本發(fā)明屬生物醫(yī)藥領(lǐng)域，涉及藥物安全的評價技術(shù)，具體涉及一種體外藥物代謝及相關(guān)毒性的評價研究方法。
背景技術(shù)：
藥物代謝及其相互作用的評價研究是在研究中的新藥（nce）安全評價的重要內(nèi)容之一。根據(jù)中華人民共和國國家食品藥品監(jiān)督管理總局（cfda）“藥物非臨床藥代動力學研究技術(shù)指導原則”（2014）：“非臨床藥代動力學研究是通過體外和動物體內(nèi)的研究方法，揭示藥物在體內(nèi)的動態(tài)變化規(guī)律，獲得藥物的基本藥代動力學參數(shù)，闡明藥物的吸收、分布、代謝和排泄（absorption,distribution,metabolism,excretion,簡稱adme）的過程和特征?！薄?/p>
cfda的該指導原則著重指出：“在藥效學和毒理學評價中，藥代動力學特征可進一步深入闡明藥物作用機制，同時也是藥效和毒理研究動物選擇的依據(jù)之一；藥物或活性代謝產(chǎn)物濃度數(shù)據(jù)及其相關(guān)藥代動力學參數(shù)是產(chǎn)生、決定或闡明藥效或毒性大小的基礎(chǔ)，可提供藥物對靶器官效應(yīng)（藥效或毒性）的依據(jù)?！?/p>
因此，nce是不是被代謝？代謝產(chǎn)物是什么？它們有沒有毒性？是nce安全評價必須要回答的問題。
目前回答這些關(guān)鍵問題的常規(guī)評價技術(shù)路線是：
1.藥物的代謝穩(wěn)定性評價（metabolicstabilityassay）：研究評價nce是否被藥物代謝酶所代謝？
2.藥物代謝產(chǎn)物的鑒定（metaboliteidentification）：如果被代謝，它的代謝產(chǎn)物是什么？
3.藥物代謝產(chǎn)物的毒性評價。
上述常規(guī)方法的挑戰(zhàn)是：上述的3個評價路線獨立進行，因此需要大量的時間和成本。特別是在進行代謝產(chǎn)物鑒定和毒性評價的試驗中，用于體代謝產(chǎn)物的合成和提取的時間和成本非常大，在若干情況下，代謝產(chǎn)物合成和提取都是不可能的，比如，有些有毒的中間代謝產(chǎn)物非常不穩(wěn)定。
上述挑戰(zhàn)的直接后果是，有關(guān)創(chuàng)新團隊在研發(fā)早期無法及時了解代謝產(chǎn)物的毒性特性，無法在早期進行分子改造和優(yōu)化，以避免不必要的失敗。
基于現(xiàn)有技術(shù)的現(xiàn)狀，本申請的發(fā)明人擬提供一種新的評價研究的技術(shù)路線，尤其是一種評價藥物代謝及相關(guān)毒性的方法。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)存在的缺陷，提供一種新的評價研究的技術(shù)路線，具體涉及一種評價藥物代謝及相關(guān)毒性的方法。本方法中將體外肝微粒代謝和體外細胞毒性實驗結(jié)合一起，不需要通過鑒定和合成代謝產(chǎn)物，就可以準確的評價藥物代謝后的毒性。本方法有利于節(jié)省人力物力并加速nce的創(chuàng)制進展。
本發(fā)明的一種評價藥物代謝及相關(guān)毒性的方法，其包括，調(diào)查藥物在人肝微粒體中的代謝情況，確定藥物是否被代謝；如果被代謝，則進一步進行細胞代謝毒性的評價。
具體的，本發(fā)明的一種評價藥物代謝及相關(guān)毒性的方法，其特征在于，其包括步驟，
1）藥物的代謝穩(wěn)定性評價（metabolicstabilityassay）：
研究評價nce是否被藥物代謝酶所代謝？
該評價所依據(jù)的原理為
a)測試系統(tǒng)：人或?qū)嶒瀯游锔挝⒘ｓw，肝微粒含有體內(nèi)最主要的藥物代謝酶-cyp450藥物氧化代謝酶系；
b)測試系統(tǒng)的輔酶：nadph；為cyp450的供氫體，其沒有nadph，cyp450沒有氧化代謝活性；
c)測試方法：將在nce與肝微粒體及cyp450輔酶ndaph一起在生理條件下孵育后，定量分析nce的母體濃度；
d)評價參數(shù)：在nce母體濃度在上述孵育后的下降程度；
如果nce的母體濃度在孵育后不顯著下降，表明nce進入人體后不被代謝；
如果nce的母體濃度在孵育后顯著下降，表明nce進入人體后被代謝。需要進一步鑒定代謝產(chǎn)物和評價其安全性；
評價的參數(shù)：半數(shù)下降時間（t1/2），即nce母體濃度下降50%所需的時間，因此t1/2越短提示nce越容易被代謝；
2)藥物代謝的毒性評價（drugmetabolismbasedcytotoxicity）：
評價研究nce在被藥物代謝酶代謝后產(chǎn)生的代謝（中間）產(chǎn)物是否對細胞有毒性，毒性是否發(fā)生改變？
e)測試系統(tǒng)：
體外藥物代謝系統(tǒng)：人肝微粒體及cyp450藥物代謝酶輔酶nadph（遵循美國usfda和中國cfda的指導原則）；
體外細胞毒性系統(tǒng)：小鼠3t3纖維母細胞（mouse3t3fibrolasts，3t3）;該系統(tǒng)沒有藥物代謝酶（遵循美國聯(lián)邦政府毒性評價體外替代方法協(xié)調(diào)委員
會iccvam的指導原則）；
f)測試方法按下表1所示，
表1
更具體的，本發(fā)明的一種評價藥物代謝及相關(guān)毒性的方法，其包括步驟：
1，確定待測物，
所述待測物選自新藥（包括中藥），化妝品，食品添加劑或環(huán)境化合物；
2，確定測試系統(tǒng)
所述測試系統(tǒng)包括體外藥物代謝系統(tǒng)和體外細胞毒性系統(tǒng)；
所述的體外藥物代謝系統(tǒng)選自人肝微粒體；本發(fā)明中根據(jù)國際醫(yī)學倫理原則和知情同意原則和本單位標準操作程序-肝微粒體的制備（sop-p-006）制備；本發(fā)明的肝微粒含藥物代謝i相酶、如cyp450，和藥物代謝ii相酶、如葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶ugt；不含有傳染性病毒如hiv、hbv、hcv；
所述的體外細胞毒性系統(tǒng)選自3t3小鼠成纖維細胞；所述3t3mousefibroblast購自中國科學院上海細胞生物研究所。
3，確定主要的溶劑/緩沖液/培養(yǎng)基
準備1l100mm磷酸緩沖液（napo4buffer）：稱取約11.93g無水na2hpo4和2.22g一水合nah2po4溶于1lmili-q水中，用磷酸調(diào)節(jié)ph至7.4，或者取22.6gna2hpo4?7h2o替代上述的11.93g無水na2hpo4；上述的試劑如有必要可以提前準備好或者預(yù)混合進行商業(yè)化出售；
i相藥物代謝酶cyp450的輔酶-nadph工作液（nadphsolution）：準備5mm新鮮配制的預(yù)溫的nadph：稱取83mgnadph溶入20ml37oc預(yù)溫的100mmnapo4buffer(ph7.4)；
肝微粒體工作液（livermicrosomesolution）：取0.78ml蛋白濃度為20mg/ml的肝微粒體加入24.22ml經(jīng)37oc預(yù)溫的100mmnapo4buffer(ph7.4)中，使蛋白終濃度為0.625mg/ml。
4，評價藥物代謝及相關(guān)毒性
3t3細胞培養(yǎng)：胰酶消化3t3細胞，調(diào)節(jié)培養(yǎng)基體積使細胞密度達到2.8×105個/1ml，按100μl/孔的量加入96孔板中，空白孔加入100μl/孔的pbs作為試劑對照組，37°c，5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時，棄去培養(yǎng)液，每孔各加入50μl含有5%新生牛血清的培養(yǎng)基，備用；
試驗給藥：
測試組：取25μl測試物溶液同200μl蛋白濃度為0.625mg/ml的肝微粒體溶液混合，37°c預(yù)孵育10分鐘，預(yù)孵育結(jié)束后，每個樣本中加入25μl5mmnadph溶液并混合以啟動反應(yīng)，37°c孵育60分鐘后離心取50μl上清加入到3t3細胞中；
空白對照組：50μl5%的新生牛血清加入到3t3細胞中；
陽性對照組：加入50μl2xcpa溶液（與測試組一樣經(jīng)微粒體代謝后的上清）到3t3細胞中，cpa終濃度為：1、5、10、50、100、1000μm.；
試劑對照組：加入50μl1%dmso溶液到3t3細胞中。dmso的終濃度為0.5%；
顯色反應(yīng)：置二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4小時，棄去培養(yǎng)液，每孔加入250μl的中性紅溶液，培養(yǎng)3小時；棄去中性紅溶液后，加入100μl的中性紅顯色液，振蕩半小時后于570nm的酶標儀中進行檢測，細胞活率越大顯色越深；
5按系數(shù)公式計算數(shù)據(jù)
相對活率（%）=（實驗組o.d.值-空白對照組o.d.值）/（試劑對照組o.d.值-空白對照組o.d.值）×l00%。
結(jié)果顯示，cpa經(jīng)小鼠肝微粒代謝后對3t3細胞有毒性；此結(jié)果與有關(guān)的文獻報道一致，證明本發(fā)明的評價藥物代謝及相關(guān)毒性的方法的可行性。
本發(fā)明的體外藥物代謝及相關(guān)毒性的評價研究方法其優(yōu)點有，
將體外肝微粒代謝和體外細胞毒性實驗結(jié)合，不需要通過鑒定或提取合成代謝產(chǎn)物，能準確評價藥物代謝后的毒性，本方法能明顯節(jié)省人力物力財力，可廣泛被運用到實際的代謝性毒性評價中，利于加速nce的創(chuàng)制進展。
具體實施方式
實施例1用本發(fā)明方法對環(huán)磷酰胺（cpa）進行代謝性毒性評價
將2xcpa的溶液加入到小鼠肝微粒體中，分成2組加減輔酶nadph，37°c孵育1小時后，離心取上清加入到已準備好的3t3細胞中，繼續(xù)孵育4小時后，去除培養(yǎng)液，加入中性紅進行顯色反應(yīng)；最后通過測570nm處的od值計算細胞的相對活率，判斷cpa及其代謝產(chǎn)物對3t3細胞是否具有毒性；
試驗結(jié)果顯示：在無輔酶啟動酶代謝反應(yīng)的測試組中，cpa母體本身對3t3細胞的活率沒有影響，說明對3t3細胞不具有毒性（如表2所示），然而，在經(jīng)輔酶啟動酶對其的代謝后，其代謝產(chǎn)物降低了3t3細胞的活率，說明對3t3細胞有毒性（如表3所示）；以上結(jié)果表明：cpa經(jīng)小鼠肝微粒代謝后的代謝產(chǎn)物對3t3細胞具有毒性，此結(jié)果與其他的文獻報道一致，證明本發(fā)明的技術(shù)方法的可行性。
表2.無輔酶nadph條件下（不啟動酶代謝），cpa對3t3細胞的毒性
表3加入輔酶nadph后（啟動酶代謝），cpa對3t3細胞的毒性
實施例2用本發(fā)明方法對他莫昔芬（tomaxifen；tox）進行代謝性毒性評價
將不同濃度的tox的溶液加入到肝微粒體中，分成2組加減輔酶nadph，37°c孵育1小時后，離心取上清加入到準備的3t3細胞中，繼續(xù)孵育4小時后，去除培養(yǎng)液，此后每孔加入15μl3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide（mtt），使最后濃度為5mg/ml；再培育3小時，每孔加入150μl二甲亞砜（dmso），置于水平振動儀，以每分鐘50次的水平搖動，在室溫下培養(yǎng)10分鐘，在570nm測光密度；
試驗結(jié)果顯示：在無輔酶啟動酶代謝反應(yīng)的測試組中（如表4所示），tom母體對3t3細胞的毒性明顯大于經(jīng)輔酶啟動酶對tom代謝后的測試組（如表5所示），以上結(jié)果表明：與實施例1中cpa的代謝增毒過程相反，tox經(jīng)肝微粒代謝后對3t3細胞的毒性減低，說明tox的代謝性質(zhì)為解毒；另外，結(jié)果證明了本發(fā)明的方法的可行性，且適用于mtt和中性紅染色。
表4無輔酶nadph條件下（不啟動酶代謝），tom對3t3細胞的毒性
表5加入輔酶nadph后（啟動酶代謝），tom對3t3細胞的毒性