本發(fā)明涉及一種體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型試劑盒，屬于生物
技術(shù)領(lǐng)域：
。
背景技術(shù)：
：當(dāng)體內(nèi)的活性氧水平失調(diào)，活性氧水平較高時，就會引起生物體氧化損傷，大量研究表明許多疾病如糖尿病、癌癥、亨廷頓氏舞蹈癥、阿茲海默癥、帕金森綜合癥、躁郁癥、精神分裂癥、焦慮癥、非酒精性脂肪肝炎、心血管疾病等病理過程都與活性氧導(dǎo)致的氧化損傷有關(guān)。目前，體內(nèi)活性氧水平失調(diào)的動物模型多以小鼠為主，但小鼠模型存在周期長，成本高，工作量大的問題，并且難以實現(xiàn)高通量。因此，大家急需一種方便、快速、低成本、高通量的體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型試劑盒。上世紀(jì)70年代初，有研究者開始嘗試使用秀麗隱桿線蟲作為模式生物，開創(chuàng)了一個全新的科研領(lǐng)域。秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditiselegans)是一種常見的模式生物，秀麗隱桿線蟲成蟲體長1mm左右，全身透明，發(fā)育過程中很容易在顯微鏡下對其細(xì)胞和組織進行跟蹤觀察。秀麗隱桿線蟲mev-1基因編碼線粒體呼吸鏈復(fù)合體II內(nèi)膜蛋白的亞基細(xì)胞色素b大亞基(cytochromeb,cytb)。MEV-1蛋白是呼吸鏈電子傳遞和氧化磷酸化的關(guān)鍵蛋白。mev-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲因體內(nèi)活性氧增加而使細(xì)胞代謝異常，最引人關(guān)注的表型就是早衰。因此如果能建立以mev-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲為模型的試劑盒，將極大方便科研人員研究相關(guān)體內(nèi)活性氧水平失調(diào)引起的疾病。本發(fā)明建立的是以體內(nèi)活性氧水平失調(diào)的秀麗隱桿線蟲為基礎(chǔ)的動物模型試劑盒，該試劑盒中的秀麗隱桿線蟲可以模擬體內(nèi)活性氧上升所致的氧化損傷 而造成的體內(nèi)代謝異常，可用于研究體內(nèi)活性氧升高對機體各種生理生化代謝過程的影響，為研究相關(guān)體內(nèi)活性氧水平失調(diào)疾病的科研工作者提供了一種工具。技術(shù)實現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供以體內(nèi)活性氧水平失調(diào)的秀麗隱桿線蟲為基礎(chǔ)的動物模型試劑盒，該試劑盒使用方法簡單易行、成本低廉，該試劑盒中的秀麗隱桿線蟲可以模擬體內(nèi)活性氧上升所致的氧化損傷而造成的細(xì)胞功能失調(diào)狀態(tài)，可用于研究體內(nèi)活性氧升高變化對機體各種生理生化代謝過程的影響，為研究相關(guān)體內(nèi)活性氧水平失調(diào)疾病的科研工作者提供了一種工具。本發(fā)明的另外一個目的是提供上述體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型試劑盒的使用方法，本發(fā)明利用mev-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲作為動物模型，操作簡單、快速。本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：一種體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型試劑盒，所述試劑盒包括的材料為：①mev-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲；②NGM培養(yǎng)基；③大腸桿菌OP50。其中，所述的mev-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲是通過分子生物學(xué)手段將秀麗隱桿線蟲mev-1基因片段插入到質(zhì)粒載體上，并將其轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中，構(gòu)建克隆菌，誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的克隆菌表達mev-1的dsRNA，給秀麗隱桿線蟲飼喂克隆菌，即建立mev-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲。其中，所述mev-1基因片段是用PCR的方法從秀麗隱桿線蟲基因組DNA中擴增出來的。其中，所述質(zhì)粒載體為質(zhì)粒L4440，宿主細(xì)胞為大腸桿菌HT115(DE3)。其中，將mev-1基因片段插入到質(zhì)粒L4440兩個反向T7啟動子之間的多克隆位點處構(gòu)建重組質(zhì)粒。其中，所述的誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后的重組克隆菌時所用的誘導(dǎo)劑為異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)。本發(fā)明還提供了一種體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型試劑盒在篩選治療體內(nèi)活性氧水平失調(diào)疾病藥物中的應(yīng)用，所述活性氧水平失調(diào)是由活性氧上升引起的。本發(fā)明還提供一種體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型試劑盒在篩選治療體內(nèi)代謝異常藥物中的應(yīng)用，所述代謝異常是活性氧上升所致的氧化損傷造成的。本發(fā)明還提供一種體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型試劑盒在研究體內(nèi)活性氧升高對機體各種生理生化代謝過程的影響中的應(yīng)用。另外，本發(fā)明還提供上述體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型試劑盒的使用方法，將mev-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲用鎳鉻絲挑針分別轉(zhuǎn)移到含有待測化合物的NGM培養(yǎng)基平板和不含有待測化合物的NGM培養(yǎng)基平板上，不含有待測化合物的NGM培養(yǎng)基平板作為空白對照組，每塊平板上接種25條mev-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲，待測化合物組與空白對照組均設(shè)置3個平行，上述平板均接種大腸桿菌OP50作為秀麗隱桿線蟲食物，每天計數(shù)待測化合物組與空白對照組的秀麗隱桿線蟲的存活條數(shù)，直至平板上所有的秀麗隱桿線蟲全部死亡，計算待測化合物組與空白對照組中秀麗隱桿線蟲的壽命。同以前的方法相比，本發(fā)明存在以下優(yōu)勢：本發(fā)明利用秀麗隱桿線蟲作為模式生物，構(gòu)建mev-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型試劑盒，該藥物試劑盒具有操作簡單、快 速、高效的優(yōu)點，為研究相關(guān)體內(nèi)活性氧水平失調(diào)疾病的科研工作者提供了一種工具。附圖說明圖1為質(zhì)粒L4440的圖譜。圖2為秀麗隱桿線蟲mev-1基因RNAi后對應(yīng)基因mRNA表達量的變化。圖3為秀麗隱桿線蟲mev-1基因RNAi后體內(nèi)活性氧含量的變化。圖4為PQ對mev-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲壽命的影響。圖5為NAC對mev-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲壽命的影響。圖6為PQ對mev-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲運動能力的影響。圖7為NAC對mev-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲運動能力的影響。圖8為PQ對mev-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲抗熱脅迫能力的影響。圖9為NAC對mev-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲抗熱脅迫能力的影響。具體實施方式以下提供具體實施例以實現(xiàn)本發(fā)明所述的一種體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型試劑盒，但不限于這些實施例。1.生物材料(1)秀麗隱桿線蟲株系：秀麗隱桿線蟲野生型N2，購自CaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。(2)大腸桿菌：E.coliHT115(DE3)，作為重組質(zhì)粒的宿主細(xì)胞，CaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)；E.coliOP50，作為秀麗隱桿秀麗隱桿線蟲正常的食物，購自CaenorhabditisGeneticsCenter(CGC)。(3)質(zhì)粒載體：L4440(pPD129.36)，RNAi質(zhì)粒載體，購于Addgene。本實驗已將其轉(zhuǎn)化進E.coliHT115(DE3)菌株中。2.試劑(1)50×TAEBuffer：242gTris堿，57mL乙酸，100mL0.5mol/L的EDTA(pH8.0)，用蒸餾水定容至1000mL，使用時根據(jù)要求用蒸餾水進行稀釋。(2)1％瓊脂糖粉：將1g瓊脂糖粉溶于100mL1×TAEBuffer中，用微波爐加熱，使瓊脂糖完全溶解，室溫冷卻至60℃左右時加入適量溴化乙錠(EB)，充分混勻后倒入膠槽，插入合適的梳子，待凝膠完全凝固后拔去梳子即可使用。(3)鹽酸四環(huán)素(TetracyclineHydrochloride，Tet)：水溶，過濾除菌，母液濃度為25mg/mL，-20℃避光保存(生工生物工程(上海)股份有限公司)。(4)氨芐青霉素(Ampicillin，Amp)：水溶，過濾除菌，母液濃度為100mg/mL，-20℃避光保存(生工生物工程(上海)股份有限公司)。(5)CaCl2：水溶，高溫高壓(121℃，20min)滅菌，儲存濃度為1mol/L，4℃保存。(6)限制性內(nèi)切酶：BglII、XhoI、HindIII(購自TaKaRa公司)(7)T4連接酶(購自TaKaRa)(8)DL-2000DNAmaker和DL-10000DNAmaker(購自TaKaRa)(9)6×LoadingBuffer(購自TaKaRa)(10)膽固醇(Cholesterol)：醇溶，過濾除菌，儲存濃度為5mg/mL，4℃避光保存(天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所)。(11)MgSO4：水溶，高溫高壓(121℃，20min)滅菌，儲存濃度為1mol/L，室溫保存。(12)S基礎(chǔ)液：NaCl0.585g，K2HPO40.1g，KH2PO40.6g，用蒸餾水定 容至100mL。(13)半飽和KCl溶液：向適量體積的蒸餾水中加入過量KCl，充分?jǐn)嚢?，使溶液達到飽和狀態(tài)，過濾上清，將濾液與蒸餾水按照1:1(v:v)的比例混勻，即為半飽和KCl溶液。(14)連二亞硫酸鈉：保險粉，分子式：NaO2SSO2Na。(15)4％Na2CO3溶液：4gNa2CO3溶解于100mL蒸餾水中，室溫保存。(16)2％NaOH溶液：0.8gNaOH溶解于100mL蒸餾水中，室溫保存。(17)0.04mol/LCuSO4溶液：1g硫酸銅(CuSO4·5H2O)溶解于100ml蒸餾水中，室溫保存。(18)0.1mol/L酒石酸鉀溶液：2g酒石酸鉀溶解于100ml蒸餾水中，室溫保存。(19)Folin-Ciocalteu’s：福林酚試劑(生工生物工程(上海)股份有限公司)。(20)M9緩沖液：NaCl5g，Na2HPO46g，KH2PO43g，MgSO4·7H2O0.25g，用蒸餾水定容至1000mL。(21)堿性硫酸銅溶液：(A)將0.1mol/L酒石酸鉀溶液和0.04mol/LCuSO4溶液等體積混合均勻，(B)將4％Na2CO3溶液和2％NaOH溶液等體積混合均勻，然后將(A)液和(B)液按照50:1(v:v)的比例混合即可?，F(xiàn)配現(xiàn)用。3.試劑盒(1)基因組提取試劑盒(購自天根生化科技(北京)有限公司)(2)質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(PlasmidMiniKitI,TaKaRa)(3)DNA膠回收試劑盒(AgaroseGelDNAFragmentRecoveryKit,購自TaKaRa)(4)總RNA提取試劑盒(RNAisoPlus,購自TaKaRa)(5)反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRTreagentKit,購自TaKaRa)(6)熒光實時定量PCR試劑盒(PremixExTaqTMII,購自TaKaRa)4.培養(yǎng)基(1)NGM(NematodeGrowthMedium)培養(yǎng)基：配制如下(500mL):NaCl1.52gKH2PO48.52gK2HPO41.15g胰蛋白胨1.36g瓊脂粉8.58g配制方法：稱取上述物質(zhì)(除瓊脂粉之外)于錐形瓶中，加入500mL蒸餾水，使各組分充分溶解，再加入瓊脂粉。高溫高壓(121℃，20min)滅菌，分別加入1mol/L的MgSO4500μL，1mol/L的CaCl2500μL，5mg/mL的膽固醇500μL，充分搖勻，待瓶內(nèi)泡沫消失后倒板。如需NGM(RNAi誘導(dǎo))培養(yǎng)基，在NGM培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓(121℃，20min)滅菌后，分別加入500μL1mol/L的MgSO4，500μL1mol/L的CaCl2，500μL5mg/mL的膽固醇，待培養(yǎng)基冷卻至60-70℃時加入100mg/mLAmp母液至終濃度為100μg/mL，25mg/mLTet母液至終濃度為5μg/mL，1mol/LIPTG母液至終濃度為0.1mmol/L，充分搖勻，待瓶內(nèi)泡沫消失后倒板。(2)LB(Luria-Bertani)培養(yǎng)基：配置如下(50mL)：NaCl0.50g胰蛋白胨0.50g酵母膏0.25g配制方法：稱取上述物質(zhì)于錐形瓶中，加入50mL蒸餾水，使各組分充分溶解，用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，高溫高壓(121℃，20min)滅菌，4℃保存。如需LB固體培養(yǎng)基，按1.6-1.8％(w:v)的比例加入AgarPowder即可。如需LB(Amp+Tet)液體培養(yǎng)基，在LB液體培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓(121℃，20min)滅菌后，冷卻至60-70℃時加入100mg/mLAmp母液至終濃度為100μg/mL，25mg/mLTet母液至終濃度為5μg/mL。4℃保存。如需LB(Amp+Tet)固體培養(yǎng)基，在LB固體培養(yǎng)基經(jīng)高溫高壓(121℃，20min)滅菌后，冷卻至60-70℃時加入100mg/mLAmp母液至終濃度為100μg/mL，25mg/mLTet母液至終濃度為5μg/mL，充分搖勻，待瓶內(nèi)泡沫消失后倒板。5.主要儀器超凈工作臺(蘇州凈化設(shè)備有限公司)；高壓滅菌鍋(上海申安醫(yī)療器械廠)；電子天平(北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司)；臺式離心機(日立)；恒溫培養(yǎng)搖床(上海一恒科技有限公司)；微量移液器(Eppendorf)；PCR儀(ABI公司)；水平電泳儀(Bio-Rad公司)；凝膠成像系統(tǒng)(GE公司)；超純水儀(Millipore)；恒溫金屬浴(北京鼎昊源科技有限公司)；連續(xù)變倍體視顯微鏡(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)；紫外-可見分光光度計(上海精科)；液態(tài)氧電極(Hansatech公司)；熒光實時定量PCR儀(Bio-Rad公司)；實施例1秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型的建立1.線粒體呼吸鏈mev-1基因RNAi克隆菌的構(gòu)建(1)引物設(shè)計根據(jù)Wormbase數(shù)據(jù)庫中的相關(guān)序列信息設(shè)計合成mev-1基因的特異性的引物。具體序列如下：表1mev-1基因片段擴增引物mev-1基因的預(yù)期擴增產(chǎn)物長度為838bp，其余為酶切位點。(2)秀麗隱桿線蟲基因組DNA的提取用基因組提取試劑盒提取秀麗隱桿線蟲基因組DNA。具體操作步驟詳見試劑盒說明書。(3)mev-1基因片段的擴增使用表1中引物，利用PCR技術(shù)從秀麗隱桿線蟲基因組DNA中擴增mev-1基因的片段。PCR反應(yīng)體系如下：表2擴增mev-1基因片段的PCR反應(yīng)體系PCR的反應(yīng)程序如下：94℃3min；之后進入PCR循環(huán)，具體為：94℃30s，55℃30s，72℃1min，總共進行30個cycles；72℃5min；4℃保存。1.0％的Agarosegel電泳鑒定PCR后得到的mev-1基因片段的純度和濃度。(4)mev-1基因片段的雙酶切使用HindIII和XhoI限制性內(nèi)切酶對上一步驟中得到的mev-1基因片段進行雙酶切。37℃進行酶切2小時，將雙酶切的產(chǎn)物進行1.0％的Agarosegel電泳，再用DNA膠回收試劑盒(AgaroseGelDNAFragmentRecoveryKit,TaKaRa)回收酶切產(chǎn)物片段。(5)質(zhì)粒L4440的制備將帶有L4440質(zhì)粒的E.coliHT115(DE3)菌株在LB(Amp+Tet)固體培養(yǎng)基上劃線，37℃培養(yǎng)16h，挑取平板上培養(yǎng)出的單菌落于5mlLB(Amp+Tet)液體培養(yǎng)基中，37℃，220rpm，震蕩培養(yǎng)16h，用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(PlasmidMiniKitI,TaKaRa)提取質(zhì)粒。將提取的L4440質(zhì)粒進行雙酶切。37℃進行酶切2小時，將雙酶切的L4440片段進行1.0％的Agarosegel電泳，用DNA膠回收試劑盒(AgaroseGelDNAFragmentRecoveryKit,TaKaRa)回收酶切產(chǎn)物中的L4440片段。(6)mev-1基因片段和質(zhì)粒的連接通過1.0％的Agarosegel電泳鑒定質(zhì)粒和mev-1基因片段之間的摩爾數(shù)關(guān)系，雙酶切后回收的載體片段與回收的mev-1基因片段之間的摩爾數(shù)比為1:10，然后在連接酶的作用下將載體與mev-1基因片段連接。連接體系如下：表3連接體系16℃連接4h即完成連接，得到連接產(chǎn)物。(7)E.coliHT115(DE3)感受態(tài)細(xì)胞的制備參照《精編分子生物學(xué)實驗指南》，制備感受態(tài)細(xì)胞，具體操作如下：1、取HT115(DE3)菌液1.5ml于離心管中，4℃4000rpm離心5min，棄上清，重復(fù)此過程兩次。2、向留有沉淀的試管中加入預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液800μL，清洗菌體，4℃4000rpm離心5min。3、徹底除去殘液，向試管內(nèi)加入預(yù)冷的0.1mol/L的CaCl2溶液200μl，懸浮菌體。即感受態(tài)細(xì)胞制備完成。(8)連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliHT115(DE3)、篩選陽性克隆及其鑒定將10μL連接產(chǎn)物加入到200μL冰浴上放置的E.coliHT115(DE3)感受態(tài)細(xì)胞溶液中，42℃熱激90s，然后迅速冰浴2min。向試管中加入800μLLB液體培養(yǎng)基，37℃，150rpm復(fù)蘇1h，再將培養(yǎng)物涂到LB(Amp+Tet)固體平板上，37℃培養(yǎng)16h，之后挑單菌落于1mlLB液體(Amp+Tet)培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37℃，220rpm，振蕩培養(yǎng)5h，進行菌液PCR鑒定。將得到的菌液進行菌液PCR。PCR反應(yīng)體系如下：表4菌液PCR驗證體系PCR的反應(yīng)程序如下：94℃5mim；之后進入PCR循環(huán)，具體為：94℃15s，55℃15s，72℃1min，總共進行30個cycles；72℃15min；4℃保存。將上述鑒定的PCR陽性克隆菌液用質(zhì)粒DNA小量提取試劑盒(PlasmidMiniKitI,TaKaRa)提取質(zhì)粒，然后對質(zhì)粒進行雙酶切驗證。1.0％Agarosegel電泳鑒定，分子量大小與理論推斷相符合，將樣品送出測序，經(jīng)blast在線比對，結(jié)果表明測序結(jié)果與已知的mev-1序列一致。即證 明RNAi克隆菌(L4440-mev-1-HT115)構(gòu)建完成。mev-1測序結(jié)果ACGATATACGACTCCTATAGGGAGACCGGCAGATCTGATATCATCGATGAATTCGAGCTCCACCGCGGTGGCGGCCGCTCTAGAAGAAAATCAGCATTGTTTCAGGATGATTAACATTCCAACTGCGATTCTGTGCCGCTTGGGCGCCAGATCGTCGATTTCCCGCTCCTTTGGAACATCGATCGTCACCAAGGTGGGGATTTTTTGAATTTTTCCGTGAAAATTGTTGATTTTTTGTGTACGCATGAAGGAGAAATGTATAACAGACACATTCTTTTCAATTAATTATTTATAATATTCACAGTCCGAGGCAAAGACGCCAATCCAGAAGTTCGGATGGGAATACCTGTTGAAGCAGCGCTCCAAGAATCGCCCAATCGCTCCACATCTCACCGTCTACCAGCCACAATTGACCTGGATGCTCTCCGGATTCCATAGAATCAGCGGTTGTGTAATGGCCGGAACCCTTCTCGTCGGAGGAATCGGATTCGCAGTTTTGCCGTTCGATTTCACCGCTTTTGTGGATTTCATCCGTAGCTGGAACTTACCATGCGCGGTGACCGCTGTCTTCAAGTACATCATTGCTTTCCCCATCATTTTCCATACTCTTAACGGAATTCGCTTCTTAGGATTCGATTTGGCTAAGGGAGTCAATAATGTTGGACAGGTAGGAGTTGAAATTATTAATTTAATTGTTTTAAAATAAAAATTAATTTTCAGATCTACAAATCGGGATATCTCGTATCTGGACTTTCGGCTATTCTTGCTCTCGCCATTGTCTTCAACTCTTGCCAGAACAAGAGCAACAAGACTGCCTAGGCACAGATGCTCCGCCTTCTTTTTTCTTACTCCGCCCCAGCCCTCGACAATTCTCGTCAATTTACTTTTACCGTTGATTTCTTCGATTTTCTCTCTTTTCCGTAAGCTTATCGATACCGTCGACCTCGAGGGGGGGCCCGGTACCCAATTCGCCCTATAGTGAGTCGTATTACGCGCGCTCACTGGCCGTCGTTTTACAACGTCGTGACTGGGAAAACCCTGCGTTACCCAACTTAATCGCCTTGCAGCACATCCCCCTTTCGCCAGCTGGCGTAATAGCGAAGAGGCCCGCACCGATCGCCCTTCCCAACAGTTGCGCAGCCTGAA2.秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型的建立(1)秀麗隱桿線蟲的同步化①挑選成熟的秀麗隱桿線蟲至裝有1mlM9液的2ml離心管中，4000rpm離心 5分鐘，去上清；②向離心管中加入500μL1M氫氧化鈉，500μL6.4％(V/V)次氯酸鈉，震蕩裂解；③去掉上清，向沉淀中加入1.5μLM9液，搖勻，4000rpm離心5分鐘，重復(fù)該步驟三次；④向洗凈的卵中加入500μLM9液，18℃24小時孵化成L1期秀麗隱桿線蟲。(2)秀麗隱桿線蟲的RNAi處理使用NGM(RNAi誘導(dǎo))培養(yǎng)基，在培養(yǎng)基表面均勻涂布RNAi克隆菌(L4440-mev-1-HT115)，37℃培養(yǎng)16h，然后將同步化的L1期秀麗隱桿線蟲N2接到涂有RNAi克隆菌的NGM(RNAi誘導(dǎo))平板上(秀麗隱桿線蟲以大腸桿菌作為唯一食物)，20℃培養(yǎng)秀麗隱桿線蟲N2至成蟲,即得到體內(nèi)活性氧水平失調(diào)的動物。(3)秀麗隱桿線蟲總RNA的提取收集經(jīng)RNAi處理的秀麗隱桿線蟲，用M9緩沖液清洗秀麗隱桿線蟲3次，盡量除去秀麗隱桿線蟲體壁附著的RNAi克隆菌。然后按照總RNA提取試劑盒(RNAisoPlus,TaKaRa)的說明書提取秀麗隱桿線蟲的總RNA，取2μL所提的總RNA樣品，加2μLddH2O，1μL6×LoadingBuffer，共5μL加入點樣空，1.0％的Agarosegel電泳。將本步驟中驗證的陽性克隆樣品進行測序。經(jīng)blast在線比對，結(jié)果表明測序結(jié)果與已知的mev-1序列一致。(4)cDNA的合成按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒(PrimeScriptTMRTreagentKit,TaKaRa)的說明書將(3)中提取的秀麗隱桿線蟲總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。共兩個反應(yīng)，即去除基因組DNA反應(yīng)和反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，反應(yīng)程序按照說明書進行。將得到的反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA放在4℃保存。如需長期保存，可放在-20℃。(5)引物設(shè)計通過Wormbase數(shù)據(jù)庫(www.wormbase.org)檢索C.elegans的mev-1及內(nèi)參β-actin基因的序列，用PrimerPremier5.0，根據(jù)引物設(shè)計原則，設(shè)計引物。所設(shè)計的引物序列見表5。表5實時熒光定量PCR基因擴增引物(6)標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶解曲線的驗證將秀麗隱桿線蟲cDNA以10倍稀釋倍數(shù)稀釋六個濃度，10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6，并以這些梯度cDNA作為模板，用mev-1及β-actin的引物，做熒光實時定量PCR，得到對應(yīng)基因的標(biāo)準(zhǔn)曲線。反應(yīng)體系為：表6實時熒光定量PCR反應(yīng)體系實時熒光定量PCR反應(yīng)程序如下：1)STAGE1，95℃預(yù)變性2min2)STAGE2，95℃變性10s3)STAGE3，50℃退火30sSTAGE2和STAGE3循環(huán)38次，并檢測熒光；4)STAGE4，60℃升溫至95℃，每3s升溫0.5℃；分析溶解曲線，記錄熒光值；5)STAGE5，95℃10s6)STAGE6，60℃30s7)STAGE7，4℃∞結(jié)果表明：所有基因的擴增效率均達到100％±10％，其標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2值也達到了實驗要求。mev-1及內(nèi)參基因β-actin的溶解曲線均為單一對稱峰，無引物二聚體，擴增反應(yīng)特異性良好。(7)熒光實時定量PCR檢測對應(yīng)基因的表達量以本實施例(4)得到的cDNA為模板，熒光實時定量PCR檢測對應(yīng)基因的表達量。(8)mev-1基因的相對表達量以處理組的cDNA為模板進行熒光實時定量PCR。β-actin作為內(nèi)參基因，2-△△Ct計算方法計算基因mRNA的相對表達量?！鳌鰿t法計算公式為：相對含量％＝2-△△Ct△Ct＝CT待測樣品-CT對照樣品△△Ct＝△Ct靶基因-△Ct內(nèi)參基因利用熒光實時定量PCR的方法檢測秀麗隱桿線蟲mev-1基因RNAi的效率。秀麗隱桿線蟲mev-1基因RNAi為模型組，秀麗隱桿線蟲RNAi空載體組為陰性對照組，其mev-1基因表達量與喂食E.coliOP50的空白組秀麗隱桿線蟲相關(guān)基因表達量相比無明顯變化，這說明飼喂帶有空載體L4440的E.coliHT115菌并不影響秀麗隱桿線蟲中mev-1的基因表達。從圖2中可以看出mev-1基因被沉默之后，其mRNA的表達量只有陰性對照組的28.74％，干擾效率達到了71.26％。實施例2體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型試劑盒的裝配本發(fā)明所述的體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型試劑盒，所述試劑盒包括的材料為：①mev-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲；②NGM培養(yǎng)基；③大腸桿菌OP50。其中，所述秀麗隱桿線蟲的濃度為100條/20μl，大腸桿菌OP50的濃度為10mg/ml。將以上試劑分裝于合適的容器中，放置到外包試劑盒中，其中M9緩沖液、S緩沖液、LB培養(yǎng)基詳細(xì)記載于使用說明書中。實施例3秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧水平失調(diào)模型的驗證1.秀麗隱桿線蟲mev-1基因RNAi后總活性氧含量的測定(1)秀麗隱桿線蟲總活性氧含量的檢測取實施例1構(gòu)建的體內(nèi)活性氧水平失調(diào)的動物模型，用M9緩沖液清洗3次，洗去秀麗隱桿線蟲蟲體上的RNAi克隆菌。將每個模型組的秀麗隱桿線蟲用S基礎(chǔ)液進行稀釋，使每20μL中含有25條秀麗隱桿線蟲，將每個模型組的稀釋好的秀麗隱桿線蟲液準(zhǔn)確轉(zhuǎn)移至底透384微孔板中，每個孔加40μL秀麗隱桿線蟲液，每個模型組做3個復(fù)孔，然后在避光條件下加活性氧熒光染料H2DCF-DA，染料濃度為50mmol/L，每個孔準(zhǔn)確加入10μL。暗室反應(yīng)15min后，用熒光酶標(biāo)儀檢測每個孔的熒光強度，激發(fā)波長為504nm，發(fā)射波長為529nm，檢測溫度為28℃。秀麗隱桿線蟲RNAi空載體組為陰性對照組，按上面方法做同樣處理，測定總活性氧含量。(2)秀麗隱桿線蟲mev-1基因RNAi后總活性氧含量的變化用ROS熒光探針H2DCF-DA檢測秀麗隱桿線蟲體內(nèi)總活性氧含量的變化，結(jié)果如圖3所示mev-1基因的干擾會引起秀麗隱桿線蟲體內(nèi)活性氧含量的顯著升高(p＜0.01)。實施例4體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型試劑盒的使用方法和可靠性驗證體內(nèi)活性氧水平失調(diào)相關(guān)疾病研究的一個重要內(nèi)容是篩選出能夠回調(diào)體內(nèi)活性氧水平上升的新化合物，這些化合物具有成為治療體內(nèi)活性氧水平失調(diào)相關(guān)疾病的潛力。本實施例就驗證了體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型試劑盒在這方面的應(yīng)用。本實施例以抗氧化劑N-乙酰-L-半胱氨酸、氧化劑百草枯作為供試樣品驗證體內(nèi)活性氧水平失調(diào)動物模型試劑盒的可靠性。1.試劑1)抗氧化劑：N-乙酰-L-半胱氨酸(N-Acetyl-L-cysteine，NAC)：水溶，過濾除菌，儲存濃度為1mol/L，-20℃避光保存(購自梯希愛(上海)化成工業(yè)發(fā)展有限公司)。2)氧化劑：百草枯(Paraquat，PQ)：水溶，過濾除菌，儲存濃度為50mmol/L，-20℃避光保存(購自Sigma公司)。2.實驗方法(1)PQ及NAC對mev-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲壽命的影響將mev-1基因RNAi后的秀麗隱桿線蟲用鎳鉻絲挑針分別轉(zhuǎn)移到NGM(含有0.1mmol/LPQ)，NGM(含有0.5mmol/LPQ)，NGM(含有0.4mmol/LNAC)，NGM(含有2.0mmol/LNAC)和NGM培養(yǎng)基(不含有待測物)上，每塊平板上挑25條秀麗隱桿線蟲，不含有待測化合物的NGM培養(yǎng)基平板作為空白對照組，上述平板均接種大腸桿菌OP50作為秀麗隱桿線蟲食物，每個處理組設(shè)3個平行。每天計數(shù)秀麗隱桿線蟲的存活條數(shù)，直至板上所有的秀麗隱桿線蟲全部死亡。為防止世代交替，在秀麗隱桿線蟲產(chǎn)卵期期間每隔一天將秀麗隱桿線蟲挑到新的處理板上。計算待測化合物組與空白對照組中秀麗隱桿線蟲的壽命。同時設(shè)定L4440組，L4440組接入的秀麗隱桿線蟲為轉(zhuǎn)入空載體L4400(不含有mev-1基因片段)的N2秀麗隱桿線蟲，將含有空載體L4440的N2秀麗隱桿線蟲接入到NGM培養(yǎng)基(不含有待測物)上，其他操作同上。用SPSS軟件進行Kaplan-Meier壽命分析，氧化劑PQ對mev-1RNAi后線蟲的壽命無顯著影響(p>0.05)；抗氧化劑NAC可使mev-1RNAi各處理組秀麗 隱桿線蟲的壽命顯著延長(p<0.05)，兩兩比較(PairwiseComparisons)比較結(jié)果如下：表7NAC處理mev-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲壽命結(jié)果兩兩比較表8NAC作用mev-1基因RNAi秀麗隱桿線蟲后壽命的中位生存時間和平均壽命組別中位生存時間平均壽命L444013.0±1.712.0±0.6mev-1RNAi7.0±1.77.7±0.5mev-1RNAi+0.4NAC7.0±1.49.0±0.7A％100.0％116.9％mev-1RNAi+2NAC13.0±0.712.6±0.9B％185.7％163.6％A％＝(mev-1RNAi+0.4NAC)/mev-1RNAi；B％＝(mev-1RNAi+2NAC)/mev-1RNAi從表7中可以看出，mev-1RNAi處理組的壽命明顯小于L4440組(p<0.05)，該結(jié)果與已有文獻中的報道相符合。用NAC處理mev-1RNAi后的線蟲，線蟲的壽命相比mev-1RNAi處理組顯著延長(p<0.05)，在一定濃度范圍內(nèi)，這種延長隨著NAC濃度呈現(xiàn)正相關(guān)。線蟲經(jīng)過mev-1RNAi處理之后，其中位生存時間和平均壽命都會縮短，NAC(0.4mmol/L和2.0mmol/L)能延長mev-1RNAi線蟲的中位生存時間和平均壽命。如表8所示，NAC(2.0mmol/L)使mev-1RNAi線蟲的中位生存時間和平均壽命延長了85.7％和63.6％。(2)PQ及NAC對mev-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲運動能力的影響將經(jīng)過mev-1RNAi處理的N2成蟲用鎳鉻絲挑針分別轉(zhuǎn)移到NGM(0.1mmol/LPQ)，NGM(0.5mmol/LPQ)，NGM(0.4mmol/LNAC)，NGM(2.0mmol/LNAC)和NGM培養(yǎng)基上，計數(shù)10日齡成蟲的運動能力。運動能力的評價分為MotionA和MotionB兩個等級，其中MotionA為線蟲表現(xiàn)非?；钴S，運動軌跡呈正常的正弦曲線；MotionB為線蟲在培養(yǎng)基上行動緩慢，用鎳鉻絲輕觸線蟲身體，線蟲只是頭部擺動。從圖6、圖7中可以看出，mev-1基因被干擾的線蟲與L4440對照組相比，其運動能力沒有顯著差異(p>0.05)。用PQ(0.5mmol/L)處理mev-1基因被干擾的線蟲，發(fā)現(xiàn)其運動能力在第十天相對對照組的線蟲的運動能力減弱。用NAC(2.0mmol/L)處理mev-1基因被干擾的秀麗隱桿線蟲，發(fā)現(xiàn)其運動能力有傾向正常的趨勢。(3)PQ及NAC對mev-1基因RNAi后秀麗隱桿線蟲抗熱脅迫能力的影響將經(jīng)過mev-1RNAi處理的N2成蟲用鎳鉻絲挑針分別轉(zhuǎn)移到NGM(0.1mmol/LPQ)，NGM(0.5mmol/LPQ)，NGM(0.4mmol/LNAC)，NGM(2.0mmol/LNAC)和NGM培養(yǎng)基上，3天之后將線蟲轉(zhuǎn)移至35℃，8小時之后，每隔半小時觀察對照組秀麗隱桿線蟲的存活率，當(dāng)對照組秀麗隱桿線蟲的死亡率大于50％時，開始計數(shù)其他所有組別線蟲的死亡率。每個處理組設(shè)3個平行，每個平行統(tǒng)計30條秀麗隱桿線蟲。實驗中的L4440對照組和mev-1RNAi的各處理組，線蟲的熱脅迫時間為8.5h。實驗結(jié)果顯示(圖8、圖9)，PQ對mev-1基因被干擾的秀麗隱桿線蟲抗熱脅迫能力沒有顯著影響(p>0.05)，而NAC可以增加mev-1基因被干擾的秀麗隱桿線蟲對熱脅迫的抵抗力，2.0mmol/L的NAC能顯著增加線蟲的抗熱脅迫能力(p<0.05)。上述實驗結(jié)果顯示，用NAC處理之后，發(fā)現(xiàn)線蟲的壽命比空白對照組有所延長，高濃度的NAC(2.0mmol/L)使mev-1基因被干擾的線蟲的壽命明顯延長，線蟲第十天運動能力在NAC的作用下相比對照組也有增強的趨勢，同時，高濃度的NAC(2.0mmol/L)使mev-1基因被干擾的線蟲的抗熱脅迫能力明增強。用PQ處理之后，發(fā)現(xiàn)線蟲的壽命和抗熱脅迫能力相比對照組無明顯變化，實驗結(jié)果驗證了NAC對體內(nèi)活性氧水平失調(diào)的治療效果，同時也證明了本發(fā)明公開的試劑盒的可靠性，能夠用于篩選治療體內(nèi)活性氧水平失調(diào)的藥物。當(dāng)前第1頁1 2 3