本發(fā)明涉及法醫(yī)學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種STR分型陽性參照物。

背景技術(shù)：

自20世紀(jì)90年代至今，STR分型技術(shù)作為第二代DNA分型技術(shù)已廣泛應(yīng)用于法醫(yī)DNA分型實驗室，因其準(zhǔn)確、快速、靈敏等優(yōu)點，成為了當(dāng)前法醫(yī)物證鑒定的主流技術(shù)。將多色熒光標(biāo)記的STR復(fù)合擴增產(chǎn)物與等位基因分型標(biāo)準(zhǔn)物ladder比對，確定各基因座的基因分型，此分型結(jié)果是個人認(rèn)定及親權(quán)關(guān)系認(rèn)定的關(guān)鍵。但是，由于法醫(yī)生物學(xué)檢材來源具有多樣性，STR分型結(jié)果有時出現(xiàn)丟峰、一個基因座檢出多個等位基因、甚至出現(xiàn)ladder樣圖譜。為了排除檢測分析人員、實驗室環(huán)境DNA污染等因素對實驗結(jié)果的影響，常用人類基因組DNA作為陽性參照物，確保檢測結(jié)果真實準(zhǔn)確。目前我國法醫(yī)學(xué)領(lǐng)域常使用9947A、9948、2800M、007、K562等的基因組DNA作為陽性參照物，然而上述幾種基因組皆源自特定匿名供體的細(xì)胞所建立細(xì)胞系，需要通過基因組DNA提取及定量，最后完成定值并作為陽性參照物而使用。上述陽性參照物具有一些不足之處。一是基因型為自然人所具有，二是需進行細(xì)胞系的建立，獲取難度大，工作量大，程序復(fù)雜，成本高。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種作為STR分型陽性參照物的DNA混合物。

本發(fā)明所提供的作為STR分型陽性參照物的DNA混合物，含有DNA片段1、DNA片段2、DNA片段3、DNA片段4、DNA片段5、DNA片段6、DNA片段7、DNA片段8、DNA片段9、DNA片段10、DNA片段11、DNA片段12、DNA片段13、DNA片段14、DNA片段15、DNA片段16、DNA片段17、DNA片段18、DNA片段19、DNA片段20、DNA片段21、DNA片段22、DNA片段23、DNA片段24、DNA片段25和DNA片段26。

所述DNA片段1為DNA片段a或含有DNA片段a的DNA分子；所述DNA片段a是將人類基因組hg38Y染色體上第4402412至4403492位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段A替換為5’-[AGAT]₁₅-3’得到的；所述區(qū)段A如人類基因組hg38Y染色體上第4402919至4402978位核苷酸所示。

所述DNA片段2為DNA片段b或含有DNA片段b的DNA分子；所述DNA片段b是將人類基因組hg38Y染色體上第12499943至12501067位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段B替換為5’-[TCTG]₅[TCTA]₁₂-3’得到的；所述區(qū)段B如人類基因組hg38Y染色體上第12500544至12500611位核苷酸所示。

所述DNA片段3為DNA片段c或含有DNA片段c的DNA分子；所述DNA片段c是將人類基因組hg38Y染色體上第12499943至12501067位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段C替換為5’

-[TCTG]₅[TCTA]₁₂TCATTATACCTACTTCTGTATCCAACTCTCATCTGTATTATCTATGTA[TCTG]₃[TCTA]₉[TCCC]₂-3’得到的；所述區(qū)段C如人類基因組hg38Y染色體上第12500440至

12500611位核苷酸所示。

所述DNA片段4為DNA片段d或含有DNA片段d的DNA分子；所述DNA片段d為人類基因組hg38Y染色體上第15162506至15163693位核苷酸所示DNA分子。

所述DNA片段5為DNA片段e或含有DNA片段e的DNA分子；所述DNA片段e是將人類基因組hg38Y染色體上第7999327至8000423位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段E替換為5’-[GAAA]₁₆-3’得到的；所述區(qū)段E如人類基因組hg38Y染色體上第7999839至7999902位核苷酸所示。

所述DNA片段6為DNA片段f或含有DNA片段f的DNA分子；所述DNA片段f是將人類基因組hg38Y染色體上第9683880至9684943位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段F替換為5’-[GAAA]₁₆-3’得到的；所述區(qū)段F如人類基因組hg38Y染色體上第9684380至9684443位核苷酸所示。

所述DNA片段7為DNA片段g或含有DNA片段g的DNA分子；所述DNA片段g為人類基因組hg38Y染色體上第18639212至18640255位核苷酸所示DNA分子。

所述DNA片段8為DNA片段h或含有DNA片段h的DNA分子；所述DNA片段h為人類基因組hg38Y染色體上第18680133至18681188位核苷酸所示DNA分子。

所述DNA片段9為DNA片段i或含有DNA片段i的DNA分子；所述DNA片段i是將人類基因組hg38Y染色體上第3262548至3263624位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段I替換為5’-[AGAT]₁₂-3’得到的；所述區(qū)段I如人類基因組hg38Y染色體上第3263111至3263158位核苷酸所示。

所述DNA片段10為DNA片段j或含有DNA片段j的DNA分子；所述DNA片段j是將人類基因組hg38Y染色體上第11981535至11982727位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段J替換為5’-[TCTA]₁₁-3’得到的；所述區(qū)段J如人類基因組hg38Y染色體上第11982089至11982132位核苷酸所示。

所述DNA片段11為DNA片段k或含有DNA片段k的DNA分子；所述DNA片段k為人類基因組hg38Y染色體上第12403016至12404148位核苷酸所示DNA分子。

所述DNA片段12為DNA片段l或含有DNA片段l的DNA分子；所述DNA片段l為人類基因組hg38Y染色體上第12258360至12259484位核苷酸所示DNA分子。

所述DNA片段13為DNA片段m或含有DNA片段m的DNA分子；所述DNA片段m為人類基因組hg38Y染色體上第20471493至20472591位核苷酸所示DNA分子。

所述DNA片段14為DNA片段n或含有DNA片段n的DNA分子；所述DNA片段n為人類基因組hg38Y染色體上第16631132至16632289位核苷酸所示DNA分子。

所述DNA片段15為DNA片段o或含有DNA片段o的DNA分子；所述DNA片段o為人類基因組hg38Y染色體上第12345767至12346826位核苷酸所示DNA分子。

所述DNA片段16為DNA片段p或含有DNA片段p的DNA分子；所述DNA片段p是將人類基因組hg38Y染色體上第12825368至12826501位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段P替換為5’-[TTTTC]₁₂-3’得到的；所述區(qū)段P如人類基因組hg38Y染色體上第12825889至12825948位核苷酸所示。

所述DNA片段17為DNA片段q或含有DNA片段q的DNA分子；所述DNA片段q為人類基因組hg38Y染色體上第22218501至22219600位核苷酸所示DNA分子。

所述DNA片段18為DNA片段r或含有DNA片段r的DNA分子；所述DNA片段r為人類基因組hg38Y染色體上第7546860至7548164位核苷酸所示DNA分子。

所述DNA片段19為DNA片段s或含有DNA片段s的DNA分子；所述DNA片段s是將人類基因組hg38Y染色體上第17113629至17114936位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段S替換為5’-[ATAG]₁₄-3’得到的；所述區(qū)段S如人類基因組hg38Y染色體上第17114309至17114364位核苷酸所示。

所述DNA片段20為DNA片段t或含有DNA片段t的DNA分子；所述DNA片段t是將人類基因組hg38Y染色體上第18888396至18889560位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段T替換為5’-[ATAG]₁₀-3’得到的；所述區(qū)段T如人類基因組hg38Y染色體上第18888956至18888995位核苷酸所示。

所述DNA片段21為DNA片段u或含有DNA片段u的DNA分子；所述DNA片段u為人類基因組hg38Y染色體上第13166268至13167351位核苷酸所示DNA分子。

所述DNA片段22為DNA片段v或含有DNA片段v的DNA分子；所述DNA片段v為人類基因組hg38Y染色體上第16968971至16970301位核苷酸所示DNA分子。

所述DNA片段23為DNA片段w或含有DNA片段w的DNA分子；所述DNA片段w是將人類基因組hg38Y染色體上第23739148至23740275位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段W替換為5’-[GAAA]₁₅[GGAA]₇-3’得到的；所述區(qū)段W如人類基因組hg38Y染色體上第23739648至23739735位核苷酸所示。

所述DNA片段24為DNA片段x或含有DNA片段x的DNA分子；所述DNA片段x為人類基因組hg38Y染色體上第25929809至25930928位核苷酸所示DNA分子。

所述DNA片段25為DNA片段y或含有DNA片段y的DNA分子；所述DNA片段y為人類基因組hg38X染色體上第11296467至11296999位核苷酸所示DNA分子。

所述DNA片段26為DNA片段z或含有DNA片段z的DNA分子；所述DNA片段z為人類基因組hg38Y染色體上第6869827至6870365位核苷酸所示DNA分子。

以上任一所述DNA片段1和/或DNA片段2和/或DNA片段3和/或DNA片段4和/或DNA片段5和/或DNA片段6和/或DNA片段7和/或DNA片段8和/或DNA片段9和/或DNA片段10和/或DNA片段11和/或DNA片段12和/或DNA片段13和/或DNA片段14和/或DNA片段15和/或DNA片段16和/或DNA片段17和/或DNA片段18和/或DNA片段19和/或DNA片段20和/或DNA片段21和/或DNA片段22和/或DNA片段23和/或DNA片段24和/或DNA片段25和/或DNA片段26均為雙鏈DNA分子。

所述DNA混合物具體由所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16、所述DNA片段17、所述DNA片段18、所述DNA片段19、所述DNA片段20、所述DNA片段21、所述DNA片段22、所述DNA片段23、所述DNA片段24、所述DNA片段25和所述DNA片段26組成。

所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16、所述DNA片段17、所述DNA片段18、所述DNA片段19、所述DNA片段20、所述DNA片段21、所述DNA片段22、所述DNA片段23、所述DNA片段24、所述DNA片段25和所述DNA片段26的質(zhì)量比為1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。

所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16、所述DNA片段17、所述DNA片段18、所述DNA片段19、所述DNA片段20、所述DNA片段21、所述DNA片段22、所述DNA片段23、所述DNA片段24、所述DNA片段25和所述DNA片段26的質(zhì)量比具體可為1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明還提供了一種作為STR分型陽性參照物的重組質(zhì)?；旌衔?。

本發(fā)明所提供的作為STR分型陽性參照物的重組質(zhì)?；旌衔?，可通過如下方法制備的：

將所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16、所述DNA片段17、所述DNA片段18、所述DNA片段19、所述DNA片段20、所述DNA片段21、所述DNA片段22、所述DNA片段23、所述DNA片段24、所述DNA片段25和所述DNA片段26分別插入到26個載體中，得到26個重組載體；將所述26個重組載體混合，得到重組質(zhì)粒混合物。

上述重組質(zhì)?；旌衔镏校?6個重組載體的質(zhì)量比可為1：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)：(0.8～1.2)。

上述重組質(zhì)?；旌衔镏?，所述26個重組載體的質(zhì)量比具體可為1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1：1。

上述重組質(zhì)?；旌衔镏校鯠NA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16、所述DNA片段17、所述DNA片段18、所述DNA片段19、所述DNA片段20、所述DNA片段21、所述DNA片段22、所述DNA片段23、所述DNA片段24、所述DNA片段25和所述DNA片段26可以分別插入到同一個載體中，也可以分別插入到不同的載體中。進一步，可以插入到載體的相同位置，也可以分別插入載體的不同位置。

所述載體為克隆載體。

所述克隆載體可為T載體。

所述T載體具體可為質(zhì)粒pMD18-T。

所述重組載體具體可為將質(zhì)粒pMD18-T和DNA片段(所述DNA片段1、所述DNA片段2、所述DNA片段3、所述DNA片段4、所述DNA片段5、所述DNA片段6、所述DNA片段7、所述DNA片段8、所述DNA片段9、所述DNA片段10、所述DNA片段11、所述DNA片段12、所述DNA片段13、所述DNA片段14、所述DNA片段15、所述DNA片段16、所述DNA片段17、所述DNA片段18、所述DNA片段19、所述DNA片段20、所述DNA片段21、所述DNA片段22、所述DNA片段23、所述DNA片段24、所述DNA片段25或所述DNA片段26)連接，得到重組載體。

上述任一所述的DNA混合物或上述任一所述的重組質(zhì)?；旌衔镌赟TR分型擴增中作為STR分型陽性參照物的應(yīng)用也屬于本發(fā)明的保護范圍。

上述應(yīng)用中，每12.5μL所述STR分型擴增的體系中，上述任一所述的DNA混合物中，所述DNA片段1—所述DNA片段26的26個DNA片段的質(zhì)量比可為0.5pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg。

上述應(yīng)用中，每12.5μL所述STR分型擴增的體系中，上述任一所述的DNA混合物中，所述DNA片段1—所述DNA片段26的26個DNA片段的質(zhì)量比具體可為0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg。

上述應(yīng)用中，每12.5μL所述STR分型擴增的體系中，上述任一所述的重組質(zhì)粒混合物中，含有所述DNA片段1—所述DNA片段26的26個重組載體的質(zhì)量比可為0.5pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg：0.4～0.6pg。

上述應(yīng)用中，每12.5μL所述STR分型擴增的體系中，上述任一所述的重組質(zhì)?；旌衔镏?，含有所述DNA片段1—所述DNA片段26的26個重組載體的質(zhì)量比具體可為0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg：0.5pg。

本發(fā)明根據(jù)目前法醫(yī)分子遺傳學(xué)中已發(fā)現(xiàn)的STR基因座位點，制備了用于STR分型陽性參照物。實驗證明，本發(fā)明提供的STR分型陽性參照物可作為多種商業(yè)試劑盒所使用的標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，具有重要的應(yīng)用價值。

附圖說明

圖1為實施例1步驟三中1的DNA檢測圖譜。

圖2為實施例1步驟三中2的DNA檢測圖譜。

具體實施方式

下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明進行進一步的詳細(xì)描述，給出的實施例僅為了闡明本發(fā)明，而不是為了限制本發(fā)明的范圍。

下述實施例中的實驗方法，如無特殊說明，均為常規(guī)方法。

下述實施例中所用的材料、試劑等，如無特殊說明，均可從商業(yè)途徑得到。

以下實施例中的定量試驗，均設(shè)置三次重復(fù)實驗，結(jié)果取平均值。

Nanodrop1000微量分光光度計為Applied Biosystems產(chǎn)品。PCR Amplification Kit為Applied Biosystems公司產(chǎn)品。9948人類基因組DNA為Promaga公司產(chǎn)品。質(zhì)粒pMD18-T為TaKaRa公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為6011。內(nèi)標(biāo)為Typer500內(nèi)標(biāo)，公安部物證鑒定中心產(chǎn)品。去離子甲酰胺為ABI公司產(chǎn)品，產(chǎn)品目錄號為4311320。ABI3130xl遺傳分析儀為ABI公司產(chǎn)品。

實施例1、STR分型陽性參照物的制備和驗證

一、重組質(zhì)粒的獲得

制備表1所示的26個重組質(zhì)粒，包含22個Y染色體STR基因座以及性別判定基因座Amelogenin，共26個等位基因。

根據(jù)測序結(jié)果，各重組質(zhì)粒的詳細(xì)信息如下(人類基因組hg38Y染色體和人類基因組hg38X染色體的基因信息見網(wǎng)址：

http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTracks？chromInfoPage＝&hgsid＝500042597_ceYXRRTAWoGaTHVgpCtg3gj4PilI)：

重組質(zhì)粒1：將DNA片段1和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒1；DNA片段1為將人類基因組hg38Y染色體上第4402412至4403492位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段A替換為5’-[AGAT]₁₅-3’得到的；所述區(qū)段A如人類基因組hg38Y染色體上第4402919至4402978位核苷酸所示；

重組質(zhì)粒2：將DNA片段2和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒2；DNA片段2為將人類基因組hg38Y染色體上第12499943至12501067位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段B替換為5’-[TCTG]₅[TCTA]₁₂-3’得到的；所述區(qū)段B如人類基因組hg38Y染色體上第12500544至12500611位核苷酸所示；

重組質(zhì)粒3：將DNA片段3和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒3；DNA片段3為將人類基因組hg38Y染色體上第12499943至12501067位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段C替換為5’

-[TCTG]₅[TCTA]₁₂TCATTATACCTACTTCTGTATCCAACTCTCATCTGTATTATCTATGTA[TCTG]₃[TCTA]₉[TCCC]₂-3’得到的；所述區(qū)段C如人類基因組hg38Y染色體上第12500440至12500611位核苷酸所示；

重組質(zhì)粒4：將DNA片段4和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒4；DNA片段4為人類基因組hg38Y染色體上第15162506至15163693位核苷酸所示DNA分子；

重組質(zhì)粒5：將DNA片段5和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒5；DNA片段5為將人類基因組hg38Y染色體上第7999327至8000423位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段E替換為5’-[GAAA]₁₆-3’得到的；所述區(qū)段E如人類基因組hg38Y染色體上第7999839至7999902位核苷酸所示；

重組質(zhì)粒6：將DNA片段6和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒6；DNA片段6為將人類基因組hg38Y染色體上第9683880至9684943位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段F替換為5’-[GAAA]₁₆-3’得到的；所述區(qū)段F如人類基因組hg38Y染色體上第9684380至9684443位核苷酸所示；；

重組質(zhì)粒7：將DNA片段7和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒7；DNA片段7為人類基因組hg38Y染色體上第18639212至18640255位核苷酸所示DNA分子；

重組質(zhì)粒8：將DNA片段8和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒8；DNA片段8為人類基因組hg38Y染色體上第18680133至18681188位核苷酸所示DNA分子；

重組質(zhì)粒9：將DNA片段9和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒9；DNA片段9為將人類基因組hg38Y染色體上第3262548至3263624位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段I替換為5’-[AGAT]₁₂-3’得到的；所述區(qū)段I如人類基因組hg38Y染色體上第3263111至3263158位核苷酸所示；

重組質(zhì)粒10：將DNA片段10和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒10；DNA片段10為將人類基因組hg38Y染色體上第11981535至11982727位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段J替換為5’-[TCTA]₁₁-3’得到的；所述區(qū)段J如人類基因組hg38Y染色體上第11982089至11982132位核苷酸所示；

重組質(zhì)粒11：將DNA片段11和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒11；DNA片段11為人類基因組hg38Y染色體上第12403016至12404148位核苷酸所示DNA分子；

重組質(zhì)粒12：將DNA片段12和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒12；DNA片段12為人類基因組hg38Y染色體上第12258360至12259484位核苷酸所示DNA分子；

重組質(zhì)粒13：將DNA片段13和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒13；DNA片段13為人類基因組hg38Y染色體上第20471493至20472591位核苷酸所示DNA分子；

重組質(zhì)粒14：將DNA片段14和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒14；DNA片段14為人類基因組hg38Y染色體上第16631132至16632289位核苷酸所示DNA分子；

重組質(zhì)粒15：將DNA片段15和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒15；DNA片段15為人類基因組hg38Y染色體上第12345767至12346826位核苷酸所示DNA分子；

重組質(zhì)粒16：將DNA片段16和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒16；DNA片段16為將人類基因組hg38Y染色體上第12825368至12826501位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段P替換為5’-[TTTTC]₁₂-3’得到的；所述區(qū)段P如人類基因組hg38Y染色體上第12825889至12825948位核苷酸所示；

重組質(zhì)粒17：將DNA片段17和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒17；DNA片段17為人類基因組hg38Y染色體上第22218501至22219600位核苷酸所示DNA分子；

重組質(zhì)粒18：將DNA片段18和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒18；DNA片段18為人類基因組hg38Y染色體上第7546860至7548164位核苷酸所示DNA分子；

重組質(zhì)粒19：將DNA片段19和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒19；DNA片段19為將人類基因組hg38Y染色體上第17113629至17114936位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段S替換為5’-[ATAG]₁₄-3’得到的；所述區(qū)段S如人類基因組hg38Y染色體上第17114309至17114364位核苷酸所示；

重組質(zhì)粒20：將DNA片段20和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒20；DNA片段20為將人類基因組hg38Y染色體上第18888396至18889560位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段T替換為5’-[ATAG]₁₀-3’得到的；所述區(qū)段T如人類基因組hg38Y染色體上第18888956至18888995位核苷酸所示；

重組質(zhì)粒21：將DNA片段21和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒21；DNA片段21為人類基因組hg38Y染色體上第13166268至13167351位核苷酸所示DNA分子；

重組質(zhì)粒22：將DNA片段22和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒22；DNA片段22為人類基因組hg38Y染色體上第16968971至16970301位核苷酸所示DNA分子；

重組質(zhì)粒23：將DNA片段23和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒23；DNA片段23為將人類基因組hg38Y染色體上第23739148至23740275位核苷酸所示DNA分子中的區(qū)段W替換為5’-[GAAA]₁₅[GGAA]₇-3’得到的；所述區(qū)段W如人類基因組hg38Y染色體上第23739648至23739735位核苷酸所示；

重組質(zhì)粒24：將DNA片段24和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒24；DNA片段24為人類基因組hg38Y染色體上第25929809至25930928位核苷酸所示DNA分子；

重組質(zhì)粒25：將DNA片段25和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒25；DNA片段25為人類基因組hg38X染色體上第11296467至11296999位核苷酸所示DNA分子；

重組質(zhì)粒26：將DNA片段26和質(zhì)粒pMD18-T連接，得到重組質(zhì)粒26；DNA片段26為人類基因組hg38Y染色體上第6869827至6870365位核苷酸所示DNA分子。

表19948人類基因組DNA中存在的STR基因座及相應(yīng)的等位基因型

二、STR分型陽性參照物的制備

1、利用Nanodrop1000微量分光光度計分別測量并稀釋步驟一中獲得的重組質(zhì)粒DNA的濃度至1ng/μL，獲得各質(zhì)粒的稀釋液。

2、完成步驟1后，取各質(zhì)粒的稀釋液1μL進行混合，然后用超純水定容至1mL，得到STR分型陽性參照物。

STR分型陽性參照物中，步驟一中各個等位基因的DNA濃度均為1pg/μL。

三、STR分型陽性參照物的驗證

1、確定STR分型陽性參照物的最佳稀釋倍數(shù)

(1)取步驟二制備的STR分型陽性參照物，然后依次用超純水稀釋至10倍、100倍、1000倍和10000倍，分別得到稀釋液1、稀釋液2、稀釋液3和稀釋液4。

(2)取0.5μL步驟(1)得到的稀釋液1、稀釋液2、稀釋液3或稀釋液4，并以其作為DNA模板，使用PCR Amplification Kit并按其操作說明書的步驟進行PCR擴增(反應(yīng)體系為12.5μL)，得到PCR擴增產(chǎn)物。

反應(yīng)程序為：95℃預(yù)變性11min；94℃變性1min，61℃退火1min，72℃延伸1min，30次循環(huán)；60℃延伸80min；4℃保存?zhèn)錂z。

(3)完成步驟(2)后，向去離子甲酰胺中加入1μL PCR擴增產(chǎn)物和0.2μL內(nèi)標(biāo)，然后用去離子甲酰胺定容至20μL，得到混合液。

(4)完成步驟(3)后，取混合液，95℃變性5min，迅速轉(zhuǎn)移至-20℃放置5min，然后用ABI3130xl遺傳分析儀進行毛細(xì)管電泳檢測，得到相應(yīng)的DNA檢測圖譜。根據(jù)DNA檢測圖譜中的檢測峰高確定STR分型陽性參照物的最佳濃度。電泳條件為：進樣電壓2kV，進樣時間為18s。

實驗結(jié)果見圖1(A為稀釋液1，B為稀釋液2，C為稀釋液3，D為稀釋液4)。結(jié)果表明：以稀釋液1作為DNA模板，多數(shù)等位基因的檢測峰出現(xiàn)滲透現(xiàn)象；以稀釋液2作為DNA模板，所有等位基因分型完整，一些基因座的等位基因檢測峰出現(xiàn)滲透，峰高為4000～8000；以稀釋液3作為DNA模板，所有等位基因分型完整，峰高為3000～4000；以稀釋液4作為DNA模板，由于模板量低一些基因座出現(xiàn)等位基因的丟失，峰高為200～600。因此，STR分型陽性參照物的最佳稀釋倍數(shù)為1000倍，也就是說，使用STR分型陽性參照物擴增時，每個等位基因的DNA濃度為0.001pg/μL。

2、STR分型陽性參照物的驗證

①取1μL步驟1得到的稀釋液3，并以其作為DNA模板，使用PCR Amplification Kit并按其操作說明書的步驟，進行PCR擴增，得到PCR擴增產(chǎn)物。

②完成步驟①后，向去離子甲酰胺中加入1μL PCR擴增產(chǎn)物和0.2μL內(nèi)標(biāo)，然后用去離子甲酰胺定容至20μL，得到混合液。

③完成步驟②后，取混合液，95℃變性5min，迅速轉(zhuǎn)移至-20℃放置5min，然后用ABI3130xl遺傳分析儀進行毛細(xì)管電泳檢測，得到相應(yīng)的DNA檢測圖譜。電泳條件為：進樣電壓2kV，進樣時間為18s。

按照上述步驟，將步驟①中的稀釋液3替換為9948人類基因組DNA，其它步驟均不變，得到9948人類基因組DNA的DNA檢測圖譜。

實驗結(jié)果見圖2(A為STR分型陽性參照物的DNA檢測圖譜，B為9948人類基因組DNA的DNA檢測圖譜)。結(jié)果表明，A中無滲透峰，峰高為2000～3500，基因座內(nèi)各等位基因分型完整、正確，峰型尖銳清晰，無stutter峰，基因座內(nèi)兩等位基因間差異較小，基因座間均衡性良好。STR分型陽性參照物的DNA檢測圖譜和9948人類基因組DNA的DNA檢測圖譜的檢測峰高相當(dāng)，各基因座分型一致。可見，步驟二制備的STR分型陽性參照物與9948人類基因組DNA擴增檢測結(jié)果無差異，可完全替代9948人類基因組DNA進行STR分型檢測。