在本發(fā)明
技術(shù)領(lǐng)域：
包括計算機模擬技術(shù)對蛋白質(zhì)的突變所進行的優(yōu)化和改造。
背景技術(shù)：
：人表皮生長因子受體（epidermalgrowthfactorreceptor，egfr）分子量為170kda的跨膜受體，其由原癌基因編碼，并且顯示固有的酪氨酸激酶活。表皮生長因子（egf），轉(zhuǎn)化生長因子-α（tgf-α），雙調(diào)蛋白，肝素結(jié)合egf和β動物纖維素等均為與egfr結(jié)合的配體。egfr經(jīng)配體激活后，經(jīng)由酪氨酸激酶介導的信號轉(zhuǎn)導途徑調(diào)節(jié)許多細胞過程，包括但不限于激活控制細胞增殖、分化、細胞存活、程序性細胞死亡等。已有大量研究表明，egfr雖然在正常組織的細胞中表達，但表達量很低，而在許多癌癥細胞表面的egfr異常過量表達，包括肺癌、乳腺癌、直腸結(jié)腸癌等。針對egfr表達過量后，其經(jīng)由配體激活引發(fā)了癌細胞增殖分化這一現(xiàn)象特點，目前已上市的小分子和抗體藥物是針對靶向egfr胞外部分的egf結(jié)合位點或胞內(nèi)部分的酪氨酸激酶活性位點。小分子酪氨酸激酶抑制劑如吉非替尼和厄洛替尼能夠阻斷egfr的自磷酸化，抑制下游信號的傳導。另一方面，單克隆抗體，靶向egfr的胞外部分，阻斷配體結(jié)合并由此抑制下游通路的激活如細胞增殖?？贵w所引發(fā)的egfr內(nèi)化正逐漸被本領(lǐng)域研究者關(guān)注。對于egfr內(nèi)化的研究為以egfr為靶點的生物藥提供了新的開發(fā)策略。從上世紀開始，egfr的內(nèi)化行為得到了廣泛研究。egfr的內(nèi)吞主要有網(wǎng)格蛋白依賴和網(wǎng)格蛋白非依賴兩種方式，當?shù)蜐舛萫gf作用時，egfr以網(wǎng)格蛋白介導的方式內(nèi)吞；當使用高濃度egf時，egfr主要以非網(wǎng)格蛋白方式內(nèi)吞，包括小窩和巨胞飲。就內(nèi)吞機制來說，近年爭論焦點在于內(nèi)吞是否依賴于egfr的二聚化，激酶活性，氨基酸位點的磷酸化，泛素化，以及碳端的模體（motif）。當同時使用兩種抗egfr第三結(jié)構(gòu)域抗體時，egfr不形成活性二聚體，絡氨酸位點無明顯磷酸化，這與使用單種抗體時，egfr發(fā)生的現(xiàn)象是一致的。索爾金等人認為,不論高低劑量的egf作用，egfr的內(nèi)吞與egfr的激酶活性、主要的絡氨酸位點的磷酸化有很大程度的相關(guān)性?？梢姡粢蕾嚵姿峄瘷C制入胞，抗體的內(nèi)吞現(xiàn)象并不能得以解釋。皮埃爾等人認為，高濃度egf作用時，egfr的泛素化修飾能促進其內(nèi)吞。泛素化是否能促進egfr的內(nèi)吞，存在廣泛爭議，低濃度egf作用時，egfr以網(wǎng)格蛋白方式內(nèi)吞，泛素化程度低，并不依賴于泛素化；但當egfr胞內(nèi)域全切除時，融合于egfr末端的單個泛素分子確能幫助egfr以小窩的方式入胞。yosefyarden的數(shù)據(jù)表明，當使用兩種抗體作用于egfr時，egfr能發(fā)生泛素化修飾，但泛素化在抗體作用的egfr內(nèi)吞機制中扮演的角色尚不清楚。zhixiangwang等人認為，egfr的入胞并不依賴于egfr激酶活性，主要賴氨酸的磷酸化修飾，以及egfr胞內(nèi)域碳末端的大部分區(qū)域。但這種機制依然不能解釋抗體的內(nèi)吞行為，yosefyarden等在2004年時指出，同時使用抗her-2的赫賽汀和l26單抗時，egfr的內(nèi)化不依賴于egfr的胞內(nèi)域，甚至是跨膜區(qū)。paulm.p.vanbergenenhenegouwen等人在研究抗egfr的具有非重疊表位的雙特異性抗體分子內(nèi)吞機制時發(fā)現(xiàn)，egfr以網(wǎng)格蛋白方式內(nèi)吞，即使切除egfr的胞內(nèi)域部分，egfr仍然發(fā)生大量內(nèi)化，內(nèi)化量甚至超過胞內(nèi)域完整的egfr，但其指出，egfr的跨膜區(qū)n端的二聚化對于完整的egfr的內(nèi)化十分重要。因此，當抗體與egfr作用時，egfr的入胞行為難以用egf作用時egfr的入胞模式來解釋。我們認為，抗體作用時，egfr的內(nèi)吞機制與其特殊的內(nèi)吞方式有關(guān)。espenstang等人發(fā)現(xiàn)，共同使用cetuximab以及抗cetuximab的igg抗體，egfr以巨胞飲的方式發(fā)生大量內(nèi)吞，不依賴磷酸化，而依賴肌動蛋白的聚合。yosefyarden等人猜測，這種入胞行為與抗體在細胞表面形成的抗體-受體復合物大小相關(guān)。當使用抗體對時，由于表位的非重疊性，使得大量的egfr得以被動聚集，從而在細胞膜上形成巨大分子量的抗體-受體復合物，這是單獨使用一種抗體或者使用兩種表位競爭的抗體所不能引起的。有質(zhì)譜實驗數(shù)據(jù)表明，具有兩個非重疊表位的抗her-2雙特異性抗體，能在細胞膜上形成1716kda的復合物。這在一定程度上證實了以上猜測，但促使egfr以巨胞飲方式入胞的機制并不清楚，且這種入胞方式伴隨受體的大量降解。有文獻表明，網(wǎng)格蛋白除了參與內(nèi)吞，還能促進內(nèi)吞體胞內(nèi)循環(huán)，且以不依賴泛素化的機制進行降解；而以巨胞飲方式內(nèi)吞，能極大提高內(nèi)吞效率以及降解效率。高濃度egf作用下，egfr依然可以發(fā)生巨胞飲，并且可以促進egfr在膜上發(fā)生聚集，形成egfr聚合體。與使用兩種非競爭抗體促進egfr聚合形成復合物所不同的是，egf作用下，egfr的聚集是一種主動的依賴于磷酸化以及肌動蛋白聚集的行為。我們認為，當兩種抗體共同使用時，在egfr發(fā)生被動聚集的過程中，引起了細胞膜的局部流動，微絲的重聚，促進egfr以巨胞飲的方式入胞，這是不依賴于胞內(nèi)域的模體以及egfr胞內(nèi)域修飾的入胞行為。以上的研究都是針對免疫球蛋白結(jié)構(gòu)的抗體進行的內(nèi)吞以及其內(nèi)吞機制的研究。靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白背景知識及其前期研究。本發(fā)明中的蛋白藥物，由于其蛋白結(jié)構(gòu)與傳統(tǒng)的免疫球蛋白抗體完全不同,該蛋白質(zhì)來源于靈芝免疫蛋白。在1989年，kino等人從赤靈芝菌絲體提取物中分離純化得到靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（immunoregulatoryproteinofganodermalucidium），并測定其氨基酸順序和免疫生理活性，命名該蛋白質(zhì)為lingzhi-8(lz-8)。lz-8由110個氨基酸殘基組成，氨基端乙?；肿恿繛?2.4kda，等電點為4.4。但kino等人提取的天然lz-8含有1.3%的多糖，我們通過基因工程技術(shù)手段，在畢赤酵母中重組表達獲得與天然lz-8氨基酸序列相同、活性相似、純度高于99%的重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白rlz-8。而后又通過動物藥效學的實驗證明了重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（rlz-8）具有抗腫瘤作用（cn101475632）。荷瘤小鼠實驗表明，rlz-8可以抑制小鼠艾氏腹水瘤細胞s180和移植性肝癌細胞h22在體內(nèi)生長。通過蛋白熒光標記實驗表明，其抗腫瘤作用是通過與腫瘤細胞膜特異性結(jié)合誘導其凋亡而殺傷或殺死腫瘤細胞。可見，找到rlz-8自身的抗腫瘤結(jié)構(gòu)域以及在腫瘤細胞上的靶受體將可能為癌癥治療帶來新的技術(shù)。靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的n端是重要的形成的二聚體結(jié)構(gòu)域，c端是一個fniii結(jié)構(gòu)域。n端由一個α-螺旋（由14個氨基酸組成，氨基酸序列為2-sdtalifrlawdvk-15）和一個β-折疊（由5個氨基酸組成，氨基酸序列為16-klsfd-20），其中在α螺旋上的ser殘基被乙?；?。n端的一個α螺旋和一個β折疊組成了二聚體中的一個單體，與另一個相同單體通過結(jié)構(gòu)域交互，形成啞鈴狀的二聚體。c端的fniii結(jié)構(gòu)域?qū)儆诿庖咔虻鞍紫嗨频娜髦谓Y(jié)構(gòu)。c端由β-平面i和β-平面ii組成，其中β-平面i和β-平面ii分別由β-折疊a-b-e和β-折疊g-f-c-d構(gòu)成。計算機分子模擬在蛋白質(zhì)類藥物的研發(fā)中也發(fā)揮著極為重要的作用。計算機分子模擬技術(shù)：首先利用計算機分子模擬技術(shù)可以根據(jù)蛋白質(zhì)藥物的晶體結(jié)構(gòu)預測其活性結(jié)構(gòu)域，通過模擬蛋白質(zhì)藥物與其作用靶點（如受體與配體）間的相互作用，可以預測其結(jié)合形式和結(jié)合部位，并且計算其結(jié)合能力。利用計算機分子模擬軟件可以對結(jié)合能力突出或位置結(jié)構(gòu)特殊的氨基酸殘基進行突變，從而分析該位置的變化對蛋白質(zhì)藥物與靶點結(jié)合能力的影響，進而分析出發(fā)揮活性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域及關(guān)鍵氨基酸殘基。通常情況下，選擇將關(guān)鍵氨基酸殘基突變?yōu)楸彼幔╝la）進行突變分析，丙氨酸是突變分析中最常用的一種氨基酸，其側(cè)鏈只有一個甲基，體積小，無其他官能團，同時還可以避免甘氨酸α-c，沒有手性基團對結(jié)構(gòu)產(chǎn)生較大影響的問題。通過將目標氨基酸突變?yōu)楸彼峥梢苑治鲈邪被釋Y(jié)構(gòu)和功能產(chǎn)生的作用。通過計算機分子模擬技術(shù)還可以對原有蛋白質(zhì)藥物進行設(shè)計和改造。如通過計算和分析靜電相互作用，對關(guān)鍵位置氨基酸進行電性的改造就是一種常見的改造策略。通過將原來產(chǎn)生靜電排斥的氨基酸改成相反電性的氨基酸，可以減少該位置與靶點之間的排斥作用，從而增加蛋白質(zhì)藥物與靶點的結(jié)合能力，得到優(yōu)化的蛋白質(zhì)藥物。此外，還有很多設(shè)計和改造策略，如根據(jù)蛋白質(zhì)藥物關(guān)鍵位置氨基酸殘基的結(jié)構(gòu)和側(cè)鏈特點從空間上進行改造等等。計算機模擬技術(shù)的另一大優(yōu)勢在于通過計算機分子模擬技術(shù)，期待可以優(yōu)化改造已知的蛋白質(zhì)，使其應具有理想的抗-egfr抗體的一個或更多的特點，包括證明其在以egfr為靶點作為抗腫瘤機制有十分突出的活性，可以十分有效的阻止或延緩病人的腫瘤生長。證明其阻止或延緩病人的腫瘤生長中有十分突出的活性，可以抗衡其他的治療藥物及其治療方案用于單獨抗腫瘤治療，如厄洛替尼、順鉑、阿霉素、曲妥單抗、西妥昔等。可以對其結(jié)構(gòu)進行工程化改造，以降低其表面疏水性，并且可以提高其工業(yè)生產(chǎn)（比如易于純化和定量、熱力學和化學穩(wěn)定性、溶解度、均一性）、制劑的穩(wěn)定性、良好的藥代動力學特點（如：減少體內(nèi)非特異性結(jié)合的清除率），同時保持或提高其對egfr的親和力。另外，可以證明其在體內(nèi)的穩(wěn)定性、良好的物理化學穩(wěn)定性，包括但是不局限于在腫瘤治療中可接受的熱力學和化學穩(wěn)定性、溶解度、藥代動力學特點。技術(shù)實現(xiàn)要素：說明書本發(fā)明是在發(fā)現(xiàn)rlz-8蛋白結(jié)構(gòu)中所存在的抗-egfr結(jié)構(gòu)區(qū)域，特別是該結(jié)構(gòu)區(qū)域通過其正電勢特征誘導一種對egfr異常表達腫瘤的殺傷作用。在以上科學發(fā)現(xiàn)的基礎(chǔ)上，利用計算機模擬技術(shù)獲得了具有更強抗腫瘤作用的rlz-8突變體蛋白。本發(fā)明中，所揭示的rlz-8抗腫瘤機制為，rlz-8與細胞膜表面過量表達的egfr結(jié)合后，通過巨胞飲的方式進行了強烈的內(nèi)化，含有rlz-8的細胞膜并未循環(huán)會細胞膜表面，細胞強烈內(nèi)吞rlz-8后，依次發(fā)生皺縮、變圓，最后膜結(jié)構(gòu)循環(huán)受阻導致細胞崩解死亡。通過使用不同內(nèi)吞方式的抑制劑，確認了rlz-8通過巨胞飲的方式入胞。根據(jù)已報道的巨胞飲的機制特點，對rlz-8內(nèi)化的細節(jié)與特點進行了進一步研究。與陰性對照組結(jié)構(gòu)完整的纖維狀肌動蛋白（f-actin）相比，rlz-8作用后細胞腹部無法觀察到貫穿狀f-actin結(jié)構(gòu)，說明f-actin參與了rlz-8的內(nèi)化，重組后的碎片化肌動蛋白參與了內(nèi)吞體的組成。rlz-8與巨胞飲的標記物——高分子量的糖苷（dextran）在細胞內(nèi)有明顯共定位現(xiàn)象。另外，隨著rlz-8的內(nèi)化，巨胞飲相關(guān)的偽足，皺縮以及囊泡均可在電鏡結(jié)果中觀察到。已有報道認為巨胞飲是一個膽固醇依賴的過程，而rlz-8的內(nèi)化效率可以被一種膽固醇抑制劑——mβcd抑制50%。由于gtp酶（gtpase）參與調(diào)節(jié)了巨胞飲過程，我們研究了其對rlz-8內(nèi)化的影響。隨著rlz-8和牛血清蛋白（bsa）的內(nèi)化,rasgtp、arf6gtp、rac1gtp均被激活，bsa引發(fā)的激活在內(nèi)化1小時后回復到最初的水平，而rlz-8持續(xù)保持著高活性狀態(tài)。綜上，rlz-8應該是通過巨胞飲的方式內(nèi)化進入腫瘤細胞，而這種內(nèi)化方式可能與rlz-8的腫瘤細胞毒性有關(guān)。本發(fā)明還通過大量的研究工作來揭示rlz-8內(nèi)化與其所誘導的細胞死亡之間的關(guān)系。100μg/mlrlz-8作用5小時后，hepg2細胞發(fā)生了皺縮與脹破死亡。通過實時動態(tài)觀察細胞依次發(fā)生皺縮，變圓，最后由于細胞膜的缺乏導致細胞崩解死亡。為更好的展現(xiàn)細胞死亡過程，更低劑量的rlz-8（10μg/ml）應用于下述實驗。rlz-8作用6小時后被撤走，更換正常培養(yǎng)基培養(yǎng)24小時后，核周紅色熒光囊泡依然存在，內(nèi)化的rlz-8似乎并未被溶酶體降解。與之相對應的是，bsa培養(yǎng)20分鐘后即被降解。但若rlz-8作用4小時后，再進行bsa的孵育，bsa并未被降解，而是與rlz-8存在明確共定位現(xiàn)象。根據(jù)以上結(jié)果，結(jié)合內(nèi)吞體與溶酶體分別在bsa降解中的作用，相關(guān)活性與細胞成像應用于rlz-8內(nèi)化的降解研究。作用于細胞10分鐘后，rlz-8與rab5開始出現(xiàn)共定位現(xiàn)象，30分鐘后共定位現(xiàn)象逐漸消失，隨之而來，rlz-8與rab7的共定位現(xiàn)象開始出現(xiàn)，并持續(xù)維持下去，而整個內(nèi)化過程中，rlz-8始終未與lamp1發(fā)生共定位。上述結(jié)果表明rlz-8的內(nèi)化滯留于晚期內(nèi)吞體階段，且不與溶酶體發(fā)生融合。這可能導致rlz-8大量積累在晚期內(nèi)吞體階段。luzio等報道通過調(diào)控ca2+的釋放能夠抑制le與溶酶體的融合，再加入足夠cacl2可以恢復兩者融合。本研究中，cacl2的加入并未引起包含rlz-8的le與溶酶體融合。因此，接下來的研究集中于rlz-8內(nèi)化過程中rab7活性的檢測。圖3e結(jié)果顯示，隨著rlz-8的內(nèi)化，rab7活性維持在較低水平，而相對的是bsa的內(nèi)化中，rab7活性增高，表明含有bsa的le與溶酶體發(fā)生融合。根據(jù)上述結(jié)果可以初步推斷含有rlz-8的晚期內(nèi)吞體未與溶酶體發(fā)生融合的原因。更重要的是，le的不斷積累對整個細胞膜轉(zhuǎn)運會造成何影響，我們通過研究rlz-8內(nèi)化過程中細胞膜的循環(huán)來考察這一影響。選用兩種細胞膜標志物——egfr和轉(zhuǎn)鐵蛋白受體（tfr），隨著rlz-81小時,2小時,4小時及6小時的進入，rlz-8始終與標志物保持高度的共定位現(xiàn)象。另一個體現(xiàn)晚期內(nèi)吞體異常滯留的重要現(xiàn)象是rlz-8與介導巨胞飲體形成的肌動蛋白一直維持明確共定位。因此可以看出，隨著rlz-8的內(nèi)化，含有rlz-8的細胞膜并未循環(huán)回細胞膜表面。綜上，rlz-8通過巨胞飲的過度內(nèi)化導致細胞膜循環(huán)的阻斷，這可能是細胞皺縮與死亡的誘因。在本發(fā)明的前期實驗中，由于rlz-8的分子量僅為12.4kda，在體內(nèi)半衰期較短，為了提高其體內(nèi)半衰期以及腎清除率等，通過對重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白（rlz-8）修飾物的研究，構(gòu)建了單甲氧基聚乙二醇丙琥珀酰亞安酯（mpeg-spa-rlz-8），在動物藥效學實驗中發(fā)現(xiàn)該修飾物的抗腫瘤效果有所下降。這說明修飾物存在的位置與rlz-8的抗腫瘤重要區(qū)域有極大的關(guān)聯(lián)性。因此運用了分子對接技術(shù)，對mpeg可能形成的空間位阻的位置進行了計算。首先以rlz-8的晶體結(jié)構(gòu)為基礎(chǔ)，構(gòu)建了mpeg-spa-rlz-8的結(jié)構(gòu)模型，利用分子對接計算mpeg聚合物所形成的空間位阻，由于mpeg鏈柔性強，計算量是普通大型工作站無法承受的，僅截取所用mpeg-spa（分子量：5000da）的十分之一進行計算，因而其計算結(jié)構(gòu)的準確性未知。將截取的peg16鏈在discoverystudio2.5中通過cdodocker操作方法，對接到rlz-8可能的活性位點上。而后對所有可能影響rlz-8的氨基酸位置進行一個或多個定點突變，產(chǎn)生的突變體用amber進行分子動力學模擬的穩(wěn)定性分析。最后共得到兩個對rlz-8抗腫瘤和與egfr結(jié)合可能性最大的區(qū)域：第一個區(qū)域由第6位-20位氨基酸組成，第二個區(qū)域為第41—74位氨基酸組成。選取其中5個具有代表性位置的氨基酸，為了探究這九個氨基酸每個氨基酸對于抗腫瘤熱點區(qū)的影響和作用，將九個氨基酸進行排列組合后，分別設(shè)計將這九個氨基酸中的部分氨基酸突變?yōu)楸彼?，重新?gòu)建質(zhì)粒、在畢赤酵母表達系統(tǒng)中重組表達突變后的氨基酸序列，按照rlz-8的純化工藝進行制備，獲得了重組表達的突變體，用重組表達的突變體在與egfr的親和力、動物藥效學實驗中，對5個突變位點所代表的兩個關(guān)鍵性區(qū)域（圖1）進行分析。rlz-8的氨基酸序列如附件中氨基酸序列所示。所選取代表氨基酸為第一個區(qū)域（第6位-20位氨基酸）中，由第九位的精氨酸(r9)、第16位賴氨酸（k16），第十八位絲氨酸（s18）。第二個區(qū)域（第41—74位氨基酸組成）中的第41位賴氨酸（k41），第55位天冬氨酸（d55）。共得到五個突變體，分別為rlz-8(k16a/s18a/k41a/d45a)、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）、rlz-8（s18a）和rlz-8（r9a）。這五個突變體與egfr的親和力測試結(jié)果顯示，rlz-8(k16a/s18a/k41a/d45a)、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）這四個突變體的親和力下降明顯，其中rlz-8(k16a/s18a/k41a/d45a)和rlz-8（k16a/k41a）幾乎與egfr無親和力，親和力常數(shù)（kd）僅分別為和。而僅改變一個氨基酸后，rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）的親和力也下降了兩個數(shù)量級至。rlz-8（r9a）的親和力并未有任何明顯改變。在體外細胞活性實驗中表明，即使劑量高達100μg/ml，除rlz-8（r9a）外，其余四種突變體與hepg2細胞膜結(jié)合和進入細胞的效率大幅下降，特別是rlz-8(k16a/s18a/k41a/d45a)，與hepg2細胞膜結(jié)合量非常少，而且?guī)缀跤^察不到其進入細胞。rlz-8是否入胞是其腫瘤殺傷的重要因素，因此證明了所預測的這兩個區(qū)域是rlz-8抗腫瘤和與egfr結(jié)合的重要區(qū)域。在肝癌、肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌動物藥效學實驗中表明，rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）組與陰性對照組相比，腫瘤質(zhì)量差異不顯著，幾乎無抑瘤效果。說明所預測的這兩個區(qū)域，對rlz-8的抗腫瘤效果起到了決定性作用。當無法與egfr結(jié)合后，其入胞和抗腫瘤藥效均顯著下降。通過丙氨酸突變體rlz-8(k16a/s18a/k41a/d45a)與rlz-8比較發(fā)現(xiàn)，rlz-8中由這四個位置的氨基酸所組成的區(qū)域表面呈正電勢，而突變成丙氨酸后，該區(qū)域表面呈中性而失去與egfr結(jié)合和抗腫瘤的能力。同時對比其相同家族結(jié)構(gòu)相似的金針菇免疫調(diào)節(jié)蛋白（fip-fve），fip-fve結(jié)構(gòu)中所在相同區(qū)域呈負電勢而同樣不具有與egfr結(jié)合和抗腫瘤的能力。因此，以增強該區(qū)域正電勢或減弱其周圍負電勢作為開發(fā)rlz-8突變體的策略，通過計算機模擬技術(shù)的計算，對該區(qū)域及其周圍負電勢區(qū)域進行定點突變，定點突變位置為：第6-9位氨基酸（6-lifr-9）、第16-20位氨基酸（16-klsfd-20）、第41-46為氨基酸（41-kvltd-46）和第68-74位氨基酸（68-eskgsqk-74）。在這些位置中，選取7個突變體作為代表進行重組表達純化，對該突變策略進行驗證。包括rlz-8丙氨酸突變體在內(nèi)的所有突變體均通過與rlz-8相同的發(fā)酵純化工藝，進行質(zhì)粒構(gòu)建、蛋白重組表達純化獲得。經(jīng)驗證，7個突變體經(jīng)過單個定點突變或者多個定點突變后，除rlz-8(k41d/k46e/k74e)外，與egfr的親和力均有明顯提高。其中rlz-8（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）與rlz-8相比，親和力平衡常數(shù)分別提高了4倍和6倍。而rlz-8(k41d/k46e/k74e)由于破壞了rlz-8關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)域，使其親和力反而下降。在肝癌、肺癌、乳腺癌和結(jié)腸癌動物藥效學實驗中表明，rlz-8（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）組較rlz-8對照組抑瘤效果顯著增強，其余突變體抑瘤效果接近或略好于rlz-8對照組，并且能在一定程度上顯著或者略微延長小鼠的存活率。說明通過對關(guān)鍵的兩個結(jié)構(gòu)區(qū)域進行該區(qū)域正電勢增強或者減弱其周圍負電勢作為策略得到的定點突變的突變體，同rlz-8相比，具有顯著的對于egfr親和力的提高和對egfr表達異常癌癥的抗腫瘤藥效的提高。基于理性設(shè)計和對rlz-8抗腫瘤機制的深入研究，進而對其關(guān)鍵的egfr結(jié)合和抗腫瘤結(jié)構(gòu)域進行定點突變，最終所得到的突變體具有顯著優(yōu)于rlz-8的抗腫瘤作用。附圖說明圖1靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的關(guān)鍵性區(qū)域展示圖2靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體bl21（de3）原核表達westernblot鑒定圖注：s為rlz-8標準品，第1泳道為rlz-8，第2泳道為rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a），第3泳道為rlz-8（k16a/k41a），第4泳道為rlz-8（d45a），第5泳道為rlz-8（s18a），第6泳道為rlz-8（r9a），第7泳道為rlz-8（d70k），第8泳道為rlz-8（l17k/d70k），第9泳道為rlz-8（d20h/d68k），第10泳道為rlz-8（d20h），第11泳道為rlz-8（l17k），第12泳道為rlz-8（k41d/k46e/k74e），第13泳道為rlz-8（k46e/k74e），第14泳道為rlz-8（k46e）。圖3靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體x33畢赤酵母表達westernblot鑒定圖注：s為rlz-8標準品，第1泳道為rlz-8，第2泳道為rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a），第3泳道為rlz-8（k16a/k41a），第4泳道為rlz-8（d45a），第5泳道為rlz-8（s18a），第6泳道為rlz-8（r9a），第7泳道為rlz-8（d70k），第8泳道為rlz-8（l17k/d70k），第9泳道為rlz-8（d20h/d68k），第10泳道為rlz-8（d20h），第11泳道為rlz-8（l17k），第12泳道為rlz-8（k41d/k46e/k74e），第13泳道為rlz-8（k46e/k74e），第14泳道為rlz-8（k46e）。圖4靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體cho-s哺乳動物細胞表達westernblot鑒定圖注：s為rlz-8標準品，第1泳道為rlz-8，第2泳道為rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a），第3泳道為rlz-8（k16a/k41a），第4泳道為rlz-8（d45a），第5泳道為rlz-8（s18a），第6泳道為rlz-8（r9a），第7泳道為rlz-8（d70k），第8泳道為rlz-8（l17k/d70k），第9泳道為rlz-8（d20h/d68k），第10泳道為rlz-8（d20h），第11泳道為rlz-8（l17k），第12泳道為rlz-8（k41d/k46e/k74e），第13泳道為rlz-8（k46e/k74e），第14泳道為rlz-8（k46e）。圖5靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的免疫印跡檢測結(jié)果圖注：s為rlz-8標準品，第1泳道為rlz-8，第2泳道為rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a），第3泳道為rlz-8（k16a/k41a），第4泳道為rlz-8（d45a），第5泳道為rlz-8（s18a），第6泳道為rlz-8（r9a），第7泳道為rlz-8（d70k），第8泳道為rlz-8（l17k/d70k），第9泳道為rlz-8（d20h/d68k），第10泳道為rlz-8（d20h），第11泳道為rlz-8（l17k），第12泳道為rlz-8（k41d/k46e/k74e），第13泳道為rlz-8（k46e/k74e），第14泳道為rlz-8（k46e），第15泳道為rlz-8（l17k）。圖6靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的電泳檢測圖注：m為標記物，s為rlz-8標準品，第1泳道為rlz-8，第2泳道為rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a），第3泳道為rlz-8（k16a/k41a），第4泳道為rlz-8（d45a），第5泳道為rlz-8（s18a），第6泳道為rlz-8（r9a），第7泳道為rlz-8（d70k），第8泳道為rlz-8（l17k/d70k）。圖7靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及突變體電泳檢測結(jié)果圖注：m為標記物，s為rlz-8標準品，第1泳道為rlz-8，第2泳道為rlz-8（d20h/d68k），第3泳道為rlz-8（d20h），第4泳道為rlz-8（l17k），第5泳道為rlz-8（k41d/k46e/k74e），第6泳道為rlz-8（k46e/k74e），第7泳道為rlz-8（k46e），第8泳道為rlz-8（l17）。圖8rlz-8純化過程中各階段樣品的電泳檢測結(jié)果圖注：m為標記物，第1泳道為rlz-8標準品，第2泳道為陽離子層析后30%的流動相b洗脫樣品，第3泳道為60%流動相b洗脫峰2，第4泳道為陽離子層析的流穿樣品，第6泳道為終樣。圖9靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白30%流動相洗脫樣品的hplc檢測圖10靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白60%流動相洗脫樣品的hplc檢測圖11靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白純化終樣的hplc檢測圖12靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白通過巨胞飲的方式入胞圖13靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白與egfr共定位觀察圖14靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白與其他膜受體的共定位觀察圖15靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白與rab5、rab7、lamp1的共定位現(xiàn)象圖16靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白入胞后細胞變化實時觀察圖17靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白撤走后對細胞死亡的影響圖18靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白凍干工藝曲線具體實施例本發(fā)明中實施例僅用于解釋而不以任何方式限制本發(fā)明。實施例1重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的原核與真核表達本實施例中“目的蛋白”代表“rlz-8及其突變體”，“目的基因”代表“rlz-8及其突變體基因”。重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的原核表達菌株構(gòu)建與表達本實施例采用原核表達系統(tǒng)中具有代表性的大腸桿菌bl21(de3)菌株進行目的蛋白表達。目的蛋白基因經(jīng)密碼子優(yōu)化，并按照pet-28a載體t7啟動子方向，在目的基因5’端添加xbai酶切位點和核糖體結(jié)合位點dna序列，3’端添加終止密碼子和xhoi酶切位點進行全基因合成。經(jīng)xbai和xhoi雙酶切并與pet-28a原核表達載體連接，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒。經(jīng)測序驗證后，熱激轉(zhuǎn)化bl21(de3)菌株，卡那霉素抗性篩選陽性克隆，得到含有重組表達載體的基因工程菌。將所得基因工程菌置于37℃下培養(yǎng)至od600≈0.6時，采用iptg在30℃條件下誘導目的蛋白表達，收集菌體破碎后，離心取上清液進行westernblot鑒定。圖2結(jié)果表明，本發(fā)明中rlz-8及其突變體在原核表達菌株bl21(de3)中得到表達。rlz-8及其突變體組成型畢赤酵母菌株構(gòu)建與表達目的蛋白基因按照畢赤酵母密碼子偏愛性進行密碼子優(yōu)化，按照組成型表達載體pgapzαa質(zhì)粒中g(shù)ap啟動子方向，在目的基因5’端添加xhoi酶切位點和kex2、ste13水解酶位點dna序列，3’端添加終止密碼子和xbai酶切位點進行全基因合成。通過酶切連接的方法構(gòu)建重組表達載體，并測序驗證。按照invitrogen公司pgapzαa質(zhì)粒說明書，電轉(zhuǎn)化x33畢赤酵母，經(jīng)zeocin抗性篩選，獲得組成型重組目的蛋白x33畢赤酵母表達菌株。將所得基因工程菌置于30℃下培養(yǎng)至od600≈6，繼續(xù)培養(yǎng)48小時使目的蛋白分泌表達，離心取上清液進行westernblot鑒定。圖3結(jié)果表明，本發(fā)明中rlz-8及其突變體在畢赤酵母x33中得到表達。重組靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體在哺乳動物細胞中的表達采用invitrogen公司freestyle?maxchoexpressionsystem進行目的蛋白表達。對目的基因密碼子進行優(yōu)化，并添加asci和xhoi酶切位點進行全基因合成。通過酶切連接的方法將目的基因轉(zhuǎn)入psectag2a表達載體中，獲得重組目的基因表達載體。使用freestyle?maxreagent將重組目的蛋白表達載體轉(zhuǎn)染導入cho-s細胞中，利用潮霉素b抗性篩選，獲得重組目的蛋白細胞株。在37℃8%co2135rpm條件下分泌表達目的蛋白，離心收集上清液westernblot鑒定目的蛋白表達情況。圖4結(jié)果表明，本發(fā)明中rlz-8及其突變體在哺乳動物細胞cho-s中得到表達。實施例2利用發(fā)酵工程技術(shù)制備rlz-8及其突變體靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體均采用相同的表達載體和菌株進行構(gòu)建和表達篩選。該實施例中采用由畢赤酵母進行基因組重組構(gòu)建獲得，所獲得的菌株經(jīng)過前期搖瓶培養(yǎng)，篩選可用于發(fā)酵罐規(guī)模制備使用的工程菌株，以下敘述中使用“目的蛋白”代表rlz-8及其突變體。發(fā)酵工藝的具體流程復蘇工作種子：從-80℃冰箱取出組成型工作種子，室溫緩慢溶解，取出10μl分別接入10mlypd液體培養(yǎng)基的100ml搖瓶中，28.5℃225rpm震蕩培養(yǎng)24h。組成型種子液培養(yǎng)：復蘇的工作種子菌液od值在2-6之間，取菌液1ml，加入2l三角燒瓶內(nèi)含400mlypd培養(yǎng)基內(nèi)，28.5℃，225rpm，振蕩培養(yǎng)，至菌液od值≈6，可作為上罐用種子液。罐上培養(yǎng)階段①調(diào)校設(shè)備：校準發(fā)酵罐的ph電極（在發(fā)酵罐滅菌前用ph校正液進行ph6.86和4.00校正）、溶氧電極（在發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基滅菌并冷卻后校正，培養(yǎng)條件的最大通氣量、最適溫度、最適ph值、最高轉(zhuǎn)數(shù)攪拌30min以上校正溶氧電極），并進行蠕動泵的流量校準。②配制3.5lbsm基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基加入7.5l發(fā)酵罐，4ml消泡劑（可滅菌），121℃，30min高壓滅菌培養(yǎng)基、發(fā)酵罐及管路。③待發(fā)酵罐內(nèi)培養(yǎng)基滅菌并冷卻后，設(shè)置以下參數(shù)：溫度（29℃），轉(zhuǎn)速為800rpm，通氣量8l/min，培養(yǎng)基的ph值為6.0。無菌操作補加0.22μm過濾膜除菌8mlbiotin及17mlptm1微量元素。④無菌操作將發(fā)酵罐接種口和種子液補料口連接，然后將上述2l三角燒瓶內(nèi)含有400mlypd菌液，利用蠕動泵補加進入發(fā)酵罐，總體積為3.9l進行發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵罐參數(shù)設(shè)置分別為攪拌速度800rpm，溫度29℃，維持do值（溶解氧）在20%左右，必要時通入純氧。⑤此階段每6h取樣1次，測od600、細胞濕重及細胞干重，分析酵母菌生長狀態(tài)，肉眼和鏡下觀察菌液，排除雜菌污染，并留上清。⑥按照每升12ml/lptm1微量元素加入高壓滅菌后冷卻的50%甘油中混勻后，用蠕動泵補加進培養(yǎng)基中，補加甘油過程中，do值不能低于20%，可以通過提高攪拌轉(zhuǎn)速和通純氧保證氧供給。⑦對每個菌株各個時間點取樣進行sds-page電泳，以檢測其表達量，分析組成型rlz-8發(fā)酵上清液。⑧當本次發(fā)酵進行到126h時，向罐中補加20ml磷酸，以使一定量的氨水進入培養(yǎng)液中，作為氮源繼續(xù)支持發(fā)酵，并150h停止培養(yǎng)。結(jié)果及分析由圖5可見，根據(jù)westernblot檢測，rlz-8及其突變體均標成功制備，且表達量較高。如圖6所示，rlz-8及其丙氨酸突變體，均成功表達，并且分子量與第2泳道的標準品保持一致。如圖6和7所示，rlz-8及其經(jīng)過表面電勢優(yōu)化后的突變體，均成功表達，并且分子量與第1泳道的標準品保持一致。本發(fā)明中構(gòu)建出組成型蛋白的畢赤酵母表達系統(tǒng)，無需給予甲醇誘導即可表達所需蛋白，以甘油作為碳源，其生長速率相比甲醇誘導更滿足其表達需要，可同時進行生長與表達，提高發(fā)酵效率和效果。實施例3靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的分離純化工藝1.實驗方法經(jīng)過實驗摸索，對發(fā)酵液按照微濾、超濾、陽離子交換層析和疏水作用層析的順序進行rlz-8及其突變體的分離純化。由于rlz-8與其突變體之間理化性質(zhì)差別較小，因而純化工藝相似，使用rlz-8的純化工藝均可成功制備突變體，并非每種突變體的最佳分離純化工藝，本實施例中未對任何一種突變體的純化工藝進行優(yōu)化。以下文字為對rlz-8的純化工藝細節(jié)的詳盡敘述。①發(fā)酵液微濾處理工藝用3l注射用水清洗已經(jīng)保存完好的0.7m2中空纖維微濾柱，清洗去除微濾柱里的50ppm次氯酸鈉保護液，用5l含有2000ppm次氯酸鈉的0.5m氫氧化鈉溶液來清洗柱子，測定ph值及檢測內(nèi)毒素含量。微濾：離心后的上清液檢測電導值和ph值，用微濾柱處理，蠕動泵速率40轉(zhuǎn)/分鐘，1擋。壓力表上下都控制在≤0.1mpa。微濾后用注射用水洗柱，收集洗柱液與樣品合并，總體積增加至少為發(fā)酵原液體積的0.25倍。清洗微濾柱，配制5l含有2000ppm次氯酸鈉的0.5m氫氧化鈉溶液清洗柱子，用10l注射用水清洗至ph值至中性，再用一定量的50ppm次氯酸鈉進行保存柱子。發(fā)酵離心上清原液、微濾后樣品分別取樣，進行sds電泳檢測，發(fā)酵離心上清原液進行細菌內(nèi)毒素檢測。②發(fā)酵液超濾處理工藝用2l注射用水清洗已經(jīng)保存完好的0.6m2膜包，清洗去除膜包中的0.1m氫氧化鈉保護液，用1m氫氧化鈉3l清洗膜包，再用酸性洗液清洗至ph為中性，測定ph值，水通量。超濾：微濾處理后的樣品用切向流過濾系統(tǒng)濃縮、除鹽。設(shè)定選擇conc-difi-conc程序進行濃縮，加入20注射用水進行除鹽，最后濃縮，根據(jù)蛋白的含量確定濃縮的5倍。超濾結(jié)束后，檢測樣品終ph值，終電導值。清洗膜包及保存：膜包處理樣品后，用5l的1m氫氧化鈉進行清洗至初始的水通量，洗至中性，再用0.1m氫氧化鈉堿液進行保存。超濾后的樣品進行sds電泳檢測。③陽離子層析純化工藝將粗純超濾后收集的目的蛋白5l加入陽離子層析的流動相a母液（ph為3.6的0.02m無水醋酸鈉溶液）中，進行調(diào)節(jié)ph值，用冰醋酸調(diào)節(jié)至ph到3.6，并用0.22μm濾膜通過板式濾器過濾，準備上樣。平衡色譜柱：用填料captos裝bpg(140/500)柱，裝1.5l填料，用6l注射用水清洗至柱內(nèi)20%乙醇和0.2m乙酸鈉保護液完全去除，做內(nèi)毒素檢測結(jié)果小于0.25eu/ml后方可使用。用流動相a平衡6個柱體積，流速30l/h，設(shè)定儀器保護壓為2bar，測定電導值，ph值和電導值達到流動相a的相應值即可。上樣：過濾后的樣品通過a3泵上樣，流速20l/h，上樣完成后，收集流穿峰，測定ph值，電導值范圍，280nm紫外吸收值范圍，洗脫未結(jié)合用8la相緩沖液進行洗脫，流速30l/h，洗至未結(jié)合峰達到起始的紫外吸收值即可，收集未結(jié)合峰，測定電導值范圍。洗脫：根據(jù)保護壓力設(shè)定流速，進行階段性洗脫，10%的流動相b（ph為3.6的含有0.02m無水醋酸鈉和1.5m氯化鈉溶液）沖洗12l，30%的流動相b沖洗6l，分別洗脫至洗脫峰達到起始的紫外吸收值即可，收集每步洗脫峰。檢測電導值范圍，280nm紫外吸收值范圍，收集的洗脫峰體積，取出一定量做sds電泳、高效液相（hplc）檢測。各階段的含有目的蛋白的洗脫峰純度低于50%則棄掉。④疏水層析純化工藝樣品處理：將陽離子超濾后收集的目的蛋白2l按體積加入hic的b相母液，進行調(diào)節(jié)ph值，用醋酸調(diào)節(jié)至ph到5.0，并用0.22μm膜板式過濾，準備上樣。平衡色譜柱：用填料captophenyl裝bpg(140/500)柱，裝1.0l填料，用5l注射用水清洗至柱內(nèi)20%乙醇保護液完全去除，再用6l1m氫氧化鈉堿液清洗，再用注射用水清洗至ph值至中性，做內(nèi)毒素檢測，合格后可使用。用流動相b平衡8個柱體積，流速30l/h，設(shè)定儀器保護壓為2bar。上樣：過濾后的樣品通過上樣泵上樣，流速20l/h，上樣完成后，收集流穿峰，測定ph值，電導值范圍，洗脫未結(jié)合用6l流動相b緩沖液進行洗脫，流速20l/h，洗至未結(jié)合峰達到起始的紫外吸收值即可，收集未結(jié)合峰，測定電導值范圍及電泳。洗脫：設(shè)定流速為30l/h進行階段性洗脫，60%b相洗脫25l，30%b相洗脫6l。分別洗脫至洗脫峰達到起始的紫外吸收值即可，收集每步洗脫峰。檢測電導值范圍，280nm紫外吸收值范圍，收集的洗脫峰體積，取出一定量做sds電泳、hplc檢測。各階段的含有目的蛋白的洗脫峰純度低于90%則棄掉。結(jié)果與分析通過rlz-8對純化結(jié)果進行驗證，根據(jù)圖8中的電泳結(jié)果表明，經(jīng)過陽離子層析30%的流動相b洗脫樣品（泳道4）、60%的流動相b中峰2洗脫樣品（泳道2）、60%的流動相b中峰1洗脫樣品（泳道3）和純化終樣（泳道6），均與標準品（泳道1）中出現(xiàn)的明顯條帶位置一致，其中30%的流動相b洗脫樣品（泳道4）、60%的流動相b中峰1洗脫樣品（泳道3）還有明顯的雜帶，而60%的流動相b中峰2洗脫樣品（泳道2）、純化終樣（泳道6）的明顯且不含雜帶證明純化方法可行。而后對相同樣品進行液相檢測，30%的流動相b洗脫樣品（圖9）中主峰（峰6）高度突出，但存在7個左右雜峰，根據(jù)峰面積計算，純度約為91%左右。如圖10和11所示，60%的流動相b中峰2洗脫樣品和純化終樣均只含一個主峰，純度為100%，液相結(jié)果與電泳結(jié)果保持一致。實施例4靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白通過巨胞飲的方式入胞1.實驗方法借助超高分辨成像系統(tǒng)，通過抑制劑實驗、共定位實驗等篩查rlz-8的入胞方式。①靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白入胞形態(tài)學觀察使用alexafluor568熒光探針標記rlz-8，然后將10μg/ml熒光標記rlz-8作用于hepg2細胞3h，之后使用超高分辨成像系統(tǒng)觀察rlz-8是否入胞，并使用imaris圖像分析軟件對所得圖像進行重構(gòu)擬合與進一步分析。②抑制劑篩查選用不同內(nèi)化方式的抑制劑，eipa（巨胞飲抑制劑）、wortmannin/ly294002（pi3k抑制劑）、nystatin+progesterone（小窩抑制劑）、chlorpromazine（網(wǎng)格蛋白抑制劑）等分別作用于hepg2細胞，來觀察其對rlz-8入胞的抑制效果。③靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白入胞對微絲的影響由于巨胞飲入胞過程中微絲起到重要的作用，能夠發(fā)生斷裂重組，因此考察了rlz-8入胞對微絲的影響，從而判斷其是否為巨胞飲入胞。④巨胞飲標志物dextran和bsa分別與rlz-8的共定位研究dextran和bsa為巨胞飲入胞方式的經(jīng)典標志物，為考察rlz-8的入胞方式，將rlz-8和dextran/bsa共同作用于hepg2細胞，觀察是否有共定位現(xiàn)象。2.實驗結(jié)果按上述方法對rlz-8的入胞方式進行了研究，結(jié)果如圖12所示。由圖12.a可知，rlz-8能夠內(nèi)化進入細胞，并在細胞核周圍形成中空狀囊泡，說明rlz-8是通過某種內(nèi)化的方式進入細胞的。接下來的抑制劑篩查發(fā)現(xiàn)（圖12.b和12.c），只有巨胞飲的抑制劑eipa有效地抑制了rlz-8的內(nèi)化，而其他內(nèi)化方式的抑制劑并未產(chǎn)生抑制效果，這說明rlz-8極有可能通過巨胞飲入胞。進而根據(jù)巨胞飲的特點，對rlz-8內(nèi)化過程中微絲的變化進行了觀察（圖12.d），發(fā)現(xiàn)該過程中細胞腹部貫穿狀的微絲發(fā)生了斷裂，這說明微絲參與了rlz-8的內(nèi)化。而rlz-8又與巨胞飲的典型標志物dextran和bsa存在高度的共定位現(xiàn)象（圖12.e）。以上結(jié)果表明rlz-8是通過巨胞飲內(nèi)化進入細胞的。實施例5靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白與egfr結(jié)合后入胞1.實驗方法鑒于rlz-8的高內(nèi)化強度可能是由于與細胞膜上受體結(jié)合后內(nèi)化導致，因此對rlz-8與細胞膜上的受體進行了篩查。使用免疫熒光的方法對細胞膜上不同受體與rlz-8的關(guān)系進行了檢測，分別使用egfr、c-met、pdgfr、n-cadherin以及l(fā)dlr的抗體對其進行熒光標記，分別觀察其與rlz-8的共定位情況。實驗結(jié)果免疫熒光結(jié)果如圖13所示。從圖13中可以看出，隨著rlz-8內(nèi)化的進行，rlz-8與egfr始終保持了高度的共定位現(xiàn)象。而如圖14，rlz-8與其他內(nèi)化相關(guān)的膜受體卻始終沒有發(fā)生共定位現(xiàn)象。因此說明rlz-8是通過與細胞膜表面egfr結(jié)合，然后發(fā)生高強度巨胞飲內(nèi)化入胞的。實施例6靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白內(nèi)化后不與溶酶體發(fā)生融合1.實驗方法正常的巨胞飲內(nèi)化過程中，內(nèi)吞物經(jīng)早期內(nèi)吞體、晚期內(nèi)吞體后會與溶酶體發(fā)生融合，然后被降解，因此考察了rlz-8內(nèi)化入胞后是否同樣經(jīng)歷了該過程。通過免疫熒光的方法，分別對rab5（早期內(nèi)吞體標志物）、rab7（晚期內(nèi)吞體標志物）和lamp1（溶酶體標志物）進行熒光標記，觀察其與rlz-8的共定位現(xiàn)象。2.實驗結(jié)果靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白分別與rab5、rab7、lamp1的共定位現(xiàn)象如圖15所示。由圖15.a可知，作用于細胞10min后，rlz-8與rab5開始出現(xiàn)共定位現(xiàn)象，30min后共定位現(xiàn)象逐漸消失，隨之而來，rlz-8與rab7的共定位現(xiàn)象開始出現(xiàn)（圖15.b），并持續(xù)維持下去，而整個內(nèi)化過程中，rlz-8始終未與lamp1發(fā)生共定位（圖15.c）。上述結(jié)果表明rlz-8的內(nèi)化滯留于晚期內(nèi)吞體階段，且不與溶酶體發(fā)生融合。這可能導致rlz-8大量積累在晚期內(nèi)吞體階段。實施例7靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白內(nèi)化后引起大量膜占用導致腫瘤細胞死亡1.實驗方法使用超高分辨成像系統(tǒng)，實時觀察rlz-8內(nèi)化后細胞變化的全過程，并結(jié)合前面的各項研究，判斷出rlz-8引起腫瘤細胞死亡的原因。實驗結(jié)果實時動態(tài)觀察結(jié)果如圖13所示。由圖13可知，rlz-8作用于細胞后，細胞依次發(fā)生皺縮，變圓，最后細胞崩解死亡。結(jié)合實施例8中rlz-8入胞后不與溶酶體結(jié)合發(fā)生降解，而是始終與晚期內(nèi)吞體發(fā)生融合的結(jié)果進行分析，rlz-8內(nèi)化入胞時形成巨胞飲體的細胞膜會隨rlz-8一起入胞，而由于未被溶酶體降解，該部分細胞膜將不會被重新降解循環(huán)回細胞膜表面又由于rlz-8的持續(xù)高強度內(nèi)化，更多的細胞膜會被不停地帶入胞內(nèi)，從而引起細胞膜的大量占用，細胞會因此發(fā)生皺縮，進而崩解死亡。若確實是這一作用機制，當rlz-8進入停止后，細胞應不會繼續(xù)皺縮死亡。由圖17所示，一旦rlz-8被撤走，其內(nèi)化行為停止，細胞不但不會繼續(xù)發(fā)生死亡，反而會重新貼壁生長，恢復正常狀態(tài)。綜上，rlz-8對細胞的殺傷機制為通過與細胞膜上egfr結(jié)合，發(fā)生高強度的巨胞飲內(nèi)化入胞，并滯留在晚期內(nèi)吞體中，不與溶酶體發(fā)生融合，從而引起大量的細胞膜占用，導致細胞發(fā)生皺縮、變圓，最終崩解死亡。實施例8靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對人肝癌細胞原位移植瘤模型小鼠的影響1、實驗方法①實驗材料與試劑選用6-8周齡的nog小鼠，體重18-22g，購自于北京維通利華，在東北師范大學spf級條件下飼養(yǎng)，實驗期間控制溫度在（20±2）℃，濕度48%，12小時交替照明。人肝癌hepg2細胞株，dmem培養(yǎng)基，胎牛血清，pbs，胰酶-edta，dmso，0.05%胰蛋白酶，rlz-8，rlz-8突變體，陽性對照藥為索拉菲尼。②儀器設(shè)備與器具二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，全自動細胞計數(shù)分析儀，臺式離心機，電子天平，微量移液器，培養(yǎng)瓶，移液管、固定架，注射器，剪刀，鑷子等。③實驗步驟人肝癌細胞hepg2細胞選用含10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)基，置于37℃、5%co2恒溫箱中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的hepg2細胞經(jīng)胰酶消化，以無血清dmem培養(yǎng)液洗滌，調(diào)整活細胞濃度為1×108個/ml，取20μl細胞懸液（dmem培養(yǎng)基：matrigel=1：1）接種于nog小鼠肝臟原位，建立nog小鼠hepg2肝癌細胞原位移植瘤模型。2周后，將模型小鼠隨機分組，每組10只。給藥方式為尾靜脈注射，每天一次，連續(xù)注射28天（qd×28,i.v.），陰性對照組注射生理鹽水，rlz-8和其突變體按照0.5mg/kg的劑量給藥，索拉菲尼對照組按照50mg/kg劑量給藥。對實驗中途死亡小鼠，在死亡當天稱量體重并取出腫瘤組織稱重；對給藥28天后依然存活的小鼠，經(jīng)脫頸處死小鼠取出腫瘤組織并稱重。詳細記錄各個實驗組中小鼠的死亡時間和死亡數(shù)量，分析實驗組和對照組的小鼠生存情況計算存活率，存活率=（小鼠總數(shù)-死亡小鼠數(shù)量）/小鼠總數(shù)。2、實驗結(jié)果①靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對小鼠體重影響分析小鼠經(jīng)尾靜脈注射連續(xù)給藥28天，陰性對照組與索拉菲尼對照組小鼠體重明顯降低，rlz-8對照組小鼠體重無明顯變化；rlz-8突變體中，rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）組小鼠體重較實驗前出現(xiàn)顯著降低，rlz-8（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）組小鼠體重較實驗前略有增加。以上結(jié)果表明，rlz-8和其突變體能調(diào)節(jié)小鼠的身體狀態(tài)。而兩個突變體（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）與索拉菲尼的聯(lián)用同樣顯示出較好的效果。表格1靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對hepg2肝癌移植瘤模型小鼠體重的影響②靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對小鼠腫瘤重量的影響瘤體重量方面：剝離下來的瘤體稱重后，每個組計算瘤體重的平均數(shù)，可以看出給藥28天后，rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）組與陰性對照組相比，腫瘤質(zhì)量差異不顯著，幾乎無抑瘤效果；rlz-8（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）組較rlz-8對照組抑瘤效果顯著增強，其余突變體抑瘤效果接近或略好于rlz-8對照組。以上結(jié)果表明：k16/s18/k41/d45為影響rlz-8抗腫瘤活性的關(guān)鍵氨基酸，在rlz-8結(jié)構(gòu)上與此區(qū)域臨近的正電勢增強突變或周圍負電勢的減弱表現(xiàn)出了更好的抗腫瘤效果。而兩個突變體（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）與索拉菲尼的聯(lián)用同樣顯示出較好的效果。表格2靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對hepg2肝癌移植瘤小鼠腫瘤重量的影響③靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對小鼠存活率的影響實驗結(jié)果表明，rlz-8抗腫瘤活性結(jié)構(gòu)域附近的正電勢增強突變體，如rlz-8（d70k）、rlz-8（l17k/d70k）等對于延長小鼠存活時間能夠起到一定作用。表格3靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對hepg2肝癌移植瘤小鼠存活率的影響綜上所述，rlz-8抗腫瘤活性結(jié)構(gòu)域附近的正電勢增強突變體，如rlz-8（d70k）、rlz-8（l17k/d70k）等，對人肝癌細胞原位移植瘤模型小鼠表現(xiàn)出了相對于rlz-8更加良好的抗腫瘤活性，并且對于延長荷瘤小鼠存活時間能夠起到一定作用。而突變體與索拉菲尼的聯(lián)用同樣顯示出較好的效果。實施例9靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對人肺癌細胞原位移植瘤模型小鼠的影響1、實驗方法①實驗材料與試劑人肺癌a549細胞株，選用6-8周齡的nog小鼠，體重18-22g，購自于北京維通利華，在東北師范大學spf級條件下飼養(yǎng)，實驗期間控制溫度在（20±2）℃，濕度48%，12小時交替照明。dmem培養(yǎng)基，胎牛血清，pbs，胰酶-edta，dmso，0.05%胰蛋白酶，rlz-8，rlz-8突變體。②儀器設(shè)備與器具二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，全自動細胞計數(shù)分析儀，臺式離心機，電子天平，微量移液器，培養(yǎng)瓶，移液管、固定架，注射器，剪刀，鑷子等。③實驗分組及給藥方式人肺癌a549細胞選用含10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)基，置于37℃、co2恒溫箱中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的a549細胞經(jīng)胰酶消化，以無血清dmem培養(yǎng)液洗滌，調(diào)整活細胞濃度為1×108個/ml，取20μl細胞懸液接種于nog小鼠肺原位，2周后，建立nog小鼠a549肺癌細胞原位移植瘤模型。2、實驗結(jié)果①靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對小鼠體重影響分析靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白和其突變體能調(diào)節(jié)a549肺癌移植瘤模型小鼠的身體狀態(tài)，其中rlz-8抗腫瘤活性結(jié)構(gòu)域附近的正電勢增強突變體對小鼠體重的增加具有一定的正向調(diào)節(jié)作用。表格4靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對a549癌移植瘤模型小鼠體重的影響②靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對小鼠腫瘤重量的影響可以看出給藥28天后，rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）組與陰性對照組相比，腫瘤質(zhì)量差異不顯著，幾乎無抑瘤效果；rlz-8（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）等突變體組較rlz-8對照組抑瘤效果顯著增強，其余突變體抑瘤效果接近或略好于rlz-8對照組。表格5靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對a549肺癌移植瘤小鼠腫瘤重量的影響③靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對小鼠存活率的影響rlz-8抗腫瘤活性結(jié)構(gòu)域附近的正電勢增強突變體，如rlz-8（d70k）、rlz-8（l17k/d70k）等相對于rlz-8可顯著延長a549肺癌移植瘤小鼠的存活時間。表格6靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對a549肺癌移植瘤小鼠存活率的影響實驗組實驗后小鼠存活率（%）陰性對照組20rlz-8對照組50rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）10rlz-8（k16a/k41a）20rlz-8（d45a）30rlz-8（s18a）30rlz-8（r9a）50rlz-8（d70k）80rlz-8（l17k/d70k）80rlz-8（d20h/d68k）70rlz-8（d20h）70rlz-8（l17k）70rlz-8（k41d/k46e/k74e）40rlz-8（k46e/k74e）50rlz-8（k46e）40實施例10靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對人乳腺癌細胞原位移植瘤模型小鼠的影響1、實驗方法①實驗材料與試劑人乳腺癌mcf7細胞株，17β雌二醇緩釋片，balb/c雌性裸鼠，dmem培養(yǎng)基，胎牛血清，pbs，胰酶-edta，dmso，0.05%胰蛋白酶，rlz-8，rlz-8突變體。②儀器設(shè)備與器具二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，全自動細胞計數(shù)分析儀，臺式離心機，電子天平，微量移液器，培養(yǎng)瓶，移液管、固定架，注射器剪刀，鑷子等。③實驗分組及給藥方式人乳腺癌mcf7細胞選用含10%胎牛血清的dmem培養(yǎng)基，置于37℃、co2恒溫箱中培養(yǎng)。實驗前1天在balb/c裸鼠頸部皮下埋植0.5mg17β雌二醇緩釋片。將處于對數(shù)生長期的mcf7細胞經(jīng)胰酶消化，以無血清dmem培養(yǎng)液洗滌，將5×106個mcf7細胞接種于balb/c裸鼠左側(cè)第二乳房墊內(nèi)，建立balb/c裸鼠mcf7乳腺癌細胞原位移植瘤模型。2、實驗結(jié)果給藥28天后，rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）組與陰性對照組相比，腫瘤質(zhì)量差異不顯著，幾乎無抑瘤效果；rlz-8（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）組較rlz-8對照組抑瘤效果顯著增強。表格7靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對mcf7乳腺癌移植瘤小鼠腫瘤重量的影響實驗組實驗后小鼠腫瘤質(zhì)量（g）陰性對照組1.03±0.24rlz-8對照組0.74±0.35rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）1.02±0.33rlz-8（k16a/k41a）1.12±0.37rlz-8（d45a）1.08±0.28rlz-8（s18a）1.04±0.30rlz-8（r9a）0.79±0.31rlz-8（d70k）0.52±0.28rlz-8（l17k/d70k）0.49±0.26rlz-8（d20h/d68k）0.60±0.27rlz-8（d20h）0.61±0.22rlz-8（l17k）0.63±0.31rlz-8（k41d/k46e/k74e）1.10±0.42rlz-8（k46e/k74e）0.73±0.24rlz-8（k46e）0.75±0.32實施例11靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對人結(jié)腸癌細胞移植瘤模型小鼠的影響1、實驗方法①實驗材料與試劑人結(jié)腸癌sw480細胞株，balb/c雄性裸鼠，rpmi1640培養(yǎng)基，dmem培養(yǎng)基，胎牛血清，pbs，胰酶-edta，dmso，0.05%胰蛋白酶，rlz-8，rlz-8突變體。②儀器設(shè)備與器具二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱，全自動細胞計數(shù)分析儀，臺式離心機，電子天平，微量移液器，培養(yǎng)瓶，移液管、固定架，注射器，剪刀，鑷子等。③實驗分組及給藥方式人結(jié)腸癌sw480細胞選用含10%胎牛血清的rpmi1640培養(yǎng)基，置于37℃、co2恒溫箱中培養(yǎng)。將處于對數(shù)生長期的細胞經(jīng)胰酶消化，以無血清rpmi1640培養(yǎng)液洗滌，將2×106個細胞接種于balb/c裸鼠背部皮下，待觀察瘤塊成型，直徑大于0.5cm時，隨機分組，建立人結(jié)腸癌sw480細胞移植瘤balb/c裸鼠模型。2、實驗結(jié)果給藥28天后，rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）、rlz-8（k16a/k41a）、rlz-8（d45a）和rlz-8（s18a）組與陰性對照組相比，腫瘤質(zhì)量差異不顯著，幾乎無抑瘤效果；rlz-8（d70k）和rlz-8（l17k/d70k）組較rlz-8對照組抑瘤效果顯著增強。表格8靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白突變體對sw480結(jié)腸癌移植瘤小鼠腫瘤重量的影響實驗組實驗后小鼠腫瘤質(zhì)量（g）陰性對照組3.13±0.64rlz-8對照組1.94±0.43rlz-8（k16a/s18a/k41a/d45a）3.12±0.54rlz-8（k16a/k41a）3.12±0.47rlz-8（d45a）3.26±0.56rlz-8（s18a）3.01±0.39rlz-8（r9a）1.89±0.37rlz-8（d70k）1.22±0.29rlz-8（l17k/d70k）1.09±0.33rlz-8（d20h/d68k）1.60±0.29rlz-8（d20h）1.54±0.45rlz-8（l17k）1.62±0.41rlz-8（k41d/k46e/k74e）3.10±0.48rlz-8（k46e/k74e）2.23±0.54rlz-8（k46e）2.15±0.62實施例12親和力測定實驗1.實驗方法選用biacoret200儀器（ge公司），通過表面等離子共振技術(shù)，對rlz-8及其突變體對egfr胞外結(jié)構(gòu)域的親和力測試。采用cm5芯片作為親和力測定芯片。①偶聯(lián)ph篩選以egfr胞外結(jié)構(gòu)域（氨基酸序列25~645）作為配體偶聯(lián)，將1mgegfr凍干粉用hepes緩沖液溶液稀釋為濃度400μg/ml待用。準備三個1.5mlep管，分別取10μl配體，加入90μl不同ph(ph4.5,5.0,5.5)的10mm醋酸鈉,充分混勻，配體最終濃度為40μg/ml。另取1個1.5mlep管，加入200μl50mm醋酸鈉。結(jié)果顯示選擇ph5.0的條件進行配體偶聯(lián)。②偶聯(lián)配體配體分子量是70kda，分析物分子量（rlz-8為12.4kda），每個rlz-8抗體理論上可以結(jié)合1個egfr，因此化學計量比sm等于1.通過下面的公式進行配體偶聯(lián)量rl的計算。即通過實驗經(jīng)驗摸索，設(shè)定最佳試劑偶聯(lián)量為3*rl，因此偶聯(lián)量設(shè)定為1700ru。egfr胞外結(jié)構(gòu)域成功偶聯(lián)在cm5芯片上。③待檢測樣品的準備在親和力測試中，為了排除不同濃度對親和力的影響，每個rlz-8或者其突變體選用8個濃度進行測試，其中7濃度為梯度濃度，第8個濃度為測試參比濃度，具體濃度如下述表格9所示。表格9待檢測樣品的梯度濃度樣品編號樣品濃度c1256nmc2128nmc364nmc432nmc516nmc68nmc74nmc8(對照)128nm2.實驗結(jié)果經(jīng)過對結(jié)果曲線進行擬合和計算后，所測試rlz-8及其突變體的親和力結(jié)果如下表10。表格10靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的親和力共對12種突變體進行親和力測定，結(jié)果顯示對于關(guān)鍵的抗腫瘤結(jié)合區(qū)域進行的丙氨酸隱性突變體（rlz-8(k16a/s18a/k41a/d45a)、rlz-8(k16a/k41a)、rlz-8(d45a)、rlz-8(s18a)），親和力下降明顯，下降了兩到三個數(shù)量級。而通過對蛋白質(zhì)表面電勢的計算，選擇幾個代表性的突變位置（如第70位、20位等），對極大可能增強表面正電勢的氨基酸進行的突變，結(jié)果顯示突變體rlz-8(d70k)、rlz-8(l17k/d70k)、rlz-8(d20h/e68k)的親和力分別提高了2.3倍、6倍和1.4倍。實施例13靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的凍干粉劑型1.實驗方法選用美國virtiswizard2.0凍干機對rlz-8及其突變體的凍干處方、凍干工藝進行摸索和確定。①靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的凍干處方通過單因素實驗的考察，對影響凍干處方劑型的穩(wěn)定劑、表面活性劑進行考察，確定添加不同的輔料對于蛋白質(zhì)含量、純度、不溶性微粒和活性的影響。其中主要活性物質(zhì)與穩(wěn)定劑采用質(zhì)量比1：5，主要活性物質(zhì)與穩(wěn)定劑采用質(zhì)量比20：1。通過處方組合后進行的篩選，確定最佳的凍干處方。基礎(chǔ)處方設(shè)計如下表。表格11靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的處方設(shè)計處方編號海藻糖（mg）甘露醇（mg）乳糖（mg）吐溫80（mg）泊洛沙姆188（mg）rlz8（mg）150501025050103505010450500.510550500.510650500.510750500.510850500.510950500.510②靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的凍干工藝通過對凍干過程中生化干燥溫度選取-23℃、-25℃、-27℃、-29℃、-31℃、-33℃六個水平，真空度選取100mtorr、150mtorr、200mtorr、250mtorr、300mtorr、350mtorr六個水平，凍干時間選取50h、60h、70h、80h、90h、100h六個水平，以性狀為考察指標分別進行單因素實驗。解析干燥溫度選取25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃六個水平，干燥時間選取15h、20h、25h、30h、35h、40h六個水平，真空度選取100mtorr、150mtorr、200mtorr、250mtorr、300mtorr、350mtorr六個水平，以水分為考察指標分別進行單因素實驗。2.實驗結(jié)果①rlz-8及其突變體的凍干處方根據(jù)表13的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，在高溫條件下，各個穩(wěn)定劑對rlz8的影響，10天與0天對比各指標降幅較小，均可應用于處方篩選的后續(xù)工作中。表格12穩(wěn)定劑對靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的影響根據(jù)表13的數(shù)據(jù)結(jié)果顯示，在高溫條件下，各個表面活性劑對靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的影響，10天與0天對比各指標降幅較小，可應用于處方篩選的后續(xù)工作中。表格13表面活性劑對靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的影響處方組合篩選實驗結(jié)果見表14，數(shù)據(jù)表明，處方3、6、9在放樣過程中各個數(shù)據(jù)指標變化較大，1、2與4、5、7、8相比不溶性微粒量及變化量無明顯差別，處方4、5、7、8中含有表面活性劑，可能會對后續(xù)毒性實驗差生影響。處方1、2均可用作備用處方，但由于處方2中注射級乳糖來源較為困難，因此選用處方1作為凍干處方。表格14靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的凍干處方篩選結(jié)果②靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白及其突變體的凍干工藝經(jīng)過凍干條件摸索后，確定最佳凍干工藝為升華干燥條件確定為溫度-30℃，真空度300mtorr，干燥時間90h，解析干燥溫度40℃，真空度250mtorr，干燥時間30h。圖18為凍干曲線，在此條件下的凍干樣品性狀水分均達到合格要求。靈芝免疫調(diào)節(jié)蛋白的突變體在相同凍干處方和凍干工藝條件上，同樣可以得到凍干性狀和水分合格的凍干粉。metseraspthralaleuilepheargleualatrpaspvallyslysleuserpheasptyrthrproasntrpglyargglyasnprpasnasnpheileaspthrvalthrpheprolysvalleuthrasplysalatyrthrtyrargvalalavalserglyargasnleuglyvallysprosertyralavalgluseraspglyserglnlysvalasnpheleuglutyrasnserglytyrglyilealaaspthrasnthrileglnvalphevalvalaspproaspthrasnasnasppheileilealaglntrpasn當前第1頁12