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      一種降解煙堿的解淀粉芽孢桿菌DGY18及其應用方法與流程

      文檔序號:11837437閱讀:635來源:國知局

      本發(fā)明涉及一種降解煙堿的解淀粉芽孢桿菌DGY18(Bacillus amyloliquefaciens DGY18)以及利用該菌降解煙絲浸提液和煙株上部煙葉中煙堿的方法,屬于微生物應用技術領域。



      背景技術:

      煙堿又名尼古丁,是存在于煙草中的主要生物堿,占生物堿量95%以上,也是卷煙和煙葉中的主要危害成分之一。目前的煙草生產(chǎn)需要煙葉中的煙堿含量達到適中即可,而我國煙草種植過程中由于大量施加化肥,導致上部煙葉中煙堿含量過高,部分上部煙葉中的煙堿含量達到5%以上;造成了該部分煙葉丟失了可利用的價值。據(jù)估算,每株煙草的上部煙葉的丟棄達到了3-5片之多,即有近20%以上的煙葉無法利用,這對于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)來說,是巨大的資源浪費。因此,本發(fā)明的目的是最大限度的利用上部煙葉,同時尋找一種適合普通煙堿降解的微生物。

      目前控制或降低煙草中煙堿含量的方法主要有三種:第一種是對煙草種植進行調(diào)控:調(diào)控的方向主要從煙草的選育、煙草的栽培、煙草的生態(tài)、煙草的管理等各個方面來控制或降低煙草中煙堿含量;第二種是運用化學處理法:處理的方向是使用熱水、有機溶劑等對煙葉進行漂洗、萃取、蒸餾等操作,從而將煙葉上部分煙堿洗脫掉;第三種是利用微生物和酶降解煙堿。前兩種辦法不僅費時費力、經(jīng)濟成本高,而且降煙堿效果欠佳,而利用微生物降低卷煙煙堿含量、提高煙葉品質(zhì)、提高資源利用率等具有重大意義。因此,利用微生物降解煙株煙堿是最大限度利用上部煙葉,同時降低煙草中煙堿對人體、煙草生產(chǎn)帶來危害的有效途徑之一。



      技術實現(xiàn)要素:

      本發(fā)明要解決的問題是控制或降低現(xiàn)有的煙草生長過程中上部煙葉的煙堿含量,提供一種能降解上部煙葉煙堿的解淀粉芽孢桿菌DGY18,并利用該解淀粉芽孢桿菌DGY18降低上部煙葉、煙絲浸提液的煙堿含量、提高煙葉可利用性。

      為解決上述技術問題,本發(fā)明使用以下技術方案:

      一種降解煙堿的解淀粉芽孢桿菌DGY18(Bacillus amyloliquefaciens DGY18),保藏編號為CGMCC NO.11900。

      所述的解淀粉芽孢桿菌DGY18的應用方法:將解淀粉芽孢桿菌DGY18配制成菌懸液,接種至煙絲浸提液,或者直接在健康煙株葉面噴灑。

      應用于煙絲浸提液接種的解淀粉芽孢桿菌DGY18菌懸液的制備方法為:純菌株接入5mL液體煙堿培養(yǎng)基中,30℃,200r/min搖床震蕩培養(yǎng)2d,然后將培養(yǎng)液10000r/min離心10min,收集菌體,用0.9%生理鹽水將離心后的菌體配制成菌體濃度為107-108CFU/mL的菌懸液。

      所述的煙堿培養(yǎng)基配方:K2HPO4 13.3g,KH2PO4 4g,MgSO4·7H2O 0.2g,微量元素溶液0.5mL,調(diào)pH至7.0,定容至1000mL,滅菌后以濾菌法加入1g純煙堿,混勻;所述的微量元素溶液是用0.1mol/L鹽酸將MnSO4·7H2O 0.4g,CaCl2·2H2O 0.2g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2g溶解并定容至100mL。

      按煙絲浸提液體積5-10%接種解淀粉芽孢桿菌DGY18后,在30℃條件下120r/min搖床培養(yǎng)4-8天。

      所述的煙絲浸提液配方:稱取10g煙絲粉,13.3g K2HPO4·3H2O,4g KH2PO4·3H2O,0.2g MgSO4·7H2O,1g麥芽糖,1g蛋白胨,量取0.5mL微量元素溶液加入到500mL的蒸餾水中,用蒸餾水定容至1000mL,分裝,殺菌;所述的微量元素溶液是用0.1mol/L鹽酸將MnSO4·7H2O 0.4g,CaCl2·2H2O 0.2g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2g溶解并定容至100mL。

      應用于煙株葉面噴灑的解淀粉芽孢桿菌DGY18菌懸液的制備方法為:純菌株接入100mL液體營養(yǎng)培養(yǎng)基30℃,120r/min的搖床振蕩培養(yǎng)過夜,按體積百分比取5%-10%培養(yǎng)液加入到2.5L的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時。

      所述的液體營養(yǎng)基配方:牛肉膏5g,蛋白胨10g,氯化鈉5g,水1000mL,調(diào)節(jié)pH為7.0-7.2。

      每株健康煙株噴灑25mL菌懸液。

      所述的內(nèi)生菌的解淀粉芽孢桿菌DGY18獲得方法為:

      取生長性狀良好、無病蟲害癥狀的、有代表性的健康煙草整株煙草植株,于超凈工作臺下分別取其葉脈、莖、根,用無菌水處理干凈,分別取其前中后三段,分別放入75%的酒精中浸泡5min,用無菌濾紙擦干;去除外表皮切成薄片;用無菌鑷子將薄片放到三種培養(yǎng)基的表面,每個平板放3片。將平板分別放置于37℃與28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1-3天,將生長出來的煙草內(nèi)生菌放在煙堿培養(yǎng)基中,觀察其生長情況。將初篩得到的降煙堿純菌株分別接入裝有5mL液體煙堿培養(yǎng)基的試管中,搖床震蕩培養(yǎng)2d,然后將培養(yǎng)液10000r/min離心10min,用0.9%生理鹽水將離心后的菌體配制成菌懸液,再將5mL菌懸液加入裝有45mL液體煙堿培養(yǎng)基的三角瓶中,每種降煙堿株3個平行,于30℃,200r/min的搖床振蕩培養(yǎng),以50mL未加煙堿的液體培養(yǎng)基作為空白,每2d測1次培養(yǎng)液中的煙堿含量,判定菌株降解煙堿的能力。

      菌株DGY18在牛肉膏瓊脂平板上生長良好,菌落周圍不整齊,呈現(xiàn)鋸齒狀,菌落白色、表面不濕潤、干燥而有皺褶,邊緣凸起,不透明。在光學顯微鏡下觀察,DGY18菌株為規(guī)則的長桿菌,兩段鈍圓而平整,往往成對分布,中生芽孢,菌體周圍無夾膜或粘液層。營養(yǎng)瓊脂平板生長情況很好,菌落形狀不規(guī)則,邊緣齒輪型,呈乳白色,表面粗糙、褶皺,凹起,不透明。菌株DGY18是一種桿菌,成對生長,兩端鈍圓,在48小時后有芽孢產(chǎn)生,無莢膜。

      根據(jù)16SrDNA序列分析,確定該菌株為解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens),命名為Bacillus amyloliquefaciens DGY18。

      本發(fā)明的有益效果:

      本發(fā)明從煙草植株中分離一株降解煙堿的內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌DGY18,利用該內(nèi)生菌可使上部煙葉中的煙堿降解30%-40%;煙絲浸提液中的煙堿降解98%。本發(fā)明比使用煙草種植、化學處理法等調(diào)控措施來降低煙草中煙堿含量的方法更省時省力,而且成本低、降煙堿效果更佳,不僅降低了煙堿的含量,還提高了煙草的可利用性,因而內(nèi)生解淀粉芽孢桿菌DGY18在降低上部煙葉煙堿含量方面具有良好的應用前景。

      解淀粉芽孢桿菌DGY18(Bacillus amyloliquefaciens DGY18)

      保藏單位名稱:中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心

      保藏編號為:CGMCC No.11900

      保藏日期:2015年12月22日

      地址:北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號。

      具體實施方式:

      下面結(jié)合實施例證進一步說明本發(fā)明,而非限制本發(fā)明。

      煙絲浸提液中煙堿降解率的測定:

      配制一系列濃度梯度的含有煙堿的溶液,在紫外可見分光光度計上測煙堿的吸光度值,得到吸光度值和煙堿濃度的線性相關曲線。

      煙堿降解率的計算過程:

      煙堿降解率=100%×(C0-C1)/C0

      C0:接入菌株解淀粉芽孢桿菌DGY18前液體煙堿培養(yǎng)基中煙堿濃度;

      C1:接入解淀粉芽孢桿菌DGY18后某天液體煙堿培養(yǎng)基中煙堿濃度。

      煙葉中煙堿含量的測定:

      準確稱取煙葉樣品0.1g到100ml三角瓶中,再稱取樣品兩倍的活性炭粉末加入25ml,0.5mol/L的HCl溶液搖勻,在沸水中加熱5min,取出定容至250ml容量瓶中,用濾紙過濾,去掉開始的10ml濾液,再過濾大約30ml進行比色,分光光度計測定濾液,236nm、259nm、282nm波長處的吸光度。

      計算公式:

      游離煙堿(mg/g)=1.059×[A259—0.5(A236+A282)]×V×1 000/樣品重×(1-含水率)×34.3×1 000

      1.059為校正系數(shù),V為定容體積,34.3為煙堿的比吸收系數(shù)。

      實施例1

      煙絲浸提液配方:稱取10g煙絲粉,13.3g K2HPO4·3H2O,4g KH2PO4·3H2O,0.2g MgSO4·7H2O,1g麥芽糖,1g蛋白胨,量取0.5mL微量元素溶液(微量元素溶液是用0.1mol/L鹽酸將MnSO4·7H2O 0.4g,CaCl2·2H2O 0.2g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2g溶解并定容至100mL。)加入到500mL的蒸餾水中,用蒸餾水定容至1000mL,分裝,殺菌。

      應用于煙絲浸提液接種的解淀粉芽孢桿菌DGY18菌懸液的制備:純菌株接入5mL液體煙堿培養(yǎng)基中,30℃,200r/min搖床震蕩培養(yǎng)2d,然后將培養(yǎng)液10000r/min離心10min,收集菌體,用0.9%生理鹽水將離心后的菌體配制成菌懸液(菌體濃度為107-108CFU/mL)。

      煙堿培養(yǎng)基配方:K2HPO4 13.3g,KH2PO4 4g,MgSO4·7H2O 0.2g,微量元素溶液0.5mL,調(diào)pH至7.0,定容至1000mL,滅菌后以濾菌法加入1g純煙堿,混勻;所述的微量元素溶液是用0.1mol/L鹽酸將MnSO4·7H2O 0.4g,CaCl2·2H2O 0.2g,F(xiàn)eSO4·7H2O 0.2g溶解并定容至100mL。

      按煙絲浸提液體積5-10%接種解淀粉芽孢桿菌DGY18后,在30℃條件下120r/min搖床培養(yǎng)4-8天;最后煙堿降解率達98%。

      實施例2

      應用于煙株葉面噴灑的解淀粉芽孢桿菌DGY18菌懸液的制備:純菌株接入100mL液體營養(yǎng)培養(yǎng)基30℃,120r/min的搖床振蕩培養(yǎng)過夜,按體積百分比取5%-10%培養(yǎng)液加入到2.5L的液體營養(yǎng)培養(yǎng)基培養(yǎng)48小時。液體營養(yǎng)基配方:牛肉膏5g,蛋白胨10g,氯化鈉5g,水1000mL,調(diào)節(jié)pH為7.0-7.2。在煙草生長進入成熟期,每株煙重點噴灑上部的6片煙葉,每株煙株噴灑25mL菌液,處理20天(每隔2天處理一次,即第1、4、7、10、13、16、19天各處理一次,于當天的傍晚進行處理),第0、3、6、9、12、15、18天(于當天早晨取樣)對各處理煙株的煙葉各取樣一次,采用所述的煙堿測定方法對煙株的煙堿含量進行測定,在試驗期間,煙堿含量下降了30%-40%。

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