本發(fā)明涉及一種產(chǎn)聚羥基丁酸羥基戊酸酯的基因工程菌及其應(yīng)用方法，屬于基因工程和發(fā)酵工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
聚羥基丁酸羥基戊酸酯(PHBV)是微生物合成的能源儲存性生物聚酯，是綠色環(huán)保、性能良好的醫(yī)用及工業(yè)用生物材料，和僅由羥基丁酸單體組成的PHB材料的硬和脆相比，加入了羥基戊酸單體的PHBV材料更柔韌，更具有可塑性，對于其應(yīng)用于醫(yī)學(xué)和工程領(lǐng)域具有更大的優(yōu)勢，所以現(xiàn)在商品化的聚酯里大部分是PHBV。能夠天然合成聚羥基脂肪酸酯(PHA)的微生物，因胞內(nèi)丙酰輔酶A的缺乏而很少積累PHBV，絕大部分積累的是PHB。
為了實(shí)現(xiàn)PHBV在胞內(nèi)的積累，需要兩分子乙酰輔酶A經(jīng)過PhaA、PhaB的兩步催化產(chǎn)生3HB單體，一分子乙酰輔酶A和一分子丙酰輔酶A經(jīng)過PhaA、PhaB的兩步催化產(chǎn)生3HV單體，然后在PhaC的催化下聚合形成PHBV共聚物。由于丙酰輔酶A非常容易通過胞內(nèi)三羧酸循環(huán)轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，因此丙酰輔酶A的胞內(nèi)濃度會持續(xù)處于比較低的水平，進(jìn)而影響到3HV單體的胞內(nèi)合成和PHBV共聚物中3HV的摩爾分?jǐn)?shù)，目前在不添加丙酸鹽的微生物PHBV生產(chǎn)菌中，PHBV共聚物中的3HV的摩爾分?jǐn)?shù)處于較低水平。
目前有通過基因工程改造實(shí)現(xiàn)PHBV合成的出發(fā)菌多為革蘭氏陰性菌，如假單胞菌，大腸桿菌等，但應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域有一定的安全隱患。谷氨酸棒桿菌為食品安全菌，多用來生產(chǎn)氨基酸，較革蘭氏陰性菌的安全性較為有保障。此外，目前無論是革蘭氏陰性菌，還是谷氨酸棒桿菌，絕大多數(shù)是通過添加丙酸鹽而實(shí)現(xiàn)PHBV的生產(chǎn)，否則在不添加相關(guān)碳源的情況下，其產(chǎn)物是PHB而不是PHBV，這會使發(fā)酵生產(chǎn)的成本增加，且PHBV中3HV的摩爾分?jǐn)?shù)仍然處于較低水平。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的是構(gòu)建一株不需要外源添加丙酸鹽即可生產(chǎn)PHBV的谷氨酸棒桿菌基因工程菌，并使得PHBV中HV比例高于50％。
為此，本發(fā)明提供了一種構(gòu)建谷氨酸棒桿菌基因工程菌WM002的方法，是將來自羅氏真養(yǎng)菌基因組的phaCAB基因簇，在谷氨酸棒桿菌WM001進(jìn)行重組表達(dá)。所述谷氨酸棒桿菌WM001(Corynebacterium glutamicum WM001)，已于2016年6月1日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M 2016303，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，是以羅氏真養(yǎng)菌基因組GenBank NC_008313.1為模板，PCR得到phaCAB基因簇，以pDXW-8為表達(dá)載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌WM001，得到正確轉(zhuǎn)化子，即為可以積累PHBV的谷氨酸棒桿菌基因工程菌WM002。
本發(fā)明還提供了一種應(yīng)用谷氨酸棒桿菌基因工程菌WM002搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)PHBV的方法，是將谷氨酸棒桿菌基因工程菌WM002的種子接入發(fā)酵培養(yǎng)基，培養(yǎng)一段時間后誘導(dǎo)基因的表達(dá)，使菌體內(nèi)部積累PHBV。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/100mL)：玉米漿1-2，硫酸銨3.5，硫酸鎂0.05-0.2，磷酸二氫鉀0.1-0.2，葡萄糖13-15，碳酸鈣2，pH為7.2。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，種子培養(yǎng)基配方為(g/100mL)：玉米漿3-4，硫酸銨0.5-1，硫酸鎂0.05-0.2，磷酸二氫鉀0.1-0.2，葡萄糖3-5，pH為7.2。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將種子以5-10％的接種量轉(zhuǎn)入發(fā)酵培養(yǎng)基，于28-32℃、200-230rpm條件下培養(yǎng)菌株至OD600達(dá)到10-15，添加IPTG誘導(dǎo)phaCAB基因簇的表達(dá)。
在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，將種子以5-10％的接種量轉(zhuǎn)入裝有補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)基的發(fā)酵罐，裝液量為50-70％，pH用50％氨水控制在7.2-7.4之間，通氣量為0.8-1.0L/min，于31℃下培養(yǎng)，前24h相對溶氧控制在30％，24h至發(fā)酵結(jié)束溶氧控制在15％；于31℃下培養(yǎng)6-8h，添加終濃度為0.5mM的IPTG，然后繼續(xù)培養(yǎng)至130h，期間當(dāng)培養(yǎng)基中剩余葡萄糖濃度低于40g/L時，流加含終濃度為0.5mM的IPTG的70％葡萄糖溶液。補(bǔ)料分批發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/100mL)：玉米漿1-3，硫酸銨0.5-1，硫酸鎂0.1-0.2，磷酸二氫鉀0.1-0.2，葡萄糖10-15，初始pH為7.2。
本發(fā)明提供的谷氨酸棒桿菌基因工程菌WM002，可以在無外源添加丙酸的條件下生產(chǎn)PHBV，其產(chǎn)量達(dá)到細(xì)胞干重的20％，且3HV的比例高達(dá)66％，既有一定的食品安全保障，又降低了生產(chǎn)成本。
生物材料保藏
谷氨酸棒桿菌WM001(Corynebacterium glutamicum WM001)，已于2016年6月1日保藏于中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCC NO：M 2016303，保藏地址為中國武漢武漢大學(xué)。
附圖說明
圖1甲酯化氣相色譜檢測結(jié)果
A商品化PHB
B商品化PHBV
C ATCC13869/pDXW-8-phaCAB中積累的PHB
D ATCC13869/pDXW-8對照
E WM002中積累的PHBV
F WM001/pDXW-8對照
具體實(shí)施方式
氣相色譜檢測PHBV產(chǎn)量和3HV比例的方法：
將搖瓶發(fā)酵結(jié)束后的菌液收集，10,000rpm離心5分鐘收集菌體，用pH7.2的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，將洗滌后的菌體冷凍干燥兩天。稱取適量菌體，加入酯化液，酯化液含有2mL甲醇，2mL氯仿，120μL濃硫酸。在沸水浴中保持6小時，冷卻至室溫，加入1mL水，充分震蕩后分層，提取下相進(jìn)行氣相色譜分析。PHBV標(biāo)樣也按如上所述的步驟進(jìn)行處理，提取下相進(jìn)行氣相色譜分析。
PHBV產(chǎn)量和3HV比例的計算方法：
PHBV的產(chǎn)量和3HV占PHBV共聚物的比例由氣相色譜法，通過比對標(biāo)準(zhǔn)樣品聚羥基丁酸和羥基戊酸單體的峰面積得到。
實(shí)施例1重組菌WM002的構(gòu)建
(1)以羅氏真養(yǎng)菌基因組NC_008313.1為模板，采用引物phaCAB-F/phaCAB-R擴(kuò)增phaCAB基因簇，擴(kuò)增phaCAB基因簇的引物phaCAB-F/phaCAB-R序列為
phaCAB-F：5’-CTGGAATTCAGAAGGAGAATCAAATCATGGCGACCGG-3’
phaCAB-R：5’-CCGCTCGAGAGGTCAGCCCATATGCAGG-3’
(2)用限制性內(nèi)切酶EcoRI和XhoI消化PCR產(chǎn)物，載體pDXW-8(載體pDXW-8的構(gòu)建方法參見申請?zhí)枮?00910233618.1，發(fā)明名稱為一種大腸桿菌-棒狀桿菌穿梭型誘導(dǎo)表達(dá)載體PDXW-8及其構(gòu)建方法的專利申請)用EcoRI和XhoI消化處理，酶切產(chǎn)物純化后，使用T4連接酶22℃過夜處理，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α，篩選正確轉(zhuǎn)化子，對于得到的正確轉(zhuǎn)化子，提取質(zhì)粒后用1.8kV，5ms電轉(zhuǎn)化入谷氨酸棒桿菌WM001感受態(tài)，再次篩選正確的基因工程重組菌WM001/pDXW-8-phaCAB轉(zhuǎn)化子，命名為WM002。
(3)提取pDXW-8質(zhì)粒后直接電轉(zhuǎn)化入WM001，獲得正確轉(zhuǎn)化子，命名為WM001/pDXW-8，作為無異源表達(dá)phaCAB基因的空載質(zhì)粒對照菌株。
實(shí)施例2應(yīng)用谷氨酸棒桿菌基因工程菌WM002搖瓶發(fā)酵生產(chǎn)PHBV
(1)重組基因工程菌的搖瓶發(fā)酵
培養(yǎng)基(g/100mL)：玉米漿1.5，硫酸銨3.5，硫酸鎂0.05，磷酸二氫鉀0.1，葡萄糖13，碳酸鈣2，pH為7.2.；
培養(yǎng)方法：31℃，230rpm，培養(yǎng)96h。
誘導(dǎo)條件：6小時時加入終濃度為0.5mM的IPTG。
(2)實(shí)施例1中的基因工程菌WM002和WM001/pDXW-8胞內(nèi)聚羥基脂肪酸酯的酯化：將所得發(fā)酵液中的菌體離心后，用pH 7.0的磷酸鹽緩沖液洗滌兩次，在真空冷凍干燥機(jī)中過夜凍干，稱取20mg左右(質(zhì)量記為Wt)的干菌體，加入到酯化管中，再加入2mL氯仿和2mL甲醇溶液，其中甲醇溶液是在甲醇中加入了3％的濃硫酸，將酯化管置于100℃的水浴鍋中，酯化6小時，置于室溫下半個小時，加入1mL水，充分震蕩后分層，吸取下相；
(3)標(biāo)樣PHB和PHBV的酯化：分別稱取約5mg的PHB和PHBV標(biāo)樣(質(zhì)量分別記為WtB和WtBV)加入酯化管中進(jìn)行酯化，之后步驟同上述(2)；
(4)實(shí)施例1中基因工程菌的聚羥基脂肪酸酯的結(jié)構(gòu)分析
得出基因工程菌WM002的酯化產(chǎn)物有兩個特征峰(如圖1E所示)，可對應(yīng)標(biāo)樣的PHBV特征峰(如圖1B)，而WM001/pDXW-8酯化產(chǎn)物無對應(yīng)特征峰(如圖1F所示)，說明WM002胞內(nèi)合成聚脂肪酸酯產(chǎn)物為PHBV；
(5)胞內(nèi)PHBV產(chǎn)量計算及HV比例計算
得出基因工程菌WM002的酯化產(chǎn)物有兩個特征峰，分別記為A和B，其面積記為As和Bs，對應(yīng)標(biāo)樣PHBV也有兩個特征峰，標(biāo)樣兩個特征峰的面積記為A0s和B0s；那么所合成的PHBV占細(xì)胞干重比為Wt％＝(As/A0s*88％WtBV+Bs/B0s*12％WtBV)/Wt；PHV的摩爾比例為
HV％＝Bs/B0s*12％WtBV/(As/A0s*88％WtBV/104.1+Bs/B0s*12％WtBV/118.1)/118.1；發(fā)酵96小時后，PHBV占細(xì)胞干重的28％，3HV摩爾分?jǐn)?shù)為58.1％。
實(shí)施例3谷氨酸棒桿菌基因工程菌ATCC13869/pDXW-8-phaCAB搖瓶發(fā)酵在胞內(nèi)積累的是PHB而非PHBV
(1)重組基因工程菌的搖瓶發(fā)酵
重組菌ATCC3869/pDXW-8-phaCAB和ATCC3869/pDXW-8的構(gòu)建方法參照實(shí)施例2中(1)；
(2)同實(shí)施例2中(2)；
(3)同實(shí)施例2中(3)；
(4)同實(shí)施例2中(4)；得出基因工程菌ATCC3869/pDXW-8-phaCAB的酯化產(chǎn)物只有1個特征峰(如圖1C所示)，可對應(yīng)標(biāo)樣PHB特征峰(如圖1A所示)，無PHBV標(biāo)樣中的PHV特征峰(如圖1B所示)，ATCC3869/pDXW-8的酯化產(chǎn)物無特征峰(如圖1D所示)說明其胞內(nèi)合成聚羥基脂肪酸酯結(jié)構(gòu)為PHB。
(5)胞內(nèi)PHBV產(chǎn)量計算及PHV比例計算
計算方法及步驟同實(shí)施例2中(5)；但發(fā)酵96小時后，ATCC3869/pDXW-8-phaCAB只可以在胞內(nèi)積累PHB，而無PHBV的積累，即3HV摩爾分?jǐn)?shù)為0％。
實(shí)施例4應(yīng)用谷氨酸棒桿菌基因工程菌WM002補(bǔ)料分批發(fā)酵生產(chǎn)PHBV
(1)重組基因工程菌的補(bǔ)料分批發(fā)酵
培養(yǎng)基(g/100mL)：玉米漿1.5，硫酸銨0.5，硫酸鎂0.05，磷酸二氫鉀0.1，葡萄糖13，碳酸鈣2，pH為7.2.；
培養(yǎng)方法：31℃，pH為7.2，溶氧前24h為30％，其后調(diào)整為15％，裝液量為1.2L，pH用50％氨水控制在7.2-7.4之間，培養(yǎng)基中剩余葡萄糖濃度低于40g/L時，流加70％葡萄糖溶液(內(nèi)含終濃度為0.5mM的IPTG)。
誘導(dǎo)條件：6小時時加入終濃度為0.5mM的IPTG，隨補(bǔ)料液添加終濃度為0.5mM的IPTG。
(2)PHBV產(chǎn)量檢測
收集96h發(fā)酵液，同實(shí)施例2中(2)所述步驟進(jìn)行胞內(nèi)產(chǎn)物酯化，再通過實(shí)施例2中(5)所述步驟進(jìn)行PHBV產(chǎn)量及HV比例計算。得到在發(fā)酵96h后，可積累PHBV產(chǎn)量占細(xì)胞干重的20％，HV比例達(dá)到66％。
雖然本發(fā)明已以較佳實(shí)施例公開如上，但其并非用以限定本發(fā)明，任何熟悉此技術(shù)的人，在不脫離本發(fā)明的精神和范圍內(nèi)，都可做各種的改動與修飾，因此本發(fā)明的保護(hù)范圍應(yīng)該以權(quán)利要求書所界定的為準(zhǔn)。