本發(fā)明涉及殺蟲真菌細(xì)胞領(lǐng)域，具體說是一種大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法。

背景技術(shù)：
萊氏野村菌作為蟲生真菌成為生物防治領(lǐng)域理論研究和生產(chǎn)應(yīng)用的熱點(diǎn)，萊氏野村菌在固體培養(yǎng)基表面出現(xiàn)兩型生長現(xiàn)象，即由酵母型細(xì)胞狀態(tài)向菌絲生長狀態(tài)轉(zhuǎn)換，一方面，萊氏野村菌酵母型細(xì)胞類似蟲體內(nèi)的蟲菌體，在液體發(fā)酵中產(chǎn)生的芽生孢子生長迅速，適用于大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)；另一方面，在邵長文研究開發(fā)的ATMT系統(tǒng)中酵母型細(xì)胞作為受體細(xì)胞，因此無論是工業(yè)生產(chǎn)或?qū)嶒?yàn)室研究，都給萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的培養(yǎng)提出了現(xiàn)實(shí)需求。目前，萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的獲得方法有兩種：一是用接種器在固體培養(yǎng)基表面劃線制備，這種方法制備量小，對分生孢子的分散效果不佳，這是由于萊氏野村菌由酵母型細(xì)胞向菌絲型的轉(zhuǎn)換受群體密度和pH的影響，往往只能在劃線的末端區(qū)域會出現(xiàn)酵母型細(xì)胞菌落，并且隨著萊氏野村菌的生長，其代謝產(chǎn)物會導(dǎo)致培養(yǎng)基pH值下降，而培養(yǎng)基pH值的下降至6.5以下時(shí)，酵母型細(xì)胞向菌絲型生長轉(zhuǎn)換則越來越迅速，因此所得的酵母型細(xì)胞的純度不高，在顯微鏡視野內(nèi)有大量菌絲體，需要多次轉(zhuǎn)接純化才能得到高純度的酵母型細(xì)胞；第二種是采用制備分生孢子懸浮液的方法，這種方法雖然孢子的分散效果較好，但是很容易污染，并且酵母型菌落長出時(shí)邊界不明顯，不便于確定刮取酵母型細(xì)胞的時(shí)間，因此探索獲得大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法亟需研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
為解決上述問題，本發(fā)明的目的是提供一種大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法。本發(fā)明為實(shí)現(xiàn)上述目的，通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，包括以下步驟：①將麥芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉攪拌均勻，加入pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH至6.5~8.5，得到混合液，將所得混合液在120~125℃下滅菌20~30分鐘，然后均勻倒在平板上至2~3毫米的厚度，冷卻后得到培養(yǎng)基；所述麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉和蒸餾水的重量體積比為2~5g：0.8~3g：0.8~3g：0.8~1.5g：90~95ml；所述的pH調(diào)節(jié)劑為氫氧化鈉，氫氧化鉀或pH緩沖劑；②用滅菌的接種器蘸取萊氏野村菌分生孢子，置于步驟①得到的培養(yǎng)基表面上方5~7厘米處，敲擊接種器，將萊氏野村菌分生孢子均勻撒在步驟①得到的培養(yǎng)基上，得到萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基，所述萊氏野村菌分生孢子接種培養(yǎng)基的分布密度為0.5~3個(gè)/cm2；③將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基置于溫度24~30℃，濕度為75~90%的光照環(huán)境中，96~168小時(shí)后在培養(yǎng)基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞；④用滅菌的工具刮取步驟③所得的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞至步驟①所得的培養(yǎng)基表面，用涂布器涂布均勻，置于溫度24~30℃，濕度為75~90%的光照環(huán)境中，24~36小時(shí)后得到7~15倍接種量的高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞。優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，pH緩沖劑為hepes。優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，步驟①為將麥芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉攪拌均勻，加入hepes調(diào)節(jié)pH至7.5，得到混合液，將所得混合液在121℃下滅菌25分鐘，然后均勻倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷卻后得到培養(yǎng)基；所述麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉和蒸餾水的重量體積比為4g：1g：1g：1g：93ml。優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，接種器為接種環(huán)、接種針或玻璃棒。優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，涂布器為不銹鋼筷子或頂端燒圓的玻璃棒。優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，工具為方嘴平頭鑷子。優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，步驟②中萊氏野村菌分生孢子接種培養(yǎng)基的分布密度為2個(gè)/cm2。優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種培養(yǎng)基置于溫度26℃，濕度為80%的光照環(huán)境中，96小時(shí)后在培養(yǎng)基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞。進(jìn)一步優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，包括以下步驟：①將麥芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉攪拌均勻，加入hepes調(diào)節(jié)pH至7.5，得到混合液，將所得混合液在121℃下滅菌25分鐘，然后均勻倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷卻后得到培養(yǎng)基；所述麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉和蒸餾水的重量體積比為4g：1g：1g：1g：93ml；②用滅菌的接種環(huán)蘸取萊氏野村菌分生孢子，置于步驟①得到的培養(yǎng)基表面上方6厘米處，敲擊接種環(huán)，將萊氏野村菌分生孢子撒在步驟①得到的培養(yǎng)基上，得到萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基，所述萊氏野村菌分生孢子接種培養(yǎng)基的分布密度為2個(gè)/cm2；③將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基置于溫度26℃，濕度為80%的光照環(huán)境中，96小時(shí)后在培養(yǎng)基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞；④用滅菌的方嘴平頭鑷子刮取步驟③所得的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞至步驟①所得的培養(yǎng)基表面，用不銹鋼筷子涂布均勻，置于溫度26℃，濕度為80%的光照環(huán)境中，24小時(shí)后得到15倍接種量的高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞。重復(fù)步驟④的操作，對步驟④所得的所獲得酵母型細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)接和擴(kuò)大培養(yǎng)，以獲得足量高純度萊氏野村菌酵母形態(tài)細(xì)胞。本發(fā)明相比現(xiàn)有技術(shù)具有以下優(yōu)點(diǎn)：本發(fā)明的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，酵母型細(xì)胞的生長期持續(xù)時(shí)間長，酵母型細(xì)胞向菌絲狀態(tài)轉(zhuǎn)換的時(shí)間相應(yīng)的延遲，因而可以提高酵母型細(xì)胞的產(chǎn)量，并且在顯微鏡鏡檢中檢測不到菌絲體，純度高；本發(fā)明的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，由于瓊脂的加入量適中，延長了酵母型細(xì)胞的生長期，解決了現(xiàn)有技術(shù)中培養(yǎng)基表面硬度低，酵母型細(xì)胞不易刮取的問題；本發(fā)明的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，孢子的分散效果好，生長出的各個(gè)菌落相對獨(dú)立，邊界明顯，容易確定酵母型細(xì)胞的刮取時(shí)間，從而能得到高純度的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞；本發(fā)明的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，預(yù)先調(diào)節(jié)培養(yǎng)基內(nèi)的pH在6.5~8.5之間，解決了現(xiàn)有的萊氏野村菌代謝產(chǎn)物導(dǎo)致的培養(yǎng)基pH下降的問題，延長了酵母型細(xì)胞的生長期，推遲了兩型轉(zhuǎn)換的時(shí)間，從而提高了酵母型細(xì)胞的產(chǎn)量和純度；采用本發(fā)明方法所得的高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞可在新制備的培養(yǎng)基進(jìn)行轉(zhuǎn)接和擴(kuò)大培養(yǎng)，以獲得足量高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞，為實(shí)驗(yàn)室研究和大規(guī)模的工業(yè)生產(chǎn)提供原料保障。具體實(shí)施方式本發(fā)明的目的是提供一種大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，包括以下步驟：①將麥芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉攪拌均勻，加入pH調(diào)節(jié)劑調(diào)節(jié)pH至6.5~8.5，得到混合液，將所得混合液在120~125℃下滅菌20~30分鐘，然后均勻倒在平板上至2~3毫米的厚度，冷卻后得到培養(yǎng)基；所述麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉和蒸餾水的重量體積比為2~5g：0.8~3g：0.8~3g：0.8~1.5g：90~95ml；所述的pH調(diào)節(jié)劑為氫氧化鈉，氫氧化鉀或pH緩沖劑；②用滅菌的接種器蘸取萊氏野村菌分生孢子，置于步驟①得到的培養(yǎng)基表面上方5~7厘米處，敲擊接種器，將萊氏野村菌分生孢子均勻撒在步驟①得到的培養(yǎng)基上，得到萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基，所述萊氏野村菌分生孢子接種培養(yǎng)基的分布密度為0.5~3個(gè)/cm2；③將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基置于溫度24~30℃，濕度為75~90%的光照環(huán)境中，96~168小時(shí)后在培養(yǎng)基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞；④用滅菌的工具刮取步驟③所得的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞至步驟①所得的培養(yǎng)基表面，用涂布器涂布均勻，置于溫度24~30℃，濕度為75~90%的光照環(huán)境中，24~36小時(shí)后得到7~15倍接種量的高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞。優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，pH緩沖劑為hepes。優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，步驟①為將麥芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉攪拌均勻，加入hepes調(diào)節(jié)pH至7.5，得到混合液，將所得混合液在121℃下滅菌25分鐘，然后均勻倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷卻后得到培養(yǎng)基；所述麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉和蒸餾水的重量體積比為4g：1g：1g：1g：93ml。優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，接種器為接種環(huán)、接種針或玻璃棒。優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，涂布器為不銹鋼筷子或頂端燒圓的玻璃棒。優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，工具為方嘴平頭鑷子。優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，步驟②中萊氏野村菌分生孢子接種培養(yǎng)基的分布密度為2個(gè)/cm2。優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種培養(yǎng)基置于溫度26℃，濕度為80%的光照環(huán)境中，96小時(shí)后在培養(yǎng)基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞。進(jìn)一步優(yōu)選的大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，包括以下步驟：①將麥芽糖，蛋白胨和酵母膏加入到蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉攪拌均勻，加入hepes調(diào)節(jié)pH至7.5，得到混合液，將所得混合液在121℃下滅菌25分鐘，然后均勻倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷卻后得到培養(yǎng)基；所述麥芽糖、蛋白胨、酵母膏、瓊脂粉和蒸餾水的重量體積比為4g：1g：1g：1g：93ml；②用滅菌的接種環(huán)蘸取萊氏野村菌分生孢子，置于步驟①得到的培養(yǎng)基表面上方6厘米處，敲擊接種環(huán)，將萊氏野村菌分生孢子撒在步驟①得到的培養(yǎng)基上，得到萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基，所述萊氏野村菌分生孢子接種培養(yǎng)基的分布密度為2個(gè)/cm2；③將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基置于溫度26℃，濕度為80%的光照環(huán)境中，96小時(shí)后在培養(yǎng)基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞；④用滅菌的方嘴平頭鑷子刮取步驟③所得的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞至步驟①所得的培養(yǎng)基表面，用不銹鋼筷子涂布均勻，置于溫度26℃，濕度為80%的光照環(huán)境中，24小時(shí)后得到15倍接種量的高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞。重復(fù)步驟④的操作，對步驟④所得的所獲得酵母型細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)接和擴(kuò)大培養(yǎng)，以獲得足量高純度萊氏野村菌酵母形態(tài)細(xì)胞。重復(fù)步驟④的操作，對步驟④所得的所獲得酵母型細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)接和擴(kuò)大培養(yǎng)，以獲得足量高純度萊氏野村菌酵母形態(tài)細(xì)胞。本發(fā)明的光照環(huán)境是指以24小時(shí)為周期的16小時(shí)光照，8小時(shí)黑暗的自然光照環(huán)境。以下結(jié)合具體實(shí)施例來對本發(fā)明作進(jìn)一步的描述。實(shí)施例1一種大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，包括以下步驟：①將麥芽糖20g，蛋白胨8g和酵母膏8g加入到900ml蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉8g攪拌均勻，加入氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至6.5，得到混合液，將所得混合液在120℃下滅菌20分鐘，然后均勻倒在平板上至2毫米的厚度，冷卻后得到培養(yǎng)基；②用滅菌的接種環(huán)蘸取萊氏野村菌分生孢子，置于步驟①得到的培養(yǎng)基表面上方5厘米處，敲擊接種環(huán)，將萊氏野村菌分生孢子均勻撒在步驟①得到的培養(yǎng)基上，得到萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基，所述萊氏野村菌分生孢子接種培養(yǎng)基的分布密度為0.5個(gè)/cm2；③將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基置于溫度24℃，濕度為75%的光照環(huán)境中，168小時(shí)后在培養(yǎng)基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞；④用滅菌的平頭鑷子刮取步驟③所得的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞至步驟①所得的培養(yǎng)基表面，用滅菌的不銹鋼筷子涂布均勻，置于溫度24℃，濕度為75%的光照環(huán)境中，36小時(shí)后得到7倍接種量的高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞。實(shí)施例2一種大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，包括以下步驟：①將麥芽糖50g，蛋白胨30g和酵母膏30g加入到950ml蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉15g攪拌均勻，加入氫氧化鉀調(diào)節(jié)pH至8.5，得到混合液，將所得混合液在125℃下滅菌30分鐘，然后均勻倒在平板上至3毫米的厚度，冷卻后得到培養(yǎng)基；②用滅菌的玻璃棒蘸取萊氏野村菌分生孢子，置于步驟①得到的培養(yǎng)基表面上方7厘米處，敲擊玻璃棒，將萊氏野村菌分生孢子均勻撒在步驟①得到的培養(yǎng)基上，得到萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基，所述萊氏野村菌分生孢子接種培養(yǎng)基的分布密度為3個(gè)/cm2；③將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基置于溫度30℃，濕度為90%的光照環(huán)境中，140小時(shí)后在培養(yǎng)基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞；④用滅菌的平頭鑷子刮取步驟③所得的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞至步驟①所得的培養(yǎng)基表面，用頂端燒圓的玻璃棒涂布均勻，置于溫度30℃，濕度為90%的光照環(huán)境中，30小時(shí)后得到9倍接種量的高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞。實(shí)施例3一種大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，包括以下步驟：①將麥芽糖40g，蛋白胨20g和酵母膏15g加入到930ml蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉12g攪拌均勻，加入hepes調(diào)節(jié)pH至7.0，得到混合液，將所得混合液在122℃下滅菌22分鐘，然后均勻倒在平板上至2.4毫米的厚度，冷卻后得到培養(yǎng)基；②用滅菌的接種器蘸取萊氏野村菌分生孢子，置于步驟①得到的培養(yǎng)基表面上方6厘米處，敲擊接種器，將萊氏野村菌分生孢子均勻撒在步驟①得到的培養(yǎng)基上，得到萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基，所述萊氏野村菌分生孢子接種培養(yǎng)基的分布密度為1個(gè)/cm2；③將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基置于溫度28℃，濕度為85%的光照環(huán)境中，110小時(shí)后在培養(yǎng)基表面得到半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞；④用滅菌的方嘴平頭鑷子刮取步驟③所得的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞至步驟①所得的培養(yǎng)基表面，用涂布器涂布均勻，置于溫度28℃，濕度為85%的光照環(huán)境中，28小時(shí)后得到10倍接種量的高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞。實(shí)施例4一種大批量培養(yǎng)高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞的方法，包括以下步驟：①將麥芽糖40g，蛋白胨10g和酵母膏10g加入到930ml蒸餾水中溶解，然后加入瓊脂粉10g攪拌均勻，加入hepes調(diào)節(jié)pH至7.5，得到混合液，將所得混合液在121℃下滅菌25分鐘，然后均勻倒在平板上至2.5毫米的厚度，冷卻后得到培養(yǎng)基；②用滅菌的接種環(huán)蘸取萊氏野村菌分生孢子，培養(yǎng)基表面萊氏野村菌產(chǎn)生大量分生孢子的照片如圖1所示，置于步驟①得到的培養(yǎng)基表面上方6厘米處，敲擊接種環(huán)，將萊氏野村菌分生孢子撒在步驟①得到的培養(yǎng)基上，得到萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基，所述萊氏野村菌分生孢子接種培養(yǎng)基的分布密度為2個(gè)/cm2；③將步驟②所得萊氏野村菌分生孢子接種的培養(yǎng)基置于溫度26℃，濕度為80%的光照環(huán)境中，96小時(shí)后在培養(yǎng)基表面得到均一半透明液滴狀的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞，如圖2所示；④用滅菌的方嘴平頭鑷子刮取步驟③所得的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞至步驟①所得的培養(yǎng)基表面，用不銹鋼筷子涂布均勻，置于溫度26℃，濕度為80%的光照環(huán)境中，24小時(shí)后得到15倍接種量的高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞，對所得的高純度萊氏野村菌酵母型細(xì)胞進(jìn)行鏡檢如圖3所示，可以看出在顯微鏡下無菌絲型菌體，純度高；⑤重復(fù)步驟④的操作，對步驟④所得的所獲得酵母型細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)接和擴(kuò)大培養(yǎng)，以獲得足量高純度萊氏野村菌酵母形態(tài)細(xì)胞，如圖4所示經(jīng)過轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)的萊氏野村菌酵母型細(xì)胞菌落照片。