本發(fā)明屬于屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立方法。

背景技術(shù)：

流行病學(xué)和臨床研究證實(shí)大約25%的成人腫瘤由慢性炎癥引起。例如，胃、肝臟及宮頸的慢性病毒或細(xì)菌感染、以及肺長期暴露于煙草煙霧或其它環(huán)境化合物，均會(huì)明顯促使這些器官的慢性組織損傷及隨后的腫瘤發(fā)生。慢性潰瘍性結(jié)腸炎（Crohn?。┌l(fā)生大腸癌的風(fēng)險(xiǎn)較正常人高4～20倍；出血性潰瘍性結(jié)直腸炎惡變風(fēng)險(xiǎn)性更大，病程超過10年者，有50%發(fā)展為癌；抗炎制劑的應(yīng)用與結(jié)直腸癌、乳腺癌及胃癌發(fā)病率的降低有關(guān)。

盡管炎癥與癌癥的關(guān)系已經(jīng)明確，且被稱為“癌癥的第七大特征”，但慢性炎癥在癌癥中發(fā)揮作用的潛在機(jī)制仍未明了，慢性炎癥促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲及轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制仍有待深入研究。目前關(guān)于炎癥促進(jìn)結(jié)直腸癌生長轉(zhuǎn)移的研究仍局限于體外細(xì)胞水平，即采用各種炎癥因子處理結(jié)直腸癌細(xì)胞，觀察對(duì)細(xì)胞生長轉(zhuǎn)移能力的影響。但體外細(xì)胞水平的研究具有一定的局限性，首先，炎癥因子種類眾多，單一的炎癥因子刺激或幾種炎癥因子的組合均難以反映活體內(nèi)的真實(shí)情況；其次，體外培養(yǎng)環(huán)境與體內(nèi)的真實(shí)情況差異巨大，體內(nèi)環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞處于三維生長狀態(tài)，且受到間質(zhì)細(xì)胞、新生血管生成、多種炎癥細(xì)胞浸潤等諸多因素的影響。因此，研究炎癥對(duì)結(jié)直腸癌生長轉(zhuǎn)移的影響，有必要建立活體的動(dòng)物模型，但目前尚無成功的范例。

建立用于研究慢性炎癥對(duì)結(jié)直腸癌演進(jìn)過程影響的動(dòng)物模型，需要從兩方面入手，一方面，需在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的結(jié)直腸壁組織上誘導(dǎo)出或移植入結(jié)直腸癌，建立結(jié)直腸原位的腫瘤模型；另一方面，需要在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物上誘導(dǎo)出結(jié)直腸慢性炎癥。兩方面相結(jié)合，方可建立具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型。

裸鼠結(jié)直腸原位移植瘤模型，是目前比較經(jīng)典的結(jié)直腸原位腫瘤模型。首先將人結(jié)直腸癌細(xì)胞注入裸鼠腋下，建立移植瘤模型。待腫瘤長至0.5～1cm后，摘除腫瘤，并用無菌眼科剪剪至直徑約2mm的瘤塊。取另一只未接種過腫瘤的裸鼠，將一2mm瘤塊縫至該裸鼠結(jié)直腸腸壁上，即建立裸鼠原位結(jié)直腸癌模型。

目前誘導(dǎo)結(jié)直腸慢性炎癥較常用的是2,4,6-三硝基苯磺酸（2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid，TNBS）與乙醇的混合液。TNBS是一種半抗原，可與腸道的高分子組織蛋白相結(jié)合，轉(zhuǎn)變成抗原。誘發(fā)機(jī)體產(chǎn)生免疫反應(yīng)，引發(fā)結(jié)腸炎。TNBS誘導(dǎo)的炎癥性腸病趨向于克羅恩病，引發(fā)以Th1型為主的免疫反應(yīng)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：針對(duì)目前尚無成功建立炎癥對(duì)結(jié)直腸癌生長轉(zhuǎn)移的動(dòng)物模型范例的缺點(diǎn)，本發(fā)明提供一種具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立方法。

技術(shù)方案：一種具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立方法，步驟如下：

第一步，pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒的構(gòu)建：

1) 通過下列反應(yīng)體系和條件制備得到pBabe-puro 酶切產(chǎn)物，其中DNA為pBabe-puro 質(zhì)粒，

反應(yīng)體系：

DNA，1 μg

10×NEbuffer3+BSA，3 μL

內(nèi)切酶BamHI，1單位

內(nèi)切酶EcoRI，1單位

加滅菌超純水至體積30 μL

反應(yīng)條件：37℃水浴2h

2) 將pBabe-puro 酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含5100 bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到純化后的pBabe-puro 酶切產(chǎn)物，

3) 通過下列PCR反應(yīng)體系和條件制備得到CMV-EGFP DNA片段，其中DNA模板為pEGFP-C1質(zhì)粒，

PCR反應(yīng)體系如下：

5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ plus）,10 μL

dNTP Mixture（各2.5 mM）,4 μL

正向引物1：5'CCGGATCCTAATAGTAATCAATTACGGG3'（10 μM）,1 μL

反向引物2：5'AAGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3'（10 μM）,1 μL

DNA模板,100 ng

PrimeSTARHS DNA Polymerase（2.5 U/μl）,0.5 μL

加滅菌超純水至體積50 μL

反應(yīng)條件：

98℃ 10 sec

55℃ 15 sec

72℃ 1 min/kbp

30 Cycles

產(chǎn)物：1400bp

4) 將CMV-EGFP DNA片段采用AxyPrep PCR 清潔試劑盒進(jìn)行純化，得到尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，

5) 通過下列反應(yīng)體系和條件制備得到CMV-EGFP酶切產(chǎn)物，其中DNA為尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，

反應(yīng)體系：

DNA，1 μg

10×NEbuffer3+BSA，3 μL

內(nèi)切酶BamHI，1單位

內(nèi)切酶EcoRI，1單位

加滅菌超純水至體積30 μL

反應(yīng)條件：37℃水浴2h

6) 將CMV-EGFP酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含1400 bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物，

7) 采用T4 DNA連接酶和快速連接試劑盒，將純化后的CMV-EGFP 酶切產(chǎn)物與純化后的pBabe-puro 酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物，

8) 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，并進(jìn)行抗性篩選，得到抗性篩選后的單克隆菌落，

9) 將抗性篩選后的菌落進(jìn)行陽性克隆篩選，得到pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒；

第二步，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過表達(dá)系統(tǒng)的建立：

將pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒與輔助包裝原件載體質(zhì)粒VSVG和pMDL g/p RRE用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，即得逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過表達(dá)系統(tǒng)，其中質(zhì)粒的質(zhì)量比例如下：pBabe-CMV-EGFP-puro:VSVG:pMDL g/p RRE=2:1:1；

第三步，穩(wěn)定表達(dá)EGFP的結(jié)直腸癌細(xì)胞系的建立：

將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過表達(dá)系統(tǒng)加入結(jié)直腸癌細(xì)胞培養(yǎng)液中，感染細(xì)胞，受感染的細(xì)胞的EGFP基因可整合至細(xì)胞基因組中，形成穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞，以終濃度4μg/mL嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞，建立得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP的結(jié)直腸癌細(xì)胞系；

第四步，裸鼠腋下結(jié)直腸癌移植瘤模型的建立：

① 將1×10⁷個(gè)穩(wěn)定表達(dá)EGFP的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整體積為50μL，細(xì)胞密度為1×10⁷/50μL，再與50μL Matrigel等體積混合，得到細(xì)胞懸液，至于冰上備用，

② 采用胰島素注射器，將100μL細(xì)胞懸液注射入A組裸鼠腋下，2周后即得裸鼠腋下結(jié)直腸癌移植瘤模型；

第五步，炎癥模型的建立：

① B組裸鼠禁食24小時(shí)，

② 根據(jù)B組裸鼠體重取用TNBS，加水補(bǔ)至50μL，加入50μL無水乙醇，即配成100μL TNBS工作液，其中每1kg裸鼠取用100 mg的TNBS，

③ B組裸鼠用乙醚麻醉，提尾巴促排便，俯臥位，將灌胃針經(jīng)小鼠肛門輕輕插入結(jié)腸，至針管頂端距離肛門4cm處，使小鼠倒立，注入100μL TNBS工作液，使小鼠保持倒立姿態(tài)30s，拔出灌胃針，

④ 一周后，重復(fù)一遍第五步①～③，繼續(xù)飼養(yǎng)一周，即得炎癥模型；

第六步，具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立：

① 摘除第四步的A組裸鼠腋下的腫瘤，用無菌眼科剪剪碎至直徑約2mm瘤塊，

② 取一瘤塊，直接縫合至第五步的B組裸鼠結(jié)直腸腸壁上，

③ 重復(fù)第五步①～③，繼續(xù)飼養(yǎng)一周，

④ 再次重復(fù)第五步①～③，繼續(xù)飼養(yǎng)一周，即在裸鼠體內(nèi)建立具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型。

上述所述的第一步的2)中采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化的具體步驟是：

①在紫外燈下切下含有目的DNA 的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎，計(jì)算凝膠重量，該重量作為一個(gè)凝膠體積；

②將凝膠放入Eppendorf管中，再往Eppendorf管加入3 個(gè)凝膠體積的Buffer DE-A，混合均勻后于75℃ 加熱，間斷混合直至凝膠塊完全熔化；

③再加入0.5 個(gè)凝膠體積的Buffer DE-B，混合均勻，得到混合液；

④吸取步驟③中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA 制備管中，將制備管置于2 mL 離心管中，在12,000×g離心力下離心1 min，棄濾液；

⑤將制備管置回2 mL 離心管，加入500 μL Buffer W1，在12,000×g 離心力下離心30 s，棄濾液；

⑥再將制備管置回2 mL 離心管，加入700 μL Buffer W2，在12,000×g 離心力下離心30 s，棄濾液，再加入700 μL Buffer W2，在12,000×g 離心力下離心1 min，棄濾液；

⑦將制備管置回2mL 離心管中，在12,000×g 離心力下離心1 min；

⑧將制備管置于潔凈的1.5 mL 離心管中，在制備膜中央加入25-30 μL Eluent 或去離子水，室溫靜置1 min，在12,000×g 離心力下離心1min 洗脫DNA，即完成純化。

上述所述的第一步的4) 中采用AxyPrep PCR 清潔試劑盒進(jìn)行純化的具體步驟是：

① 在PCR、酶切、酶標(biāo)、或測(cè)序反應(yīng)液中，加3個(gè)體積的Buffer PCR-A，Buffer PCR-A，不足100 μL時(shí)加至100 μL，接著混勻，轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2 mL離心管中，12,000×g 離心1 min，棄濾液；

② 將制備管置回2 mL離心管，加700 μLBuffer W2，12,000×g 離心1 min，棄濾液；

③ 將制備管置于離心管中，將制備管置回 2 mL離心管，加 400 μL Buffer W2，12,000×g 離心1 min；

④ 將制備管置于潔凈的1.5 mL離心管中，在制備管膜中央加25-30 μLEluent或去離子水，室溫靜置1 min，12,000×g 離心1 min 洗脫DNA。

上述所述的第一步的7)中將純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物與純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接的具體步驟是：

①將50 ng純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物和3倍摩爾量的純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物混合，加蒸餾水至總體積為10 μl；

②加入10 μl 2×Quick Ligation Buffer，混勻；

③加入1 μl Quick T4 DNA連接酶，混勻；

④在室溫下作用5分鐘后即得連接產(chǎn)物，鏈接產(chǎn)物貯存于-20℃的環(huán)境中。

上述所述的第一步的8)中抗性刪選的具體步驟是：

①取一管感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，在冰上溶解后加入3μL連接產(chǎn)物，混勻，冰浴30min；

②將管靜置于42℃中水浴90s后，迅速轉(zhuǎn)移至冰中，冰浴1-2min；

③在管中加入900 μL LB，在37℃中水浴10min；

④將管置于搖床中，在37℃、轉(zhuǎn)速210 rpm下?lián)u菌45min；

⑤將100 μL已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布于氨芐青霉素平板上；

⑥倒置平板，在37℃培養(yǎng)16-20h，即完成抗性篩選。

上述所述的第一步的9)中陽性克隆篩選的具體步驟是：

(1) 菌落PCR篩選：

挑取單克隆菌落，置于300μL含氨芐青霉素的LB中，在37℃、轉(zhuǎn)速280 rpm下?lián)u菌 6-8h，得到菌液，菌液采用PrimerSTAR HS DNA polymerase進(jìn)行PCR篩選，得到菌落PCR結(jié)果陽性的克?。?/p>

(2) 酶切鑒定：

取菌落PCR結(jié)果陽性的克隆，采用質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，并采用BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，能切出1400bp片段的即為酶切鑒定陽性的克?。?/p>

(3) 測(cè)序鑒定：

取酶切鑒定陽性的克隆，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用Clustalx軟件與EGFP序列進(jìn)行比對(duì)，序列匹配即構(gòu)建成功，即得到pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒。

上述所述的 (2)中采用質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒的具體步驟是：

①取1-4 mL在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌落PCR結(jié)果陽性的克隆的菌液，在12,000×g離心力下離心1 min，棄盡上清液；

②加入250 μL Buffer S1 懸浮細(xì)菌進(jìn)行沉淀；

③加入250 μL Buffer S2，上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液；

④加350 μL Buffer S3，上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次，在12,000×g離心力下離心10 min；

⑤吸取步驟④中的離心上清液并轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2 mL離心管中，在12,000×g離心力下離心1 min，棄濾液；

⑥將制備管置回離心管，加入500 μL Buffer W1，在12,000×g離心力下離心1 min，棄濾液；

⑦將制備管置回離心管，加入700 μL Buffer W2，在12,000×g離心力下離心1 min，棄濾液，再加入700 μL Buffer W2，在12,000×g離心力下離心1 min，棄濾液；

⑧將制備管置回2 mL離心管中，在12,000×g離心力下離心1 min；

⑨將制備管移入1.5 mL離心管中，在制備管膜中央加60-80 μL Eluent或去離子水，室溫靜置1 min，在12,000×g離心力下離心1 min，即完成質(zhì)粒的提取。

上述所述的第二步中逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過表達(dá)系統(tǒng)建立的具體步驟是：

①接種293T細(xì)胞至匯合度為70-90%時(shí)轉(zhuǎn)染；

②使用無血清培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 3000試劑；

③使用無血清培養(yǎng)基稀釋pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒、VSVG質(zhì)粒和pMDL g/p RRE質(zhì)粒，然后添加P3000試劑，混勻，得到預(yù)混液；

④在已稀釋的Lipofectamine 3000試劑中加入等量的預(yù)混液，室溫孵育5min，得到DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物；

⑤將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中；

⑥轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24、48、72h，分別收集富含逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的上清液，上清液通過超離心濃縮病毒，即得到逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過表達(dá)系統(tǒng)。

有益效果：本發(fā)明提供的一種具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立方法，該建立方法中使用的EGFP能夠被激光器激發(fā)產(chǎn)生熒光，其發(fā)光強(qiáng)度并可被相應(yīng)儀器設(shè)備（小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)，IVIS; Lumina II, PerkinElmer公司）檢測(cè)到，從而能夠證實(shí)腫瘤的存在，并評(píng)估腫瘤的大小。

附圖說明

圖1為采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)炎癥組和對(duì)照組對(duì)腫瘤生長的影響檢測(cè)結(jié)果圖。

圖2為處死炎癥組和對(duì)照組的裸鼠取出腫瘤后的稱重結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

以下實(shí)施例中所使用的pBabe-puro 質(zhì)粒購自Addgene公司，酶切反應(yīng)采用NEB公司限制性內(nèi)切酶。

AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒購自AXYGEN公司。

pEGFP-C1質(zhì)粒購自Clontech公司，PCR反應(yīng)采用TAKARA公司的PrimerSTAR HS DNA polymerase，PrimerSTAR HS DNA polymerase購自TAKARA公司。

AxyPrep PCR 清潔試劑盒購自AXYGEN公司。

尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段以pEGFP-C1質(zhì)粒為模板，用PCR反應(yīng)體系做出。

T4 DNA連接酶和快速連接試劑盒購自NEB公司。

感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞購自Tiangeng公司。

質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒購自AXYGEN公司。

質(zhì)粒VSVG和pMDL g/p RRE購自Addgene公司，Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑購自Lifetechnologies公司。

TNBS（2,4,6-三硝基苯磺酸，2,4,6-trinitrobenzenesulfonic acid）購自Sigma公司，（批號(hào)：1002020045），為50 g／L水溶液。

實(shí)施例1

一種具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立方法，步驟如下：

第一步，pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒的構(gòu)建：

1) 通過下列反應(yīng)體系和條件制備得到pBabe-puro 酶切產(chǎn)物，其中DNA為pBabe-puro 質(zhì)粒，

反應(yīng)體系：

DNA，1 μg

10×NEbuffer3+BSA，3 μL

內(nèi)切酶BamHI，1單位

內(nèi)切酶EcoRI，1單位

加滅菌超純水至體積30 μL

反應(yīng)條件：37℃水浴2h

2) 將pBabe-puro 酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含5100 bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到純化后的pBabe-puro 酶切產(chǎn)物，其中采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化的具體步驟是：

①在紫外燈下切下含有目的DNA 的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎，計(jì)算凝膠重量，該重量作為一個(gè)凝膠體積；

②將凝膠放入Eppendorf管中，再往Eppendorf管加入3 個(gè)凝膠體積的Buffer DE-A，混合均勻后于75℃ 加熱，間斷混合直至凝膠塊完全熔化；

③再加入0.5 個(gè)凝膠體積的Buffer DE-B，混合均勻，得到混合液；

④吸取步驟③中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA 制備管中，將制備管置于2 mL 離心管中，在12,000×g離心力下離心1 min，棄濾液；

⑤將制備管置回2 mL 離心管，加入500 μL Buffer W1，在12,000×g 離心力下離心30 s，棄濾液；

⑥再將制備管置回2 mL 離心管，加入700 μL Buffer W2，在12,000×g 離心力下離心30 s，棄濾液，再加入700 μL Buffer W2，在12,000×g 離心力下離心1 min，棄濾液；

⑦將制備管置回2mL 離心管中，在12,000×g 離心力下離心1 min；

⑧將制備管置于潔凈的1.5 mL 離心管中，在制備膜中央加入25-30 μL Eluent 或去離子水，室溫靜置1 min，在12,000×g 離心力下離心1min 洗脫DNA，即完成純化；

3) 通過下列PCR反應(yīng)體系和條件制備得到CMV-EGFP DNA片段，其中DNA模板為pEGFP-C1質(zhì)粒，

PCR反應(yīng)體系如下：

5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ plus）,10 μL

dNTP Mixture（各2.5 mM）,4 μL

正向引物1：5'CCGGATCCTAATAGTAATCAATTACGGG3'（10 μM）,1 μL

反向引物2：5'AAGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3'（10 μM）,1 μL

DNA模板,100 ng

PrimeSTARHS DNA Polymerase（2.5 U/μl）,0.5 μL

加滅菌超純水至體積50 μL

反應(yīng)條件：

98℃ 10 sec

55℃ 15 sec

72℃ 1 min/kbp

30 Cycles

產(chǎn)物：1400bp

4) 將CMV-EGFP DNA片段采用AxyPrep PCR 清潔試劑盒進(jìn)行純化，得到尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，其中采用AxyPrep PCR 清潔試劑盒進(jìn)行純化的具體步驟是：

① 在PCR、酶切、酶標(biāo)、或測(cè)序反應(yīng)液中，加3個(gè)體積的Buffer PCR-A，Buffer PCR-A，不足100 μL時(shí)加至100 μL，接著混勻，轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2 mL離心管中，12,000×g 離心1 min，棄濾液；

② 將制備管置回2 mL離心管，加700 μLBuffer W2，12,000×g 離心1 min，棄濾液；

③ 將制備管置于離心管中，將制備管置回 2 mL離心管，加 400 μL Buffer W2，12,000×g 離心1 min；

④ 將制備管置于潔凈的1.5 mL離心管中，在制備管膜中央加25-30 μLEluent或去離子水，室溫靜置1 min，12,000×g 離心1 min 洗脫DNA；

5) 通過下列反應(yīng)體系和條件制備得到CMV-EGFP酶切產(chǎn)物，其中DNA為尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，

反應(yīng)體系：

DNA，1 μg

10×NEbuffer3+BSA，3 μL

內(nèi)切酶BamHI，1單位

內(nèi)切酶EcoRI，1單位

加滅菌超純水至體積30 μL

反應(yīng)條件：37℃水浴2h

6) 將CMV-EGFP酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含1400 bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物，

7) 采用T4 DNA連接酶和快速連接試劑盒，將純化后的CMV-EGFP 酶切產(chǎn)物與純化后的pBabe-puro 酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物，其中將純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物與純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接的具體步驟是：

①將50 ng純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物和3倍摩爾量的純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物混合，加蒸餾水至總體積為10 μl；

②加入10 μl 2×Quick Ligation Buffer，混勻；

③加入1 μl Quick T4 DNA連接酶，混勻；

④在室溫下作用5分鐘后即得連接產(chǎn)物，鏈接產(chǎn)物貯存于-20℃的環(huán)境中；

8) 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，并進(jìn)行抗性篩選，得到抗性篩選后的單克隆菌落，其中抗性刪選的具體步驟是：

①取一管感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，在冰上溶解后加入3μL連接產(chǎn)物，混勻，冰浴30min；

②將管靜置于42℃中水浴90s后，迅速轉(zhuǎn)移至冰中，冰浴1-2min；

③在管中加入900 μL LB，在37℃中水浴10min；

④將管置于搖床中，在37℃、轉(zhuǎn)速210 rpm下?lián)u菌45min；

⑤將100 μL已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布于氨芐青霉素平板上；

⑥倒置平板，在37℃培養(yǎng)16-20h，即完成抗性篩選；

9) 將抗性篩選后的菌落進(jìn)行陽性克隆篩選，得到pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒，其中陽性克隆篩選的具體步驟是：

(1) 菌落PCR篩選：

挑取單克隆菌落，置于300μL含氨芐青霉素的LB中，在37℃、轉(zhuǎn)速280 rpm下?lián)u菌 6-8h，得到菌液，菌液采用PrimerSTAR HS DNA polymerase進(jìn)行PCR篩選，得到菌落PCR結(jié)果陽性的克??；

(2) 酶切鑒定：

取菌落PCR結(jié)果陽性的克隆，采用質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，并采用BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，能切出1400bp片段的即為酶切鑒定陽性的克隆，采用質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒的具體步驟是：

①取1-4 mL在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過夜的菌落PCR結(jié)果陽性的克隆的菌液，在12,000×g離心力下離心1 min，棄盡上清液；

②加入250 μL Buffer S1 懸浮細(xì)菌進(jìn)行沉淀；

③加入250 μL Buffer S2，上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液；

④加350 μL Buffer S3，上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次，在12,000×g離心力下離心10 min；

⑤吸取步驟④中的離心上清液并轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2 mL離心管中，在12,000×g離心力下離心1 min，棄濾液；

⑥將制備管置回離心管，加入500 μL Buffer W1，在12,000×g離心力下離心1 min，棄濾液；

⑦將制備管置回離心管，加入700 μL Buffer W2，在12,000×g離心力下離心1 min，棄濾液，再加入700 μL Buffer W2，在12,000×g離心力下離心1 min，棄濾液；

⑧將制備管置回2 mL離心管中，在12,000×g離心力下離心1 min；

⑨將制備管移入1.5 mL離心管中，在制備管膜中央加60-80 μL Eluent或去離子水，室溫靜置1 min，在12,000×g離心力下離心1 min，即完成質(zhì)粒的提??；

(3) 測(cè)序鑒定：

取酶切鑒定陽性的克隆，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用Clustalx軟件與EGFP序列進(jìn)行比對(duì)，序列匹配即構(gòu)建成功，即得到pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒。

第二步，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過表達(dá)系統(tǒng)的建立：

①接種293T細(xì)胞至匯合度為70-90%時(shí)轉(zhuǎn)染；

②使用無血清培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 3000試劑；

③使用無血清培養(yǎng)基稀釋pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒、VSVG質(zhì)粒和pMDL g/p RRE質(zhì)粒，然后添加P3000試劑，混勻，得到預(yù)混液，其中質(zhì)粒的質(zhì)量比例如下：pBabe-CMV-EGFP-puro:VSVG:pMDL g/p RRE=2:1:1；

④在已稀釋的Lipofectamine 3000試劑中加入等量的預(yù)混液，室溫孵育5min，得到DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物；

⑤將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中；

⑥轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24、48、72h，分別收集富含逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的上清液，上清液通過超離心濃縮病毒，即得到逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過表達(dá)系統(tǒng)。

第三步，穩(wěn)定表達(dá)EGFP的結(jié)直腸癌細(xì)胞系的建立：

將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過表達(dá)系統(tǒng)加入直腸癌細(xì)胞培養(yǎng)液中，感染細(xì)胞，受感染的細(xì)胞的EGFP基因可整合至細(xì)胞基因組中，形成穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞，以終濃度4μg/mL嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞，建立得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP的直腸癌細(xì)胞系；

第四步，裸鼠腋下結(jié)直腸癌移植瘤模型的建立：

① 將1×10⁷個(gè)穩(wěn)定表達(dá)EGFP的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整體積為50μL，細(xì)胞密度為1×10⁷/50μL，再與50μL Matrigel等體積混合，得到細(xì)胞懸液，至于冰上備用，

② 采用胰島素注射器，將100μL細(xì)胞懸液注射入A組裸鼠腋下，2周后即得裸鼠腋下結(jié)直腸癌移植瘤模型；

第五步，炎癥模型的建立：

① B組裸鼠禁食24小時(shí)，

② 根據(jù)B組裸鼠體重取用TNBS，加水補(bǔ)至50μL，加入50μL無水乙醇，即配成100μL TNBS工作液，其中每1kg裸鼠取用100 mg的TNBS，

③ B組裸鼠用乙醚麻醉，提尾巴促排便，俯臥位，將灌胃針經(jīng)小鼠肛門輕輕插入結(jié)腸，至針管頂端距離肛門4cm處，使小鼠倒立，注入100μL TNBS工作液，使小鼠保持倒立姿態(tài)30s，拔出灌胃針，

④ 一周后，重復(fù)一遍第五步①～③，繼續(xù)飼養(yǎng)一周，即得炎癥模型；

第六步，具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立：

① 摘除第四步的A組裸鼠腋下的腫瘤，用無菌眼科剪剪碎至直徑約2mm瘤塊，

② 取一瘤塊，直接縫合至第五步的B組裸鼠結(jié)直腸腸壁上，

③ 重復(fù)第五步①～③，繼續(xù)飼養(yǎng)一周，

④ 再次重復(fù)第五步①～③，繼續(xù)飼養(yǎng)一周，即在裸鼠體內(nèi)建立具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型。

對(duì)比例1

本對(duì)比例直接在裸鼠的結(jié)直腸腸壁上接種腫瘤胞，未進(jìn)行TNBS處理（即不誘導(dǎo)形成炎癥）。

將實(shí)施例1中的進(jìn)行TNBS處理的裸鼠命名為炎癥組，對(duì)比例1中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的未進(jìn)行TNBS處理的裸鼠命名為對(duì)照組，炎癥組和對(duì)照組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)的裸鼠各為25只。

采用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)檢測(cè)炎癥對(duì)腫瘤生長的影響。得到的檢測(cè)結(jié)果如圖1所示。由圖1可知，炎癥組腫瘤體積明顯大于對(duì)照組。說明炎癥促進(jìn)結(jié)直腸癌生長。（**P<0.01，與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。）

處死裸鼠后，取出腫瘤并稱重。稱重結(jié)果如圖2所示，炎癥組腫瘤明顯大于對(duì)照組。說明炎癥促進(jìn)結(jié)直腸癌生長。（**P<0.01，與對(duì)照組有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。）

剖腹探查發(fā)現(xiàn)，炎癥組實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均出現(xiàn)腫瘤腹腔淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，而對(duì)照組均未見腫瘤轉(zhuǎn)移。說明炎癥促進(jìn)結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移。