專利名稱：紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的球狀體融合的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及融合紅發(fā)夫酵母(Phaffia rhodozyma)球狀體的方法及新的紅發(fā)夫酵母菌株。
蝦青素(astaxanthin)(反式3，3′-二羥基-4，4′-二酮-β-β′-胡蘿卜素，也稱為反式3，3′-二羥基-β，β′-胡蘿卜素-4，4′-二酮)是一種廣泛分布于植物和動(dòng)物體內(nèi)的氧化類胡蘿卜素色素。它是主要見于甲殼綱動(dòng)物和鮭科魚中的氧化類胡蘿卜素色素。蝦青素也見于藻類、酵母(如紅發(fā)夫酵母)、細(xì)菌和鳥類動(dòng)物中。
在商業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖中，期望向鮭科魚類和甲殼動(dòng)物的食物中加入蝦青素，以賦予見于固有鮭科魚類、甲殼綱動(dòng)物及鳥類動(dòng)物中的不同粉紅顏色。據(jù)信給商業(yè)水產(chǎn)養(yǎng)殖生產(chǎn)的鮭科魚和甲殼動(dòng)物賦予不同的粉紅顏色對(duì)于鼓勵(lì)消費(fèi)者接受它們是很重要的。目前還沒有蝦青素的經(jīng)濟(jì)來源。
用于水產(chǎn)養(yǎng)殖目的之蝦青素的一個(gè)潛在來源是紅發(fā)夫酵母。已對(duì)紅發(fā)夫酵母有所了解，其為分類學(xué)上具有高蝦青素含量的酵母種(其類胡蘿卜素色素的約85%是蝦青素，N.W.Miller，et al.，Int.J.Syst.Bacteriol.，Vol.26，P.286(1976))。自80年代以來，Eric A.Joh Johnson和其他研究者就已開發(fā)利用這種酵母作為鮭科魚和甲殼動(dòng)物的食物添加劑。
由于沒有能產(chǎn)生高水平蝦青素的紅發(fā)夫酵母菌株而阻礙了使用紅發(fā)夫酵母作為蝦青素之商業(yè)開源的開發(fā)工作。目前可得到的紅發(fā)夫酵母菌株，一般每克細(xì)胞產(chǎn)生30至3000μg蝦青素。但遺憾的是具有高蝦青素產(chǎn)率的紅發(fā)夫酵母菌株生長(zhǎng)速度極慢，而不適于商業(yè)性生產(chǎn)發(fā)酵。此此，期望開發(fā)既能高水平產(chǎn)生蝦青素又有所期生長(zhǎng)速度的紅發(fā)夫酵母菌株(從而可提供高的總產(chǎn)率)。
目前得到改良之紅發(fā)夫酵母菌株的方法，只有通過反復(fù)多次誘變。但反復(fù)多次誘變所產(chǎn)生的紅發(fā)夫酵母菌株有許多對(duì)商業(yè)發(fā)酵有毒的突變。因此每次成功地誘變都給改善紅發(fā)夫酵母菌株帶來新的困難。這一問題不能利用傳統(tǒng)的交配技術(shù)來解決，因?yàn)橛嘘P(guān)紅發(fā)夫酵母的有性繁殖尚不明了。如果能用一種技術(shù)產(chǎn)生紅發(fā)夫酵母球狀體，即可能以球狀體融合技術(shù)代替?zhèn)鹘y(tǒng)的交配技術(shù)作為改善紅發(fā)夫酵母菌株的方法。但紅發(fā)夫酵母具有堅(jiān)韌的細(xì)胞壁，而阻礙了研究者制備適用于細(xì)胞融合的紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)球狀體。
因此，期望建立能以高水平產(chǎn)生蝦青素的新的紅發(fā)夫酵母菌株。
還期望建立一種產(chǎn)生適用于細(xì)胞融合之紅發(fā)夫酵母球狀體的方法。
進(jìn)而期望建立一種融合紅發(fā)夫酵母球狀體的方法。
因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供以高水平產(chǎn)生蝦青素的紅發(fā)夫酵母菌株。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種產(chǎn)生適用于細(xì)胞融合的紅發(fā)夫酵母球狀體。
本發(fā)明的再一個(gè)目的是提供一種融合紅發(fā)夫酵母球形體的方法。
本發(fā)明的其他方面、目的及幾個(gè)優(yōu)點(diǎn)將會(huì)從整個(gè)說明書中看出。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)了一個(gè)穩(wěn)定的紅發(fā)夫酵母融合菌株，當(dāng)其在適當(dāng)生長(zhǎng)條件下，于搖瓶中培養(yǎng)時(shí)可產(chǎn)生大約1430μg/g至大約1660μg/g(干重)的蝦青素和大約2350μg/g至2950μg/g(干重)的總類胡蘿卜素，并提供至少24%(干重)的產(chǎn)率;基于5天搖瓶檢驗(yàn)，其生產(chǎn)能力約為4500μg/1至8600μg/l，其中菌株被培養(yǎng)在利于該菌株接近最佳生長(zhǎng)的適當(dāng)條件下。
根據(jù)本發(fā)明，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了產(chǎn)生適用于細(xì)胞融合之紅發(fā)夫酵母球狀體的方法，包括在適當(dāng)條件下使存活的有細(xì)胞壁的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞與有效量的得自Trichoderma harzianium的適當(dāng)消化酶制劑接觸，以利于除去所說的細(xì)胞壁并形成活的紅發(fā)夫酵母球狀體。
在本發(fā)明的另一實(shí)施方案中，發(fā)明人還發(fā)現(xiàn)了融合紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的方法，該方法包括(a)在適當(dāng)條件下，使用細(xì)胞壁的活紅發(fā)夫酵母細(xì)胞與有效量的得自harzianium木霉的適當(dāng)酶制劑接觸，以利于除去所說的細(xì)胞壁并形成活的紅發(fā)夫酵母球狀體;
(b)以一種有利于一個(gè)或多個(gè)球狀體之細(xì)胞壁融合的方式處理所說的球狀體。
紅發(fā)夫酵母菌株的細(xì)胞融合提供了一種使具有弱生長(zhǎng)特征之紅發(fā)夫酵母的高蝦青素生產(chǎn)菌株恢復(fù)為強(qiáng)生長(zhǎng)特性的方法。因此發(fā)現(xiàn)形成紅發(fā)夫酵母細(xì)胞融合的方法為連續(xù)改善發(fā)夫酵母細(xì)胞菌株提供了較容易的途徑。因?yàn)橐郧暗难芯空卟荒艹ゼt發(fā)夫酵母細(xì)胞的特征性堅(jiān)韌細(xì)胞壁，所以不可能融合紅發(fā)夫酵母細(xì)胞菌株。發(fā)明人已發(fā)現(xiàn)，可利用得自真菌harzianium木霉的酶制劑有效地形成紅發(fā)夫酵母的球狀體。利用這些制劑有可能第一次形成紅發(fā)夫酵母球狀體并用這些球狀體完成細(xì)胞融合。
適用的harzianium木霉菌株可由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(12301 Parklaun Drire，Rockville，Maryland)得到(如ATCC 64986)?？捎帽绢I(lǐng)域已知的深層發(fā)酵法培養(yǎng)并刺激這些菌株產(chǎn)生消化酶。harzianium木霉消化酶制劑的一個(gè)適當(dāng)來源是Novo Enzymes SP-299-MutanaseTM和NovozymeTMSP-234(一種純化形式的MutanaseTM)。
用有效量的harzianium木霉消化酶制劑處理存活的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞，可基本上除去紅發(fā)夫酵母細(xì)胞壁，而保留以本方法形成之球狀體部分的存活性。一般可用本領(lǐng)域已知的適當(dāng)技術(shù)檢驗(yàn)紅發(fā)夫酵母細(xì)胞壁的去除，包括用顯微鏡檢查，或光度計(jì)監(jiān)測(cè)混濁度，或平皿接種。目前優(yōu)選的是用光度計(jì)監(jiān)測(cè)混濁度的方法來檢查細(xì)胞壁的去除情況。通?？蓪悠贩湃牒钢苿┑乃芤褐?，并監(jiān)測(cè)溶液的混濁度，直至觀察到混濁度明顯降低為止?；鞚岫冉档鸵话闩c被消化酶制劑溶解的細(xì)胞部分相對(duì)應(yīng)。每100g/升含水紅發(fā)夫酵母所加消化酶制劑的量一般取決于溫度、PH及紅發(fā)夫酵母的狀態(tài)。推薦的用量是每100g/升紅發(fā)夫酵母細(xì)胞約使用0.5至5.0單位harzianium木霉消化酶制劑。通常，優(yōu)選的用量范圍為每100g/升紅發(fā)夫酵母細(xì)胞使用1至2單位harzianium木霉消化酶制劑。一單位定義為，當(dāng)消化酶與紅發(fā)夫酵母細(xì)胞在22℃和PH4.5條件下接觸并保溫24小時(shí)，與對(duì)處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期除去的密度為100g/升的含水紅發(fā)夫酵母樣品，按實(shí)施例Ⅴ所述方法用丙酮提取時(shí)，提供等價(jià)量被釋放的蝦青素所需要的harzianium木霉消化酶制劑的量。
紅發(fā)夫酵母細(xì)胞與消化酶制劑接觸的溫度可以是允許消化酶制劑消化酶制劑消化紅發(fā)夫酵母細(xì)胞壁的任何溫度。一般溫度范圍為大約0℃至60℃。本發(fā)明實(shí)踐中優(yōu)選的溫度范圍為大約20℃至30℃。
紅發(fā)夫酵母細(xì)胞與消化酶制劑接觸的PH可以是允許消化酶制劑消化紅發(fā)夫酵母細(xì)胞壁的任何適當(dāng)PH。一般紅發(fā)夫酵母細(xì)胞與消化酶制劑接觸的PH范圍為大約PH4.0至PH5.5，且優(yōu)選的PH范圍是大約PH4.5至PH5.0。
紅發(fā)夫酵母細(xì)胞可在其生活周期的任何時(shí)間與得自harzianium木霉的消化酶制劑接觸。但較好是紅發(fā)夫酵母細(xì)胞在達(dá)到晚期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期或早期靜止期后與消化酶接觸，特別是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后的大約1至10代，且更好是在大約2至4代時(shí)與消化酶接觸。
可用適當(dāng)方法混合紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的含水懸浮液和harzianium木霉消化酶制劑。一般是使干燥的消化酶制劑與含水紅發(fā)夫酵母發(fā)酵液或含水細(xì)胞懸浮液接觸并將所說的干消化酶制劑混入溶液中來完成混合步驟。
得自harzianium木霉的消化酶制劑與活紅發(fā)夫酵母的接觸時(shí)間應(yīng)足以基本上除去紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的細(xì)胞壁。接觸時(shí)間取決于細(xì)胞濃度、PH、溫度和所用消化酶制劑的單位數(shù)。一般紅發(fā)夫酵母細(xì)胞與得自harzianium木霉之消化酶制劑的接觸時(shí)間應(yīng)在大約1至4小時(shí)范圍內(nèi)，且接觸時(shí)間最好是大約2小時(shí)。
紅發(fā)夫酵母球狀體融合技術(shù)一旦得到球狀體，即可使用常規(guī)酵母融合技術(shù)融合紅發(fā)夫酵母球狀體。酵母融合技術(shù)是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。實(shí)施例1中描述了一種適用的技術(shù)。下面討論的是這可用于紅發(fā)夫酵母球狀體融合之技術(shù)的一個(gè)實(shí)際例子。
在基本上除去了細(xì)胞膜之后，由與之接觸的消化酶制劑中收集并分離出由此形成的活球狀體。從消化酶制劑中除去細(xì)胞的適當(dāng)分離技術(shù)包括但不僅限于離心或過濾。用于從與之接觸的消化酶制劑中分離出球狀體的適當(dāng)分離技術(shù)應(yīng)有利于球狀體的繼續(xù)存活?？稍诘葷B溶液中適當(dāng)洗滌紅發(fā)夫酵母球狀體，以利于完全除去消化酶制劑。然后可用適當(dāng)?shù)姆蛛x技術(shù)從等滲洗滌液中回收紅發(fā)夫酵母球狀體。
除去紅發(fā)夫酵母細(xì)胞壁之后，必須小心地處理如此形成的球狀體，以避免破壞細(xì)胞膜。為了避免破壞球狀體，最好在完成球狀體融合并再生細(xì)胞壁之前一直將球狀體保存在基本上等滲的溶液中。可用各種緩沖液和葡萄糖、D-甘露醇、D-山梨醇、蔗糖或氯化鉀等水溶性無毒性劑制成等滲溶液。等滲溶液中溶質(zhì)(其至少包括緩沖劑和可溶性無毒性劑)的濃度較好在大約0.5至3M范圍內(nèi)，最好是大約1M。
為了誘導(dǎo)原生質(zhì)球狀體融合，應(yīng)使用能促進(jìn)細(xì)胞膜之間粘附和融合的試劑如聚乙二醇處理球狀體。因?yàn)榫垡叶紝?duì)球狀體是毒性的，所以球狀體只能與之接觸有限的時(shí)間。一般在合理時(shí)間內(nèi)，與球狀體接觸的聚乙二醇濃度應(yīng)是以誘導(dǎo)融合，但又要使用足夠低的濃度以避免過多的球狀體死亡。在其本上等滲的溶液中提供的聚乙二醇濃度較好為大約100g/升至300g/升，更好是每升與球狀體接觸的等滲溶液中約含200g聚乙二醇。聚乙二醇與球狀體接觸的時(shí)間長(zhǎng)短取決于單位體積內(nèi)的細(xì)胞數(shù)目及期望達(dá)到的融合程度(如接觸時(shí)間較長(zhǎng)，每單位體積細(xì)胞濃度較高，則更可能發(fā)生三個(gè)或更多個(gè)細(xì)胞的多細(xì)胞融合)。在本發(fā)明的實(shí)踐中，聚乙二醇與球狀體的接觸時(shí)間較好是大約10至20分鐘，更好是15分鐘左右。然后用等滲溶液洗融合的球狀體并離心回收之。
融合的球狀體被回收后，必須將其置于有利于該融合之紅發(fā)夫酵母的細(xì)胞壁再生的適當(dāng)條件下。一種利于紅發(fā)夫酵母細(xì)胞壁再生的適當(dāng)技術(shù)是將融合的球狀體鋪敷在平皿上的等滲表面瓊脂中。鋪敷紅發(fā)夫酵母須稍加小心。因?yàn)榧t發(fā)夫酵母細(xì)胞是溫度敏感性的，所以表面瓊脂應(yīng)是低熔點(diǎn)的，或者以一個(gè)能迅速冷卻的很薄層加入。因?yàn)槠谕诃傊行纬傻木浯┩副砻姝傊⑴c空氣接觸，所以最好以很薄層使用瓊脂。只有穿透表面瓊脂并與空氣接觸的菌落才能表現(xiàn)出紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的特征性類胡蘿卜素顏色(這樣將有利于鑒定有用菌落)。在本發(fā)明的實(shí)踐中，表面瓊脂下面的底層或支持層瓊脂最好是等滲的?？墒褂贸Ｒ?guī)微生物學(xué)技術(shù)分離融合后形成的菌落并根據(jù)蝦青素產(chǎn)生情況、菌株穩(wěn)定性及生長(zhǎng)特征篩選之。
下表所示數(shù)據(jù)表明，有可能利用選擇之紅發(fā)夫酵母菌株間的原生質(zhì)球狀體融合來改良該菌株，提供顯著改良了的紅發(fā)夫酵母融合菌株。這些融合菌株與親代菌株P(guān)C8055相比，表現(xiàn)有明顯改善的蝦青素生產(chǎn)率和改善的生長(zhǎng)特性。
表ⅠPhillips培養(yǎng)物蝦青素1保藏號(hào) NRRL登記號(hào) (μg/l)PC8055＊Y-10291 1268PC81662Y-18730 8200PC81682Y-18731 7636PC81702Y-18732 7706PC82392Y-18733 8568PC82432Y-18734 7661＊親代菌株為67-210，也即PC·8055，該菌株已經(jīng)保藏，并且公眾可從地址在Peoria，Illinois的United States Depactment of Agrjculture，Agri-cultural Research Service，Northern Regiononal Research Centre得到，其保藏登記號(hào)為NRRLY-10291。
1用實(shí)施例Ⅱ中所述的方法檢測(cè)蝦青素含量。菌株生長(zhǎng)于實(shí)施例Ⅱ中所述的條件下。
2有相應(yīng)NRRL保藏登記號(hào)的分離的基本上純的紅發(fā)夫酵母菌株已根據(jù)布達(dá)佩斯條約保藏于United States Depart-ment of Agriculture，Agricultural Research Service，Northern Regional Research Centre1815 North University Street，Pedria，Illinois 61604。
使用本發(fā)明的紅發(fā)夫酵母菌株P(guān)C8166、PC8168、PC8170、PC8239和PC8243，可因提高了蝦青素(即反式3，3′-二羥基-4，4′-二酮-β-β′-胡蘿卜素-4，4′-二酮)產(chǎn)生的水平而提高蝦青素生產(chǎn)率。當(dāng)在適當(dāng)生長(zhǎng)條件下?lián)u瓶中培養(yǎng)時(shí)，這些菌株增加的蝦青素生產(chǎn)率大約為4500μg/l至8600μg/l。在上述條件下，這些菌株的蝦青素生產(chǎn)率較好是大約5600μg/l至8600μg/l，且最好是大約7600μg/l至8600μg/l。當(dāng)在搖瓶中培養(yǎng)時(shí)，這些菌株提高的蝦青素生產(chǎn)率也可導(dǎo)致蝦青素生產(chǎn)水平增加，基于干重，其增加范圍為大約1430μg/g至1660μg/g。當(dāng)在搖瓶中培養(yǎng)時(shí)，所產(chǎn)生的蝦青素水平較好是約為1515μg/g至1660μg/g(基于干重)。所觀察到的生產(chǎn)率也可轉(zhuǎn)換成總胡蘿卜素生產(chǎn)率的增加，其增加范圍為大約2350μg/g至300μg/g胡蘿卜素(基于干重)。所產(chǎn)生的胡蘿卜素量較好為大約2460μg/g至2950μg/g胡蘿卜素(干重)。
在搖瓶中的適當(dāng)生長(zhǎng)條件限定為使紅發(fā)夫酵母培養(yǎng)在強(qiáng)力攪拌的搖瓶中，生長(zhǎng)5天后達(dá)到最大比生長(zhǎng)速率所需的條件。本發(fā)明紅發(fā)夫酵母菌株在搖瓶?jī)?nèi)的適當(dāng)生長(zhǎng)條件包括利用本申請(qǐng)實(shí)施例中所限定的搖瓶試驗(yàn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基(Shake Flask Assay Growth Medium)，并在強(qiáng)力攪拌下于20℃至22℃之間培養(yǎng)菌株(如實(shí)施例Ⅱ所述)。
發(fā)酵紅發(fā)夫酵母是用于工業(yè)發(fā)酵的相對(duì)新的微生物。紅發(fā)夫酵母發(fā)酵領(lǐng)域的幾個(gè)研究者已觀察到，如果提供過量的糖形式存在的碳源，將會(huì)使醇或醛的積聚量達(dá)到對(duì)發(fā)夫酵母有毒性的水平。因此這些研究者建議在提供有限量碳源的條件下培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母細(xì)胞。但限制碳源量將使依賴碳源之紅發(fā)夫酵母的蝦青素產(chǎn)率降低，并釋放出可在發(fā)酵容器內(nèi)引起過多泡沫產(chǎn)生的化合物。存在這些泡沫生成化合物就必須使用消泡劑來避免發(fā)酵容器溢流。然而，使用消泡劑又會(huì)降低每個(gè)細(xì)胞的蝦青素產(chǎn)率。
我們已發(fā)現(xiàn)，在含有紅發(fā)夫酵母細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)素的發(fā)酵液中保留稍為過量的至少一種適當(dāng)?shù)奶荚次镔|(zhì)。能易于控制醇及醛的產(chǎn)生并避免泡沫形成。另外存在稍為過量的碳源也可增加細(xì)胞生長(zhǎng)速度和蝦青素產(chǎn)率。
在改善蝦青素和細(xì)胞產(chǎn)率中，特別重要的是當(dāng)紅發(fā)夫酵母細(xì)胞處于接種和對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之間的過渡期時(shí)，在培養(yǎng)基中維持可檢測(cè)之過量的至少一種適當(dāng)?shù)奶荚?。最好在接種后的過渡期至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的實(shí)質(zhì)性階段使紅發(fā)夫酵母細(xì)胞與可檢測(cè)之過量的至少一種適當(dāng)碳源接觸。
所提供的可檢測(cè)之過量的至少一種適當(dāng)碳源應(yīng)能在紅發(fā)夫酵母發(fā)酵期間有效地避免過多泡沫形成，而且不產(chǎn)生生長(zhǎng)抑制或毒性水平的醇或醛。在由含水紅發(fā)夫酵母細(xì)胞和營(yíng)養(yǎng)素組成的發(fā)酵液中可檢測(cè)到的稍為過量的至少一種碳源，含量較好為大約1.0g/升至20mg/升，且最好為大約1.0g/升至5.0g/升。應(yīng)控制發(fā)酵液中稍為過量的至少一種適當(dāng)?shù)奶荚?，以避免產(chǎn)生過多的醇和醛。發(fā)酵液中醇的量較好應(yīng)在大約0.0g/升至3.0g/升范圍內(nèi)。發(fā)酵液中醛的量較好應(yīng)在大約0.0g/升至1.0g/升范圍內(nèi)。
可使用多種不同的碳源和/或營(yíng)養(yǎng)素源，按液體連續(xù)或分批給料方式進(jìn)行紅發(fā)夫酵母發(fā)酵。培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母的適當(dāng)碳源包括但不僅限于選自琥珀酸鹽、富馬酸鹽、蘋果酸鹽、丙酮酸鹽、葡萄糖、蔗糖、果糖、麥芽糖、玉米糖漿、水解淀粉及其兩種或多種合用的碳源。培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母的優(yōu)選碳源是選自琥珀酸鹽、葡萄糖及兩者合用的碳源。紅發(fā)夫酵母的適當(dāng)營(yíng)養(yǎng)或培養(yǎng)基源可包括至少一種氮源、至少一種磷酸鹽源、至少一種礦物質(zhì)如鐵、銅、鋅、鎂、錳、鈣及其他微量元素源，且必要時(shí)還包括維生素(如生物素、泛酸和硫胺素)。
可從各種不同的來源得到所說的至少一種碳源的營(yíng)養(yǎng)素，或者其可由單一來源如甘蔗廢糖蜜。但最好是有限定之特征的至少一種碳源和/或營(yíng)養(yǎng)素源。表2中列出了已證明特別有效的至少一種碳源及營(yíng)養(yǎng)素組合物。
表2碳源和營(yíng)養(yǎng)素每升水中含有的成分葡萄糖 10-100(g/l)H3PO4(85%) 0.16-2.7(ml/l)CaSO4·2H2O 0.011-0.8(g/l)K2SO40.171-1.3(g/l)MgSO4·7H2O 0.140-1.56(g/l)KOH 0.047-0.35(g/l)生物素 0.006-0.044(mg/l)硫胺素 0.12-9.8(mg/l)1酵母浸膏 1.2-6.0(g/l)2礦物質(zhì)和微量金屬 0.118-9.8(ml/l)1浸母浸膏商品名為Amberex 1003，其可購(gòu)自Universal Foods Corporation，Milwaukee，Wisconsin。
2礦物質(zhì)和微量元素是FeSO4·7H2O(65.0g/l)，CuSO4·5H2O(6.0g/l，ZnSO4·7H2O(20g/l)、MnSO4(3.0g/l)和H2SO4(5.0ml/l)。
用于本發(fā)明的酵母浸膏包括但不僅限于選自AmberexTM1003(Universal Foods Corporation)和BactoTMYeast Extract(Difco Laboratories Incorpoorated)的酵母浸膏。
用于本發(fā)明的微量元素一般是適于酵母生長(zhǎng)且其用量不足以限制紅發(fā)夫酵母的生長(zhǎng)速度或蝦青素產(chǎn)生，它們包括但不僅限于選自鈷和鉬的微量元素。
發(fā)酵溫度一般約為18℃至22℃，且較好為大約20℃。
在以分批給料方式進(jìn)行發(fā)酵容器內(nèi)所溶解的氧含量約為10%至80%飽和度，且較好為大均30%至60%飽和度。在連續(xù)發(fā)酵中，發(fā)酵容器內(nèi)溶解的氧含量一般為大約70%至100%飽和度，且較好為大約70%至80%飽和度。培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母所需的PH一般為大約3.0至5.5，且較好為大約4.5至5.4。
可在含有紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的發(fā)酵液達(dá)到所要求的細(xì)胞密度或蝦青素含量之后收獲細(xì)胞。較好使紅發(fā)夫酵母培養(yǎng)物在靜止期保持約4至24小時(shí)，且最好保持約8至12小時(shí)，以增加蝦青素產(chǎn)率。
然而，由紅發(fā)夫酵母細(xì)胞會(huì)形成對(duì)細(xì)胞破裂不利的堅(jiān)韌細(xì)胞壁、故不宜使之在靜止期保持過長(zhǎng)時(shí)間。
細(xì)胞破裂鮭科魚類、甲殼綱動(dòng)物和鳥類不能利用未破碎之紅發(fā)夫酵母細(xì)胞中的蝦青素。為了利用紅發(fā)夫酵母作為蝦青素的食物來源，必須用物理、化學(xué)、機(jī)械或酶學(xué)方法破壞紅發(fā)夫酵母的細(xì)胞壁。紅發(fā)夫酵母細(xì)胞壁對(duì)普通溶解方法有很強(qiáng)的抗性。例如，紅發(fā)夫酵母在三次通過珠粒碾磨機(jī)碾磨后只能釋放出其中的約40%蝦青素(在珠粒碾磨機(jī)內(nèi)通過更多次數(shù)不能在實(shí)質(zhì)上增加蝦青素的釋放)。紅發(fā)夫酵母只有在三次通過Gaulin Press碾磨機(jī)后才能釋放出其中的約95%蝦青素(該方法費(fèi)時(shí)而花費(fèi)的成本高)。在本發(fā)明出現(xiàn)之前，也不能證明酶促溶解紅發(fā)夫酵母是由紅發(fā)夫酵母細(xì)胞中釋放蝦青素的經(jīng)濟(jì)或有效的方法。
申請(qǐng)人已發(fā)現(xiàn)，有效量的harzianium木霉消化酶制劑能夠消化紅發(fā)夫酵母的細(xì)胞壁。實(shí)施例Ⅴ中所述與丙酮提取方法相比較，可測(cè)知用該方法幾乎可得到存在中紅發(fā)夫酵母中的全部蝦青素。
公眾可由美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(ATCC，12301 Parklawh Drive，Rockville，Maryland)得到適用的harzianium木霉菌株(如ATCC64986)?？捎帽绢I(lǐng)域已知的深層發(fā)酵法培養(yǎng)并刺激產(chǎn)生消化酶。harzianium木霉消化酶制劑的一個(gè)適當(dāng)來源是Novo Enzymes SP-299-Mutanase。
用有效量的herzianium木霉消化酶制劑處理含有蝦青素的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞，基本上可得到其中所含有的所有蝦青素。一般每100g/升含水紅發(fā)夫酵母所用消化酶制劑的量依據(jù)溫度、PH和所用紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的狀態(tài)而定。原則上推薦每100g/升紅發(fā)夫酵母細(xì)胞使用0.2至10.0單位harzianium木霉消化酶制劑。一單位定義為，當(dāng)消化酶與紅發(fā)夫酵母細(xì)胞在22℃和PH4.5條件下接觸并允許保溫24小時(shí)，與對(duì)處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期除去的密度為100g/升的含水紅發(fā)夫酵母樣品，按實(shí)施例Ⅴ所述方法用丙酮提取臨，提供等價(jià)量被釋放的蝦青素所需要的harianium木霉消化酶制劑的量。
紅發(fā)夫酵母細(xì)胞與消化酶制劑接觸的溫度可以是允許消化酶制劑消化紅發(fā)夫酵母細(xì)胞壁的任何溫度。一般溫度范圍約為0℃至60℃本發(fā)明實(shí)踐中優(yōu)選的溫度范圍是大約20℃至30℃。
紅發(fā)夫酵母細(xì)胞與消化酶制劑接觸的PH可以是允許消化酶制劑消化紅發(fā)夫酵母細(xì)胞壁的任何適當(dāng)PH。一般紅發(fā)夫酵母細(xì)胞與消化酶接觸的PH范圍為大約PH4.0至PH5.5，且較好是大約PH4.5至PH5.0。
含蝦青素的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞可在其生活周期的任何時(shí)間與得自harzcanium木霉的消化酶制劑接觸。但較好是在紅發(fā)夫酵母細(xì)胞已處在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期之后即與消化酶制劑接觸，特別是在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后約0至72小時(shí)，更好是約0至24小時(shí)與消化酶接觸。
可用任何適當(dāng)方法混合紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的水懸浮液和harzianium木霉消化酶制劑。一般是將干燥的消化酶制劑與含水紅發(fā)夫酵母發(fā)酵液或含水細(xì)胞懸液接觸并將所說的干消化酶制劑混入溶液中來完成混合步驟。
得自harzianium木霉的消化酶制劑可與含有蝦青素的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞接觸一定時(shí)間，以與實(shí)施例Ⅴ、A中所述的丙酮提取法相比使之能基本上釋放出存在于紅發(fā)夫酵母細(xì)胞內(nèi)的蝦青素。接觸時(shí)間的長(zhǎng)短取決于細(xì)胞濃度、PH、溫度及所用消化酶的量。一般紅發(fā)夫酵母細(xì)胞與衍生于harzianium木霉之消化酶制劑的接觸時(shí)間為大約12至24小時(shí)，較好是大約24小時(shí)。
紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的干燥可在已破壞或以一種使其中的蝦青素能作為食物色素添加劑使用的方式消化細(xì)胞后，干燥這些紅發(fā)夫酵母細(xì)胞?？墒褂昧骰哺稍餀C(jī)、轉(zhuǎn)鼓式干燥機(jī)或噴霧干燥機(jī)進(jìn)行干燥。最使使用噴霧干燥法，因?yàn)檫@樣可使細(xì)胞暴露于高溫下的時(shí)間短，從而使所存在蝦青素不致遭受可能的降解。
干燥后，可用任何適當(dāng)方法如用旋風(fēng)分離器回收作為粉末狀酵母材料的所得產(chǎn)物，并作進(jìn)一步處理以用于飼料中、儲(chǔ)存或裝運(yùn)。
實(shí)施例菌株紅發(fā)夫酵母PC8055 NRRL Y-10921紅發(fā)夫酵母PC8166 NRRL Y-18730紅發(fā)夫酵母PC8168 NRRL Y-18731紅發(fā)夫酵母PC8170 NRRL Y-18732紅發(fā)夫酵母PC8239 NRRL Y-18733紅發(fā)夫酵母PC8243 NRRL Y-18734搖瓶試驗(yàn)生長(zhǎng)培養(yǎng)基葡萄糖 20.0g/LKH2PO410.0g/LK2HPO45.0g/L(NH4)2SO41.0g/L泛酸鈣 0.0200g/L吡多素HCl 0.0125g/L
硫胺素·HCl 0.0100g/L煙酸 0.0100g/LCaCl2·2H2O 0.01g/LZnSO4·7H2O 0.0070g/L氯化血紅素 0.005g/LCuSO4·5H2O 0.0006g/LMnSO4·2H2O 0.0002g/L生物素 0.00015g/LMaZu DF37C消泡劑 10.0滴/L改良的YMA培養(yǎng)基Bacto酵母浸膏 3.0g/LDifco麥芽汁 3.0g/L右旋糖 20.0g/L瓊脂 20.0g/L水 1.0LBio Lafitte培養(yǎng)基(每升水)H3PO4(85%) 14.5ml 酵母浸膏 20.0gCaSO4·2H2O 0.60g 微量金屬14.0mlK2SO49.12g 生物素 8mgMgSO4·7H2O 7.60g 硫胺素 8mg
KOH 2.60g MAZU DF 37C葡萄糖 40.0g 消泡劑 12滴1微量金屬包括(YTM-4)FeSO4·7H2O 16.25g/250mlCaSO4·5H2O 1.50g/250mlZnSO4·7H2O 5.00g/250mlMnSO4·H2O 0.75g/250mlH2SO41.25g/250ml實(shí)施例1球狀體融合在100ml改良的YMA培養(yǎng)基中制備紅發(fā)夫酵母的培養(yǎng)物并于20℃保溫5天。各培養(yǎng)物在無菌離心管內(nèi)以2.5ml(總體積)當(dāng)量Klett單位混合并于20℃以12，000g離心10分鐘。沉淀團(tuán)塊用含7M山梨醇的100mM滅菌磷酸鹽緩沖液(PH4.0)洗兩次并重新懸浮于25ml含山梨醇的同樣緩沖液中。將所得溶液分成兩等份(各10ml)。向一等份內(nèi)加入0.5ml 10mg/ml Mutanase(SP299)，兩份均于室溫下保溫2小時(shí)，然后在冰上冷卻。向4.9ml 5%SDS中每等份各加入0.1ml并檢測(cè)600nm(吸光率(A600)，然后在光學(xué)顯微鏡下觀察各等分部分，以監(jiān)測(cè)細(xì)胞壁去除情況。
于20℃下以120g離心10分鐘，由各等分樣品中沉淀出球狀體，并用含有1M山梨醇10ml滅菌的100mM磷酸鹽緩沖液(PH4.0)洗兩次。將各等分樣品重新輕輕攪拌于1.0ml含有1M山梨醇的100mM磷酸鹽緩沖液(PH4.0)中。向其中加入9ml溶于100mM磷酸鹽緩沖液(PH4.0)中無菌20%聚乙二醇-3350中并于室溫下保溫15分鐘。
然后于20℃下以120g離心10分鐘沉淀出球狀體并使用無菌吸管除去PEG。將球狀體重新懸浮于10ml含1M山梨醇的改良的Ym培養(yǎng)液中并于室溫下保溫30分鐘。用吸管將各0.1ml等分樣品吸加到20個(gè)含1M山梨醇之改良YMA平皿的表面上。向各平皿表面上加入10ml含1M山梨醇和1%瓊脂(此前保持在42℃)的改良之YM。將細(xì)胞混入輕輕旋動(dòng)的表面瓊脂中，然后將平皿置于室溫下保溫5至10天，提取單個(gè)菌落并接種在改良的YMA平皿上，20℃下保溫5天并檢測(cè)蝦青素含量。
實(shí)施例Ⅱ融合菌株的蝦青素生產(chǎn)量下表顯示實(shí)施例1中產(chǎn)生的融合菌株及各菌株在搖瓶中生長(zhǎng)5天后所產(chǎn)生之蝦青素的水平。各菌株都生長(zhǎng)于100ml改良的YM搖瓶?jī)?nèi)，各搖瓶分別接種1菌環(huán)由生長(zhǎng)5-10天的舊改良YMA平皿中得到的紅發(fā)夫酵母培養(yǎng)物。搖瓶在軌道振蕩器(行程10cm，200rpm)上20℃保溫5天。將10ml搖瓶培養(yǎng)物接種于加在2.8L三折流Fernbach燒瓶?jī)?nèi)的1000ml搖瓶試驗(yàn)培養(yǎng)基中。樣品在軌道振蕩器(行程10cm，200rpm)上20℃保溫5天后，根據(jù)洗過之細(xì)胞的干重、蝦青素含量(HPLC)和總類胡蘿卜素含量(HPLC)進(jìn)行分析。用下列公式計(jì)算細(xì)胞產(chǎn)率(基于總葡萄糖濃度)
(洗過之細(xì)胞的干重(g/L))/(20g/L(葡萄糖濃度)) ×100%使用下列公式計(jì)算容量蝦青素產(chǎn)率洗過的細(xì)胞干重(g/L)×蝦青素(μg/g細(xì)胞)
1三個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)的搖瓶平均值(WCDW/葡萄糖重)(WCDW＝洗過的細(xì)胞干重)代表理論上的百分收率(基于20克可利用的碳源)。因此4.94g細(xì)胞提供24.7%的收率(即4.94/20×100)。
2數(shù)據(jù)是只對(duì)反式3，3′-二羥基-β，β′-胡蘿卜素-4，4′-二酮所作HPLC分析的結(jié)果(參見實(shí)施例Ⅲ)。
3每升中蝦青素微克(μg)數(shù)，是按實(shí)施例Ⅱ所述用ppm數(shù)乘以在搖瓶中生長(zhǎng)5天后的細(xì)胞濃度而算得的。
如由PC8166、PC8239和PC8243所證明的，某些融合菌株在蝦青素生產(chǎn)上明顯地超出了先前生成它們的親代菌株。然而，PC8168和PC8170等菌株也代表了對(duì)它們的親代菌株的顯著改良。用于上述某些融合實(shí)驗(yàn)的親代菌株P(guān)C8117和PC8216則不適于大規(guī)模發(fā)酵生產(chǎn)，因?yàn)樗鼈儍A向于產(chǎn)生不帶色素或帶很淺色素的子細(xì)胞。但利用PC8117和PC8216經(jīng)細(xì)胞融合所產(chǎn)生的融合細(xì)胞不會(huì)產(chǎn)生不帶色素或只有很淺色素的子細(xì)胞因此，由不穩(wěn)定的高色素生成菌株產(chǎn)生的融合菌株提供了一種連續(xù)開發(fā)高生產(chǎn)性紅發(fā)夫酵母新菌株的方法。
實(shí)施例Ⅲ發(fā)夫酵母的HPLC色素分析使用標(biāo)準(zhǔn)相HPLC系統(tǒng)分析紅發(fā)夫酵母中的類胡蘿卜素色素。該系統(tǒng)使用了向正庚烷中提取的步驟，可將正庚烷直接裝在標(biāo)準(zhǔn)相層析柱上。
用吸管將0.5ml發(fā)夫酵母培養(yǎng)物吸入2.0ml微量離心管中。經(jīng)在離心管內(nèi)離心5分鐘使細(xì)胞沉淀。棄去上清液并加入玻璃珠(Sigma，0.4-0.5mm)復(fù)蓋留存的沉淀團(tuán)塊。向細(xì)胞沉淀物內(nèi)加入300μl冰醋酸，并在機(jī)械振蕩器中將其振蕩15分鐘以破壞細(xì)胞。加入1.0ml去離子水，然后再加入0.5ml正庚烷。將離心管放在機(jī)械振蕩器上振蕩10分鐘，使類胡蘿卜素被提取到上層庚烷相中。在微量離心管中離心5分鐘以分離溶劑相。將離心管置于冷處保存?zhèn)渥鞣治鲇谩Ｗ⑸潴w積為30μl。
用于蝦青素定量分析的HPLC系統(tǒng)是Waters HPLC系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括兩個(gè)510型泵，一個(gè)U6K手工注樣器、一個(gè)490E可編程序的多波長(zhǎng)紫外/可見光檢測(cè)器、一個(gè)680型自動(dòng)梯度控制器和一個(gè)740型記錄儀/積分儀。所用的固定相是裝在3.9mm×300mm柱內(nèi)的10μm Waters micropor-osil。在最初安裝后，泵入加在甲醇中的1.0%(W/V)磷酸溶液，使之以每分鐘1ml的流速通過柱，將固定相預(yù)處理1小時(shí)。流動(dòng)相是正己烷和丙酮。
分離發(fā)夫酵母提取物之所有在470nm有吸收的組分時(shí)需要使用梯度程序。層析30分鐘得到層析圖譜，并經(jīng)5分鐘重新建立初始溶劑濃度比例。也可使用等滲己烷∶丙酮(87∶13)系統(tǒng)層析20分鐘完成蝦青素的定量分析，而無須在注射下一個(gè)樣品前平衡柱床。
實(shí)施例Ⅳ蝦青素測(cè)定A.蝦青素的平皿測(cè)定在改良的YMA平皿上劃線接種待檢培養(yǎng)物并于20-22℃下通氣保溫。四天后，用點(diǎn)樣器柄或環(huán)從各改良YMA培養(yǎng)皿中刮取小塊培養(yǎng)物(凈重0.1-0.2克)。將細(xì)胞重新懸浮于1.0ml去離子蒸餾水中并加于錐形底微量離心管中。
用吸管各取0.1ml細(xì)胞懸浮液加入9.9ml去離子蒸餾水中，檢測(cè)600nm吸光率以確定細(xì)胞濃度(洗過的細(xì)胞干重(克)/升)。
然后將原細(xì)胞懸液(0.9ml)于4℃下以14，000g離心5分鐘并棄去上清。加入二甲基甲酰胺使體積準(zhǔn)確達(dá)到10ml。加入0.25g 450-500微米玻璃珠并至少共渦旋振蕩10分鐘(中間定時(shí)放在ik上冷卻)。4℃下以14000g離心沉淀所得細(xì)胞碎片和玻璃珠。除去0.5ml上清液并加入1.0ml二甲基甲酰胺。然后檢測(cè)478nm吸光率。
按下述方法計(jì)算蝦青素濃度假定1μg純蝦青素/L有A478＝176×10-6(1cm光程)原來1.0ml細(xì)胞懸浮液的總蝦青素濃度〔蝦青素〕μg／L＝ (A478×稀釋因數(shù))/(b×176×10-6)其中b＝光程長(zhǎng)度(cm)(通常為1)，稀釋因數(shù)＝ (1.5ml)/(0.5ml) × (1.0ml)/(0.9ml) ＝ 3/0.9 ＝3.33
然后按下列公式計(jì)算細(xì)胞蝦青素濃度細(xì)胞的〔蝦青素〕(μg/g)＝ (蝦青素濃度(μg/L))/(細(xì)胞濃度(g/L))實(shí)施例Ⅴ蝦青素測(cè)定A.檢測(cè)被處理培養(yǎng)液中細(xì)胞破裂的分光光度法得自22份0.2ml被處理之培養(yǎng)液樣品的細(xì)胞(每升培養(yǎng)液約100g細(xì)胞)加在平頂微量離心管(Hermle Z 230M，National Labnet Co.，Woodbridge，N.J.)中，4℃下以14，000g離心5分鐘，重新懸浮于1.0ml去離子的蒸餾水中并移入2.0ml錐形底聚丙烯微量離心管內(nèi)。在聚丙烯管中以14，000g 4℃離心5分鐘重新沉淀細(xì)胞并棄去上清。向管內(nèi)各樣品中加入丙酮，準(zhǔn)確達(dá)到1.0ml體積。向一份樣品中加入0.25g玻璃珠(450-500微米)并在Vortex，Jr混合器(Scientific Products，Inc.)上將兩管4℃下旋轉(zhuǎn)振蕩10分鐘。以14，000g 4℃離心5分鐘，沉淀玻璃珠和細(xì)胞碎片。除去0.5ml等分上清液并加至1.0ml丙酮中檢測(cè)478nm吸光率。按下列公式計(jì)算細(xì)胞破碎比例(A478(無玻璃珠))/(A478(玻璃珠)) ×100%
B.在Biolafitte中分批進(jìn)料培養(yǎng)紅發(fā)夫酵母將紅發(fā)夫酵母的新鮮培養(yǎng)物接種在發(fā)酵器中。最好以下述方法接種由平皿上提取菌落并移入100ml搖瓶?jī)?nèi)保溫72小時(shí)。然后將100ml搖瓶的內(nèi)容物移入1000ml搖瓶中保溫72小時(shí)。再將1000ml搖瓶?jī)?nèi)容物移入發(fā)酵器內(nèi)。使用的搖瓶培養(yǎng)基包含0.6%酵母浸膏、0.6%麥芽汁、0.2%葡萄糖。發(fā)酵器初始容積為10升，PH＝5.2，溫度20℃。
4天發(fā)酵期間的PH值控制在4.5和5.2之間(使用氨水和磷酸)、溫度控制在19℃和21℃之間(使用冷水浴)、且百分溶解氧(DO)保持在50%和100%之間(必要時(shí)增加攪拌速度至最大1000rpm，空氣流量最大增加至2體積/分鐘)。
發(fā)酵的前100個(gè)小時(shí)要保持稍為正值葡萄糖含量(0.1%至0.3%)。發(fā)酵器內(nèi)初始葡萄糖消耗之后，開始由50%葡萄糖進(jìn)料池(1750葡萄糖+1750g H2O，滅菌)進(jìn)料。一般最初進(jìn)料速度要慢，此后逐漸加快。進(jìn)料過程中用LC監(jiān)測(cè)葡萄糖濃度。然后在限制葡萄糖的條件下發(fā)酵(測(cè)不到葡萄糖)。在加入1750g葡萄糖后的24小時(shí)，發(fā)酵液內(nèi)即測(cè)不到葡萄糖。
注意為控制泡沫形成，須每升工作體積加入3-4滴MaZu DF 37C消泡劑。
權(quán)利要求
1.穩(wěn)定的紅發(fā)夫酵母(Phaffia rhodozyma)融合細(xì)胞株，當(dāng)在搖瓶中于適當(dāng)條件下培養(yǎng)時(shí)，該菌株產(chǎn)生約1430μg/g至1660μg/g蝦青素，約2350μg/g至2950μg/g總類胡蘿卜素，且基于干重提供至少24%的收率，同時(shí)基于5天搖瓶培養(yǎng)物測(cè)定，產(chǎn)率為大約4500μg/L至8600μg/L，其中菌株被培養(yǎng)在利于該菌株達(dá)到差不多最佳生長(zhǎng)的適當(dāng)條件下。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的菌株，其中該菌株基于5天搖瓶測(cè)定提供約7600μg/L至8600μg/L的產(chǎn)率，其中該菌株被培養(yǎng)在利于其達(dá)到差不多最佳生長(zhǎng)的適當(dāng)條件下。
3.根據(jù)權(quán)利要求1的菌株，其中該菌株的百分收率為大約25%至28%。
4.保藏在NRRL登記號(hào)為Y-18730的紅發(fā)夫酵母菌株。
5.保藏在NRRL登記號(hào)為Y-18731的紅發(fā)夫酵母菌株。
6.保藏在NRRL登記號(hào)為Y-18732的紅發(fā)夫酵母菌株。
7.保藏在NRRL登記號(hào)為Y-18733的紅發(fā)夫酵母菌株。
8.保藏在NRRL登記號(hào)為Y-18734的紅發(fā)夫酵母菌株。
9.生產(chǎn)適用于細(xì)胞融合之紅發(fā)夫酵母原生質(zhì)球狀體的方法，其包括在適當(dāng)條件下使帶有細(xì)胞壁的活紅發(fā)夫酵母細(xì)胞與有效量的得自Trichoderma harzianium的適當(dāng)消化酶制劑接觸，以利于除去所說的細(xì)胞壁并形成活的紅發(fā)夫酵母球狀體。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中消化酶制劑選自于Novo Enzyme SP-299-Mutanase和Novozyme SP-234。
11.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中紅發(fā)夫酵母細(xì)胞在PH范圍大約為PH4.5至5.0的條件下與適當(dāng)?shù)南钢苿┙佑|。
12.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中與消化酶制劑接觸的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞至少達(dá)到了其生長(zhǎng)周期的晚期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
13.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中紅發(fā)夫酵母細(xì)胞與消化酶制劑接觸約2小時(shí)。
14.融合紅發(fā)夫酵母細(xì)胞的方法，其包括a)使帶有細(xì)胞壁的活的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞在適當(dāng)條件下與得自harzianium木霉的適當(dāng)消化酶制劑接觸，以除去所說的細(xì)胞壁并形成活的紅發(fā)夫酵母球狀體;b)以有利于一個(gè)或多個(gè)球狀體融合的方式處理所說的球狀體。
15.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中消化酶制劑是Novo Enzyme SP-299-Mutanase和Novozyme SP-234。
16.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中紅發(fā)夫酵母細(xì)胞在大約PH4.5至PH5.0的范圍內(nèi)與適當(dāng)?shù)南钢苿┙佑|。
17.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中與消化酶制劑接觸的紅發(fā)夫酵母細(xì)胞至少已達(dá)到了其生長(zhǎng)周期的晚期對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
18.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中紅發(fā)夫酵母細(xì)胞與消化酶制劑接觸約2小時(shí)。
19.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中在等滲溶液中洗滌除去所說的細(xì)胞壁后所形成的活的紅發(fā)夫酵母球狀體，以除去其中所說的消化酶制劑，然后以一種有利于一個(gè)或多個(gè)球狀體融合的方式處理所說的球狀體。
20.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中有利于融合的處理所說的球狀體的方式是使所說的球狀體與含有有效量聚乙二醇的等滲溶液接觸10分鐘至大約20分鐘。
21.根據(jù)權(quán)利要求14的方法，其中有利于融合的方式是使所說的球狀體與含有20%聚乙二醇的等滲溶液接觸。
全文摘要
本發(fā)明提供了紅發(fā)夫酵母菌株之細(xì)胞融合的方法，從而提供了新的紅發(fā)夫酵母菌株。
文檔編號(hào)C12N15/04GK1060872SQ9110588
公開日1992年5月6日 申請(qǐng)日期1991年8月23日 優(yōu)先權(quán)日1990年10月23日
發(fā)明者W·D·普雷瓦特 申請(qǐng)人:菲利浦石油公司