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      一種牛支原體MbovP579蛋白及其應(yīng)用的制作方法

      文檔序號(hào):11399089閱讀:390來(lái)源:國(guó)知局
      一種牛支原體MbovP579蛋白及其應(yīng)用的制造方法與工藝

      本發(fā)明屬于動(dòng)物傳染病防治技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及到一種牛支原體mbovp579蛋白及其應(yīng)用。所述的蛋白可以作為抗原蛋白應(yīng)用于制備牛支原體感染診斷試劑盒中。



      背景技術(shù):

      牛支原體(mycoplasmabovis,m.bovis)是一種主要引起任何月齡肉牛和奶牛呼吸系統(tǒng)疾病和關(guān)節(jié)炎的重要病原,主要臨床癥狀為肺炎,還可導(dǎo)致乳腺炎、關(guān)節(jié)炎、生殖道炎癥、結(jié)膜炎、中耳炎等多種癥狀,發(fā)病率為40%,死亡率為10%。牛支原體于1961年首次在美國(guó)從患乳房炎奶牛的牛奶中分離得到,1976年證實(shí)其是導(dǎo)致肺炎的重要病原體。2008年,湖北省從外地引進(jìn)肉牛中流行呼吸道疾病,牛群引進(jìn)后2周左右發(fā)病,表現(xiàn)為發(fā)熱,咳嗽,流鼻涕,犢牛和體質(zhì)弱的牛發(fā)病嚴(yán)重,華中農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室病毒分室于2008年率先確定該病為“傳染性牛支原體肺炎”。由于我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)向規(guī)?;图s化發(fā)展,牛養(yǎng)殖量大大增加,專門化程度大幅度提高,肉?!爱惖赜省币呀?jīng)成為重要的肉牛養(yǎng)殖模式。不同研究機(jī)構(gòu)均證實(shí)該病在全國(guó)范圍內(nèi)流行,這與近些年的肉牛養(yǎng)殖模式不無(wú)關(guān)系。

      牛支原體是影響?zhàn)B牛業(yè)健康發(fā)展的重要疾病,大部分感染牛支原體的牛呈亞臨床癥狀或隱形感染,在應(yīng)激條件下可以引起臨床癥狀。目前長(zhǎng)距離運(yùn)輸是“異地育肥”的重要環(huán)節(jié),作為一種重要的應(yīng)激因素,這無(wú)疑將會(huì)給肉牛的健康養(yǎng)殖帶來(lái)更大的困難。目前國(guó)內(nèi)沒(méi)有牛支原體的診斷試劑盒,實(shí)驗(yàn)室一般采取包被牛支原體的全菌蛋白檢測(cè)臨床血清樣本,這種檢測(cè)方法的特異性和靈敏性都不高。目前的診斷方法已經(jīng)不能滿足牛支原體防控的需求,因此迫切需要找到牛支原體診斷的特異性靶標(biāo),開發(fā)出特異性和敏感性高的檢測(cè)試劑盒。本申請(qǐng)人所在的農(nóng)業(yè)微生物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室病毒分室通過(guò)雙向電泳和免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)牛支原體膜蛋白mbovp579蛋白具有很強(qiáng)的免疫原性,并成功地將mbovp579蛋白作為牛支原體血清抗體檢測(cè)的分子靶標(biāo)。



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      本發(fā)明的目的在于提供一個(gè)可以診斷牛支原體感染與否的分子標(biāo)識(shí)mbovp579蛋白。

      本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供一種檢測(cè)牛支原體mbovp579蛋白抗體的特異性檢測(cè)方法,用于區(qū)分牛支原體感染與否及評(píng)價(jià)疫苗抗體反應(yīng)。更進(jìn)一步,本發(fā)明的目的還包括重組mbovp579蛋白(即:rmbovp579)在制備牛支原體感染診斷或疫苗抗體反應(yīng)檢測(cè)試劑盒中的應(yīng)用。

      為了實(shí)現(xiàn)上述的目的,本發(fā)明采用以下技術(shù)措施和路線:

      申請(qǐng)人于2008年6月從湖北省應(yīng)城市某養(yǎng)牛場(chǎng)發(fā)病的黃牛的肺組織中分離得到一株牛支原體本地分離株hb0801,申請(qǐng)人將其命名為牛支原體hb0801,mycoplasmabovishb0801,于2010年2月1日送交中國(guó).武漢.武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號(hào)為cctccno:m2010040。

      根據(jù)大腸桿菌對(duì)密碼子的偏愛(ài)性,本發(fā)明以牛支原體hb0801(基因組在genbank上的登錄號(hào)為cp002058)中mbov_579基因?yàn)槟0蹇寺≡摶?,同時(shí)根據(jù)大腸桿菌的密碼子偏愛(ài)性,將mbov_579基因進(jìn)行克隆修飾,將牛支原體色氨酸密碼子uga突變成大腸桿菌中的色氨酸密碼子ugg進(jìn)而在大腸桿菌中表達(dá)。

      經(jīng)過(guò)人工突變后的牛支原體基因mbov_579的核苷酸序列是序列表seqidno:13的1-2387位堿基所示的序列,其長(zhǎng)度為2387bp;其中在該序列的:165位,690位,1455位和1674位發(fā)生等位基因突變。

      該牛支原體mbovp579蛋白的蛋白質(zhì)序列如序列表seqidno:14所示,共編碼728個(gè)氨基酸。

      將本發(fā)明的牛支原體mbov_579基因的核苷酸序列通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒載體pet-30-mbov_579轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α得到重組的大腸桿菌菌株,申請(qǐng)人將該重組的大腸桿菌菌株命名為大腸桿菌pet-30-mbov-579;escherichiacolipet-30-mbov-579,于2015年12月18日送交中國(guó).武漢.武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號(hào)為cctccno:m2015763。該菌株的iptg誘導(dǎo)下,表達(dá)mbov-579基因編碼的重組蛋白rmbovp579。

      經(jīng)過(guò)驗(yàn)證,本發(fā)明純化的rmbovp579蛋白可以作為診斷抗原在制備牛支原體感染診斷試劑盒中的應(yīng)用。

      本發(fā)明所述的牛支原體rmbovp579蛋白在區(qū)分牛支原體感染中的應(yīng)用,包括下列步驟:

      使用間接elisa方法診斷牛支原體野毒株感染,以rmbovp579蛋白作為抗原包被酶標(biāo)板于4℃過(guò)夜,經(jīng)pbst洗滌后加入5%脫脂乳,然后在37℃封閉1h,pbst洗滌后加入檢測(cè)樣本37℃孵育1h,血清樣本稀釋比例為體積比1:1600。pbst洗滌后加入辣根過(guò)氧化物酶 標(biāo)記羊抗牛二抗(1:5000,v/v)37℃孵育1h。經(jīng)pbst洗滌后加入底物(tmb/h2o2)顯色,測(cè)定od630nm值,大于規(guī)定閾值時(shí)判斷為抗體陽(yáng)性,發(fā)生了牛支原體感染。

      本發(fā)明具有以下優(yōu)點(diǎn):

      1、本發(fā)明的抗原蛋白mbovp579是發(fā)明人從牛支原體全菌蛋白中篩選出來(lái)的新型免疫原性蛋白,目前功能未知。

      2、本發(fā)明的抗原蛋白mbovp579檢測(cè)牛支原體的特異性是發(fā)明人首次確定的,利用該蛋白抗原建立的間接elisa能有效區(qū)分牛支原體和其它病原體感染。

      3、目前國(guó)內(nèi)市場(chǎng)上還沒(méi)有商品化的牛支原體鑒別診斷試劑盒,與市場(chǎng)上國(guó)外商品化試劑盒比較,本發(fā)明的抗原蛋白rmbovp579的檢測(cè)靈敏度與特異性顯著高于同類產(chǎn)品,說(shuō)明以本發(fā)明的蛋白制備的試劑盒更能適應(yīng)基層單位檢測(cè)的需求。

      更詳細(xì)的發(fā)明方案見(jiàn)《具體實(shí)施方式》所述。

      附圖說(shuō)明

      序列表seqidno:1是擴(kuò)增mbov_579基因片段的引物579a1的序列。

      序列表seqidno:2是擴(kuò)增mbov_579基因片段的引物579a2的序列。

      序列表seqidno:4是擴(kuò)增mbov_579基因片段的引物579b1的序列。

      序列表seqidno:5是擴(kuò)增mbov_579基因片段的引物579b2的序列。

      序列表seqidno:6是擴(kuò)增mbov_579基因片段的引物579c1的序列。

      序列表seqidno:7是擴(kuò)增mbov_579基因片段的引物579c2的序列。

      序列表seqidno:6是擴(kuò)增mbov_579基因片段的引物579d1的序列。

      序列表seqidno:9是擴(kuò)增mbov_579基因片段的引物579d2的序列。

      序列表seqidno:10是擴(kuò)增mbov_579基因片段的引物579e1的序列。

      序列表seqidno:11是擴(kuò)增mbov_579基因片段的引物579e2的序列。

      序列表seqidno:12是擴(kuò)增mbov_579基因片段的引物579m1的序列。

      序列表seqidno:13是擴(kuò)增mbov_579基因片段的引物579m2的序列。

      序列表seqidno:13是本發(fā)明人工突變牛支原體mbov_579基因的核苷酸序列,序列長(zhǎng)度為2187bp。其中在該序列的165位,690位,1455位和1674位發(fā)生等位基因突變。

      序列表seqidno:14是本發(fā)明的牛支原體mbovp579蛋白的蛋白質(zhì)序列,編碼728個(gè)氨基酸。

      圖1:是本發(fā)明實(shí)施例涉及空質(zhì)粒pet-30a的質(zhì)粒圖譜。pet-30a為商業(yè)化質(zhì)粒,購(gòu)自novagen 公司。

      圖2:是本發(fā)明制備的重組質(zhì)粒pet-30-mbov_579的圖譜。重組質(zhì)粒pet-30-mbov_579是由pet-30a質(zhì)粒和突變后的mbov_579基因全長(zhǎng)經(jīng)過(guò)限制性內(nèi)切酶消化后連接重組而成。

      圖3:是本發(fā)明純化的牛支原體rmbovp579蛋白膠圖。附圖標(biāo)記說(shuō)明:泳道m(xù):蛋白質(zhì)marker;1:純化的牛支原體rmbovp579重組蛋白。

      圖4:包被rmbovp579蛋白通過(guò)間接elisa診斷牛支原體感染的結(jié)果。牛支原體自然感染和疫苗株免疫檢測(cè)及閾值的確定,當(dāng)閾值為0.442時(shí),臨床樣本檢測(cè)的敏感性為90.2%,特異性為97.8%。

      具體實(shí)施方式

      實(shí)施例1:牛支原體mbov579蛋白的表達(dá)

      1.1牛支原體mbov_579基因克隆表達(dá)

      由于大腸桿菌對(duì)密碼子的偏愛(ài)性,在本發(fā)明中牛支原體中編碼色氨酸的密碼子uga在大腸桿菌被用作終止子,因此,用大腸桿菌表達(dá)牛支原體基因時(shí),需要對(duì)支原體基因進(jìn)行突變,使密碼子uga突變?yōu)槟茉诖竽c桿菌中表達(dá)色氨酸的密碼子ugg。

      申請(qǐng)人于2008年6月從湖北省應(yīng)城市某養(yǎng)牛場(chǎng)發(fā)病的黃牛的肺組織中分離得到牛支原體地方分離株,將其命名牛支原體hb0801,mycoplasmabovishb0801,于2010年2月1日送交中國(guó).武漢.武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號(hào)為cctccno:m2010040。本發(fā)明利用自行設(shè)計(jì)的pcr引物對(duì)該基因進(jìn)行了突變,具體步驟是:以牛支原體hb0801(基因組genbank登錄號(hào)為cp002058)中的mbov_579基因?yàn)槟0澹萌缦略O(shè)計(jì)的5對(duì)引物(編號(hào)分別為:579a1/579a2,579b1/579b2,579c1/579c2,579d1/579d2,579e1/579e2)分別擴(kuò)增出突變后的mbov_579基因的5個(gè)片段,然后,以突變后的5個(gè)片段為模板,利用579m1/579m2引物對(duì)擴(kuò)增得到突變后的mbov_579基因的全序列,序列長(zhǎng)度為2187bp(見(jiàn)序列表seqidno:13中1-2187位堿基所示的序列,其編碼區(qū)也是1-2187位堿基對(duì)應(yīng)的序列)。

      擴(kuò)增mbov_579基因的引物序列如下所示:

      (1)579a1/579a2擴(kuò)增片段在mbov_579基因中的位置為683802-683980堿基處,pcr擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為179bp。

      正向引物579a1:5’atgagtaagaaaaataaattaatgattgggctttcatctactgct3’,(即序列表seqidno:1所示的序列)。

      反向引物579a2:5’gaagccatagtattccattgtggctgacca3’,(即序列表seqidno:2所示的序列;下劃線部分為突變位點(diǎn),即由t突變?yōu)閏)

      (2)579b1/579b2擴(kuò)增片段在mbov_579基因中的位置為683952-684510堿基處,pcr擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為559bp。

      正向引物579b1:5’ggtcagccacaatggaatactatggctt3’(其中:下劃線部分為突變位點(diǎn),即由a突變?yōu)間;即序列表seqidno:3所示的序列)。

      反向引物579b2:5’gtgaactttcaaattcaccccataatttttgtacttcact3’(下劃線部分為突變位點(diǎn),即由t突變?yōu)閏;即序列表seqidno:4所示的序列)。

      (3)579c1/579c2擴(kuò)增片段在mbov_579基因中的位置為684472-685274堿基處,pcr擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為803bp。

      正向引物579c1:5’gtgaagtacaaaaattatggggtgaatttgaaagttcaca3’(下劃線部分為突變位點(diǎn),即由a突變?yōu)間;即序列表seqidno:5所示的序列)。

      反向引物579c2:5’ttctcttaagaataatagccattgtttattatcactagcttc3’(下劃線部分為突變位點(diǎn),即由t突變?yōu)閏;即序列表seqidno:6所示的序列)。

      (4)579d1/579d2擴(kuò)增片段在mbov_579基因中的位置為685235-685490堿基處,pcr擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為256bp。

      正向引物579d1:5’agctagtgataataaacaatggctattattcttaagagaagat3’(下劃線部分為突變位點(diǎn),即由a突變?yōu)間;即序列表seqidno:7所示的序列)。

      反向引物579d2:5’ttcattagatttattccatttaccaggcacagc3’(下劃線部分為突變位點(diǎn),即由t突變?yōu)閏;即序列表seqidno:8所示的序列)。

      (5)579e1/579e2擴(kuò)增片段在mbov_579基因中的位置為685458-685988堿基處,pcr擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為531bp:

      正向引物579e1:5’gctgtgcctggtaaatggaataaatctaatga3’,(下劃線部分為突變位點(diǎn),即由a突變?yōu)間;即序列表seqidno:9所示的序列)。

      反向引物579e2:5’ttatttaagaatttgactgcttgatgcaataattgatccaata3’,(即序列表seqidno:10所示的序列)。

      (6)579m1/579m2擴(kuò)增片段在mbov_579基因中的位置為683802-685988堿基處,pcr擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為2205bp

      正向引物579m1:5’ggtaccatgagtaagaaaaataaattaatgattgg3’,(下劃線部分為kpni酶切位點(diǎn),波浪線部分為保護(hù)性堿基;即序列表seqidno:11所示的序列)。

      反向引物579m2:5’gaattcttatttaagaatttgactgcttgatgc3’,(下劃線部分為ecori酶切位點(diǎn),波浪線部分為保護(hù)性堿基;即序列表seqidno:9所示的序列)。

      上述5個(gè)片段的pcr反應(yīng)體系如下:

      模板dna2.5μl,pfu酶(thermo)1.5μl,pfubufferwithmgso4(thermo)5μl,10倍dntpmix(thermo)1μl,引物各2μl,超純水36μl。

      回收以上五個(gè)片段的pcr擴(kuò)增產(chǎn)物,以此為模板,使用引物579m1/579m2擴(kuò)增突變后的mbov_579基因,其pcr反應(yīng)體系如下:每個(gè)片段2.5μl,pfu酶(thermo)1.5μl,pfubufferwithmgso4(thermo)5μl,10倍dntpmix(thermo)1μl,引物各2μl,超純水36μl。上述引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

      回收mbov_579基因的擴(kuò)增產(chǎn)物,用kpni和ecori酶切,同時(shí)將pet-30a質(zhì)粒(購(gòu)自默克中國(guó)有限公司)用kpni和ecori進(jìn)行雙酶切。將酶切后的mbov_579基因和pet-30a質(zhì)粒用dna連接酶(t4dnaligase)連接,得到重組質(zhì)粒pet-30-mbov_579。用該重組質(zhì)粒pet-30-mbov_579轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α后,置于37℃搖床在180r/min下培養(yǎng)12小時(shí),提取質(zhì)粒經(jīng)過(guò)測(cè)序正確后轉(zhuǎn)化大腸桿菌bl21,將該大腸桿菌在lb液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)至od=0.6時(shí)取1ml菌液作為誘導(dǎo)前對(duì)照,同時(shí)加入異丙基硫代半乳糖苷(iptg)至終濃度為0.8mm,37℃搖床誘導(dǎo)表達(dá)3小時(shí)。取1ml菌液進(jìn)行下一步處理:樣品處理方法為12000r/min離心1min后棄掉上清加入1ml磷酸鹽緩沖液即pbs(配方:kcl0.2g,nacl8g,na2hpo41.44g,kh2po40.24g,1000ml蒸餾水,ph=7.6)溶液重懸后再以12000r/min離心1min棄掉上清,然后加入30ul的pbs和30ul上樣緩沖液【1mtris-hcl(ph=6.8)1ml,200mmddt0.31g,4%sds0.4g,0.2%溴酚藍(lán)0.02g,20%甘油2ml,7ml超純水】重懸。100℃沸水中煮沸10min。用sds-page凝膠電泳鑒定是否表達(dá)。

      將本發(fā)明的蛋白的核苷酸序列通過(guò)構(gòu)建質(zhì)粒載體pet-30-mbov_579轉(zhuǎn)化到大腸桿菌dh5α中得到重組大腸桿菌,申請(qǐng)人將該重組的大腸桿菌命名為大腸桿菌pet-30-mbov-579;escherichiacolipet-30-mbov-579,于2015年12月18日送交中國(guó).武漢.武漢大學(xué)中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心保藏,保藏編號(hào)為cctccno:m2015763。

      1.2牛支原體rmbovp579重組蛋白的純化

      將重組的大腸桿菌bl21按上述方法誘導(dǎo)表達(dá)后,取菌液8000r/min離心10min后棄掉上清,用500ml的pbs洗一次后在8000r/min離心10min,再重復(fù)用500ml的pbs洗一次。 棄掉上清后加入30ml的pbs重懸,加入蛋白酶抑制劑(購(gòu)自羅氏公司),使用液壓破碎儀破碎。破碎后以12000r/min離心30min,取30μl上清加入30μl上樣緩沖液,在沸水中煮沸10min作為上清組。取少許沉淀加入30μl的pbs和30μl上樣緩沖液煮沸10min作沉淀組。經(jīng)過(guò)sds-page凝膠電泳后,確定rmbovp579蛋白大部分表達(dá)于上清中。

      rmbovp579蛋白具體純化步驟如下:

      (1)向親和層析柱中加入1mlni-nta金屬螯合his蛋白純化介質(zhì)填料(購(gòu)自ge公司);

      (2)向親和層析柱中加入12mlddh2o洗滌;

      (3)加入12ml的bindingbuffer(20mmna3po4,0.5mnacl,20mm咪唑,ph=7.4)平衡柱子;

      (4)加入經(jīng)過(guò)0.45μm孔徑濾器過(guò)濾的蛋白表達(dá)上清,收集前幾滴濾出的液體,編號(hào)為1;

      (5)加入50mlbindingbuffer緩沖液平衡柱子,收集前幾滴液體,編號(hào)為2;

      (6)加入50mlwashingbuffer緩沖液(20mmna3po4,0.5mnacl,60mm咪唑,ph=7.4)洗去雜蛋白,收集前幾滴,編號(hào)為3;

      (7)加入12mlelutebuffer緩沖液(20mmna3po4,0.5mnacl,1m咪唑,ph=7.4)洗脫目的蛋白,收集前幾滴,編號(hào)為4;

      (8)將編號(hào)為1到4的管中各加入50μl上樣緩沖液煮沸10min;

      (9)配置sds-page聚丙酰胺凝膠,將處理好的樣品加入孔中(20μl/每孔),電泳(濃縮膠電泳條件為直流電壓為80伏特,分離膠電泳條件為直流電壓為120伏特),電泳完成后,取下凝膠用考馬斯亮藍(lán)染色過(guò)夜。然后脫色,確定得到純化的目的蛋白。

      實(shí)施例2:牛支原體mbovp579蛋白在診斷牛支原體野毒株自然感染中的應(yīng)用

      2.1以牛支原體rmbovp579重組蛋白為抗原,通過(guò)間接elisa方法診斷牛支原體野毒株自然感染

      elisa方法的具體操作程序:

      (1)抗原包被:用包被液(na2co31.59g,nahco32.93g,加ddh2o至1000ml)稀釋濃縮后rmbovp579蛋白,按每孔100ng的比例加入稀釋rmbovp579蛋白后的包被液100μl每孔加入96孔酶標(biāo)板,4℃包被過(guò)夜。棄去包被液,每孔加300μlpbst(pbs:nacl8.0g,kcl0.2g,na2hpo4·12h2o2.9g,nah2po40.2g,加ddh2o至1000ml。pbst:加入0.05%比例的 tween-20到pbs中)洗滌3次,每次2分鐘。

      (2)封閉:每孔加入100μl5%脫脂牛奶(5g脫脂牛奶加pbst至100ml),置于37℃溫箱中封閉1h,甩干封閉液,加入300μlpbst洗3次,每次2分鐘。

      (3)加樣:用pbst按1:1600(v/v)比例稀釋待檢血清和對(duì)照血清,每孔加100μl稀釋后的樣本,37℃孵育1h。甩干孔中溶液,加入300μlpbst洗3次,每次2分鐘。

      (4)加酶標(biāo)二抗:用pbst按(500μl吐溫-20加入1000mlpbs(按v/v1:5000的比例稀釋酶標(biāo)二抗(購(gòu)自southernbiotech公司),每孔加入100μl稀釋后的二抗,置于37℃溫箱培養(yǎng)60分鐘。甩干孔中溶液,加入300μlpbst洗5次,每次2分鐘。

      (5)加底物顯色:每孔加入tmb底物顯色液a液和tmb底物顯色液b液(購(gòu)自武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司)各50μl,避光顯色10min,每孔加50μl終止液(購(gòu)自武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司)終止反應(yīng),用酶標(biāo)儀在630nm波長(zhǎng)下測(cè)定od630值。使用在線工具(http://epitools.ausvet.com.au/content.php?page=roc_curves)軟件確定閾值。

      2.2基于rmbovp579蛋白抗原的間接elisa與商品elisa試劑盒的比較

      選取123份通過(guò)牛肺臟組織分菌及分離培養(yǎng)確定為牛支原體感染的病牛陽(yáng)性血清作為比較實(shí)驗(yàn)的陽(yáng)性檢測(cè)樣本。商品化試劑盒(mycoplasmaboviselisakit,references:biok302;購(gòu)自比利時(shí)bio-xdiagnostics公司)。具體步驟如下:

      rmbovp579蛋白的包被、檢測(cè)方法及條件按3.1中所述進(jìn)行,商品化試劑盒的操作按照試劑盒的說(shuō)明書進(jìn)行。檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表1,用本發(fā)明的rmbovp579蛋白抗原對(duì)牛支原體感染樣本的檢出率為90.24%(111/123),顯著高于商品化試劑盒的31.7%(39/123)(p<0.01)。

      表1:商業(yè)化牛支原體抗體elisa試劑盒和rmbovp579間接elisa檢測(cè)比較

      實(shí)施例3:牛支原體rmbovp579蛋白診斷牛支原體自然感染試劑盒的組裝

      本發(fā)明的試劑盒包括牛支原體rmbovisp579抗原包被板2塊(96孔/塊,100ng/孔),牛支原體抗體elisa陰性、陽(yáng)性對(duì)照各1管(0.5ml/管),樣品稀釋液1瓶(40ml/瓶),羊抗牛酶標(biāo)記二抗(iggfc-hrp)(購(gòu)自southernbiotech公司)1管(200μl/管),20倍濃縮洗滌液1瓶(30ml/瓶),tmb底物顯色液a液,tmb底物顯色液b液各1瓶(10ml/瓶;購(gòu)自武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司)),終止液1瓶(10ml/瓶,購(gòu)自武漢科前動(dòng)物生物制品有限責(zé)任公司)。

      (1)20倍濃縮洗滌液的配制:nacl160g、kcl4g、na2hpo4·12h2o58g、kh2po44g,tween-2010ml定容至1000ml純化水中。

      (2)羊抗牛(iggfc-hrp)酶標(biāo)二抗(購(gòu)自southernbiotech公司)的配制:用保護(hù)劑(含1%bsa的pbst溶液)稀釋至(單位)1:500倍中間濃度。

      (3)封閉液:含5%脫脂乳的磷酸鹽緩沖液。

      (4)樣品稀釋液:含0.05%tween-20的磷酸鹽緩沖液。

      (5)tmb底物顯色液:包括

      tmb底物顯色液a液:na2hpo414.6g,檸檬酸9.33g,過(guò)氧化氫脲0.52g,加純化水至1000ml,調(diào)至ph值5.0~5.4;

      tmb底物顯色液b液:tmb20mg,無(wú)水乙醇10ml,加純化水至1000ml。

      (6)終止液:0.25%氫氟酸。

      名詞術(shù)語(yǔ)說(shuō)明:

      在本說(shuō)明書中:

      牛支原體mbovp579重組蛋白以rmbovp579表示;

      牛支原體mbovp579蛋白基因以mbov_579表示;

      牛支原體本地分離株,牛支原體野毒株,野毒株以牛支原體hb0801或m.bovishb0801表示。

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