本發(fā)明涉及腫瘤的分子診斷領域，更具體地，本發(fā)明涉及骨髓瘤細胞中的分子標志物mk2基因及其在制備診斷多發(fā)性骨髓瘤的產品中的應用。

背景技術：

多發(fā)性骨髓瘤(multiplemyeloma，mm)是一種漿細胞惡性腫瘤，其特點是骨髓中漿細胞克隆性增殖，并分泌單克隆免疫球蛋白或輕鏈。由于異常漿細胞浸潤骨骼、骨髓和全身多個器官組織，引起病理性的骨骼破壞，患者的血清中出現(xiàn)異常的單克隆免疫球蛋白，從而抑制了機體的正常的多克隆免疫球蛋白，患者的尿內出現(xiàn)蛋白，患者最后表現(xiàn)出導致貧血、腎功能損害及病理性骨折等。mm是全世界發(fā)病率排名第二位的血液腫瘤，當前我國50歲以上的腫瘤病人中mm患者大約占據3％左右，隨著我國人口的老齡化，mm發(fā)病率以每年1％的速度上升。目前認為mm發(fā)生是一個逐步進展的過程，很多患者在早期發(fā)生意義不明的單克隆球蛋白癥，然后進展為mm，部分患者最終發(fā)展為髓外骨髓瘤(漿細胞白血病)，整個過程中患者骨髓漿細胞伴有多種基因的突變。

目前多發(fā)性骨髓瘤的診斷主要依靠骨髓克隆性漿細胞比例和(或)活組織病理學檢查作為mm診斷基礎。國際骨髓瘤工作組(imwg)于2014年修訂了意義未明的單克隆免疫球蛋白血癥(mgus)、mm診斷標準。mm診斷標準包括骨髓中克隆性漿細胞比例≥10％和/或活組織病理學檢查證實為漿細胞瘤；同時伴有以下一種或多種情況：高鈣血癥、腎功能不全、貧血和溶骨性骨損害。單克隆免疫球蛋白(m蛋白)是臨床常用的mm診斷標志物，但修訂后的診斷標準強調m蛋白不是診斷mm的必備條件，但可用來區(qū)別分泌型或非分泌型mm。此外，mri、低劑量全身ct、fdg/pet及pet/ct等現(xiàn)代影像學技術被納入檢查輔助方法。

目前多發(fā)性骨髓瘤診斷的方法復雜、檢查項目多，缺少一種可靠、方便的臨床診斷方法。近年來，本課題組基于基因芯片表達譜，發(fā)現(xiàn)在多發(fā)性骨髓瘤患者中，mk2基因的表達顯著增高，mk2基因的表達水平與與多發(fā)性骨髓瘤患者病理進程及耐藥性密切相關。表明mk2是一種高危的骨髓瘤基因，可為多發(fā)性骨髓瘤的臨床診斷提供可靠的判斷。

mk2(mitogen-activatedproteinkinase-activatedproteinkinase2，mapkapk2)是于1992年發(fā)現(xiàn)并被純化的第一個mapk激活蛋白激酶，主要被p38蛋白激酶直接磷酸化激活，是p38蛋白激酶的重要底物，在介導胞外信號引起的細胞增殖、分化、衰老、凋亡及炎癥等反應中起著重要作用。mk2為致癌基因，可通過磷酸化途徑直接活化多種腫瘤相關因子如細胞分裂周期蛋白25b/c和熱休克蛋白27等；其亦可通過轉錄后調控機制上調多個癌基因和促炎因子的表達，而促進腫瘤包括肺癌的發(fā)生發(fā)展；mk2過表達可活化lim激酶而激活vegf誘導的血管生成過程，從而促進腫瘤的侵襲和轉移。

技術實現(xiàn)要素：

解決的技術問題：本發(fā)明的目的在于提供一種分子標志物mk2基因及其在制備診斷多發(fā)性骨髓瘤的產品中的應用。

技術方案：分子標志物mk2基因，序列如seqidno.1所示。

分子標志物mk2蛋白，序列如seqidno.2所示。

分子標志物mk2基因在制備診斷多發(fā)性骨髓瘤的產品中的應用。

上述產品包括：通過rt-pcr、實時定量pcr、免疫組化、原位雜交、芯片或高通量測序平臺檢測mk2基因表達水平以診斷多發(fā)性骨髓瘤的產品。

上述用實時定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產品至少包括一對特異擴增mk2基因的引物；所述用免疫組化診斷多發(fā)性骨髓瘤的產品包括：與mk2蛋白特異性結合的抗體；所述用原位雜交診斷多發(fā)性骨髓瘤的產品包括：與mk2基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷多發(fā)性骨髓瘤的產品包括：蛋白芯片和基因芯片，其中蛋白芯片包括與mk2蛋白特異性結合的抗體，基因芯片包括與mk2基因的核酸序列雜交的探針。

上述用實時定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產品至少包括一對特異擴增mk2基因的引物，序列如：seqidno.3和seqidno.4所示。

一種用于診斷多發(fā)性骨髓瘤的工具，該工具能夠檢測樣本中mk2基因的表達。

上述工具包括芯片、試劑盒、試紙或高通量測序平臺。

上述芯片包括基因芯片或蛋白質芯片，所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測mk2基因轉錄水平的針對mk2基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質芯片包括固相載體以及固定在固相載體的mk2蛋白的特異性抗體；所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫組化試劑盒；所述基因檢測試劑盒包括用于檢測mk2基因轉錄水平的試劑；所述蛋白免疫組化試劑盒包括mk2蛋白的特異性抗體；所述試紙包括用于檢測mk2基因轉錄水平的試紙；所述高通量測序平臺包括用于檢測mk2基因轉錄水平的試劑。

上述檢測mk2基因轉錄水平的試劑包括針對mk2基因的引物和/或探針。

有益效果：本發(fā)明首次發(fā)現(xiàn)了mk2基因表達與多發(fā)性骨髓瘤相關。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種診斷多發(fā)性骨髓瘤的分子標志物mk2，使用該分子標志物可以在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生的早期即可作為判斷，或者判斷受試者是否存在患有多發(fā)性骨髓瘤的風險,提供了患者的生存率。本發(fā)明發(fā)現(xiàn)了一種新的生物標記物mk2基因，相比傳統(tǒng)的檢測手段，基因診斷不僅穩(wěn)定、方便，且靈敏、特異，從而及時控制多發(fā)性骨髓瘤的進程，降低死亡率。

附圖說明

圖1顯示利用基因芯片(geneexpressionprofiling,gep)檢測mk2基因在多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中的表達差異圖。分析22例正常骨髓(np)、44例意義未明的單克隆丙種球蛋白疾病(monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance，mgus，骨髓瘤前體疾病)以及351例初診mm患者樣本，mk2表達水平在mm患者樣本中顯著升高。

圖2顯示利用qpcr檢測mk2基因在多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中的表達差異圖。

圖3顯示利用免疫組化(ihc)染色方法分析mk2在正常骨髓和mm患者骨髓樣本中表達情況圖，結果顯示mk2在mm患者樣本中表達顯著升高。

具體實施方式

下面結合附圖和實施例對本發(fā)明作進一步詳細的說明。以下實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。實施例中未注明具體條件的試驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克隆：實驗室手冊(newyork：coldspringharborlaboratorypress，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明提供了檢測mk2基因表達的產品在制備診斷多發(fā)性骨髓瘤的工具中的應用。

進一步，上面所提到的檢測mk2基因表達的產品包括：通過實時定量pcr、免疫檢測、原位雜交、芯片或高通量測序平臺等檢測mk2基因表達水平以診斷多發(fā)性骨髓瘤的產品。

進一步，所述用實時定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產品至少包括一對特異擴增mk2基因的引物；所述用免疫檢測診斷多發(fā)性骨髓瘤的產品包括：與mk2蛋白特異性結合的抗體；所述用原位雜交診斷多發(fā)性骨髓瘤的產品包括：與mk2基因的核酸序列雜交的探針；所述用芯片診斷多發(fā)性骨髓瘤的產品包括：蛋白芯片和基因芯片；其中，蛋白芯片包括與mk2蛋白特異性結合的抗體，基因芯片包括與mk2基因的核酸序列雜交的探針。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述用實時定量pcr診斷多發(fā)性骨髓瘤的產品至少包括一對特異擴增mk2基因的引物的序列如：seqidno.3和seqidno.4所示。

優(yōu)選地，所述診斷工具包括芯片、試劑盒、試紙或高通量測序平臺。其中，高通量測序平臺是一種特殊的診斷工具，檢測mk2基因表達的產品可以應用于該平臺實現(xiàn)對mk2基因的表達情況的檢測。隨著高通量測序技術的發(fā)展，對一個人的基因表達譜的構建將成為十分便捷的工作。通過對比疾病患者和正常人群的基因表達譜，容易分析出哪個基因的異常與疾病相關。因此，在高通量測序中獲知mk2基因的異常與多發(fā)性骨髓瘤相關也屬于mk2基因的用途，同樣在本發(fā)明的保護范圍之內。

本發(fā)明還提供了一種多發(fā)性骨髓瘤的工具，所述產品包括芯片、試劑盒、試紙、或高通量測序平臺。

其中，所述芯片包括基因芯片、蛋白質芯片；所述基因芯片包括固相載體以及固定在固相載體的寡核苷酸探針，所述寡核苷酸探針包括用于檢測mk2基因轉錄水平的針對mk2基因的寡核苷酸探針；所述蛋白質芯片包括固相載體以及固定在固相載體的mk2蛋白的特異性抗體；所述基因芯片可用于檢測包括mk2基因在內的多個基因(例如，與多發(fā)性骨髓瘤相關的多個基因)的表達水平。所述蛋白質芯片可用于檢測包括mk2蛋白在內的多個蛋白質(例如與多發(fā)性骨髓瘤相關的多個蛋白質)的表達水平。通過將多個與多發(fā)性骨髓瘤相關的標志物同時檢測，可大大提高多發(fā)性骨髓瘤診斷的準確率。

其中，所述試劑盒包括基因檢測試劑盒和蛋白免疫檢測試劑盒；所述基因檢測試劑盒包括用于檢測mk2基因轉錄水平的試劑；所述蛋白免疫檢測試劑盒包括mk2蛋白的特異性抗體。進一步，所述試劑包括使用實時定量pcr、免疫檢測、原位雜交或芯片方法檢測mk2基因表達水平過程中所需的試劑。優(yōu)選地，所述試劑包括針對mk2基因的引物和/或探針。根據基因的核苷酸序列信息容易設計出可以用于檢測mk2基因表達水平的引物和探針。

所述高通量測序平臺包括檢測mk2基因表達水平的試劑。

所述試紙包括試紙載體和固定在試紙載體上的寡核苷酸，所述寡核苷酸能夠檢測mk2基因的轉錄水平。

與mk2基因的核酸序列雜交的探針可以是dna、rna、dna-rna嵌合體、pna或其他衍生物。所述探針的長度沒有限制，只要完成特異性雜交、與目的核苷酸序列特異性結合，任何長度都可以。所述探針的長度可短至25、20、15、13或10個堿基長度。同樣，所述探針的長度可長至60、80、100、150、300個堿基對或更長，甚至整個基因。由于不同的探針長度對雜交效率、信號特異性有不同的影響，所述探針的長度通常至少是14個堿基對，最長一般不超過30個堿基對，與目的核苷酸序列互補的長度以15-25個堿基對最佳。所述探針自身互補序列最好少于4堿基對，以免影響雜交效率。

進一步，所述mk2蛋白的特異性抗體包括單克隆抗體、多克隆抗體。所述mk2蛋白的特異性抗體包括完整的抗體分子、抗體的任何片段或修飾(例如：嵌合抗體，scfv、fab、f(ab’)2、fv等)。只要所述片段能夠保留與mk2蛋白的結合能力即可。用于蛋白質水平的抗體的制備時本領域技術人員公知的，并且本發(fā)明可以使用任何方法來制備所述抗體。

本發(fā)明的具體實施方案中，所述針對mk2基因的引物序列如下：正向引物序列如seqidno.3所示，反向引物序列如seqidno.4所示。

用于診斷多發(fā)性骨髓瘤的mk2基因及其表達產物的來源包括但不限于骨髓、血液、組織液、尿液、唾液等可以獲得基因組dna的體液。在本發(fā)明的具體實施方案中，用于診斷多發(fā)性骨髓瘤的mk2基因及其表達產物的來源是骨髓。

本發(fā)明的上下文中，“mk2基因”包括mk2基因以及mk2基因的任何功能等同物的多核苷酸。mk2基因包括與目前國際公共核酸序列genebank中mk2基因(nc_000001.11)dna序列具有70％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的dna序列；

優(yōu)選地，mk2基因的編碼序列包括以下任意一種：

(1)序列表中seqidno.1所示的dna序列；

(2)在嚴格條件下與(1)限定的dna序列雜交且編碼相同蛋白質的dna序列；

(3)與(1)或(2)限定的dna序列具有70％、優(yōu)選地，90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質的dna分子。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述mk2基因的編碼序列是seqidno.1所示的dna序列。

在本發(fā)明的上下文中，mk2基因表達產物包括mk2蛋白以及mk2蛋白的部分肽。所述mk2蛋白的部分肽含有與多發(fā)性骨髓瘤相關的功能域。

“mk2蛋白”包括mk2蛋白以及mk2蛋白的任何功能等同物。所述功能等同物包括mk2蛋白保守性變異蛋白質、或其活性片段，或其活性衍生物，等位變異體、天然突變體、誘導突變體、在高或低的嚴謹條件下能與mk2的dna雜交的dna所編碼的蛋白質。

優(yōu)選地，mk2蛋白是具有下列氨基酸序列的蛋白質：

(1)由序列表中seqidno.2所示的氨基酸序列組成的蛋白質；

(2)將seqidno.2所示的氨基酸序列經過一個或幾個氨基酸殘基的取代和/或缺失和/或添加且與seqidno.2所示的氨基酸序列具有相同功能的由seqidno.2所示的氨基酸序列衍生物的蛋白質。取代、缺失或者添加的氨基酸的個數通常為1-50個，較佳地1-20個，最佳地1-10個。

(3)與seqidno.2所示的氨基酸序列至少具有80％同源性(又稱為序列統(tǒng)一性)，更優(yōu)選地，與seqidno.2所示的氨基酸序列至少約90％至95％的同源性，常為96％、97％、98％、99％同源性的氨基酸序列構成的多肽。

在本發(fā)明的具體實施方案中，所述mk2蛋白是具有seqidno.2所示的氨基酸序列的蛋白質。

通常，已知的是，一個蛋白質中一個或多個氨基酸的修飾不會影響蛋白質的功能。本領域技術人員會認可改變單個氨基酸或小百分比的氨基酸或對氨基酸序列的個別添加、缺失、插入、替換是保守修飾，其中蛋白質的改變產生具有相似功能的蛋白質。提供功能相似的氨基酸的保守替換表是本領域公知的。

通過添加一個氨基酸或多個氨基酸殘基修飾的蛋白質的例子是mk2蛋白的融合蛋白。對于與mk2蛋白融合的肽或者蛋白質沒有限制，只要所得的融合蛋白保留mk2蛋白的生物活性即可。

本發(fā)明的mk2蛋白也包括對seqidno.2所示的氨基酸序列的非保守修飾，只要經過修飾的蛋白質仍然能夠保留mk2蛋白的生物學活性即可。在此類修飾蛋白質中突變的氨基酸數目通常是10個或者更少，例如6個或者更少，例如3個或者更少。

在本發(fā)明的上下文中，“多發(fā)性骨髓瘤”既包括判斷受試者是否已經患有多發(fā)性骨髓瘤、也包括受試者是否存在患有多發(fā)性骨髓瘤的風險。

實施例1篩選多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中差異表達的基因

1、研究對象：

收集多發(fā)性骨髓瘤患者8例，正常人8例

多發(fā)性骨髓瘤患者的納入標準：所有多發(fā)性骨髓瘤的診斷根據who診斷多發(fā)性骨髓瘤標準，所有初治多發(fā)性骨髓瘤患者骨髓單個核細胞標本獲得病人的知情同意。

多發(fā)性骨髓瘤患者的排除標準：轉移癌，反應性漿細胞增多癥和未定性的單克隆免疫球蛋白病。

2、骨髓中總rna的提取

(1)骨髓單個核細胞的分離：向收集到的骨髓標本中加入3倍體積的紅細胞裂解液，用滴管反復吹打混勻后于冰上放置10～15min，使骨髓標本中的紅細胞充分裂解；1200rpm/min離心5min，棄上清，pbs洗滌細胞1次。棄上清，加入1mlpbs吹打混勻后轉移至1.5mlep管中，1200rpm/min離心5min，棄上清。每個樣本加1mltrizol，吹打混勻。

(2)每1mltrizol加入氯仿200μl，充分混勻劇烈震蕩15秒，室溫靜置10min等待分層。

(3)于4℃12000rpm/min離心15min。離心后可見管中混合物液面分為3層，最上層為無色水相，含有rna；中間層為白色絮狀，含有蛋白層與dna；最下層為紅色的酚-氯仿有機相。

取上層水相約400μl至另一ep管中，注意避免吸入中間的蛋白層，每管加入等體積異丙醇，輕輕上下顛倒混勻，室溫靜置10min，于4℃12000rpm/min離心10min，可見管底白色沉淀。

棄上清，加入-20℃預冷的75％depc酒精1ml，懸起沉淀，4℃7500rpm/min離心5min。

棄上清，室溫放置10-20min風干沉淀，依據沉淀量的多少酌情加入depc水溶解沉淀。-80℃冰箱保存。

3、rna樣品的質量分析

紫外分光光度計檢測rna樣品，od260/od280為1.8-2.0。

4、基因芯片雜交及掃描

采用affymetrixu133plus2.0microarrays檢測rna水平。多發(fā)性骨髓瘤患者組的數據可在nih基因表達綜合(geo)下gse2658檢索號查得，正常組和未定性的單克隆免疫球蛋白病的基因芯片數據在gse5900下。

5、芯片數據處理與分析

基因芯片的數據分析基于gco1.1軟件(affymetrix)，包含對與疾病相關相關的生存的單變量的對數等級檢測。對于兩組比值的自然對數絕對值大于2.0或小于0.5的基因作為差異表達基因。

6、統(tǒng)計學處理

采用spss13.0統(tǒng)計軟件進行數據分析，組間差異比較采用單因素方差分析法，p＜0.05有顯著意義。

7、結果

結果顯示(如圖1所示，分析22例正常骨髓，44例意義未明的單克隆丙種球蛋白疾病(monoclonalgammopathyofundeterminedsignificance，mgus，mm前體疾病)，351例mm初診病人漿細胞基因芯片數據庫，發(fā)現(xiàn)mk2基因的表達水平在mm患者中要明顯高于正常以及mgus樣本)，與正常人相比，多發(fā)性骨髓瘤患者mk2基因的mrna水平顯著升高，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)。

實施例2qpcr實驗驗證多發(fā)性骨髓瘤患者和正常人中差異表達的基因

1、研究對象

篩選標準同實施例1，多發(fā)性骨髓瘤患者46例，正常人66例。

2、骨髓中總rna的提取

步驟同實施例1。

3、逆轉錄

根據takara逆轉錄試劑盒進行rna逆轉錄。采用10μl反應體系，分別加入5×primescriptrtmastermix2μl，總rna0.5μg，加一定量rnasefreewater至10μl。37℃反應15min，85℃反應5s。產物cdna置-20℃冰箱保存。

4、qpcr

采用10μl反應體系，每個樣本設置3個復孔，加樣過程避光。配制以下反應體系：2×sybgreenmastermix5μl，正向引物0.5μl，反向引物(5pm)0.5μl，反向引物(5pm)0.5μl，模板cdna1μl，ddh2o3μl。擴增mk2基因的正向引物序列為5’-tggggcgttaactgcatctgg-3’(seqidno.3)，反向引物序列為5’-tgggcctgctgttcacagtt-3’(seqidno.4)；擴增gapdh基因的正向引物序列為5’-gcaccgtcaaggctgagaac-3’(seqidno.5)，反向引物序列為5’-tggtgaagacgccagtgga-3’(seqidno.6)，各項操作均于冰上進行。擴增程序為：95℃1min，95℃15s，60℃15s，72℃30s；共40個循環(huán)。以sybrgreen作為熒光標記物，在lightcycler熒光實時定量pcr儀上進行反應，通過融解曲線分析和電泳確定目的條帶，△△ct法進行相對定量。

5、統(tǒng)計學方法

結果數據都是以平均值±標準差的方式來表示，采用spss13.0統(tǒng)計軟件來進行統(tǒng)計分析，兩者之間差異采用t檢驗，認為當p＜0.05時具有統(tǒng)計學意義。

6、結果

結果如圖2所示，與正常人相比，多發(fā)性骨髓瘤患者的mk2基因的mrna水平顯著增高，差異具有統(tǒng)計學意義(p＜0.05)，結果同基因芯片實驗。

上述實施例為本發(fā)明較佳的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受上述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

sequencelisting

<110>南京中醫(yī)藥大學

<120>分子標志物mk2基因及其應用

<130>

<160>6

<170>patentinversion3.3

<210>1

<211>49266

<212>dna

<213>人源

<400>1

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