本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種水稻孕穗期耐冷性相關(guān)蛋白ctb4a及編碼基因與應(yīng)用。

背景技術(shù)：

非生物逆境是影響植物正常生長發(fā)育，限制著作物產(chǎn)量提高的主要脅迫因子之一。水稻是喜溫植物，低溫影響水稻高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)、品質(zhì)以及水稻復(fù)種面積的擴(kuò)大。水稻低溫冷害，通常指水稻遭遇連續(xù)或短期低溫最低臨界溫度以下的低溫影響，使作物生育延遲，甚至發(fā)生生理障礙，嚴(yán)重時(shí)還造成營養(yǎng)或生殖器官遭到破壞，從而導(dǎo)致水稻不能正常發(fā)育而造成減產(chǎn)。

按照冷害發(fā)生的時(shí)期，水稻冷害一般分為芽期冷害、苗期冷害、孕穗期冷害。水稻的花穗是低溫的敏感部位，其中花藥是直接感受低溫影響結(jié)實(shí)的器官，孕穗期遭遇低溫，會(huì)引起花粉敗育，結(jié)實(shí)率降低，并會(huì)導(dǎo)致出穗延遲，器官發(fā)育發(fā)生異常，穗長變短，枝梗及穎花退化，最終影響水稻的產(chǎn)量。

因此，孕穗期冷害是影響水稻產(chǎn)量最嚴(yán)重的時(shí)期，對水稻孕穗期耐冷性研究具有十分重要的意義。但是利用傳統(tǒng)育種方法培育耐冷水稻品種周期長，進(jìn)展比較緩慢，而利用基因工程技術(shù)可以直接在基因水平上改造植物的遺傳背景，定向改造植物的遺傳性狀。發(fā)掘水稻孕穗期耐冷基因?qū)ε嘤屠渌拘缕贩N具有十分重要的理論和實(shí)踐意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種水稻孕穗期耐冷性相關(guān)蛋白ctb4a及編碼基因。

本發(fā)明提供的蛋白，命名ctb4a，是如下1)或2)：

1)序列表中序列2所示的蛋白質(zhì)；

2)將序列表中序列2所示的氨基酸序列經(jīng)過一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能由序列2衍生的蛋白質(zhì)。

上述一個(gè)或幾個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加為不超過10個(gè)氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加。

編碼上述蛋白質(zhì)的dna分子也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述dna分子是如下1)-4)中任一種的dna分子：

1)編碼區(qū)為序列表中序列3所示的dna分子；

2)編碼區(qū)為序列表中序列1所示的dna分子；

3)在嚴(yán)格條件下與1)或2)限定的dna序列雜交且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的 dna分子；

4)與1)或2)限定的dna序列至少具有70％、至少具有75％、至少具有80％、至少具有85％、至少具有90％、至少具有95％、至少具有96％、至少具有97％、至少具有98％或至少具有99％同源性且編碼具有相同功能蛋白質(zhì)的dna分子。

序列1是cdna,序列3是基因組。

上述嚴(yán)格條件可為在6×ssc，0.5％sds的溶液中，在65℃下雜交，然后用2×ssc，0.1％sds和1×ssc，0.1％sds各洗膜一次。

含有上述dna分子的重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述重組載體為序列表序列3所示ctb4a基因的基因組dna取代表達(dá)載體pmdc32上asci和paci酶切位點(diǎn)間的片段，得到重組載體35s::ctb4a(即為ctb4a過表達(dá)重組載體)。

擴(kuò)增上述dna分子全長或其任意片段的引物對也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述蛋白、上述dna分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在調(diào)控植物抗逆性中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍；

或上述蛋白、上述dna分子或上述重組載體、表達(dá)盒、轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系或重組菌在培育抗逆性提高轉(zhuǎn)基因植物中的應(yīng)用也是本發(fā)明保護(hù)的范圍。

上述應(yīng)用中，所述抗逆性為抗低溫；所述低溫具體為15-18℃；

所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；

所述單子葉植物具體為水稻。

本發(fā)明另一個(gè)目的是提供一種培育抗逆性提高轉(zhuǎn)基因植物的方法。

本發(fā)明提供的方法，包括如下步驟：為將編碼上述蛋白的dna分子導(dǎo)入目的植物，獲得轉(zhuǎn)基因植物，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性高于所述目的植物。

上述方法中，所述抗逆性為抗低溫。

上述方法中，所述轉(zhuǎn)基因植物的抗逆性高于所述目的植物體現(xiàn)在孕穗期低溫脅迫下所述轉(zhuǎn)基因植物的結(jié)實(shí)率高于所述目的植物；

所述低溫具體為15-18℃；

所述植物為單子葉植物或雙子葉植物；

所述單子葉植物具體為水稻。

本發(fā)明的實(shí)驗(yàn)證明，本發(fā)明克隆了一個(gè)新的正向調(diào)控水稻孕穗期耐冷基因ctb4a，將其轉(zhuǎn)入野生型水稻中，表現(xiàn)出孕穗期耐冷，為水稻的耐冷品種選育提供基因資源。

附圖說明

圖1為親本kmxbg、towada及近等基因系nil1913在北京(正常溫度)和云南(生 育期低溫)的表型圖。

圖2為親本kmxbg、towada及近等基因系nil1913在北京(正常溫度)和云南(生育期低溫)的結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)圖。

圖3為ctb4a在親本kmxbg和towada不同組織中的表達(dá)模式分析圖，內(nèi)參為osactin1基因。stem為莖，leaf為葉片，sheath為葉鞘，root為根，yp1為1cm穗，yp3為3cm穗，yp5為5cm穗，yp10為10cm穗，yp15為15cm穗，yp20為20cm穗。

圖4為ctb4a在親本kmxbg和towada穗部冷誘導(dǎo)下表達(dá)模式分析圖，內(nèi)參為osactin1基因。

圖5為ctb4a過表達(dá)載體構(gòu)建示意圖。

圖6為pcr鑒定t0代ctb4a過表達(dá)植株。

圖7為ctb4a過表達(dá)植株不同轉(zhuǎn)基因株系實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測結(jié)果。

圖8為不同的冷處理方式表示圖。

圖9為ctb4a過表達(dá)植株孕穗期冷處理后穗部表型圖。

圖10為ctb4a過表達(dá)植株及對照植株孕穗期冷水灌溉處理后結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)圖。

圖11為ctb4a過表達(dá)植株及對照植株孕穗期人工氣候室冷處理后結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)圖。

圖12為ctb4a過表達(dá)植株及對照植株高海拔地區(qū)種植結(jié)實(shí)率統(tǒng)計(jì)圖。

具體實(shí)施方式

下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

水稻品種kmxbg：文獻(xiàn)：戴陸園等.云南稻種昆明小白谷耐冷性指標(biāo)性狀的遺傳分析.中國水稻科學(xué),1999,13(2):73-76.公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

水稻品種towada：文獻(xiàn)：戴陸園等.云南稻種昆明小白谷耐冷性指標(biāo)性狀的遺傳分析.中國水稻科學(xué),1999,13(2):73-76.公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

水稻近等基因系nil1913：本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建和保存，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

過表達(dá)載體pmdc32：文獻(xiàn):markd.curtisandueligrossniklaus.agatewaycloningvectorsetforhigh-throughput.plantphysiology,october2003,vol.133,pp.462–469.公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

根癌農(nóng)桿菌eha105：文獻(xiàn)：高世武等.影響根癌農(nóng)桿菌eha105感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化效率因素的研究.熱帶生物學(xué)報(bào).2012年3月第3卷第1期，公眾可從中國農(nóng)業(yè)大學(xué)獲得。

實(shí)施例1、ctb4a基因的定位及克隆

1、ctb4a基因的獲得

利用耐冷品種kmxbg和冷敏感品種towada構(gòu)建的分離群體，考察各個(gè)單株在昆明和阿子營的結(jié)實(shí)率，作為qtl定位的表型數(shù)據(jù)(圖1，圖2)。同時(shí)，運(yùn)用bsa法從均 勻分布在水稻12條染色體上的1513對ssr標(biāo)記中篩選出的多態(tài)性標(biāo)記，標(biāo)記帶型與kmxbg一致，記為a，與towada一致，記為b，雜合記為h。利用mapmaker3.0進(jìn)行標(biāo)記連鎖作圖，group命令分組，kosambi方法計(jì)算遺傳距離。qtl掃描采用qtlicimapping3.0(王建康等，2009)，以lod值3.0作為qtl存在的閾值，同時(shí)計(jì)算加性和顯性效應(yīng)。qtl的命名原則采用mccouch等命名方法。最終在兩個(gè)環(huán)境中均能檢測到微效qtlqctb4-1，該qtl位于rm518-rm6770之間，兩個(gè)環(huán)境中的lod值分別為14.81和4.15，解釋表型的貢獻(xiàn)率分別為0.9％和3.93％。然后利用qctb4-1兩側(cè)標(biāo)記rm2146和rm6770對3102個(gè)單株bc6f2群體篩選，獲得6個(gè)純合重組單株，并且利用f3家系進(jìn)行表型確定。最終將目的基因定位在標(biāo)記rm16349和sts12之間，物理距離為134.8kb。該區(qū)間內(nèi)共有4個(gè)候選基因，其中基因os04g0132500編碼一個(gè)亮氨酸重復(fù)的跨膜蛋白激酶。該基因啟動(dòng)子及編碼區(qū)序列在親本kmxbg和towada中均存在多處差異，是最有可能的候選基因，命名為ctb4a。

ctb4a基因的核苷酸序列為序列表中序列1，開放閱讀框?yàn)樾蛄?第1-3447位核苷酸，其編碼的蛋白為ctb4a，該蛋白的氨基酸序列為序列表中序列2。

2、內(nèi)源ctb4a基因的表達(dá)模式

正常處理：取kmxbg和towada正常種植條件下不同組織的樣品，包括根、莖、葉片、葉鞘、1cm穗、3cm穗、5cm穗、10cm穗、15cm穗和20cm穗。取樣后用液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

低溫脅迫處理：將正常條件下生長至孕穗期的kmxbg和towada移栽至18度的人工氣候室內(nèi)，分別取處理1h、2h、4h、8h、12h、16h、24h、1d、2d、3d、4d、5d、6d、7d時(shí)葉片和穗部樣品，液氮速凍，-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

提取上述各種處理的樣品取總rna，利用反轉(zhuǎn)錄酶m-mlv反轉(zhuǎn)錄合成cdna第一鏈，以該cdna第一鏈為模板，采用引物進(jìn)行實(shí)時(shí)定量分析，以osactin1為內(nèi)參基因；

ctb4a擴(kuò)增引物：

ctb4a-rt1f:5-cgccggatcatatggctacatc-3

ctb4a-rt1r:5-cacgtcgctcttctccgtta-3

osactin1擴(kuò)增引物：

actin1-f:5-acaggtattgtgttggactctgg-3

actin1-r:5-agtaaccacgctccgtcagg-3

實(shí)時(shí)熒光定量pcr在實(shí)時(shí)熒光定量pcr儀appliedbiosystems7500realtimepcrsystem(abi,usa)上進(jìn)行，一次平行試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)。利用livakkj和schmittgentd(2001)報(bào)道的方法，即2-δδct計(jì)算相對表達(dá)量。

δδct＝(ct.target－ct.actin)timex－(ct.target－ct.actin)time0

timex表示任意時(shí)間點(diǎn)，time0表示經(jīng)actin1校正后1倍量的目標(biāo)基因表達(dá)。

ctb4a組織表達(dá)模式如圖3，可以看出，ctb4a基因是一個(gè)在不同組織中均表達(dá)的基因，尤其在莖、葉鞘和穗中表達(dá)豐度最高。

ctb4a冷誘導(dǎo)表達(dá)分析如圖4，可以看出，在耐冷親本kmxbg中被低溫誘導(dǎo)的強(qiáng)度要顯著高于冷敏感親本towada，說明ctb4a基因是一個(gè)與低溫脅迫相關(guān)的基因。

實(shí)施例2、ctb4a基因的功能驗(yàn)證

一、ctb4a過表達(dá)重組載體的構(gòu)建

提取水稻kmxbg的基因組dna為模板，用cb1f和cb1r進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到4676bp的pcr產(chǎn)物，經(jīng)過測序，該pcr產(chǎn)物為ctb4a基因的基因組dna，為序列表序列3所示。

cb1f:gcaactagtctcccattgtcagtgcca(限制性內(nèi)切酶asci)

cb1r:ccttaattaattcacaacaaactcgcatca(限制性內(nèi)切酶paci)。

將上述序列表序列3所示ctb4a基因的基因組dna取代表達(dá)載體pmdc32上asci和paci酶切位點(diǎn)間的片段，得到重組載體35s::ctb4a(即為ctb4a過表達(dá)重組載體，結(jié)構(gòu)示意圖如圖5)，其中ctb4a基因插入雙煙草花葉病毒啟動(dòng)子35s下游。

二、轉(zhuǎn)ctb4a水稻的獲得

1、重組菌

將上述一制備的重組載體35s::ctb4a凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌eha105，得到重組菌eha105/35s::ctb4a，用于侵染轉(zhuǎn)基因受體品種的愈傷。

2、轉(zhuǎn)ctb4a水稻

采取經(jīng)典的農(nóng)桿菌介導(dǎo)的愈傷侵染方法，具體步驟如下：

(1)胚性愈傷的獲得：將成熟的towada種子(以下也稱為野生型水稻)去殼后用75％酒精消毒2min，再用20％naclo消毒40min，無菌水漂洗3-5次，風(fēng)干。接種于誘導(dǎo)培養(yǎng)基，28℃暗培養(yǎng)2周，將胚性愈傷剝下，繼代至新的誘導(dǎo)培養(yǎng)基，繼代培養(yǎng)2周(繼代兩次)。

(2)制備侵染液：吸取保存的農(nóng)桿菌液20μl，涂布到y(tǒng)ep(含20mg/l利福平和相應(yīng)抗生素)固體培養(yǎng)基上，28℃倒置暗培養(yǎng)2d，刮取少量農(nóng)桿菌至aam液體培養(yǎng)基中(含10mm乙酰丁香酮)，菌液濃度od600約為0.3。

(3)共培養(yǎng)：挑選自然分散、顏色鮮黃、直徑約為3～5mm的顆粒狀愈傷組織至三角瓶中，加入制備好的侵染液，侵染10min，用無菌濾紙吸取多余的侵染液，置于鋪有一層濾紙的共培養(yǎng)培養(yǎng)基上，19℃共培養(yǎng)2-3d。

(4)抗性愈傷組織的篩選：將共培養(yǎng)后的愈傷組織取出，用無菌水快速搖動(dòng)清洗5～6次，再用含250mg/l頭孢霉素和250mg/l羧芐青霉素的無菌水清洗20min，最 后置于無菌濾紙上瀝干3h。然后移到篩選培養(yǎng)基上。兩周一次，篩選兩次。

(5)分化：將篩選獲得的抗性愈傷組織接入預(yù)分化培養(yǎng)基中，26℃，暗培養(yǎng)2周，然后轉(zhuǎn)移至分化培養(yǎng)基上，光照培養(yǎng)2-3周，得到再生轉(zhuǎn)基因幼苗植株。

(6)將幼苗移至生根培養(yǎng)基上，待幼苗生根長成后，移出培養(yǎng)瓶，洗凈根上的培養(yǎng)基，煉苗7d，移至大田栽種，直至成熟，得到t0代轉(zhuǎn)ctb4a水稻。

上述轉(zhuǎn)基因過程中所用培養(yǎng)基配方如下：

(1)胚性愈傷誘導(dǎo)及繼代培養(yǎng)基：nb基本培養(yǎng)基(含2mg/l2,4-d)。

(2)共培養(yǎng)培養(yǎng)基：nb基本培養(yǎng)基(含2mg/l2,4-d，10g/l葡萄糖，10mm乙酰丁香酮,ph5.6)。

(3)篩選培養(yǎng)基：nb基本培養(yǎng)基(含2mg/l2,4-d，400mg/l特美汀和50mg/l潮霉素，ph5.8)。

(4)預(yù)分化培養(yǎng)基：nb基本培養(yǎng)基(含1mg/l6-ba，2mg/lnaa，5mg/laba，50mg/l潮霉素，ph5.8)。

(5)分化培養(yǎng)基：nb基本培養(yǎng)基(含2mg/l6-ba，1mg/lnaa，1mg/lkt，50mg/l潮霉素，ph5.8)。

(6)生根培養(yǎng)基：1/2ms培養(yǎng)基基本成分(含0.5mg/lnaa,0.25mg/l多效唑，ph5.8)。

(7)nb培養(yǎng)基基本成分包括n6大量元素，b5微量元素，b5有機(jī)成分，150mg/l肌醇，300mg/l水解酪蛋白，500mg/l谷氨酰胺，600mg/l脯氨酸，30g/l蔗糖，3g/l植物凝膠。

采用同樣的方法將空載體pmdc32轉(zhuǎn)入野生型水稻中，得到t3代轉(zhuǎn)pmdc32水稻。

3、分子鑒定

提取t0代轉(zhuǎn)ctb4a水稻基因組dna，用引物為5′-aaaagttcgacagcgtctccgacc-3′和5′-tctacacagccatcggtccagacg-3′進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到919bp的pcr產(chǎn)物(靶基因?yàn)閔yg)為陽性t0代轉(zhuǎn)ctb4a水稻，不含有目的片段的植株為陰性，部分陽性樣本的鑒定結(jié)果如圖6所示(t-1、t-3、t-5、t-6、t-9、t-12)。

陽性t0代收種、播種，得到t3代。

提取t3代轉(zhuǎn)ctb4a水稻株系t-1、t-5、t-9、t-12的rna，反轉(zhuǎn)錄得到cdna，以ctb4a擴(kuò)增引物進(jìn)行擴(kuò)增，以osactin1為內(nèi)參基因。

ctb4a擴(kuò)增引物：

ctb4a-rt2f:tccgcaacctcaccaagc

ctb4a-rt2r:cgagccggtttcctcctag

osactin1擴(kuò)增引物：

actin1-f:5-acaggtattgtgttggactctgg-3

actin1-r:5-agtaaccacgctccgtcagg-3

結(jié)果如圖7所示，可以看出，與野生型水稻(towada)相比，t-1、t-5、t-9、t-12株系中ctb4a基因表達(dá)量均提高5倍以上。

采用同樣的方法鑒定t3代轉(zhuǎn)pmdc32水稻，結(jié)果與野生型水稻無顯著差異。

后續(xù)選用表達(dá)較高的t3代轉(zhuǎn)ctb4a水稻株系t-1和t-12進(jìn)行進(jìn)行耐冷鑒定實(shí)驗(yàn)。

三、轉(zhuǎn)ctb4a水稻的耐冷性鑒定

耐冷性鑒定采用三種方法，分別是孕穗期大田50cm深冷水池(18℃)7天，孕穗期人工氣候室18℃處理7天和云南自然鑒定等方法多方驗(yàn)證ctb4a的孕穗期耐冷功能(圖8)。

選取nil1913、野生型水稻(冷敏感品種towada)、t3代轉(zhuǎn)ctb4a水稻株系t-1、t3代轉(zhuǎn)ctb4a水稻株系t-12、t3代轉(zhuǎn)pmdc32水稻正處于孕穗期的主穗掛牌，做上記號。脅迫結(jié)束后，將參試材料復(fù)種到大田，恢復(fù)水稻生長，成熟后考察掛牌主穗的結(jié)實(shí)率，以正常生長的植株結(jié)實(shí)率為對照，計(jì)算相對結(jié)實(shí)率(相對結(jié)實(shí)率＝處理后的結(jié)實(shí)率/正常條件下結(jié)實(shí)率*100％)，作為耐冷性鑒定指標(biāo)。云南自然鑒定則在云南黑龍?zhí)兜貐^(qū)，海拔1916米，常年氣溫19-22℃，從播種至孕穗期均處在自然低溫狀態(tài)下生長，成熟后考察主穗結(jié)實(shí)率。上述每個(gè)材料設(shè)置3個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10株。

孕穗期大田50cm深冷水池(18℃)7天結(jié)果如圖9和10所示，可以看出，在大田冷水灌溉7天的脅迫下，在孕穗期處理的參試材料的農(nóng)藝性狀發(fā)生顯著變化，t3代轉(zhuǎn)ctb4a水稻株系t-1、t3代轉(zhuǎn)ctb4a水稻株系t-12的生長顯著好于野生型水稻；統(tǒng)計(jì)結(jié)實(shí)率如圖10所示，towada的相對結(jié)實(shí)率為50.40％，而nil1913的相對結(jié)實(shí)率為77.72％，t-1和t-12的相對結(jié)實(shí)率為77.08％和87.27％,均顯著高于towada。

孕穗期人工氣候室18℃處理7天結(jié)果如圖11所示，towada的相對結(jié)實(shí)率為55.40％，nil1913的相對結(jié)實(shí)率為85.47％，t-1和t-12的相對結(jié)實(shí)率為73.80％和85.42％，也是顯著高于towada。

在云南全生育期的自然低溫處理下結(jié)果如圖12所示，ni1913l與過表達(dá)株系的結(jié)實(shí)率均顯著超過towada。

t3代轉(zhuǎn)pmdc32水稻結(jié)果與野生型水稻無顯著差異。

上述結(jié)果表明，孕穗期遭遇低溫主要影響了結(jié)實(shí)率的高低，不同地點(diǎn)、不同方式處理方式下，nil1913和過表達(dá)株系的主穗結(jié)實(shí)率都顯著高于冷敏感親本towada，說明基因cbt4a具有孕穗期耐低溫的功能，是一個(gè)起正向長效作用的基因，能夠在低溫脅迫下降低低溫對結(jié)實(shí)率的影響。