核酸分子可在其5’端具有共同的核酸序列而另一個(gè)核酸分子可在其5’端與3’端之間具有該共同的核酸序列)。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“支持物”通常是指在其上面可固定另一種物質(zhì)的物質(zhì)。支持物的非限制性實(shí)例包括顆粒、孔的表面、容器的表面、固體表面、平面、陣列的表面、多孔表面(例如，多孔表面的微腔)、樹脂(例如，柱中的樹脂)和纖維(例如，膜或支持物中的纖維)。此外，支持物可包含任何合適的材料，其非限制性的實(shí)例包括金屬、金屬氧化物、碳質(zhì)材料和聚合物質(zhì)。支持物可用來(lái)例如固定核酸分子和/或可用來(lái)固定核酸復(fù)合體。

如本文所用，術(shù)語(yǔ)“靶核酸”和“靶核酸分子”可互換使用且通常是指具有靶序列的核酸分子的起始群體中的核酸分子，需要確定該核酸分子的存在、量和/或核苷酸序列或其中一項(xiàng)或多項(xiàng)的變化。在一些實(shí)施方案中，靶核酸分子可以是雙鏈的。在一些實(shí)施方案中，靶核酸分子可以是單鏈的。通常，術(shù)語(yǔ)“靶核酸鏈”是指單鏈靶核酸分子。通常，術(shù)語(yǔ)“靶核酸序列”是指靶核酸鏈上的核酸序列。靶核酸分子或靶核酸序列可以是基因、調(diào)節(jié)序列、基因組dna、cdna、包括mrna、mirna、rrna在內(nèi)的rna，或其他的一部分。靶核酸序列或靶核酸分子可以是來(lái)自樣品或二級(jí)靶標(biāo)如擴(kuò)增反應(yīng)的產(chǎn)物的靶核酸序列或靶核酸分子。

本公開內(nèi)容的各個(gè)方面提供了用于核酸擴(kuò)增的顆粒組以及包含與多個(gè)顆粒連接的核酸分子的分離的核酸復(fù)合體。顆粒組可包含各自與核酸分子如引物和/或捕獲序列締合的第一和第二顆粒。分離的核酸復(fù)合體可包含第一顆粒和第二顆粒，該第一和第二顆粒經(jīng)由連接至該第一顆粒和第二顆粒二者上的雙鏈核酸分子來(lái)連接。

一方面，本公開內(nèi)容提供了用于核酸擴(kuò)增的顆粒組，其包含第一顆粒和第二顆粒。第一顆粒可包含第一引物，該第一引物具有5’端和3’端且經(jīng)由該第一引物的5’端與第一顆粒連接。第一引物可在靶核酸鏈的5’端顯示出與靶核酸鏈的序列同源性。第二顆?？砂诙铮摰诙锞哂?’端和3’端且經(jīng)由該第二引物的5’端與第二顆粒連接。第二引物可在靶核酸鏈的互補(bǔ)核酸鏈的5’端顯示出與該互補(bǔ)核酸鏈的序列同源性。此外，第一引物與之顯示出同源性的靶核酸鏈上的序列可不同于第二引物與之顯示出同源性的互補(bǔ)核酸鏈上的序列。

在另一方面，本公開內(nèi)容提供了用于核酸擴(kuò)增的顆粒組，其包含第一顆粒和第二顆粒。第一顆?？砂谝灰铮摰谝灰锞哂?’端和3’端且經(jīng)由該第一引物的5’端與第一顆粒連接。第一引物可在靶核酸鏈的5’端顯示出與靶核酸鏈的序列同源性。第二顆?？砂诙?，該第二引物具有5’端和3’端且經(jīng)由該第二引物的5’端與第二顆粒連接。第二引物可在靶核酸鏈的互補(bǔ)核酸鏈的5’端顯示出與該互補(bǔ)核酸鏈的序列同源性。此外，第一引物與之顯示出同源性的靶核酸鏈的序列可以與第二引物與之顯示出互補(bǔ)性的靶核酸鏈的序列相隔至少約10個(gè)核苷酸。

在本文所述的任何顆粒組中，第一引物與之顯示出同源性的靶核酸鏈上的序列可與第二引物與之顯示出互補(bǔ)性的靶核酸鏈上的序列相隔至少約10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100個(gè)或更多個(gè)核苷酸。此外，在本文所述的任何顆粒組中，當(dāng)與靶核酸鏈最佳比對(duì)時(shí)，第一引物可在靶核酸鏈的5’端顯示出與靶核酸鏈至少約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同源性。類似地，在本文所述的任何顆粒組中，當(dāng)與靶核酸鏈的互補(bǔ)核酸鏈最佳比對(duì)時(shí)，第二引物可在該互補(bǔ)核酸鏈的5’端顯示出與該互補(bǔ)核酸鏈至少約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同源性。

在本文所述的任何顆粒組中，第一顆?？砂辽偌s1、2、10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000個(gè)或更多個(gè)第一引物分子。此外，第二顆?？砂辽偌s1、2、10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000個(gè)或更多個(gè)第二引物分子。在本文所述的任何顆粒組中，第一顆粒和第二顆粒還可以分別包含第二引物和第一引物。此外，分別與該第一和第二顆粒連接的第一引物和第二引物的長(zhǎng)度可根據(jù)具體應(yīng)用而變化。例如，該第一或第二引物的長(zhǎng)度可以為約1個(gè)核苷酸至約100個(gè)核苷酸長(zhǎng)；約5至約50個(gè)核苷酸長(zhǎng)；約5至約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)；或約15至約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，該第一引物或第二引物的長(zhǎng)度可以為約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個(gè)或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)。

此外，包括經(jīng)由直接附接或經(jīng)由例如至少一個(gè)連接體的間接附接，第一引物可與第一顆粒連接且第二引物可與第二顆粒連接。此類連接體的非限制性實(shí)例包括聚合物質(zhì)、核酸、磷酸部分、氨基酸、肽、烴鏈、多糖、聚乙二醇(peg)及其組合。引物與顆粒之間的直接和間接附接可經(jīng)由共價(jià)鍵(例如，引物與顆粒之間的共價(jià)鍵、連接體與顆粒和/或引物之間的共價(jià)鍵)或非共價(jià)相互作用(例如，核酸分子之間的雜交、親和結(jié)合對(duì)(例如，鏈霉親和素/生物素)的成員的結(jié)合、離子相互作用、疏水相互作用、范德華力等)及其組合。

此外，本文所述的任何顆粒組中的顆?？山?jīng)由任何合適的化學(xué)法或化學(xué)法的組合與各自的引物連接(例如，以供采用可用于連接引物和顆粒的基團(tuán)使顆粒功能化)。此類化學(xué)法的非限制性實(shí)例包括巰基化學(xué)法、膦酸化學(xué)法(例如，在顆粒包含金屬氧化物的情況下)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺(edc)化學(xué)法、醛化學(xué)法、環(huán)氧化學(xué)法、同雙功能交聯(lián)劑化學(xué)法(例如，經(jīng)由胺官能團(tuán)、經(jīng)由巰基官能團(tuán))、異雙功能交聯(lián)劑化學(xué)法(例如，經(jīng)由胺官能團(tuán)、經(jīng)由巰基官能團(tuán))、1,4-亞苯基二異硫氰酸酯(pdc)化學(xué)法、有機(jī)硅烷化、電離氣體處理、uv照射、點(diǎn)擊化學(xué)法、雙丙酮丙烯酰胺交聯(lián)及其組合。

在本文所述的任何顆粒組中，第一引物的3’端可適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成靶核酸鏈或其一部分的拷貝。此外，第二引物的3’端可適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成互補(bǔ)核酸鏈或其一部分。此外，本文所述的任何顆粒組還可以包含比第一顆粒和第二顆粒更多的顆粒，其中每個(gè)附加顆粒包含第一和/或第二引物。例如，本文所述的顆粒組可包含約2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000、50000000、100000000、500000000、1000000000個(gè)或更多個(gè)各自包含第一和/或第二引物的顆粒。

在另一方面，本公開內(nèi)容提供了分離的核酸復(fù)合體。該分離的核酸復(fù)合體可包含具有至少第一鏈和至少部分互補(bǔ)于該第一鏈的第二鏈的雙鏈核酸分子。該第一鏈可在該第一鏈的5’端與第一顆粒偶聯(lián)，并且該第二鏈可在該第二鏈的5’端與單獨(dú)的第二顆粒偶聯(lián)。

在一些實(shí)施方案中，包括經(jīng)由如本文別處所述的供連接引物和顆粒的直接附接或間接附接，所述雙鏈核酸分子的第一鏈可與第一顆粒偶聯(lián)且所述雙鏈核酸分子的第二鏈可與第二顆粒偶聯(lián)。第一和第二鏈與各自顆粒之間的直接和間接附接可經(jīng)由也如本文別處所述的共價(jià)鍵、非共價(jià)相互作用及其組合。例如，第一鏈可在該第一鏈的5’端與第一顆粒共價(jià)連接和/或第二鏈可在該第二鏈的5’端與第二顆粒共價(jià)連接。此外，在一些實(shí)施方案中，分離的核酸復(fù)合體可不固定于支持物上，而是例如懸浮或自由漂浮在液體介質(zhì)中。

在一些實(shí)施方案中，所述雙鏈核酸分子可包含第一端序列和第二端序列。該第一和第二端序列中的每一個(gè)可以是分別與該雙鏈核酸分子的第一和第二鏈的5’或3’端連接的單鏈核酸序列。第一端序列可經(jīng)由與第一顆粒連接的第一捕獲序列而與第一顆粒復(fù)合，且第二端序列可經(jīng)由與第二顆粒連接的第二捕獲序列而與第二顆粒復(fù)合。第一捕獲序列可以是與第一顆粒連接且被配置為經(jīng)由序列互補(bǔ)性與該雙鏈核酸分子的第一端序列雜交的寡核苷酸。第一捕獲序列可以完全或至少部分互補(bǔ)于第一端序列。此外，第二捕獲序列可以是與第二顆粒連接且被配置為經(jīng)由序列互補(bǔ)性與該雙鏈核酸分子的第二端序列雜交的寡核苷酸。第二捕獲序列可以完全或至少部分互補(bǔ)于第二端序列。在一些實(shí)施方案中，第一和/或第二捕獲序列可包含鎖定核酸(lna)。

在一些實(shí)施方案中，第一捕獲序列可在該第一捕獲序列的3’端與第一顆粒連接和/或第二捕獲序列可在該第二捕獲序列的3’端與第二顆粒連接。此外，包括經(jīng)由如本文別處所述的供連接引物和顆粒的直接附接或間接附接，第一捕獲序列可與第一顆粒連接且第二捕獲序列可與第二顆粒連接。捕獲序列與顆粒之間的直接和間接附接可經(jīng)由也如本文別處所述的共價(jià)鍵、非共價(jià)相互作用及其組合。

在一些實(shí)施方案中，第一顆粒可包含至少約1、2、10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000個(gè)或更多個(gè)第一捕獲序列的分子。此外，第二顆粒可包含至少約1、2、10、50、100、500、1000、5000、10000、50000、100000、500000、1000000、5000000、10000000個(gè)或更多個(gè)第二捕獲序列的分子。在一些實(shí)施方案中，第一顆粒和第二顆粒還可以分別包含第二捕獲序列和第一捕獲序列。

此外，第一和第二捕獲序列的長(zhǎng)度可根據(jù)具體應(yīng)用而變化。例如，第一或第二捕獲序列的長(zhǎng)度可以為約1個(gè)核苷酸至約100個(gè)核苷酸長(zhǎng)；約5至約50個(gè)核苷酸長(zhǎng)；約5至約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)；或約15至約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，第一或第二捕獲序列的長(zhǎng)度可以為約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個(gè)或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)。

第一和第二端序列的長(zhǎng)度可根據(jù)具體應(yīng)用而變化。例如，第一或第二端序列的長(zhǎng)度可以為約1個(gè)核苷酸至約100個(gè)核苷酸長(zhǎng)；約5至約50個(gè)核苷酸長(zhǎng)；約5至約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)；或約15至約30個(gè)核苷酸長(zhǎng)。在一些實(shí)施方案中，第一或第二端序列的長(zhǎng)度可以為約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50個(gè)或更多個(gè)核苷酸長(zhǎng)。

在一些實(shí)施方案中，所述分離的核酸復(fù)合體可包含與約1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個(gè)或更多個(gè)雙鏈核酸分子締合的至少約2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100個(gè)或更多個(gè)顆粒。該分離的核酸復(fù)合體的每一個(gè)顆粒可通過(guò)與所述雙鏈核酸基本上相同的附加的雙鏈核酸分子而與該分離的核酸復(fù)合體中的另一個(gè)顆粒連接。如本文所用的術(shù)語(yǔ)“基本上相同”是指該雙鏈核酸分子與該附加的雙鏈核酸分子之間的序列同源性的程度為至少約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、97％、98％、99％或100％。

本文所述的任何顆粒、顆粒組或核酸復(fù)合體可包含任何合適類型的顆粒。顆粒類型的非限制性實(shí)例包括固體顆粒、多孔顆粒、納米顆粒(例如，納米管、納米棒、納米殼、球形納米顆粒)、微粒、珠粒、金屬顆粒、磁性顆粒(磁性納米顆粒)、半導(dǎo)體顆粒(例如，量子點(diǎn))、聚合物顆粒、核酸顆粒(例如，含dna的顆粒、含rna的顆粒等)、熒光顆粒、比色顆粒、其復(fù)合物及其組合。此外，本文所述的任何顆粒、顆粒組的顆?；蚍蛛x的核酸復(fù)合體的顆?？砂魏魏线m的材料或多種材料(例如，涂覆有另一種材料的一種材料的顆粒、由復(fù)合材料制成的顆粒等)。顆?？砂牟牧系姆窍拗菩詫?shí)例包括金屬(例如，銀、金、鉑、銅、鈀)、金屬氧化物(例如，al2o3、nio、fe2o3、zro2、moo3、ceo2、y2o3、tio2、zno、sno、ito、co3o4)、聚合物(例如，聚丙烯酰胺、聚苯乙烯、右旋糖、聚苯胺、聚吡咯、聚乙炔)、熒光蛋白、碳、其復(fù)合物及其組合。在一些實(shí)施方案中，顆粒組和/或核酸復(fù)合體中的第一顆粒和第二顆?？砂嗤牟牧?。在一些實(shí)施方案中，顆粒組和/或核酸復(fù)合體中的第一顆粒和第二顆?？砂煌牟牧?。例如，顆粒組或核酸復(fù)合體可包含含有金的第一顆粒和含有銀的第二顆粒。

本文所述的任何顆粒、顆粒組的顆?；蚍蛛x的核酸復(fù)合體的顆?？筛鶕?jù)例如設(shè)想的具體應(yīng)用而具有不同的顆粒大小。通常，如本文所用的“顆粒大小”通常指顆粒的尺寸的大小。例如，這樣的尺寸可以是顆粒的直徑、圓周、周長(zhǎng)、流體動(dòng)力學(xué)直徑、半徑、長(zhǎng)度、寬度或深度。在一些實(shí)施方案中，顆?？删哂屑s0.1納米(nm)至約100nm；約0.5nm至約100nm；約1nm至約20nm；約1nm至約10nm；或約1nm至5nm的尺寸。在一些實(shí)施方案中，顆?？删哂兄炼?00nm、至多50nm、至多20nm、至多10nm或至多5nm的尺寸。在一些實(shí)施方案中，顆?？删哂屑s0.1、0.5、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、100nm的尺寸，或根據(jù)具體的顆粒該尺寸可以更大或更小。

本文所述的任何顆粒、顆粒組的顆?；蚍蛛x的核酸復(fù)合體的顆粒可具有任何合適的形狀/構(gòu)型，它可以是規(guī)則的形狀/構(gòu)型，或者可以是不規(guī)則的形狀/構(gòu)型。顆粒形狀的非限制性實(shí)例包括球、桿、空心殼、管、橢圓形顆粒，芯-殼顆粒(例如，涂覆的顆粒)、較小顆粒的凝聚及其組合。此外，本文所述的任何顆粒、顆粒組的顆?；蚍蛛x的核酸復(fù)合體的顆?？梢耘c或可以不與支持物連接。在顆粒、顆粒組的顆?；蚍蛛x的核酸復(fù)合體的顆粒不與支持物連接的實(shí)施方案中，該顆?？梢岳缱杂善』驊腋≡谝后w介質(zhì)(例如，水性介質(zhì))中。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的顆粒、顆粒組的顆?；蚍蛛x的核酸復(fù)合體的顆?？砂慌渲脼榕c結(jié)合配偶體結(jié)合的親和捕獲劑。該親和捕獲劑對(duì)于其結(jié)合配偶體的合適的親和力通?？稍试S此兩種物質(zhì)結(jié)合。如本文別處所述，親和捕獲劑可用于分離顆粒、顆粒組或核酸復(fù)合體的顆粒。親和捕獲劑的非限制性實(shí)例包括結(jié)合對(duì)的非核酸成員(例如，來(lái)自鏈霉親和素-生物素結(jié)合對(duì)的鏈霉親和素或生物素)、捕獲序列(例如，包含鎖定核酸(lna)的捕獲序列，抗體-抗原對(duì)(例如，抗熒光素抗體和熒光素、抗洋地黃毒苷抗體和洋地黃毒苷)、瘦素-糖對(duì)、適體和結(jié)合對(duì)、多肽與其結(jié)合對(duì)和/或其他類型的聚合物與其結(jié)合對(duì)。

例如，本文所述的顆粒、顆粒組的顆?；蚍蛛x的核酸復(fù)合體的顆?？砂磁c另一個(gè)核酸分子偶聯(lián)的游離引物或捕獲序列。在另一個(gè)實(shí)例中，本文所述的顆粒、顆粒組的顆?；蚍蛛x的核酸復(fù)合體的顆?？砂Y(jié)合對(duì)的成員，例如，鏈霉親和素或生物素的其中之一或兩者。此外，包括經(jīng)由如本文別處所述的供連接引物和顆粒的直接附接或間接附接，親和捕獲劑可與顆粒連接。親和捕獲序列與顆粒之間的直接和間接附接可經(jīng)由也如本文別處所述的共價(jià)鍵、非共價(jià)相互作用及其組合。

此外，本文所述的任何顆粒、顆粒組或分離的核酸復(fù)合體可被包含在分區(qū)中。該分區(qū)可以是任何合適類型的分區(qū)，其中分區(qū)的非限制性實(shí)例包括小滴(例如，乳液中的小滴，例如，油包水乳液或水包油乳液)、容器(例如，任何合適類型的管、毛細(xì)管、離心管、小杯(cuvette)、移液管尖端、袋子、盒子、器皿(container))及其組合。

在一些實(shí)施方案中，分區(qū)可以是孔(例如，孔陣列中的孔如微孔板中的孔、微孔、納米孔)?？梢詫⒖孜⒓庸ぴ诨桌绻杌字?例如，蝕刻到硅基底中)或它的上面(例如，將孔材料沉積在基底上)。此外，孔內(nèi)的表面可具有不同于在其中或其上包含孔的大部分表面基底的性質(zhì)。例如，孔表面可以是親水性的而大部分基底表面可以是疏水性的，反之亦然。此外，在一些實(shí)施方案中，孔和大部分基底的表面可采用不同的官能團(tuán)進(jìn)行差異修飾，使得它們各自選擇性地捕獲特定的化學(xué)劑(例如，對(duì)于顆粒、顆粒組、核酸復(fù)合體等具有親和力的化學(xué)劑)。

包含孔的基底可以置于流動(dòng)池隔室中或作為流動(dòng)池隔室的一部分被包含在內(nèi)，該隔室具有用于液體轉(zhuǎn)移的進(jìn)口和出口。在一些實(shí)施方案中，這樣的流動(dòng)池還可以包含平的或彎曲的內(nèi)表面，在該內(nèi)表面中孔被圖案化。液相溶液可以穿過(guò)流動(dòng)池，使得孔暴露于溶液。根據(jù)該溶液的物理和/或化學(xué)性質(zhì)以及孔和/或其他流動(dòng)池表面的表面性質(zhì)，可以將該溶液分配到孔中或選擇性地阻止其進(jìn)入孔。例如，當(dāng)孔表面含有親水性表面時(shí)，流經(jīng)孔的油溶液可以避免分配，而流經(jīng)孔的水溶液則可以分配到孔中?？椎某叽缈梢允侨魏魏线m的尺寸。例如，孔的尺寸可以為約1納米(“nm”)至約1毫米(“mm”)、10nm至1mm、100nm至1mm、1微米(“μm”)至1mm、10μm至1mm或100μm至1mm。

在分區(qū)為乳液中的小滴的情況下，可以以任何合適的方式生成該小滴，包括批量(bulk)乳化方法和/或借助于微流體裝置。批量乳化和/或微流體裝置還可以用于將顆粒分配到小滴中。此外，小滴的體積可以是任何合適的體積。例如，該小滴的體積可以為約1飛升(“fl”)至100μl微升(“μl”)、10fl至10μl、100fl至10μl、1皮升(“pl”)至1μl、1納升(“nl”)至10μl、10nl至10μl、100nl至10μl或1μl至10μl。

本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于測(cè)定或鑒定樣品中靶核酸分子/靶核酸序列的存在與否的方法、用于生成包含靶核酸分子的核酸復(fù)合體的方法和用于核酸擴(kuò)增的方法。

在另一方面，本公開內(nèi)容提供了用于測(cè)定在具有或懷疑具有靶核酸分子的樣品中該靶核酸分子的存在與否的方法。該方法包括在產(chǎn)生與至少第一顆粒和第二顆粒連接的擴(kuò)增的靶核酸分子的條件下使該樣品在反應(yīng)混合物中經(jīng)歷核酸擴(kuò)增反應(yīng)，其中該擴(kuò)增的靶核酸分子包含該靶核酸分子的序列的至少一部分。該反應(yīng)混合物可包含該第一顆粒和第二顆粒。該第一顆?？删哂械谝灰铮摰谝灰锞哂?’端和3’端，其中經(jīng)由該第一引物的5’端與第一顆粒連接。第一引物可在靶核酸分子鏈的5’端顯示出與靶核酸分子鏈的序列同源性。第二顆?？删哂械诙?，該第二引物具有5’端和3’端，其中經(jīng)由該第二引物的5’端與第二顆粒連接。第二引物可在靶核酸分子鏈的互補(bǔ)鏈的5’端顯示出與該互補(bǔ)鏈的序列同源性。此外，第一引物與之顯示出同源性的靶核酸分子鏈上的序列可不同于第二引物與之顯示出同源性的互補(bǔ)鏈的序列。此外，第一引物和第二引物可適合于在引物延伸反應(yīng)中延伸以形成靶核酸分子或其一部分的拷貝。

在一些實(shí)施方案中，當(dāng)與靶核酸分子鏈最佳比對(duì)時(shí)，第一引物可顯示出與靶核酸分子鏈的5’端至少約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同源性。類似地，當(dāng)與所述互補(bǔ)鏈最佳比對(duì)時(shí)，第二引物可顯示出與該互補(bǔ)鏈的5’端至少約60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的序列同源性。此外，在一些實(shí)施方案中，靶核酸分子可以是單鏈的，或在一些實(shí)施方案中，靶核酸分子可以是雙鏈的。此外，包括經(jīng)由如本文別處所述的直接附接或間接附接，第一引物可與第一顆粒連接且第二引物可與第二顆粒連接。引物與顆粒之間的直接和間接附接可經(jīng)由也如本文別處所述的共價(jià)鍵、非共價(jià)相互作用及其組合。

所述反應(yīng)混合物還可以包含擴(kuò)增靶核酸分子所需的試劑，該試劑包括聚合酶以及本文別處所述擴(kuò)增核酸分子所需的其他此類試劑。聚合酶可以在引物延伸反應(yīng)中延伸第一引物的3’端以形成靶核酸鏈或其一部分的拷貝和/或可以在第二引物延伸反應(yīng)中延伸第二引物的3’端以形成互補(bǔ)鏈或其一部分。此外，在一些實(shí)施方案中，該反應(yīng)混合物可被包含在分區(qū)中?？墒褂萌魏魏线m的分區(qū)來(lái)包含反應(yīng)混合物，其包括本文別處所述的分區(qū)的實(shí)例類型。

在一些實(shí)施方案中，所述方法可進(jìn)一步包括檢測(cè)與第一顆粒和第二顆粒連接的擴(kuò)增的靶核酸分子。包括經(jīng)由本文別處所述的檢測(cè)方式，例如，光學(xué)檢測(cè)，可以檢測(cè)該擴(kuò)增的靶核酸分子。例如，所述反應(yīng)混合物可進(jìn)一步包含光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì)，并且檢測(cè)可經(jīng)由光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì)(例如，染料或本文別處所述的其他光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì))來(lái)實(shí)現(xiàn)。該光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì)可與該擴(kuò)增的靶核酸分子相互作用，使得在成功擴(kuò)增靶核酸時(shí)，可從光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì)檢測(cè)到可檢測(cè)的信號(hào)(或缺乏可檢測(cè)的信號(hào))。在一些實(shí)施方案中，通過(guò)檢測(cè)到第一或第二顆粒中的任一者或兩者或該擴(kuò)增的靶核酸分子與第一和第二顆粒的組裝，可檢測(cè)到該擴(kuò)增的靶核酸分子(例如，如本文別處所述的核酸復(fù)合體的檢測(cè))。在一些實(shí)施方案中，擴(kuò)增的靶核酸分子與第一和第二顆粒的組裝可在檢測(cè)之前使用例如本文別處所述的分離方式來(lái)分離。

在一些實(shí)施方案中，該方法可包括產(chǎn)生多個(gè)擴(kuò)增的靶核酸分子，并且在一些實(shí)施方案中包括檢測(cè)多個(gè)擴(kuò)增的靶核酸分子。在這種情況下，反應(yīng)混合物可包含多個(gè)擴(kuò)增的核酸分子可與之連接的超過(guò)兩個(gè)的顆粒。每個(gè)附加的顆?？砂谝灰锖偷诙镏械娜我徽呋騼烧摺?/p>

在另一方面，本公開內(nèi)容提供了用于鑒定樣品中靶核酸分子的存在或不存在的方法。該方法包括提供懷疑含有靶核酸分子的溶液，其中該靶核酸分子包含與第一顆粒連接的第一核酸鏈和與第二顆粒連接的第二核酸鏈。該第二核酸鏈可經(jīng)由序列互補(bǔ)性與該第一核酸鏈雜交以產(chǎn)生核酸復(fù)合體。此外，該方法還包括檢測(cè)指示在溶液中存在或不存在該核酸復(fù)合體的信號(hào)，從而鑒定該靶核酸分子的存在。

在一些實(shí)施方案中，可向檢測(cè)器提供溶液，并且該檢測(cè)器可檢測(cè)指示在該溶液中存在或不存在核酸復(fù)合體的信號(hào)。檢測(cè)指示在溶液中存在或不存在核酸復(fù)合體的信號(hào)可經(jīng)由任何合適的檢測(cè)方法完成，并且在一些實(shí)施方案中經(jīng)由檢測(cè)器來(lái)完成。在本文別處描述了檢測(cè)方式和檢測(cè)的實(shí)例。在一些實(shí)施方案中，指示存在或不存在核酸復(fù)合體的信號(hào)可以指示核酸復(fù)合體的光學(xué)性質(zhì)(例如，與核酸復(fù)合體締合的光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì)，例如，本文別處所述的示例染料)、物理性質(zhì)(例如，該核酸復(fù)合體的密度、大小)、電性質(zhì)(例如，電導(dǎo)率、阻抗)、靜電性質(zhì)和/或電化學(xué)性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，第一和第二顆?？梢允墙饘兕w粒，并且可如本文別處所述通過(guò)目視檢查來(lái)檢測(cè)信號(hào)。

包含核酸復(fù)合體的溶液可以是任何合適的溶液，例如，如本文別處所述的核酸擴(kuò)增反應(yīng)混合物或經(jīng)處理的反應(yīng)混合物(例如，用稀釋劑如水、緩沖液、其他液體介質(zhì)或其組合稀釋的反應(yīng)混合物)。在一些實(shí)施方案中，該溶液可以是包含該核酸復(fù)合體的水溶液。在一些實(shí)施方案中，該溶液可包含已使用任何合適的分離方式從反應(yīng)混合物中分離出的核酸復(fù)合體，所述分離方式包括本文別處所述的分離核酸復(fù)合體的實(shí)例。在一些實(shí)施方案中，該溶液可被包含在分區(qū)內(nèi)?？墒褂萌魏魏线m類型的分區(qū)來(lái)包含該溶液，其包括本文別處所述的分區(qū)的示例類型。在一些實(shí)施方案中，該溶液可包含含有兩個(gè)或更多個(gè)顆粒的核酸復(fù)合體(例如，包含2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20個(gè)或更多個(gè)顆粒的核酸復(fù)合體)。在一些實(shí)施方案中，該溶液可包含多個(gè)含有兩個(gè)或更多個(gè)顆粒的核酸復(fù)合體，其中在一些實(shí)施方案中，所檢測(cè)到的信號(hào)指示多個(gè)核酸復(fù)合體的存在或不存在。在一些實(shí)施方案中，該核酸復(fù)合體可以或可以不固定或附著(例如，連接)于該溶液中的支持物上。在該核酸復(fù)合體不固定或附著于該溶液中的支持物上的實(shí)施方案中，該核酸復(fù)合體可以懸浮和/或自由漂浮在該溶液內(nèi)。

此外，包括經(jīng)由如本文別處所述的直接附接或間接附接，第一核酸鏈可與第一顆粒連接且第二核酸鏈可與第二顆粒連接。靶核酸鏈與顆粒之間的直接和間接附接可經(jīng)由也如本文別處所述的共價(jià)鍵、非共價(jià)相互作用及其組合。

在另一方面，本公開內(nèi)容提供了用于測(cè)定樣品中靶核酸序列的存在或不存在的方法。該方法包括接受測(cè)定樣品中該靶核酸序列的存在或不存在的請(qǐng)求，以及測(cè)定該樣品中該靶核酸序列的存在或不存在。測(cè)定可通過(guò)檢測(cè)包含與至少第一顆粒和第二顆粒連接的雙鏈核酸分子的至少一個(gè)核酸復(fù)合體來(lái)完成。該雙鏈核酸分子可包含第一單鏈核酸分子和互補(bǔ)于該第一單鏈核酸分子的第二單鏈核酸分子。此外，該第一單鏈核酸分子和該第二單鏈核酸分子中的至少一個(gè)可包含靶核酸序列。此外，該方法可進(jìn)一步包括生成指示在該樣品中存在或不存在靶核酸序列的報(bào)告。

在一些實(shí)施方案中，測(cè)定可進(jìn)一步包括檢測(cè)指示存在或不存在該核酸復(fù)合體的信號(hào)。檢測(cè)指示在溶液中存在或不存在核酸復(fù)合體的信號(hào)可經(jīng)由任何合適的檢測(cè)方法例如本文別處所述的示例檢測(cè)方式完成。所檢測(cè)到的信號(hào)可以指示該核酸復(fù)合體的光學(xué)性質(zhì)(例如，由與該核酸復(fù)合體締合的光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì)(例如，染料或本文別處所述的其他光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì))的活動(dòng)生成的信號(hào))、物理性質(zhì)(例如，密度或大小)、電性質(zhì)(例如，電導(dǎo)率、阻抗)、靜電性質(zhì)和/或電化學(xué)性質(zhì)。在一些實(shí)施方案中，該核酸復(fù)合體可以在分區(qū)中被檢測(cè)到。該核酸復(fù)合體可以在任何合適類型的分區(qū)中被檢測(cè)到，該分區(qū)包括本文別處所述的分區(qū)的示例類型。在一些實(shí)施方案中，如本文別處所述，該核酸可以在檢測(cè)之前分離(例如，從反應(yīng)混合物中分離)。在一些實(shí)施方案中，如本文別處所述，該核酸復(fù)合體可包含多個(gè)與超過(guò)兩個(gè)顆粒連接的雙鏈核酸分子。

此外，生成的報(bào)告可以是任何適當(dāng)類型的報(bào)告。報(bào)告可包含任何數(shù)目的所需元素，其非限制性實(shí)例包括關(guān)于樣品中靶核酸序列的存在或不存在、樣品中靶核酸復(fù)合體的存在或不存在、靶核酸序列、在樣品中所檢測(cè)到的核酸分子的數(shù)目、在樣品中所檢測(cè)到的靶核酸序列的拷貝數(shù)目等的信息。該報(bào)告可以以打印報(bào)告(例如，硬拷貝)的形式提供和/或可以以電子報(bào)告的形式提供。電子報(bào)告可以呈現(xiàn)在用戶界面(ui)上，如在電子設(shè)備的電子顯示器上的ui。在一些實(shí)例中，電子設(shè)備可包括電阻式或電容式觸摸屏。電子顯示器的非限制性實(shí)例包括監(jiān)視器或電視、與檢測(cè)器可操作地連接的屏幕、平板電腦屏幕、移動(dòng)設(shè)備屏幕、便攜式計(jì)算機(jī)屏幕等。在一些實(shí)施方案中，ui可以是被配置用于向用戶提供報(bào)告的圖形用戶界面(gui)。gui可包括文本、圖形和/或音頻組件。打印報(bào)告和電子報(bào)告均可分別存儲(chǔ)在文件或數(shù)據(jù)庫(kù)中，使得它們是可訪問(wèn)的以供將來(lái)應(yīng)用。此外，可使用包括例如網(wǎng)絡(luò)連接、無(wú)線連接和/或互聯(lián)網(wǎng)連接的任何合適的通信介質(zhì)將報(bào)告?zhèn)鬏斨帘镜鼗蜻h(yuǎn)程位置。

在一些實(shí)施方案中，可接受來(lái)自任何類型的請(qǐng)求者測(cè)定樣品的請(qǐng)求，其中請(qǐng)求者的非限制性類型包括研究專業(yè)人員(例如，科學(xué)家、實(shí)驗(yàn)室技術(shù)員、教授等)、醫(yī)療保健專業(yè)人員(例如，護(hù)士、醫(yī)生、醫(yī)生助手、醫(yī)療技術(shù)人員等)、研究組織(例如，實(shí)驗(yàn)室、研究醫(yī)院、研究中心、研究所和學(xué)術(shù)機(jī)構(gòu)、大學(xué))、醫(yī)療保健組織(例如，醫(yī)院、療養(yǎng)院、臨終安養(yǎng)院(hospice)、醫(yī)療中心、診所)、公共衛(wèi)生組織(例如，政府機(jī)構(gòu)，如美國(guó)疾病控制中心(cdc))及其組合。在一些實(shí)施方案中，可向該請(qǐng)求者和/或任何其他期望的接收者提供所生成的報(bào)告。上述請(qǐng)求者的示例類型還可以是報(bào)告的接收者。

在另一方面，本公開內(nèi)容提供了用于生成包含靶核酸分子的核酸復(fù)合體的方法。該方法包括在產(chǎn)生該核酸復(fù)合體的條件下在反應(yīng)混合物中用正向引物和反向引物擴(kuò)增靶核酸分子。該核酸復(fù)合體可包含擴(kuò)增的靶核酸分子，其中所述擴(kuò)增的靶核酸分子包含第一鏈和至少部分互補(bǔ)于該第一鏈的第二鏈。該第一鏈可在該第一鏈的5’端與第一顆粒偶聯(lián)，并且該第二鏈可在該第二鏈的5’端與第二顆粒偶聯(lián)。

在一些實(shí)施方案中，正向引物可與第一顆粒連接且反向引物可與第二顆粒連接。包括經(jīng)由如本文別處所述的直接附接或間接附接，正向和反向引物可分別與第一顆粒和第二顆粒連接。引物與顆粒之間的直接和間接附接可經(jīng)由也如本文別處所述的共價(jià)鍵、非共價(jià)相互作用及其組合。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物還可以包含第一顆粒和第二顆粒，以及如本文別處所述的擴(kuò)增靶核酸分子所需的任何其他試劑。此外，如本文別處所述，該反應(yīng)混合物可包含與附加的正向和/或反向引物偶聯(lián)的附加的顆粒，以產(chǎn)生包含超過(guò)兩個(gè)與附加的擴(kuò)增靶核酸分子偶聯(lián)的顆粒的核酸復(fù)合體。例如，在一些實(shí)施方案中，該方法可進(jìn)一步包括采用在其上連接有正向引物或反向引物的第三顆粒來(lái)擴(kuò)增靶核酸分子以產(chǎn)生核酸復(fù)合體。在此類實(shí)施方案中，該核酸復(fù)合體可進(jìn)一步包含經(jīng)由附加的擴(kuò)增靶核酸分子與第一顆粒和/或第二顆粒偶聯(lián)的第三顆粒。

此外，在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括檢測(cè)核酸復(fù)合體。該核酸復(fù)合體的檢測(cè)可以經(jīng)由任何合適的方式來(lái)實(shí)現(xiàn)，所述方式包括本文別處所述的檢測(cè)的示例方式(例如，光學(xué)(例如，借助于光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì))、光譜學(xué)、電化學(xué)、靜電、物理、電等)。在一些實(shí)施方案中，第一和第二顆?？梢允墙饘兕w粒，并且核酸復(fù)合體的檢測(cè)可通過(guò)目視檢查來(lái)實(shí)現(xiàn)。

在一些實(shí)施方案中，所述反應(yīng)混合物可被包含在分區(qū)中。可使用任何合適的分區(qū)類型來(lái)包含反應(yīng)混合物，該分區(qū)類型包括本文別處所述的分區(qū)的示例類型。在該反應(yīng)混合物被包含在分區(qū)中的實(shí)施方案中，該方法可進(jìn)一步包括將核酸復(fù)合體從該分區(qū)釋放并檢測(cè)所釋放的核酸復(fù)合體。在一些實(shí)施方案中，該方法進(jìn)一步包括分離該核酸復(fù)合體，該分離可在核酸復(fù)合體的任何檢測(cè)之前、期間或之后進(jìn)行?？梢允褂梅蛛x核酸復(fù)合體的任何合適的方式，其包括本文別處所述的分離的示例方式(例如，離心、磁分離、色譜法、毛細(xì)管作用、色譜法、過(guò)濾、沉降、親和捕獲(例如，親和捕獲于支持物之上)等)。

在另一方面，本公開內(nèi)容提供了用于生成包含靶核酸分子的核酸復(fù)合體的方法。該方法包括在反應(yīng)混合物中用正向引物和反向引物擴(kuò)增靶核酸分子以產(chǎn)生擴(kuò)增的靶核酸分子。該正向引物和該反向引物可各自包含能夠在引物延伸反應(yīng)中延伸的3’端和發(fā)夾結(jié)構(gòu)。此外，該擴(kuò)增的靶核酸分子可包含在該擴(kuò)增的靶核酸分子的一端含有第一突出端序列的第一鏈，以及在該擴(kuò)增的靶核酸分子的另一端含有第二突出端序列的第二鏈。此外，該方法進(jìn)一步包括使擴(kuò)增的靶核酸分子與第一顆粒和第二顆粒接觸以產(chǎn)生核酸復(fù)合體。該核酸復(fù)合體可包含與第一顆粒和第二顆粒復(fù)合的擴(kuò)增的靶核酸分子。該擴(kuò)增的靶核酸分子可經(jīng)由第一突出端序列與連接至第一顆粒的第一捕獲序列之間的序列互補(bǔ)性而與第一顆粒復(fù)合，以及經(jīng)由第二突出端序列與連接至第二顆粒的第二捕獲序列之間的序列互補(bǔ)性而與第二顆粒復(fù)合。

在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括將第一鏈與第二捕獲序列連接和/或?qū)⒌诙溑c第一捕獲序列連接。連接可經(jīng)由任何合適的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)，其包括經(jīng)由反應(yīng)混合物中存在的連接酶例如dna連接酶的作用。此外，該反應(yīng)混合物可包含擴(kuò)增靶核酸分子所需的一種或多種試劑，如本文別處所述的核酸擴(kuò)增所需的試劑。

在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括分離和/或檢測(cè)核酸復(fù)合體。核酸復(fù)合體的分離和/或檢測(cè)可使用任何合適的分離和檢測(cè)方式來(lái)完成，所述方式包括本文別處所述的分離和檢測(cè)的示例方式。

如本文所用，“突出端序列”通常是指與雙鏈核酸分子的5’或3’端締合的單鏈序列。突出端序列可以用于連接(例如，通過(guò)經(jīng)由序列互補(bǔ)性的雜交)雙鏈核酸分子與另一核酸分子。

此外，在一些實(shí)施方案中，正向引物和/或反向引物可包含不能經(jīng)由引物延伸反應(yīng)拷貝的間隔區(qū)。引物的間隔區(qū)可用于在衍生自引物的擴(kuò)增的靶核酸分子上生成突出端序列。可以生成突出端序列是因?yàn)樵陂g隔區(qū)5’側(cè)的任何引物序列也可能不被拷貝，這是由于間隔區(qū)的存在阻止了引物延伸反應(yīng)期間聚合酶的進(jìn)一步作用。間隔區(qū)可包含單個(gè)核苷酸、一系列的核苷酸和/或非核酸物質(zhì)?？杀话陂g隔區(qū)中的物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括聚乙二醇(peg)、1’,2’-二脫氧核糖(脫堿基位點(diǎn))、碳質(zhì)連接體(例如，可從integrateddnatechnologies獲得的多碳連接體、c3間隔區(qū)，間隔區(qū)、間隔區(qū)9，間隔區(qū)18)及其組合。

圖3a示意性地描述了具有能夠在引物延伸反應(yīng)中延伸的3’端、具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)和間隔區(qū)的正向或反向引物的實(shí)例。如圖3a所示，引物300被配置為包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)且包含能夠在引物延伸反應(yīng)中延伸的3’端。在發(fā)夾結(jié)構(gòu)的環(huán)區(qū)301中，引物300的序列包含不能經(jīng)由引物延伸反應(yīng)拷貝的間隔區(qū)302。該引物還包含莖區(qū)303。此外，圖3b示意性地描述了圖3a中所示的引物的線性構(gòu)型。如圖3b所示，該引物包含處于間隔區(qū)的5’側(cè)的突出端序列區(qū)304，以及間隔區(qū)302的3’側(cè)的引發(fā)序列區(qū)305。在圖3a中所示的發(fā)夾構(gòu)型中，突出端序列區(qū)304的一部分與引發(fā)序列區(qū)305的一部分雜交，這形成了莖區(qū)303。

突出端序列304在與核酸分子上的靶核酸序列雜交時(shí)的解鏈溫度(tm,1)可低于與莖區(qū)303中的引發(fā)序列區(qū)305的一部分雜交的突出端序列區(qū)304的一部分的解鏈溫度(tm,2)，所述解鏈溫度均可低于引發(fā)序列305在與模板核酸分子上的其靶核酸序列雜交時(shí)的解鏈溫度(tm,3)。當(dāng)暴露于高于tm,2的溫度時(shí)，圖3a中所示的引物300可采取圖3b中所示的線性構(gòu)型。此外，在這樣的溫度也低于tm,3的情況下，引發(fā)序列305可引發(fā)靶核酸序列，因?yàn)橐l(fā)序列305在低于tm,3的溫度下不與靶核酸序列解鏈。對(duì)于圖3a和圖3b中所示的示例引物300，tm,1為28℃，tm,2為55℃且tm,3為59℃。

圖3c示意性地描述了圖3a和圖3b中所示的引物300的功能性的實(shí)例。如圖3c中所示，在反應(yīng)混合物中提供引物300，且在暴露310于適當(dāng)?shù)臏囟?t)(例如，tm,1和tm,2<t<tm,3)時(shí)，引物300被線性化。線性化的引物300隨后可經(jīng)由引發(fā)序列區(qū)305以及也被包含在反應(yīng)混合物中的核酸分子306上針對(duì)引發(fā)區(qū)305的核酸序列而引發(fā)320核酸分子306。引發(fā)序列305可在引物延伸反應(yīng)中在其3’端得以延伸307(例如，經(jīng)由聚合酶的作用)。此外，由于間隔區(qū)302的存在，在引物延伸反應(yīng)(或后續(xù)的引物延伸反應(yīng))中，核酸分子306不被延伸為包含互補(bǔ)于突出端序列304的序列。引物延伸反應(yīng)產(chǎn)生包含引物300、與單鏈突出端序列304連接的核酸分子306的雙鏈核酸分子。

該反應(yīng)混合物還可以包含與捕獲序列309在該捕獲序列的3’端偶聯(lián)的顆粒308。捕獲序列309可包含至少部分互補(bǔ)于突出端序列304的序列。在這種情況下，突出端序列304可與捕獲序列309雜交330，使得與突出端序列304連接的雙鏈分子與顆粒308偶聯(lián)。在突出端序列304與捕獲序列309雜交之后，該雙鏈核酸分子的核酸分子306的3’端可與捕獲序列309在其5’端連接，使得該雙鏈分子共價(jià)固定于顆粒308上。

圖4示意性地描述了用類似于圖3a/圖3b中所示引物300的引物擴(kuò)增雙鏈核酸分子(例如，靶核酸分子)并且生成核酸復(fù)合體的示例方法。如圖4所示，在反應(yīng)混合物中可提供雙鏈核酸分子401、正向引物402、反向引物403和擴(kuò)增雙鏈核酸分子401所需的其他試劑(例如，聚合酶、dntp、輔因子等)。正向引物402和反向引物403被配置為包含發(fā)夾結(jié)構(gòu)和可在引物延伸反應(yīng)中延伸的3’端，類似于圖3a和圖3b中描述的示例引物300。

該反應(yīng)混合物隨后可經(jīng)受適合于經(jīng)由正向引物402和反向引物403擴(kuò)增雙鏈核酸分子401的條件410，以生成多個(gè)擴(kuò)增的雙鏈核酸分子404。例如，該反應(yīng)混合物的溫度可以循環(huán)，使得雙鏈核酸分子401經(jīng)由正向引物402和反向引物403來(lái)擴(kuò)增。單獨(dú)的擴(kuò)增雙鏈核酸分子的一條鏈可在其5’端包含第一突出端序列405，并且該單獨(dú)的擴(kuò)增雙鏈核酸分子的另一條鏈可在其5’端包含第二突出端序列406。

擴(kuò)增的雙鏈核酸分子404隨后可與一個(gè)或多個(gè)第一顆粒406和一個(gè)或多個(gè)第二顆粒407接觸。在一些情況下，在雙鏈核酸分子401的擴(kuò)增之前，該反應(yīng)混合物可初始包含第一顆粒406和第二顆粒407。在其他情況下，在雙鏈核酸分子401擴(kuò)增期間或之后，可將第一顆粒406和第二顆粒407添加至反應(yīng)。此外，第一顆粒406的單獨(dú)第一顆粒包含第一捕獲序列408的一個(gè)或多個(gè)拷貝，第一捕獲序列408在其3’端與單獨(dú)第一顆粒偶聯(lián)。第一捕獲序列408至少部分互補(bǔ)于擴(kuò)增的雙鏈核酸分子404的突出端序列405。此外，第二顆粒407的單獨(dú)第二顆粒包含第二捕獲序列409的一個(gè)或多個(gè)拷貝，第二捕獲序列409在其3’端與該單獨(dú)第二顆粒偶聯(lián)。第二捕獲序列409至少部分互補(bǔ)于擴(kuò)增的雙鏈核酸分子404的突出端序列406。

在與第一顆粒406和第二顆粒407接觸時(shí)，突出端序列405和406可經(jīng)由序列互補(bǔ)性分別與捕獲序列408和409雜交，使得單獨(dú)的擴(kuò)增雙鏈核酸分子404與單獨(dú)第一顆粒406和/或單獨(dú)第二顆粒407偶聯(lián)。由于突出端序列位于單獨(dú)的擴(kuò)增雙鏈核酸分子404的每條鏈的5’端，因此每一個(gè)擴(kuò)增的雙鏈核酸分子404在其互補(bǔ)鏈之一的5’端與單獨(dú)第一顆粒406和單獨(dú)第二顆粒407偶聯(lián)。在第一顆粒406和第二顆粒407的其中之一或兩者分別包含多個(gè)捕獲序列408和409的情況下，多個(gè)擴(kuò)增的雙鏈核酸分子404可與每個(gè)顆粒偶聯(lián)，使得可以生成核酸復(fù)合體411。在捕獲序列與突出端序列雜交之后，每一個(gè)擴(kuò)增的雙鏈核酸分子的每條鏈的3’端可與其相鄰的捕獲序列408或409連接(例如，經(jīng)由連接酶的作用)，使得該雙鏈分子共價(jià)附接至各自的捕獲序列。如果可以，可隨后如本文別處所述來(lái)分離和/或檢測(cè)核酸復(fù)合體411和/或核酸復(fù)合體411的擴(kuò)增雙鏈核酸分子。

在另一方面，本公開內(nèi)容提供了用于核酸擴(kuò)增的方法。該方法包括將與第一顆粒連接的正向引物與核酸鏈退火，以及將與第二顆粒連接的反向引物與該核酸鏈的互補(bǔ)鏈退火。然后，該方法進(jìn)一步包括以模板指導(dǎo)的方式延伸正向引物和反向引物以產(chǎn)生與第一顆粒連接的第一雙鏈核酸分子和與第二顆粒連接的第二雙鏈核酸分子。此外，該方法進(jìn)一步包括使第一雙鏈核酸分子和第二雙鏈核酸分子變性以生成與第一顆粒連接的第一單鏈分子和與第二顆粒連接的第二單鏈分子。此外，該方法進(jìn)一步包括將正向引物與第二單鏈分子退火和將反向引物與第一單鏈分子退火以產(chǎn)生包含擴(kuò)增的雙鏈核酸分子的核酸復(fù)合體。該擴(kuò)增的雙鏈核酸分子可在一端與第一顆粒連接且在其另一端與第二顆粒連接。

所述方法的步驟可在反應(yīng)混合物中進(jìn)行，該反應(yīng)混合物包含與正向引物連接的第一顆粒、與第二引物連接的第二顆粒、核酸鏈以及核酸擴(kuò)增所需的一種或多種試劑。此外，這樣的反應(yīng)混合物還可以包含與正向和/或反向引物連接的附加的顆粒(例如，第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九、第十、第十一、第十二、第十三、第十四、第十五、第十六、第十七、第十八、第十九、第二十或更多的顆粒)，使得生成包含與附加的擴(kuò)增雙鏈核酸分子連接的附加顆粒的核酸復(fù)合體。例如，在一些實(shí)施方案中，該方法可進(jìn)一步包括采用在其上連接有正向引物或反向引物的第三顆粒來(lái)擴(kuò)增該核酸鏈以產(chǎn)生核酸復(fù)合體，其中所述核酸進(jìn)一步包含經(jīng)由附加的擴(kuò)增雙鏈核酸分子與第一顆粒和/或第二顆粒偶聯(lián)的第三顆粒。

在一些實(shí)施方案中，所述方法的一個(gè)或多個(gè)步驟可以在分區(qū)中進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，整個(gè)方法可以在分區(qū)中進(jìn)行。該方法的一個(gè)或多個(gè)步驟或整個(gè)方法可以在任何合適類型的分區(qū)中進(jìn)行，所述合適類型包括本文別處所述的分區(qū)的示例類型。此外，該方法的一個(gè)或多個(gè)步驟(直到該方法的所有步驟)可重復(fù)一個(gè)或多個(gè)循環(huán)，由此可以生成包含超過(guò)兩個(gè)顆粒和/或多個(gè)核酸復(fù)合體的核酸復(fù)合體。

在一些實(shí)施方案中，所述方法進(jìn)一步包括分離和/或檢測(cè)核酸復(fù)合體。該核酸復(fù)合體的分離和/或檢測(cè)可使用任何合適的分離和/或檢測(cè)方式來(lái)完成，所述方式包括本文別處所述的分離和檢測(cè)的示例方式(例如，光學(xué)檢測(cè)、光譜檢測(cè)、物理檢測(cè)、電檢測(cè)、電化學(xué)檢測(cè)、靜電檢測(cè))。

圖5示意性地描述了采用與顆粒偶聯(lián)的正向和反向引物來(lái)擴(kuò)增雙鏈核酸分子以產(chǎn)生核酸復(fù)合體的實(shí)例方法。如圖5中所示，在反應(yīng)混合物中可以提供雙鏈核酸分子501；多個(gè)第一顆粒502，每一個(gè)均與正向引物503的一個(gè)或多個(gè)拷貝在其5’端偶聯(lián)(例如，共價(jià)偶聯(lián))；多個(gè)第二顆粒504，每一個(gè)均與反向引物505的一個(gè)或多個(gè)拷貝在其5’端偶聯(lián)(例如，共價(jià)偶聯(lián))；以及擴(kuò)增雙鏈核酸分子501所需的其他試劑(例如，聚合酶、dntp、輔因子等)。正向引物503顯示出與雙鏈核酸分子501的鏈501a的5’端的序列同源性，并且還至少部分互補(bǔ)于雙鏈核酸分子501的鏈501b的3’端的至少一部分。反向引物504顯示出與雙鏈核酸分子501的鏈501b的5’端的序列同源性，并且還至少部分互補(bǔ)于雙鏈核酸分子501的鏈501a的3’端的至少一部分。該反應(yīng)混合物可經(jīng)受適合于使雙鏈核酸分子501變性為其組成鏈501a和501b的條件510。例如，可使該反應(yīng)混合物達(dá)到適合于使雙鏈核酸分子501變性的變性溫度。

在雙鏈核酸分子501變性之后，可使鏈501a和501b分別與單獨(dú)第二顆粒504及單獨(dú)第一顆粒502接觸。該反應(yīng)混合物隨后可經(jīng)受合適的條件，使得正向引物503的單獨(dú)拷貝可與它在鏈501b的3’端的互補(bǔ)序列退火，并且使得反向引物505的單獨(dú)拷貝可與它在鏈501a的3’端的互補(bǔ)序列退火。例如，可使該反應(yīng)混合物的溫度達(dá)到退火溫度，使得正向引物503和反向引物504與它們?cè)阪?01b和501a上的相應(yīng)序列退火。

在正向引物503和反向引物505退火之后，可使反應(yīng)混合物處于條件520下，使得正向引物503和反向引物505的3’端在引物延伸反應(yīng)中以模板指導(dǎo)的方式延伸(例如，經(jīng)由聚合酶的作用)。例如，可使反應(yīng)混合物的溫度達(dá)到延伸溫度，在該溫度下可發(fā)生引物延伸反應(yīng)。在正向引物503的延伸和反向引物505的延伸之后，單獨(dú)第一顆粒502和單獨(dú)第二顆粒504與擴(kuò)增的雙鏈核酸分子偶聯(lián)，該擴(kuò)增的雙鏈核酸分子包含與雙鏈核酸分子501的鏈501a和501b相同或基本上相同的組成鏈。經(jīng)由與雙鏈核酸分子501的核酸鏈501a相同或基本上相同的核酸鏈的5’端，單獨(dú)第一顆粒502與其擴(kuò)增的雙鏈核酸分子偶聯(lián)。經(jīng)由與雙鏈核酸分子501的核酸鏈501b相同或基本上相同的核酸鏈的5’端，單獨(dú)第二顆粒504與其擴(kuò)增的雙鏈核酸分子偶聯(lián)。

可通過(guò)使反應(yīng)混合物經(jīng)受適當(dāng)?shù)臈l件530，針對(duì)每一個(gè)擴(kuò)增的雙鏈核酸分子重復(fù)正向引物503和反向引物505的附加拷貝的變性、退火的循環(huán)，以生成附加的擴(kuò)增雙鏈核酸分子。例如，如上所述，該反應(yīng)混合物的溫度可通過(guò)合適的變性、退火和延伸溫度進(jìn)行循環(huán)?？稍谠摲磻?yīng)混合物中通過(guò)附加的單獨(dú)第一顆粒502和單獨(dú)第二顆粒504提供正向引物503和反向引物505的附加拷貝。與附加的單獨(dú)第一顆粒502偶聯(lián)的正向引物503的拷貝以及與附加的單獨(dú)第二顆粒504偶聯(lián)的反向引物505的拷貝可分別與偶聯(lián)于單獨(dú)第二顆粒504和單獨(dú)第一顆粒502的核酸鏈上的互補(bǔ)序列退火。該引物隨后可在后續(xù)的引物延伸反應(yīng)中延伸，使得生成與單獨(dú)第一顆粒502和單獨(dú)第二顆粒504均偶聯(lián)的附加的擴(kuò)增雙鏈核酸分子。該過(guò)程可重復(fù)所需的循環(huán)數(shù)，使得在反應(yīng)混合物中經(jīng)由分別與第一顆粒502和第二顆粒504偶聯(lián)的正向引物503和反向引物504的附加拷貝生成核酸復(fù)合體506。如果可以，隨后可如本文別處所述檢測(cè)核酸復(fù)合體506和/或核酸復(fù)合體506的雙鏈核酸分子。

在本文所述的各個(gè)方面，方法可進(jìn)一步包括分離核酸復(fù)合體。例如，核酸復(fù)合體可在擴(kuò)增反應(yīng)之后從反應(yīng)混合物中分離。在一些實(shí)施方案中，核酸復(fù)合體可在檢測(cè)核酸復(fù)合體之前、期間或之后從反應(yīng)混合物中分離?？梢允褂梅蛛x核酸復(fù)合體的任何合適的方式。分離核酸復(fù)合體的方式的非限制性實(shí)例包括離心、磁分離(例如，經(jīng)由顆?；蚝怂釓?fù)合體的顆粒的磁性)、色譜法(例如，尺寸色譜法、親和色譜法)、電泳、毛細(xì)管作用(例如，通過(guò)固體基質(zhì)如濾紙或妊娠試紙的毛細(xì)管作用)、過(guò)濾、沉降、親和捕獲及其組合。

在使用親和捕獲來(lái)分離核酸復(fù)合體的情況下，核酸復(fù)合體的一個(gè)或多個(gè)顆粒可包含與其結(jié)合配偶體結(jié)合的親和捕獲劑，該親和捕獲劑可以例如固定在支持物上。核酸復(fù)合體的親和捕獲劑與其固定于支持物上的結(jié)合對(duì)的結(jié)合可將核酸復(fù)合體固定于該支持物上。例如，核酸復(fù)合體的一個(gè)或多個(gè)顆粒可包含未經(jīng)延伸的引物或未與另一核酸分子偶聯(lián)的捕獲序列。這樣的引物或捕獲序列可與可固定于支持物上的互補(bǔ)序列雜交，使得該引物或捕獲序列與該互補(bǔ)序列的雜交通過(guò)將該核酸復(fù)合體固定于支持物上而分離所締合的核酸復(fù)合體。在另一實(shí)例中，核酸復(fù)合體的一個(gè)或多個(gè)顆粒可包含與固定于支持物上的各個(gè)生物素部分結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)鏈霉親和素部分。或者，例如，所述一個(gè)或多個(gè)顆?？砂锼厍以撝С治锟砂溍褂H和素。在任一情況下，鏈霉親和素與生物素的結(jié)合可將該核酸復(fù)合體固定于該支持物上。

圖6示意性地描述了生成核酸復(fù)合體和分離核酸復(fù)合體的實(shí)例。如圖6所示，油包水乳液601提供于容器602中。該油包水乳液包含在連續(xù)油相603中的多個(gè)小滴，其中每一個(gè)小滴包含含有多個(gè)兩種類型的顆粒605和606的水性反應(yīng)混合物604。第一種類型的顆粒605可包含正向引物，第二種類型的顆粒606可包含反向引物?；蛘撸谝环N類型的顆粒605和第二種類型的顆粒606可包含如本文別處所述能夠與擴(kuò)增的核酸分子的突出端序列雜交的第一和第二捕獲序列。每一個(gè)小滴中的顆粒在小滴反應(yīng)混合物中是游離的，并且最初未與核酸復(fù)合體結(jié)合。此外，陽(yáng)性小滴607包含模板核酸分子608，而陰性小滴609不包含模板核酸分子608。模板核酸分子可以是單鏈的或可以是雙鏈的。

陽(yáng)性小滴607和陰性小滴609經(jīng)受適合于擴(kuò)增模板核酸分子608的條件610，以生成與核酸復(fù)合體611締合的擴(kuò)增的核酸分子。由于陽(yáng)性小滴607包含模板核酸分子，因此在擴(kuò)增模板核酸分子608之后在陽(yáng)性小滴607中生成核酸復(fù)合體611。此外，在陰性小滴609中未生成核酸復(fù)合體611，因?yàn)殛幮孕〉?09不包含模板核酸分子608，并因此沒(méi)有發(fā)生擴(kuò)增。

油包水乳液601隨后可被打破620成連續(xù)油相603和水相612，水相612包含來(lái)自油包水乳液601的陽(yáng)性小滴607和陰性小滴609的水性反應(yīng)混合物604的合并物。水相612可與連續(xù)油相603分離，例如通過(guò)經(jīng)由分液漏斗將油從水相中倒出或經(jīng)由移液從容器602中移出。隨后可將分離的水相612涂覆630于固定于親和捕獲劑614的表面(例如，陣列，如核酸陣列)613，使得水相612中的核酸復(fù)合體611固定于該表面。例如，親和捕獲劑614可以是捕獲序列，該捕獲序列互補(bǔ)于與核酸復(fù)合體611的一個(gè)或多個(gè)顆粒締合的引物或捕獲序列。在另一實(shí)例中，親和捕獲劑614可以是結(jié)合對(duì)的成員，該成員與該結(jié)合對(duì)的另一成員結(jié)合，該另一成員與核酸復(fù)合體611的一個(gè)或多個(gè)顆粒偶聯(lián)?？呻S后檢測(cè)分離的復(fù)合體611，其包括經(jīng)由本文別處所述的檢測(cè)的示例方式。

在本文所述的各個(gè)方面，方法可包括檢測(cè)一個(gè)或多個(gè)核酸分子(例如，擴(kuò)增的核酸分子、雙鏈核酸分子、單鏈核酸分子、靶核酸分子、與核酸復(fù)合體結(jié)合的核酸分子)、核酸序列(例如，靶核酸序列)和/或核酸復(fù)合體。這些物質(zhì)中的任何一種的檢測(cè)可以是定性的，而在一些實(shí)施方案中是定量的。在一些實(shí)施方案中，核酸復(fù)合體的檢測(cè)可用來(lái)確定或測(cè)定作為核酸復(fù)合體的組分的核酸分子(例如，靶核酸分子)和/或核酸序列(例如，靶核酸序列)的不存在或存在。例如，檢測(cè)到的核酸復(fù)合體數(shù)目可指示樣品中被擴(kuò)增以生成核酸復(fù)合體的靶核酸分子的拷貝數(shù)。核酸分子、核酸序列或核酸復(fù)合體的檢測(cè)可以采用任何合適的檢測(cè)方法或方式來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，核酸復(fù)合體可在檢測(cè)之前、期間或之后分離。所使用的檢測(cè)方法的具體類型可依賴于例如被檢測(cè)的具體物質(zhì)、檢測(cè)期間存在的其他物質(zhì)、可檢測(cè)的物質(zhì)是否存在、待使用的可檢測(cè)物質(zhì)的具體類型和/或具體應(yīng)用。

檢測(cè)方法的非限制性實(shí)例包括光學(xué)檢測(cè)、電檢測(cè)、物理檢測(cè)、光譜檢測(cè)、靜電檢測(cè)和電化學(xué)檢測(cè)。因此，可通過(guò)檢測(cè)指示存在或不存在核酸分子、核酸序列和/或核酸復(fù)合體的信號(hào)(例如，指示核酸分子、核酸序列和/或核酸復(fù)合體或相關(guān)的可檢測(cè)物質(zhì)的光學(xué)性質(zhì)、光譜性質(zhì)、靜電性質(zhì)或電化學(xué)性質(zhì)的信號(hào))檢測(cè)核酸復(fù)合體、核酸分子或核酸序列。光學(xué)檢測(cè)方法包括但不限于目視檢查(例如，經(jīng)由眼睛的檢測(cè)、未借助于光學(xué)檢測(cè)器觀察光學(xué)性質(zhì)或光學(xué)事件)、熒光測(cè)定法(例如，熒光、熒光能量轉(zhuǎn)移、猝滅的熒光)、uv-可見(jiàn)光吸光度和比色檢測(cè)。配備有光學(xué)檢測(cè)方式(例如，熒光顯微鏡檢查、光學(xué)顯微鏡檢查等)的成像(例如，顯微鏡檢查)也可以用于光學(xué)檢測(cè)。光譜檢測(cè)方法包括但不限于質(zhì)譜法、核磁共振(nmr)光譜法和紅外光譜法。靜電檢測(cè)方法包括但不限于基于凝膠的技術(shù)，例如，凝膠電泳。這樣的凝膠技術(shù)還可用于分離如本文別處所述的核酸復(fù)合體。電化學(xué)檢測(cè)方法包括但不限于安培滴定法。電化學(xué)檢測(cè)方法包括但不限于電導(dǎo)率或阻抗的檢測(cè)。物理檢測(cè)方法包括但不限于顆粒大小、密度、沉降速率和/或粘度的檢測(cè)。

在一些實(shí)施方案中，核酸分子、顆粒、顆粒組或核酸復(fù)合體的檢測(cè)可采用流體流動(dòng)來(lái)實(shí)現(xiàn)。包含待檢測(cè)物質(zhì)的流體(例如，溶液、反應(yīng)混合物)可以流過(guò)合適的檢測(cè)器，使得在流體流過(guò)檢測(cè)器時(shí)該檢測(cè)器檢測(cè)該物質(zhì)?；蛘?，由于向檢測(cè)器提供包含待檢測(cè)物質(zhì)的流體且檢測(cè)在沒(méi)有流體流動(dòng)的情況下進(jìn)行，因此檢測(cè)可以靜態(tài)地完成。例如，待檢測(cè)物質(zhì)可以涂覆于載玻片或其他表面，并使用配備有合適檢測(cè)器的照相機(jī)進(jìn)行成像。

顆粒、顆粒組或包含顆粒的核酸的檢測(cè)可至少部分地基于顆?；蚝怂釓?fù)合體的一個(gè)或多個(gè)物理性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)顆?；虬w粒的核酸復(fù)合體的檢測(cè)可至少部分地基于顆粒的大小、核酸復(fù)合體中顆粒的大小或核酸復(fù)合體的大小。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)顆?；虬w粒的核酸復(fù)合體的檢測(cè)可至少部分地基于顆粒的密度、核酸復(fù)合體中顆粒的密度或核酸復(fù)合體的密度。在一些實(shí)施方案中，一個(gè)或多個(gè)顆?；蚝怂釓?fù)合體的檢測(cè)可基于核酸復(fù)合體的顆粒的沉降速率和/或粘度。此外，一個(gè)或多個(gè)顆?；虬w粒的核酸的檢測(cè)可至少部分地基于顆?；蚝怂釓?fù)合體的一個(gè)或多個(gè)電性質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

在一些實(shí)施方案中，檢測(cè)核酸分子、核酸序列或核酸復(fù)合體可借助于可檢測(cè)物質(zhì)來(lái)實(shí)現(xiàn)?？蓹z測(cè)物質(zhì)可與核酸分子、與核酸復(fù)合體締合的核酸分子和/或核酸復(fù)合體的任何其他組分連接或偶聯(lián)，包括共價(jià)地和非共價(jià)地(例如，包括雙鏈核酸分子的嵌入)。此外，如本文別處所述，可檢測(cè)物質(zhì)可被包含在用來(lái)生成核酸復(fù)合體和/或用于核酸擴(kuò)增的反應(yīng)混合物中。可檢測(cè)物質(zhì)的非限制性實(shí)例包括光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì)(例如，光學(xué)響應(yīng)性染料、光學(xué)響應(yīng)性寡核苷酸探針(例如，taqman探針、taqmantamara探針、taqmanmgb探針、lion探針、分子信標(biāo)))和放射性標(biāo)記(例如，¹⁴c、¹²³i、¹²⁴i、¹²⁵i、¹³¹i、^99mtc、³⁵s或³h)。

在一些實(shí)施方案中，可檢測(cè)物質(zhì)可以是當(dāng)經(jīng)受適當(dāng)條件時(shí)生成(或不能生成)信號(hào)的光學(xué)響應(yīng)性染料(例如，熒光染料)。染料的非限制性實(shí)例包括sybr綠、sybr藍(lán)、dapi、碘化丙錠、hoeste、sybr金、溴化乙錠、吖啶、原黃素、吖啶橙、吖啶黃素、氟香豆素(fluorcoumanin)、玫瑰樹堿、道諾霉素、氯喹、偏端霉素d、色霉素、乙菲啶、光神霉素、聚吡啶釕、氨茴霉素、亞甲藍(lán)、菲啶和吖啶、碘化丙錠、碘化己錠(hexidiumiodide)、二氫乙錠、乙錠同型二聚體-1和-2、單疊氮化乙錠和acma、hoechst33258、hoechst33342、hoechst34580、dapi、派洛寧y、blueview、吖啶橙、7-aad、放線菌素d、lds751、藻紅蛋白、羥芪巴脒、sytox藍(lán)、sytox綠、sytox橙、popo-1、popo-3、yoyo-1、yoyo-3、toto-1、toto-3、jojo-1、lolo-1、bobo-1、bobo-3、po-pro-1、po-pro-3、bo-pro-1、bo-pro-3、to-pro-1、to-pro-3、to-pro-5、jo-pro-1、lo-pro-1、yo-pro-1、yo-pro-3、picogreen、oligreen、ribogreen、sybr金、sybr綠i、sybr綠ii、sybrdx、syto-40、-41、-42、-43、-44、-45(藍(lán))、syto-13、-16、-24、-21、-23、-12、-11、-20、-22、-15、-14、-25(綠)、syto-81、-80、-82、-83、-84、-85(橙)、syto-64、-17、-59、-61、-62、-60、-63(紅)、熒光素、異硫氰酸熒光素(fitc)、四甲基異硫氰酸羅丹明(tritc)、羅丹明、四甲基羅丹明、r-藻紅蛋白、cy-2、cy-3、cy-3.5、cy-5、cy5.5、cy-7、德克薩斯紅、phar-red、別藻藍(lán)蛋白(apc)、celltracker綠、7-aad、乙錠同源二聚體i、乙錠同源二聚體ii、乙錠同源二聚體iii、傘形酮、曙紅、熒光蛋白(例如，綠色熒光蛋白、紅色熒光蛋白)、赤蘚紅、香豆素、甲基香豆素、芘、孔雀石綠、芪、熒光黃、級(jí)聯(lián)藍(lán)、二氯三嗪基胺熒光素、丹酰氯、諸如包含銪和鋱的那些的熒光鑭系元素絡(luò)合體、羧基四氯熒光素、5和/或6-羧基熒光素(fam)、5-(或6-)碘乙酰胺熒光素、5-{[2(和3)-5-(乙酰巰基)-琥珀?；鵠氨基}熒光素(samsa-熒光素)、麗絲胺羅丹明b磺酰氯、5和/或6羧基羅丹明(rox)、7-氨基-甲基-香豆素、7-氨基-4-甲基香豆素-3-乙酸(amca)、bodipy熒光團(tuán)、8-甲氧基芘-1,3,6-三磺酸三鈉鹽、3,6-二磺酸鹽-4-氨基-萘酰亞胺、藻膽蛋白、alexafluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、633、635、647、660、680、700、750和790染料、dylight350、405、488、550、594、633、650、680、755和800染料或其他熒光團(tuán)。

在一些實(shí)施方案中，核酸復(fù)合體可以經(jīng)由在核酸復(fù)合體形成時(shí)觀察到的光學(xué)變化來(lái)檢測(cè)。例如，如本文別處所述，核酸復(fù)合體可由多個(gè)顆粒生成。該顆粒可以是例如金屬顆粒(例如，金屬納米顆粒)，例如，金納米顆?；蜚y納米顆粒。游離顆粒在核酸復(fù)合體的形成之前可以顯示第一顏色，并且包含相同顆粒的核酸復(fù)合體可以顯示第二顏色?？梢詸z測(cè)(例如，采用目視檢查和/或檢測(cè)器)第二顏色來(lái)鑒定/定量該核酸復(fù)合體，并且第一顏色到第二顏色的顏色變化(或不存在顏色變化)可用來(lái)測(cè)定該核酸復(fù)合體的存在或不存在。在一些實(shí)施方案中，該核酸復(fù)合體可以從其他物質(zhì)中分離出以便觀察任何顏色變化。此外，顆粒的其他合適的光學(xué)性質(zhì)可以用于檢測(cè)核酸復(fù)合體，例如，從半導(dǎo)體顆粒接收的光信號(hào)。

在一些實(shí)施方案中，核酸復(fù)合體可包含至少兩種不同類型的顆粒(例如，具有兩種不同材料成分的顆粒，例如金顆粒和銀顆粒)。核酸復(fù)合體的光學(xué)檢測(cè)可經(jīng)由這兩種類型的顆粒之間的能量轉(zhuǎn)移進(jìn)行。例如，第一種類型的顆粒可具有波長(zhǎng)1a和發(fā)射波長(zhǎng)1e。例如，第二種類型的顆?？删哂形詹ㄩL(zhǎng)2a和發(fā)射波長(zhǎng)2e?？梢詸z測(cè)發(fā)射波長(zhǎng)2e，當(dāng)包含該核酸復(fù)合體的溶液在波長(zhǎng)1a下被激發(fā)(當(dāng)核酸復(fù)合體存在時(shí))時(shí)可以檢測(cè)到發(fā)射波長(zhǎng)2e。在不存在核酸復(fù)合體的情況下，當(dāng)顆粒在波長(zhǎng)1a下被激發(fā)時(shí)，第一顆粒和第二顆粒是分離的并且未檢測(cè)到發(fā)射波長(zhǎng)2e。

圖1示意性地描述了經(jīng)由核酸擴(kuò)增生成核酸復(fù)合體、分離所生成的核酸復(fù)合體和檢測(cè)該核酸復(fù)合體的實(shí)例。提供了兩種反應(yīng)混合物101和102。兩種反應(yīng)混合物包含含有正向引物的第一種類型的顆粒103和含有反向引物的第二種類型的顆粒104。或者，顆粒103和顆粒104可包含如本文別處所述能夠與擴(kuò)增的核酸分子的突出端序列雜交的第一和第二捕獲序列。顆粒103和104在反應(yīng)混合物中是游離的且最初未與核酸復(fù)合體締合。在一些實(shí)施方案中，顆粒103和104均為金屬顆粒，例如金或銀納米顆粒。反應(yīng)混合物101包含可在顆粒104和105的存在下擴(kuò)增的模板核酸分子105，使得生成包含一個(gè)或多個(gè)擴(kuò)增的核酸分子和顆粒104和105的核酸復(fù)合體。反應(yīng)混合物102不包含模板核酸分子105。模板核酸分子可以是單鏈的或者可以是雙鏈的。此外，兩種反應(yīng)混合物的顏色由于顆粒103和104的顏色而呈紅色。

反應(yīng)混合物101和102經(jīng)受適合于擴(kuò)增模板核酸分子105的條件106，以生成與核酸復(fù)合體107締合的擴(kuò)增的核酸分子。由于反應(yīng)混合物101包含模板核酸分子，因此在擴(kuò)增模板核酸分子105之后在反應(yīng)混合物101中生成核酸復(fù)合體107。此外，因?yàn)榉磻?yīng)混合物102未包含模板核酸分子105，所以在反應(yīng)混合物102中未生成核酸復(fù)合體107，并因此沒(méi)有發(fā)生擴(kuò)增。在核酸復(fù)合體107形成時(shí)，反應(yīng)混合物101的顏色因核酸復(fù)合體107中顆粒104和105的偶聯(lián)而由紅色變?yōu)樗{(lán)色。由于未生成核酸復(fù)合體，故反應(yīng)混合物102的顏色仍然為紅色。

可以采用目視檢查來(lái)檢測(cè)反應(yīng)混合物101的藍(lán)色，以確定反應(yīng)混合物101包含核酸復(fù)合體107(并因此包含擴(kuò)增的核酸分子)?？梢圆捎媚恳暀z查來(lái)檢測(cè)反應(yīng)混合物102的紅色，以確定反應(yīng)混合物102不包含核酸復(fù)合體107(并因此不包含擴(kuò)增的核酸分子)。在核酸復(fù)合體107的分離有助于觀察其藍(lán)色的情況下(例如，由于例如來(lái)自反應(yīng)混合物101中其他物質(zhì)的可能的干擾)，可以從反應(yīng)混合物101中(例如，經(jīng)由色譜法或過(guò)濾)分離108核酸107。

藍(lán)色帶的存在109指示反應(yīng)混合物中核酸復(fù)合體107(并因此，反應(yīng)混合物中模板核酸分子105)的藍(lán)色。藍(lán)色帶的不存在110指示反應(yīng)混合物102不包含核酸復(fù)合體107(并因此不包含核酸分子105)。核酸復(fù)合體107的藍(lán)色是顆粒104和105聚集(經(jīng)由擴(kuò)增)而生成核酸復(fù)合體107的結(jié)果。

圖2示意性地描述了分離和檢測(cè)核酸復(fù)合體的實(shí)例。如圖所示，反應(yīng)混合物201被包含在容器202中且包含核酸復(fù)合體。容器202被封裝在密封容器203中。密封容器203可用來(lái)防止反應(yīng)混合物201的污染。容器203還包含固體基質(zhì)204(例如，一片濾紙或妊娠試紙)和能夠在容器202的底部形成出口的機(jī)構(gòu)205(例如，穿孔機(jī)構(gòu))。形成206出口以使得反應(yīng)混合物201涂覆207于固體基質(zhì)204。通過(guò)因毛細(xì)管作用210而產(chǎn)生的流動(dòng)，將反應(yīng)混合物201的內(nèi)含物分離。由于反應(yīng)混合物201中的核酸復(fù)合體與反應(yīng)混合物201中的其他試劑(例如，游離顆粒、用于引物延伸反應(yīng)的試劑、引物等)相比尺寸較大，它的移動(dòng)與其他試劑相比比較遲緩。因此，在固體基質(zhì)204上可生成對(duì)應(yīng)于核酸復(fù)合體的帶208，并將帶208與在該固體基質(zhì)的更遠(yuǎn)的下部生成的且表示反應(yīng)混合物201中其他試劑的帶209分離。可以在目視檢查(如果可行)時(shí)檢測(cè)帶208與209的分離，或采用合適類型的檢測(cè)器(例如，光學(xué)檢測(cè)器)進(jìn)行檢測(cè)。此外，帶208的不存在指示反應(yīng)混合物201不包含核酸復(fù)合體。

本文所述的各個(gè)方面可用于進(jìn)行多重核酸擴(kuò)增反應(yīng)。多重核酸擴(kuò)增可用于各種不同的應(yīng)用，其非限制性實(shí)例包括精確檢測(cè)和定量小百分比基因拷貝數(shù)差異；檢測(cè)和定量序列突變(例如，插入、缺失)和罕見(jiàn)突變(例如，與癌癥相關(guān)的低患病率靶標(biāo)中的罕見(jiàn)突變)；檢測(cè)和定量病原體(例如，檢測(cè)和絕對(duì)定量細(xì)菌和病毒載量，檢測(cè)和定量污染食物和水供應(yīng)的低水平病原體)；生成參考和標(biāo)準(zhǔn)(例如，生成遺傳測(cè)量、計(jì)量和交叉實(shí)驗(yàn)室測(cè)量的絕對(duì)參考標(biāo)準(zhǔn))；制備測(cè)序文庫(kù)；在有或沒(méi)有參考標(biāo)準(zhǔn)的情況下定量測(cè)序文庫(kù)(例如，在沒(méi)有參考標(biāo)準(zhǔn)的情況下絕對(duì)定量測(cè)序文庫(kù)和驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果)；檢測(cè)和定量基因表達(dá)變化(例如，在沒(méi)有參考基因的情況下檢測(cè)基因表達(dá)變化，以供絕對(duì)轉(zhuǎn)錄物定量)；檢測(cè)和定量轉(zhuǎn)基因生物(gmo)(例如，檢測(cè)和絕對(duì)定量植物中的外源基因)；檢測(cè)和定量血液中可能存在的循環(huán)腫瘤細(xì)胞(ctc)或其他罕見(jiàn)核酸；分析樣品中的基因拷貝數(shù)；分析生物樣品中的病原體載量和病原體載量變化；分析響應(yīng)于藥物治療的轉(zhuǎn)錄水平；環(huán)境測(cè)試；法醫(yī)鑒定；臨床診斷以及檢測(cè)核苷酸多態(tài)性或基因型，如hla或hmc分型。

在一些實(shí)施方案中，本文所述的組合物和方法可用于rna分析。在這樣的分析中，rna可經(jīng)由逆轉(zhuǎn)錄酶的作用進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄以生成cdna。隨后可使用本文別處所述的顆粒或顆粒組擴(kuò)增該cdna以生成核酸復(fù)合體。核酸復(fù)合體一旦形成便可隨后使用任何合適的方法進(jìn)行分離和/或檢測(cè)，所述方法包括本文別處所述的那些。

圖7示意性地描述了多重核酸擴(kuò)增的示例方法。如圖7所示，懷疑包含或包含一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的核酸樣品701(例如，包含dna的樣品)提供于容器702中?？梢韵蚨鄠€(gè)容器703中的每一個(gè)提供核酸樣品701的等分試樣。在圖7所示的實(shí)例中，將核酸樣品等分至四個(gè)容器中，然而可向任何合適數(shù)目的容器提供核酸樣品701的等分試樣。在每一個(gè)容器中，提供了被配置為擴(kuò)增包含獨(dú)特靶核酸序列的核酸分子的引物組(例如，至少包含正向引物和反向引物的引物組)。例如，可提供至少部分互補(bǔ)于靶核酸序列的正向引物，并且可提供至少部分互補(bǔ)于該靶核酸序列的互補(bǔ)序列的反向引物。

在圖7所示的實(shí)例中，每一個(gè)引物組由“a”、“b”、“c”和“d”表示，并且每一個(gè)組被配置為擴(kuò)增包含四個(gè)獨(dú)特靶核酸序列中的一個(gè)的核酸分子。此外，如本文別處所述，每一個(gè)引物組中的引物可以按照與顆粒偶聯(lián)(例如，經(jīng)由引物的5’端偶聯(lián))的方式提供，或如本文別處所述以游離于顆粒的方式提供。在該引物以游離于顆粒的方式提供的情況下，該引物可被配置成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，并且該發(fā)夾結(jié)構(gòu)還可以包含對(duì)于特定引物的特定引發(fā)序列獨(dú)特的突出端序列(并因此包含特定的靶核酸序列)。除了引物組之外，還向容器703提供擴(kuò)增核酸分子所需的附加試劑(例如，聚合酶、dntp、合適的緩沖液、輔因子)以及生成核酸復(fù)合體所需的附加試劑(例如，與互補(bǔ)于任何突出端序列的捕獲序列偶聯(lián)的顆粒，等)以在每個(gè)容器中生成預(yù)反應(yīng)混合物704。

隨后可向每個(gè)預(yù)反應(yīng)混合物704中添加710適合于生成油包水乳液的試劑(例如，油、表面活性劑等)，使得在每個(gè)容器中生成在連續(xù)油相中包含多個(gè)水性小滴的油包水乳液705。每個(gè)油包水乳液705中的水性小滴包含水性反應(yīng)混合物，該水性反應(yīng)混合物包含相應(yīng)的預(yù)反應(yīng)混合物704的內(nèi)含物。在一些實(shí)施方案中，可以生成油包水乳液705，使得油包水乳液705中的一些水性小滴不包含待擴(kuò)增的核酸分子?？梢岳缤ㄟ^(guò)控制預(yù)反應(yīng)混合物704中樣品的稀釋水平和/或?yàn)榱松捎桶橐?05而添加710的試劑的量來(lái)實(shí)現(xiàn)這種控制。

來(lái)自每個(gè)油包水乳液705的小滴隨后可合并720至提供給共同的容器707的共同的油包水乳液706中。如本文別處所述，該共同的油包水乳液706(或油包水乳液703)可隨后經(jīng)受適合于擴(kuò)增每個(gè)小滴中的核酸分子(例如，經(jīng)由每個(gè)小滴中存在的引物組)以及在擴(kuò)增期間或之后生成核酸復(fù)合體的條件730。例如，如本文別處所述，共同的油包水乳液706的溫度可以循環(huán)。作為擴(kuò)增的結(jié)果，可在小滴中生成740核酸復(fù)合體(例如，對(duì)應(yīng)于740中的閉環(huán))，該小滴包含特定的引物組和包含相應(yīng)的靶核酸序列的一個(gè)或多個(gè)核酸分子。在不存在核酸分子或不存在包含對(duì)應(yīng)于小滴中引物組的靶核酸序列的核酸分子的小滴中，可能由于缺乏靶核酸序列而不能在小滴中生成核酸復(fù)合體(例如，對(duì)應(yīng)于740中的開環(huán))。

隨后可打破750共同的油包水乳液706，使得兩相混合物包含來(lái)自共同的油包水乳液706的連續(xù)油相的油708以及合并的水性混合物709，該水性混合物709包含共同的油包水乳液706的小滴的水性反應(yīng)混合物。合并的水性混合物709可與油708分離并提供760給陣列711。陣列711的每個(gè)位置可包含表面，在該表面上固定有至少部分互補(bǔ)于游離引物的一個(gè)或多個(gè)捕獲序列或與特定靶核酸序列(并因此與核酸復(fù)合體)締合的捕獲序列?？梢园才抨嚵械奈恢?，使得特定列、行或位置的其他配置對(duì)應(yīng)于特定捕獲序列或捕獲序列組，并且因此對(duì)應(yīng)于特定靶核酸序列。

在圖7所示的實(shí)例中，陣列711的每一列對(duì)應(yīng)于與特定靶核酸序列相對(duì)應(yīng)的特定引物組(例如，上述的“a”、“b”、“c”和“d”)并標(biāo)記為“a”、“b”、“c”和“d”。經(jīng)由固定于陣列711的捕獲序列，生成的核酸復(fù)合體的相應(yīng)游離引物或捕獲序列可與它們?cè)陉嚵?11上的合適位置結(jié)合。由于特定核酸復(fù)合體的每一個(gè)游離引物或捕獲序列對(duì)于特定靶核酸序列是獨(dú)特的，因此可根據(jù)該核酸復(fù)合體在陣列711上結(jié)合哪個(gè)(哪些)位點(diǎn)，將它鑒定為對(duì)應(yīng)于特定靶核酸序列。在圖7所示的實(shí)例中，在陣列位置處的閉環(huán)表示核酸復(fù)合體的結(jié)合，而在陣列位置處的開環(huán)表示在該陣列位置沒(méi)有核酸復(fù)合體的結(jié)合。核酸復(fù)合體的結(jié)合可經(jīng)由任何合適的方式檢測(cè)，所述方式包括本文別處所述的檢測(cè)方式?？梢杂?jì)數(shù)770(例如，數(shù)字計(jì)數(shù))包含特定的結(jié)合的靶核酸復(fù)合體(并因此，特定的靶核酸序列)的位置，并將計(jì)數(shù)數(shù)據(jù)用于下游應(yīng)用。

圖8示意性地描述了多重核酸擴(kuò)增及其在核酸測(cè)序中的可能用途的附加實(shí)例。如圖8所示，懷疑包含或包含一個(gè)或多個(gè)靶核酸序列的核酸樣品801(例如，包含dna的樣品)提供于容器802中?？梢韵蚨鄠€(gè)容器803中的每一個(gè)提供核酸樣品801的等分試樣。在圖8所示的實(shí)例中，將核酸樣品等分至四個(gè)容器中，然而可向任何合適數(shù)目的容器提供核酸樣品801的等分試樣。在每一個(gè)容器中，提供了被配置用于擴(kuò)增包含獨(dú)特靶核酸序列的核酸分子的引物組(例如，至少包含正向引物和反向引物的引物組)。例如，可提供至少部分互補(bǔ)于靶核酸序列的正向引物，并且可提供至少部分互補(bǔ)于該靶核酸序列的互補(bǔ)序列的反向引物。

在圖8所示的實(shí)例中，每一個(gè)引物組由“a”、“b”、“c”和“d”表示，并且每一個(gè)組被配置用于擴(kuò)增包含四個(gè)獨(dú)特靶核酸序列之一的核酸分子。此外，如本文別處所述，每個(gè)引物組中的引物可以以游離于顆粒的方式提供。在該引物以游離于顆粒的方式提供的情況下，該引物可被配置成發(fā)夾結(jié)構(gòu)(例如，如在圖3和圖4所示的實(shí)例中)，并且該發(fā)夾結(jié)構(gòu)還可以包含對(duì)于該特定引物的特定引發(fā)序列獨(dú)特的突出端序列(并因此包含特定的靶核酸序列)。除了該引物組之外，還向容器803提供擴(kuò)增核酸分子所需的附加試劑(例如，聚合酶、dntp、合適的緩沖液、輔因子)以及生成核酸復(fù)合體所需的附加試劑(例如，與互補(bǔ)于任何突出端序列的捕獲序列偶聯(lián)的顆粒)以在每個(gè)容器中生成預(yù)反應(yīng)混合物804。在一些實(shí)施方案中，與捕獲序列一起提供的顆粒還可以包含共同的親和捕獲劑，如結(jié)合對(duì)的成員(例如，生物素)。

隨后可向每個(gè)預(yù)反應(yīng)混合物804中添加810適合于生成油包水乳液的試劑(例如，油、表面活性劑等)，使得在每個(gè)容器中生成在連續(xù)油相中包含多個(gè)水性小滴的油包水乳液805。每個(gè)油包水乳液805中的水性小滴包含水性反應(yīng)混合物，該水性反應(yīng)混合物包含相應(yīng)的預(yù)反應(yīng)混合物804的內(nèi)含物。在一些實(shí)施方案中，可以生成油包水乳液805，使得油包水乳液805中的一些水性小滴不包含待擴(kuò)增的核酸分子?？梢岳缤ㄟ^(guò)控制預(yù)反應(yīng)混合物804中樣品的稀釋水平和/或?yàn)榱松捎桶橐?05而添加810的試劑的量來(lái)實(shí)現(xiàn)這種控制。

來(lái)自每個(gè)油包水乳液805的小滴隨后可合并820至提供給共同的容器807的共同的油包水乳液806中。如本文別處所述，該共同的油包水乳液806(或油包水乳液803)可隨后經(jīng)受適合于擴(kuò)增每個(gè)小滴中的核酸分子(例如，經(jīng)由每個(gè)小滴中存在的引物組)以及在擴(kuò)增期間或之后生成核酸復(fù)合體的條件830。例如，如本文所述，共同的油包水乳液806的溫度可以循環(huán)。作為擴(kuò)增的結(jié)果，可在小滴中生成840核酸復(fù)合體(例如，對(duì)應(yīng)于840中的閉環(huán))，該小滴包含特定的引物組和包含相應(yīng)的靶核酸序列的一個(gè)或多個(gè)核酸分子。在不存在核酸分子或不存在包含對(duì)應(yīng)于該小滴中引物組的靶核酸序列的核酸分子的小滴中，可能由于缺乏靶核酸序列而不能在該小滴中生成核酸復(fù)合體(例如，對(duì)應(yīng)于840中的開環(huán))。生成的核酸復(fù)合體在結(jié)構(gòu)上可類似于圖4所示的示例核酸復(fù)合體411，因?yàn)樯傻暮怂釓?fù)合體的擴(kuò)增的雙鏈核酸分子可經(jīng)由顆粒的捕獲序列與擴(kuò)增的雙鏈核酸分子的突出端序列之間的雜交而與生成的核酸復(fù)合體的顆粒偶聯(lián)。

隨后可打破850共同的油包水乳液806，使得兩相混合物包含來(lái)自共同的油包水乳液806的連續(xù)油相的油808以及合并的水性混合物809，所述水性混合物809包含共同的油包水乳液806的小滴的水性反應(yīng)混合物。必要時(shí)，合并的水性混合物809可與油808分離。此外，合并的水性混合物809可經(jīng)受適合于將與核酸復(fù)合體締合的擴(kuò)增雙鏈核酸分子(例如，經(jīng)由向合并的水性混合物809中加入連接酶或經(jīng)由合并的水性混合物809中已經(jīng)存在的連接酶)連接860至與該擴(kuò)增雙鏈核酸分子締合的相應(yīng)捕獲序列的條件。在將擴(kuò)增的雙鏈核酸分子與捕獲序列連接之后，核酸復(fù)合體可變性870為包含擴(kuò)增的雙鏈核酸分子的單鏈的組分顆粒，使得顆粒和單鏈不再在核酸復(fù)合體中締合。

隨后可將組分顆粒和鏈提供880給測(cè)序陣列811。測(cè)序陣列811的每個(gè)位置可包含表面，在該表面上固定有可與核酸復(fù)合體結(jié)合的一個(gè)或多個(gè)親和捕獲劑。在一些實(shí)施方案中，例如，所述一個(gè)或多個(gè)親和捕獲劑可包含至少部分互補(bǔ)于與特定靶核酸序列締合或甚至至少部分互補(bǔ)于該靶核酸本身的游離引物或捕獲序列?？梢园才抨嚵械奈恢茫沟锰囟?、行或位置的其他配置對(duì)應(yīng)于特定捕獲序列或捕獲序列組，并且因此對(duì)應(yīng)于特定靶核酸序列。在組分顆粒包含共同的親和捕獲劑(例如，生物素)的情況下，親和捕獲劑可包含能夠結(jié)合共同的親和捕獲劑(例如，生物素)的試劑(例如，鏈霉親和素)。

經(jīng)由固定于測(cè)序陣列811的親和捕獲劑，組分顆粒的相應(yīng)結(jié)合物質(zhì)(例如，游離引物、捕獲序列、共同的親和捕獲劑或與顆粒偶聯(lián)的單鏈核酸分子的序列)可與測(cè)序陣列811上的位置結(jié)合。在圖8所示的實(shí)例中，在陣列位置的閉環(huán)表示顆粒的結(jié)合，而在陣列位置的開環(huán)表示在該陣列位置沒(méi)有顆粒的結(jié)合。與組分顆粒偶聯(lián)的單鏈核酸分子可隨后在核酸測(cè)序反應(yīng)890例如合成測(cè)序反應(yīng)中用作模板。從測(cè)序反應(yīng)獲得的序列可經(jīng)由任何合適的方式來(lái)檢測(cè)，所述方式包括本文別處所述的實(shí)例檢測(cè)方式。

圖9顯示了處理核酸復(fù)合體以用于測(cè)序反應(yīng)的實(shí)例。如圖9所示，核酸擴(kuò)增期間生成的核酸復(fù)合體901可包含與擴(kuò)增的雙鏈核酸分子903偶聯(lián)的多個(gè)顆粒902，所述偶聯(lián)經(jīng)由與所述顆粒(例如，在捕獲序列的3’端)偶聯(lián)的捕獲序列和與擴(kuò)增的雙鏈核酸分子903(例如，在擴(kuò)增的雙鏈核酸分子的組分鏈的5’端)偶聯(lián)的突出端序列的雜交。核酸復(fù)合體901隨后可經(jīng)受適合于將擴(kuò)增的雙鏈核酸分子903與各自的捕獲序列連接的條件。

在連接之后，核酸復(fù)合體可(例如，在變性溫度下和/或在添加變性劑(例如，堿劑)的情況下)變性920為組分顆粒904。變性可通過(guò)將擴(kuò)增的雙鏈核酸分子903的鏈分離成組分單鏈核酸分子905，而將擴(kuò)增的雙鏈核酸分子903分離成組分顆粒904。如圖9所示，將示例組分顆粒904分離并使之與單鏈核酸分子905在單鏈分子905的3’端偶聯(lián)。

隨后可將組分顆粒904提供給與一個(gè)或多個(gè)親和捕獲劑907和908締合的表面906。在圖9所示的實(shí)例中，表面906包含至少部分互補(bǔ)于組分顆粒904上的游離捕獲序列或組分顆粒904上的其他序列的捕獲序列907和908。捕獲序列907和908可經(jīng)由與偶聯(lián)至組分顆粒904的合適物質(zhì)的雜交而結(jié)合組分顆粒904。在一些實(shí)施方案中，組分顆粒904可包含結(jié)合對(duì)的共同成員(例如，生物素)且表面906的親和捕獲劑可包含該結(jié)合對(duì)的另一成員(例如，鏈霉親和素)。該結(jié)合對(duì)的兩個(gè)成員可以結(jié)合，使得組分顆粒904與表面906結(jié)合。

如圖9所示，結(jié)合使與組分顆粒締合的單鏈核酸分子905固定于表面906。單鏈分子905可在測(cè)序反應(yīng)例如合成測(cè)序反應(yīng)中用作模板。該測(cè)序反應(yīng)的檢測(cè)可經(jīng)由任何合適的檢測(cè)方式來(lái)完成，所述方式包括本文別處所述的示例檢測(cè)方式。

在本文所述的各個(gè)方面，方法可包括核酸分子的擴(kuò)增。通常，核酸擴(kuò)增可在反應(yīng)混合物中進(jìn)行，其中待擴(kuò)增的核酸分子與擴(kuò)增核酸分子所需的附加的試劑(例如，正向引物、反向引物、聚合酶、dntp、輔因子、合適的緩沖液等)一起提供。該反應(yīng)混合物隨后可經(jīng)受適合于擴(kuò)增該核酸分子的條件(例如，合適的溫度、熱的添加/移除、緩沖液濃度等)。

例如，可在反應(yīng)混合物中提供單鏈或雙鏈核酸分子，該反應(yīng)混合物還包含附加試劑(例如，本文別處所述的正向引物和反向引物，聚合酶、dntp、輔因子、緩沖液、擴(kuò)增單鏈或雙鏈核酸分子所需的其他的酶(例如，用于由rna生成cdna的逆轉(zhuǎn)錄酶、連接酶等))。在一些實(shí)施方案中，反應(yīng)混合物的溫度可經(jīng)過(guò)變性溫度(例如，以使雙鏈核酸分子變性、分離或解鏈為組分核酸鏈)、退火溫度(例如，以使引物與組分核酸鏈中的每一個(gè)退火或雜交)和延伸溫度(例如，以在引物延伸反應(yīng)中經(jīng)由聚合酶的作用將核苷酸延伸或添加至退火的引物)重復(fù)循環(huán)，以便擴(kuò)增該單鏈或雙鏈核酸分子。反應(yīng)混合物的溫度循環(huán)可以例如借助于任何合適的熱循環(huán)儀儀器或其他類型的加熱裝置來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些實(shí)施方案中，雙鏈核酸分子的變性可以經(jīng)由變性劑例如堿劑(例如，氫氧化鈉(naoh))來(lái)實(shí)現(xiàn)。在一些情況下，核酸的擴(kuò)增可以等溫地，例如在沒(méi)有反應(yīng)混合物的溫度變化的情況下實(shí)現(xiàn)。

核酸擴(kuò)增反應(yīng)可以包括聚合酶的使用和作用。在引物延伸反應(yīng)期間，聚合酶可通常以模板指導(dǎo)的方式將核苷酸添加至與單鏈核酸分子退火的引物的3’端。任何合適的聚合酶可以用于引物延伸反應(yīng)，包括商購(gòu)可得的聚合酶。聚合酶的非限制性實(shí)例包括taq聚合酶、tth聚合酶、tli聚合酶、pfu聚合酶、vent聚合酶、deepvent聚合酶、ex-taq聚合酶、la-taq聚合酶、expand聚合酶、sso聚合酶、poc聚合酶、pab聚合酶、mth聚合酶、pho聚合酶、phusiondna聚合酶、es4聚合酶、tru聚合酶、tac聚合酶、tne聚合酶、tma聚合酶、tih聚合酶、tfi聚合酶、platinumtaq聚合酶、hi-fi聚合酶、tbr聚合酶、tfl聚合酶、pfutubo聚合酶、pyrobest聚合酶、pwo聚合酶、kod聚合酶、bst聚合酶、sac聚合酶、klenow片段、具有3’到5’外切核酸酶活性的聚合酶、kletaqdna聚合酶及其變體、經(jīng)修飾的產(chǎn)物和衍生物。

在一些實(shí)施方案中，合適的變性溫度可以為例如，約60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃、81℃、82℃、83℃、84℃、85℃、86℃、87℃、88℃、89℃、90℃、91℃、93℃、94℃、95℃、96℃、97℃、98℃、99℃、100℃、101℃、102℃、103℃、104℃、105℃或更高。在一些實(shí)施方案中，合適的退火溫度可以為例如，約45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高。在一些實(shí)施方案中，合適的延伸溫度可以為例如，約45℃、46℃、47℃、48℃、49℃、50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃、60℃、61℃、62℃、63℃、64℃、65℃、66℃、67℃、68℃、69℃、70℃、71℃、72℃、73℃、74℃、75℃、76℃、77℃、78℃、79℃、80℃或更高。在一些實(shí)施方案中，退火和變性步驟可以合并，使得它們?cè)谙嗤臏囟认逻M(jìn)行。

任何合適類型的核酸擴(kuò)增反應(yīng)可以用來(lái)擴(kuò)增核酸分子。核酸擴(kuò)增反應(yīng)的一個(gè)實(shí)例是聚合酶鏈反應(yīng)(pcr)，它依賴于如上所述的引物退火、引物延伸和擴(kuò)增的核酸分子的變性的重復(fù)循環(huán)。核酸擴(kuò)增反應(yīng)類型的附加非限制性實(shí)例包括逆轉(zhuǎn)錄、連接酶鏈反應(yīng)、巢式擴(kuò)增、多重?cái)U(kuò)增、解旋酶依賴性擴(kuò)增、不對(duì)稱擴(kuò)增、滾環(huán)擴(kuò)增、多重置換擴(kuò)增(mda)；以及pcr的變化形式，其包括實(shí)時(shí)pcr、熱啟動(dòng)pcr、反向pcr、甲基化特異性pcr、等位基因特異性pcr、裝配pcr、不對(duì)稱pcr、微引物pcr、多重pcr、嵌套式pcr、重疊延伸pcr、數(shù)字pcr、乳液pcr、撥出pcr、解旋酶依賴性pcr、巢式pcr、熱不對(duì)稱交錯(cuò)pcr和降落(touchdown)pcr。在一些實(shí)施方案中，數(shù)字pcr和其他擴(kuò)增過(guò)程可以與本文所述的任一種擴(kuò)增方法、顆粒、引物和/或捕獲序列一起使用。

本公開內(nèi)容的附加方面提供了用于測(cè)定或鑒定樣品中靶核酸分子/靶核酸序列的存在與否和/或執(zhí)行本公開內(nèi)容的方法的系統(tǒng)。一方面，本公開內(nèi)容提供了用于分析溶液的內(nèi)含物的系統(tǒng)。該系統(tǒng)可包含適合于包含或引導(dǎo)含有核酸復(fù)合體的溶液的檢測(cè)池，該核酸復(fù)合體包含至少與第一顆粒和第二顆粒連接的雙鏈核酸分子。該雙鏈核酸分子可包含第一單鏈核酸分子和互補(bǔ)于該第一單鏈核酸分子的至少一部分的第二單鏈核酸分子。此外，該系統(tǒng)還可以包含檢測(cè)器，該檢測(cè)器與檢測(cè)池連接并檢測(cè)指示在溶液中存在或不存在該核酸復(fù)合體的信號(hào)。此外，該系統(tǒng)還可以包含計(jì)算機(jī)處理器，該計(jì)算機(jī)處理器與該檢測(cè)器連接且被編程為接收來(lái)自該檢測(cè)器的信號(hào)(例如，指示存在或不存在該核酸復(fù)合體的信號(hào))，以及根據(jù)所檢測(cè)到的信號(hào)確定在溶液中存在或不存在該核酸復(fù)合體。

在一些實(shí)施方案中，該檢測(cè)池可包含容器(例如，本文別處所述的容器的實(shí)例類型)、孔(例如，微孔、機(jī)器微孔、微加工的微孔或腔)、孔陣列(例如，微孔板、模制微孔)和/或支持物(例如，本文別處所述的支持物的示例類型)。在一些實(shí)施方案中，該檢測(cè)池可包含流體流動(dòng)路徑，如微流體裝置的一個(gè)或多個(gè)通道。在這樣的實(shí)施方案中，該溶液可以經(jīng)由流體流動(dòng)提供給和/或引導(dǎo)至檢測(cè)池內(nèi)和/或其他系統(tǒng)組件內(nèi)。在一些實(shí)施方案中，系統(tǒng)還可以包含可被配置為使溶液流動(dòng)至和/或流過(guò)檢測(cè)池和任何其他系統(tǒng)組件的一個(gè)或多個(gè)泵。在一些實(shí)施方案中，所述一個(gè)或多個(gè)泵可以與檢測(cè)池和/或檢測(cè)器流體連接，以便將溶液提供給檢測(cè)池。核酸復(fù)合體的檢測(cè)可以在核酸復(fù)合體流過(guò)流體流動(dòng)路徑中的檢測(cè)器時(shí)進(jìn)行。在一些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)可包含一個(gè)或多個(gè)試劑儲(chǔ)器，其中單獨(dú)的試劑儲(chǔ)器可含有溶液和/或用于在該核酸復(fù)合體(例如，可檢測(cè)物質(zhì))包含在溶液和/或試劑中之前對(duì)其進(jìn)行檢測(cè)的任何其他試劑。該試劑儲(chǔ)器可以經(jīng)由流體流動(dòng)路徑如微流體裝置的一個(gè)或多個(gè)通道與檢測(cè)池流體連接。

在一些實(shí)施方案中，所述檢測(cè)池可包含溶液。此外，該溶液可以或可以不被包含在分區(qū)內(nèi)。在該溶液包含在分區(qū)中的情況下，該分區(qū)可以是任何合適類型的分區(qū)，其包括本文別處所述的分區(qū)的示例類型(例如，乳液的小滴、孔、腔)。在一些實(shí)施方案中，如本文別處所述，所述核酸復(fù)合體可包含多個(gè)與超過(guò)兩個(gè)顆粒連接的雙鏈核酸分子。在一些實(shí)施方案中，該溶液可包含多個(gè)核酸復(fù)合體。所述檢測(cè)器可以被配置用于檢測(cè)多個(gè)核酸復(fù)合體，并且所述計(jì)算機(jī)處理器可以被編程為用于確定所述多個(gè)核酸復(fù)合體(和/或與該核酸復(fù)合體締合的任何締合的核酸分子)的存在與否。

此外，所述檢測(cè)器可以是任何合適類型的檢測(cè)器，該檢測(cè)器的類型可依賴于使用的具體檢測(cè)方式。例如，在系統(tǒng)被配置用于光學(xué)檢測(cè)的情況下，該檢測(cè)器可以是光學(xué)檢測(cè)器(例如，分光光度計(jì)、uv-可見(jiàn)光吸光度分光光度計(jì)、熒光計(jì)、色度計(jì)、照相機(jī)(例如，電荷耦合器件(ccd)照相機(jī)、電子倍增電荷耦合器件(emccd)照相機(jī))、光電二極管、光電二極管陣列等)。檢測(cè)器的附加的非限制性實(shí)例包括光譜檢測(cè)器(例如，質(zhì)譜儀、核磁共振(nmr)光譜儀、粒度儀、電檢測(cè)器、紅外光譜儀、電子順磁共振(epr)光譜儀)和電化學(xué)檢測(cè)器。

各個(gè)系統(tǒng)組件之間的連接可依賴于所連接的具體系統(tǒng)組件。檢測(cè)池和檢測(cè)器可以電子連接，使得該檢測(cè)池與檢測(cè)器進(jìn)行電子通信。此外，該檢測(cè)器與檢測(cè)池之間的連接可依賴于例如具體的檢測(cè)方式。例如，檢測(cè)器和檢測(cè)池可以光學(xué)連接，使得光從檢測(cè)池到檢測(cè)器和/或從檢測(cè)器到檢測(cè)池穿過(guò)。此外，所述計(jì)算機(jī)處理器可以與檢測(cè)器電子連接，使得由該檢測(cè)器檢測(cè)到的信號(hào)由該檢測(cè)器進(jìn)行電子傳輸并由該計(jì)算機(jī)處理器進(jìn)行電子接收。在一些實(shí)施方案中，該檢測(cè)池還可與該計(jì)算機(jī)處理器連接(例如，電子連接)。此外，該計(jì)算機(jī)處理器還可被編程為用于控制檢測(cè)器操作(例如，檢測(cè)時(shí)機(jī)、用于特定的檢測(cè)模式或溶液的檢測(cè)器配置等)、檢測(cè)池操作或任何其他組件(例如，泵)的操作。此外，該系統(tǒng)的各種組件可以被包含在外殼中。在一些實(shí)施方案中，該檢測(cè)器和檢測(cè)池可以被包含在同一外殼中或可以被包含在不同的外殼中。在一些實(shí)施方案中，該計(jì)算機(jī)處理器可以與檢測(cè)器和/或檢測(cè)池被包含在同一外殼中，或可以被包含在不同的外殼中。在一些實(shí)施方案中，該系統(tǒng)的所有組件都可以被包含在單個(gè)外殼中。

在一些實(shí)施方案中，所述計(jì)算機(jī)處理器可以作為計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的一部分被包含在內(nèi)。該計(jì)算機(jī)系統(tǒng)可以與檢測(cè)器和/或檢測(cè)池分開安置，或可以與組件中的一個(gè)或兩者安置在一起。例如，如圖10所示，計(jì)算機(jī)處理器1005(例如，中央處理單元(cpu))可以作為計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1001的一部分被包含在內(nèi)，并且可以是單核或多核處理器以及用于并行處理的多個(gè)處理器。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1001還可以包含存儲(chǔ)器或存儲(chǔ)器位置1010(例如，隨機(jī)存取存儲(chǔ)器、只讀存儲(chǔ)器、閃速存儲(chǔ)器)，電子存儲(chǔ)單元1015(例如，硬盤)，用于與一個(gè)或多個(gè)其他系統(tǒng)通信的通信接口1020(例如，網(wǎng)絡(luò)適配器)，以及外圍設(shè)備1025，如高速緩存、其他存儲(chǔ)器、數(shù)據(jù)存儲(chǔ)和/或電子顯示適配器。存儲(chǔ)器1010、存儲(chǔ)單元1015、接口1020和外圍設(shè)備1025(例如，鍵盤、鼠標(biāo)、語(yǔ)音系統(tǒng)、麥克風(fēng)、打印機(jī)或其他輸入或輸出設(shè)備)可以通過(guò)通信總線(實(shí)線)如主板與計(jì)算機(jī)處理器1005進(jìn)行通信。存儲(chǔ)單元1015可以是用于存儲(chǔ)數(shù)據(jù)的數(shù)據(jù)存儲(chǔ)單元(或數(shù)據(jù)儲(chǔ)存庫(kù))。計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1001可以借助于通信接口1020與計(jì)算機(jī)網(wǎng)絡(luò)(“網(wǎng)絡(luò)”)1030可操作地耦合。網(wǎng)絡(luò)1030可以是因特網(wǎng)、互聯(lián)網(wǎng)和/或外聯(lián)網(wǎng)，或者與因特網(wǎng)通信的內(nèi)聯(lián)網(wǎng)和/或外聯(lián)網(wǎng)。在一些實(shí)施方案中，網(wǎng)絡(luò)1030可以是電信和/或數(shù)據(jù)網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)1030可以包括可以實(shí)現(xiàn)分布式計(jì)算如云計(jì)算的一個(gè)或多個(gè)計(jì)算機(jī)服務(wù)器。在一些實(shí)施方案中，網(wǎng)絡(luò)1030可以借助于計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1001實(shí)現(xiàn)對(duì)等網(wǎng)絡(luò)，該對(duì)等網(wǎng)絡(luò)可以使與計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1001耦合的設(shè)備能夠起到客戶端或服務(wù)器的作用。

計(jì)算機(jī)處理器1005可以執(zhí)行可在程序或軟件中體現(xiàn)的一系列機(jī)器可讀指令。該指令可以存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器位置如存儲(chǔ)器1010中。計(jì)算機(jī)處理器1005進(jìn)行的操作的實(shí)例可以包括讀取、解碼、執(zhí)行和回寫。存儲(chǔ)單元1015可以存儲(chǔ)文件，如驅(qū)動(dòng)程序、程序庫(kù)和保存的程序。存儲(chǔ)單元1015可以存儲(chǔ)由用戶生成的程序以及記錄的會(huì)話，以及與該程序相關(guān)的輸出。存儲(chǔ)單元1015可以存儲(chǔ)用戶數(shù)據(jù)，例如，用戶偏好和用戶程序。在一些實(shí)施方案中，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1001可以包括計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1001外部的一個(gè)或多個(gè)附加數(shù)據(jù)存儲(chǔ)單元，如位于通過(guò)內(nèi)聯(lián)網(wǎng)或因特網(wǎng)與計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1001進(jìn)行通信的遠(yuǎn)程服務(wù)器上的附加存儲(chǔ)單元。

計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1001可以通過(guò)網(wǎng)絡(luò)1030與一個(gè)或多個(gè)遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行通信。例如，計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1001可以與用戶的遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)系統(tǒng)進(jìn)行通信。遠(yuǎn)程計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的實(shí)例包括個(gè)人計(jì)算機(jī)(便攜式個(gè)人計(jì)算機(jī))、平板或平板個(gè)人計(jì)算機(jī)(例如，ipad、galaxytab)、電話、智能電話(例如，iphone、支持android的設(shè)備、)或個(gè)人數(shù)字助理。用戶可以經(jīng)由網(wǎng)絡(luò)1030訪問(wèn)計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1001。

本文所述的方法以及用于操作檢測(cè)池、檢測(cè)器和系統(tǒng)的任何其他組件(例如，泵)的指令可以通過(guò)存儲(chǔ)在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1001的電子存儲(chǔ)位置如存儲(chǔ)器1010或電子存儲(chǔ)單元1015上的機(jī)器(例如，計(jì)算機(jī)處理器)可執(zhí)行代碼來(lái)實(shí)現(xiàn)。機(jī)器可執(zhí)行或機(jī)器可讀代碼可以以軟件的形式提供。在使用過(guò)程中，該代碼可由處理器1005執(zhí)行。在一些實(shí)施方案中，可以從存儲(chǔ)單元1015檢索該代碼并將其存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器1010中，以備處理器1005存取。在一些情況下，可以不包括電子存儲(chǔ)單元1015，而將機(jī)器可執(zhí)行指令存儲(chǔ)在存儲(chǔ)器1010上。該代碼可以被預(yù)編譯和配置為與具有適于執(zhí)行該代碼的處理器的機(jī)器一起使用，或者可以在運(yùn)行過(guò)程中編譯。該代碼可以以編程語(yǔ)言提供，可以選擇該編程語(yǔ)言以使該代碼能夠以預(yù)編譯或編譯的方式執(zhí)行。

本文提供的系統(tǒng)和方法的方面，如計(jì)算機(jī)系統(tǒng)1001，可以體現(xiàn)在編程中。所述技術(shù)的各個(gè)方面可以被認(rèn)為是通常以機(jī)器(或處理器)可執(zhí)行代碼和/或相關(guān)數(shù)據(jù)的形式的“產(chǎn)品”或“制品”，所述可執(zhí)行代碼和/或相關(guān)數(shù)據(jù)在一種類型的機(jī)器可讀介質(zhì)中攜帶或體現(xiàn)。機(jī)器可執(zhí)行代碼可以存儲(chǔ)在電子存儲(chǔ)單元如存儲(chǔ)器(例如，只讀存儲(chǔ)器、隨機(jī)存取存儲(chǔ)器、閃速存儲(chǔ)器)或硬盤上?！按鎯?chǔ)”型介質(zhì)可以包括計(jì)算機(jī)、處理器等的任何或所有有形存儲(chǔ)器或其相關(guān)的模塊，如各種半導(dǎo)體存儲(chǔ)器、磁帶驅(qū)動(dòng)器、磁盤驅(qū)動(dòng)器等，其可以在軟件編程的任何時(shí)間提供非暫時(shí)性存儲(chǔ)。有時(shí)可以通過(guò)因特網(wǎng)或各種其他電信網(wǎng)絡(luò)來(lái)傳送軟件的全部或部分。例如，這樣的通信可以使軟件能夠從一個(gè)計(jì)算機(jī)或處理器加載到另一個(gè)，例如從管理服務(wù)器或主機(jī)計(jì)算機(jī)加載到應(yīng)用服務(wù)器的計(jì)算機(jī)平臺(tái)。因此，可承載軟件元素的另一種類型的介質(zhì)包括光波、電波和電磁波，如跨過(guò)在本地設(shè)備之間的物理接口、通過(guò)有線和光學(xué)陸路網(wǎng)絡(luò)以及沿著各種空中鏈路使用的。攜帶這類波的物理元件如有線或無(wú)線鏈路、光學(xué)鏈路等也可以被認(rèn)為是承載該軟件的介質(zhì)。如本文所用，除非限于非暫時(shí)性、有形“存儲(chǔ)”介質(zhì)，否則術(shù)語(yǔ)如計(jì)算機(jī)或機(jī)器“可讀介質(zhì)”是指參與向處理器提供指令以供執(zhí)行的任何介質(zhì)。

因此，機(jī)器可讀介質(zhì)如計(jì)算機(jī)可執(zhí)行代碼可以采用許多形式，包括但不限于有形存儲(chǔ)介質(zhì)、載波介質(zhì)或物理傳輸介質(zhì)。非易失性存儲(chǔ)介質(zhì)包括例如光盤或磁盤，如任何計(jì)算機(jī)中的任何存儲(chǔ)設(shè)備等，如可用于實(shí)現(xiàn)附圖中所示的數(shù)據(jù)庫(kù)等。易失性存儲(chǔ)介質(zhì)包括動(dòng)態(tài)存儲(chǔ)器，如這樣的計(jì)算機(jī)平臺(tái)的主存儲(chǔ)器。有形傳輸介質(zhì)包括同軸電纜；銅線和光纖，包括在計(jì)算機(jī)系統(tǒng)內(nèi)構(gòu)成總線的導(dǎo)線。載波傳輸介質(zhì)可以采用電信號(hào)或電磁信號(hào)或者聲波或光波的形式，如在射頻(rf)和紅外(ir)數(shù)據(jù)通信期間生成的那些。因此，計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)的常見(jiàn)形式包括例如：軟盤、柔性盤、硬盤、磁帶、任何其他磁性介質(zhì)、cd-rom、dvd或dvd-rom、任何其他光學(xué)介質(zhì)、穿孔卡片紙帶、具有孔洞圖案的任何其他物理存儲(chǔ)介質(zhì)、ram、rom、prom和eprom、flash-eprom、任何其他存儲(chǔ)器芯片或筒匣、載波傳輸數(shù)據(jù)或指令、傳輸這類載波的電纜或鏈路，或計(jì)算機(jī)可從中讀取編程代碼和/或數(shù)據(jù)的任何其他介質(zhì)。這些形式的計(jì)算機(jī)可讀介質(zhì)中的許多種可以參與將一個(gè)或多個(gè)順序的一個(gè)或多個(gè)指令攜帶到處理器以供執(zhí)行。

本公開內(nèi)容的附加方面提供了試劑盒，其可包含顆粒組、引物、其他試劑(例如，擴(kuò)增核酸分子所需的一種或多種試劑)，以及適合于擴(kuò)增核酸分子、進(jìn)行引物延伸反應(yīng)、測(cè)定靶核酸分子和/或生成(并且在一些情況下檢測(cè))核酸復(fù)合體的說(shuō)明書。一方面，本公開內(nèi)容提供了用于測(cè)定在具有或懷疑具有靶核酸鏈的樣品中靶核酸鏈的存在或不存在的試劑盒。該試劑盒可包含第一顆粒、第二顆粒以及關(guān)于使用該第一和第二顆粒經(jīng)由引物延伸反應(yīng)鑒定樣品中靶核酸鏈的存在或不存在的說(shuō)明書。第一顆?？砂谝灰?，該第一引物具有與靶核酸鏈的一部分顯示出序列同源性的第一核酸序列。第二顆?？砂诙?，該第二引物具有與靶核酸鏈的互補(bǔ)核酸鏈的一部分顯示出序列同源性的第二核酸序列。此外，該第一核酸序列可不同于該第二核酸序列。

在一些實(shí)施方案中，第一顆粒和/或第二顆粒可被包含在容器中。第一和/或第二顆?？杀话谌魏魏线m類型的容器中，其包括本文別處所述的容器的示例類型。此外，第一顆粒和/或第二顆?？梢允侨魏魏线m類型的顆粒(包括本文別處所述的顆粒的示例類型)，可包含任何合適類型的材料(包括本文別處所述的顆粒材料的示例類型)，和/或可以具有任何合適的顆粒大小(包括本文別處所述的示例顆粒大小)。在一些實(shí)施方案中，第一顆粒和第二顆粒包含相同的材料。在一些實(shí)施方案中，第一顆粒和第二顆?？砂煌牟牧稀?/p>

在一些實(shí)施方案中，所述試劑盒可進(jìn)一步包含適合于生成油包水乳液或水包油乳液的一種或多種試劑。這類試劑的非限制性實(shí)例包括水性介質(zhì)(例如，水、緩沖液等)、油(例如，礦物油)和表面活性劑(例如，abilem90(來(lái)自evonikindustries))、abilwe90(來(lái)自evonikindustries)、triton-x100、吐溫80、司盤(span)80)。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒可進(jìn)一步包含可允許鑒定靶核酸鏈和/或擴(kuò)增的靶核酸鏈的可檢測(cè)物質(zhì)(例如，光學(xué)響應(yīng)性物質(zhì))。在一些實(shí)施方案中，該試劑盒可進(jìn)一步包含被包括在反應(yīng)混合物中的一種或多種試劑，如進(jìn)行引物延伸反應(yīng)所需的試劑(例如，聚合酶、核苷酸(例如，dntp)、其他的酶、緩沖液、輔因子等)。

實(shí)施例

實(shí)施例1：聚合物顆粒的制備

本文提供了生成聚合物顆粒的實(shí)例方法，所述聚合物顆粒如本文別處所述可用來(lái)擴(kuò)增核酸分子和/或生成核酸復(fù)合體。

制備含8％丙烯酰胺和5％雙丙烯酰胺的水溶液并用氮?dú)?n2)脫氣10分鐘。單獨(dú)地，制備在礦物油中含有10％表面活性劑abilwe90(來(lái)自evonikindustries)的油溶液并在高真空下脫氣10分鐘。隨后將200μl的該水溶液與10μl的6％過(guò)硫酸銨(nh4)2s2o8和20μl的丙烯酰胺修飾的寡核苷酸(例如，dna寡核苷酸)或acrydite修飾的寡核苷酸混合，以生成經(jīng)修飾的水溶液。單獨(dú)地，將400μl的該油溶液與4μl的四甲基乙二胺(temed)混合，以生成經(jīng)修飾的油溶液。

隨后將經(jīng)修飾的水溶液和經(jīng)修飾的油溶液混合在一起，并立即在約2500rpm下渦旋2分鐘以乳化該混合物。隨后使乳化的混合物在環(huán)境溫度下靜置約三小時(shí)，使得在該溶液中生成顆粒。

接著，將10ml的乙醇添加至該乳液中，并將顆粒渦旋且隨后在5000rpm下離心6分鐘(min)。離心后，經(jīng)由例如移液從該混合物中移除上清液。隨后重復(fù)另外兩輪以下步驟：用10ml乙醇洗滌所述顆粒，然后渦旋并在5000rpm下離心6min。隨后用兩輪10ml水來(lái)洗滌顆粒，然后渦旋并在5000rpm下離心6min。隨后將洗滌的珠粒懸浮于20ml水中，并使較大的顆粒通過(guò)重力沉降到該混合物的底部。較小的顆粒保持在該混合物的頂部。隨后可移取該溶液的頂部的較小顆粒，用水稀釋，并通過(guò)選擇具有所需顆粒大小的顆粒的過(guò)濾器或膜予以過(guò)濾。所選擇的顆粒隨后可通過(guò)sybr綠染色進(jìn)行定量。

雖然本文已顯示并描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見(jiàn)的是，此類實(shí)施方案僅通過(guò)舉例的方式來(lái)提供。在不脫離本發(fā)明的情況下，本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)想到許多變化、改變和替換。應(yīng)當(dāng)理解，本文描述的本發(fā)明的實(shí)施方案的各種替代方案可用于實(shí)施本發(fā)明。旨在由以下權(quán)利要求來(lái)限定本發(fā)明的范圍，以及旨在由此涵蓋這些權(quán)利要求范圍內(nèi)的方法和結(jié)構(gòu)及其等同物。