1.一種具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于步驟如下：
第一步，pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒的構(gòu)建：
1) 通過(guò)下列反應(yīng)體系和條件制備得到pBabe-puro 酶切產(chǎn)物，其中DNA為pBabe-puro 質(zhì)粒，
反應(yīng)體系：
DNA，1 μg
10×NEbuffer3+BSA，3 μL
內(nèi)切酶BamHI，1單位
內(nèi)切酶EcoRI，1單位
加滅菌超純水至體積30 μL
反應(yīng)條件：37℃水浴2h
2) 將pBabe-puro 酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含5100 bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到純化后的pBabe-puro 酶切產(chǎn)物，
3) 通過(guò)下列PCR反應(yīng)體系和條件制備得到CMV-EGFP DNA片段，其中DNA模板為pEGFP-C1質(zhì)粒，
PCR反應(yīng)體系如下：
5×PrimeSTAR Buffer（Mg2+ plus）,10 μL
dNTP Mixture（各2.5 mM）,4 μL
正向引物1：5'CCGGATCCTAATAGTAATCAATTACGGG3'（10 μM）,1 μL
反向引物2：5'AAGAATTCTTACTTGTACAGCTCGTCCAT3'（10 μM）,1 μL
DNA模板,100 ng
PrimeSTARHS DNA Polymerase（2.5 U/μl）,0.5 μL
加滅菌超純水至體積50 μL
反應(yīng)條件：
98℃ 10 sec
55℃ 15 sec
72℃ 1 min/kbp
30 Cycles
產(chǎn)物：1400bp
4) 將CMV-EGFP DNA片段采用AxyPrep PCR 清潔試劑盒進(jìn)行純化，得到尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，
5) 通過(guò)下列反應(yīng)體系和條件制備得到CMV-EGFP酶切產(chǎn)物，其中DNA為尚未酶切的CMV-EGFP DNA片段，
反應(yīng)體系：
DNA，1 μg
10×NEbuffer3+BSA，3 μL
內(nèi)切酶BamHI，1單位
內(nèi)切酶EcoRI，1單位
加滅菌超純水至體積30 μL
反應(yīng)條件：37℃水浴2h
6) 將CMV-EGFP酶切產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，切膠并回收含1400 bp大小的DNA片段，并采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化，得到純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物，
7) 采用T4 DNA連接酶和快速連接試劑盒，將純化后的CMV-EGFP 酶切產(chǎn)物與純化后的pBabe-puro 酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接，得到連接產(chǎn)物，
8) 將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，并進(jìn)行抗性篩選，得到抗性篩選后的單克隆菌落，
9) 將抗性篩選后的菌落進(jìn)行陽(yáng)性克隆篩選，得到pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒；
第二步，逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)的建立：
將pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒與輔助包裝原件載體質(zhì)粒VSVG和pMDL g/p RRE用Lipofectamine 3000轉(zhuǎn)染試劑轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，即得逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)，其中質(zhì)粒的質(zhì)量比例如下：pBabe-CMV-EGFP-puro:VSVG:pMDL g/p RRE=2:1:1；
第三步，穩(wěn)定表達(dá)EGFP的結(jié)直腸癌細(xì)胞系的建立：
將逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)加入結(jié)直腸癌細(xì)胞培養(yǎng)液中，感染細(xì)胞，受感染的細(xì)胞的EGFP基因可整合至細(xì)胞基因組中，形成穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞，以終濃度4μg/mL嘌呤霉素篩選穩(wěn)定表達(dá)EGFP的細(xì)胞，建立得到穩(wěn)定表達(dá)EGFP的結(jié)直腸癌細(xì)胞系；
第四步，裸鼠腋下結(jié)直腸癌移植瘤模型的建立：
① 將1×107個(gè)穩(wěn)定表達(dá)EGFP的結(jié)直腸癌細(xì)胞系，重懸于DMEM培養(yǎng)液中，調(diào)整體積為50μL，細(xì)胞密度為1×107/50μL，再與50μL Matrigel等體積混合，得到細(xì)胞懸液，至于冰上備用，
② 采用胰島素注射器，將100μL細(xì)胞懸液注射入A組裸鼠腋下，2周后即得裸鼠腋下結(jié)直腸癌移植瘤模型；
第五步，炎癥模型的建立：
① B組裸鼠禁食24小時(shí)，
② 根據(jù)B組裸鼠體重取用TNBS，加水補(bǔ)至50μL，加入50μL無(wú)水乙醇，即配成100μL TNBS工作液，其中每1kg裸鼠取用100 mg的TNBS，
③ B組裸鼠用乙醚麻醉，提尾巴促排便，俯臥位，將灌胃針經(jīng)小鼠肛門(mén)輕輕插入結(jié)腸，至針管頂端距離肛門(mén)4cm處，使小鼠倒立，注入100μL TNBS工作液，使小鼠保持倒立姿態(tài)30s，拔出灌胃針，
④ 一周后，重復(fù)一遍第五步①～③，繼續(xù)飼養(yǎng)一周，即得炎癥模型；
第六步，具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立：
① 摘除第四步的A組裸鼠腋下的腫瘤，用無(wú)菌眼科剪剪碎至直徑約2mm瘤塊，
② 取一瘤塊，直接縫合至第五步的B組裸鼠結(jié)直腸腸壁上，
③ 重復(fù)第五步①～③，繼續(xù)飼養(yǎng)一周，
④ 再次重復(fù)第五步①～③，繼續(xù)飼養(yǎng)一周，即在裸鼠體內(nèi)建立具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的2)中采用AxyPrep DNA凝膠回收試劑盒進(jìn)行純化的具體步驟是：
①在紫外燈下切下含有目的DNA 的瓊脂糖凝膠，用紙巾吸盡凝膠表面液體并切碎，計(jì)算凝膠重量，該重量作為一個(gè)凝膠體積；
②將凝膠放入Eppendorf管中，再往Eppendorf管加入3 個(gè)凝膠體積的Buffer DE-A，混合均勻后于75℃ 加熱，間斷混合直至凝膠塊完全熔化；
③再加入0.5 個(gè)凝膠體積的Buffer DE-B，混合均勻，得到混合液；
④吸取步驟③中的混合液，轉(zhuǎn)移到DNA 制備管中，將制備管置于2 mL 離心管中，在12,000×g離心力下離心1 min，棄濾液；
⑤將制備管置回2 mL 離心管，加入500 μL Buffer W1，在12,000×g 離心力下離心30 s，棄濾液；
⑥再將制備管置回2 mL 離心管，加入700 μL Buffer W2，在12,000×g 離心力下離心30 s，棄濾液，再加入700 μL Buffer W2，在12,000×g 離心力下離心1 min，棄濾液；
⑦將制備管置回2mL 離心管中，在12,000×g 離心力下離心1 min；
⑧將制備管置于潔凈的1.5 mL 離心管中，在制備膜中央加入25-30 μL Eluent 或去離子水，室溫靜置1 min，在12,000×g 離心力下離心1min 洗脫DNA，即完成純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的4) 中采用AxyPrep PCR 清潔試劑盒進(jìn)行純化的具體步驟是：
① 在PCR、酶切、酶標(biāo)、或測(cè)序反應(yīng)液中，加3個(gè)體積的Buffer PCR-A，Buffer PCR-A，不足100 μL時(shí)加至100 μL，接著混勻，轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2 mL離心管中，12,000×g 離心1 min，棄濾液；
② 將制備管置回2 mL離心管，加700 μLBuffer W2，12,000×g 離心1 min，棄濾液；
③ 將制備管置于離心管中，將制備管置回 2 mL離心管，加 400 μL Buffer W2，12,000×g 離心1 min；
④ 將制備管置于潔凈的1.5 mL離心管中，在制備管膜中央加25-30 μLEluent或去離子水，室溫靜置1 min，12,000×g 離心1 min 洗脫DNA。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的7)中將純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物與純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物進(jìn)行連接的具體步驟是：
①將50 ng純化后的pBabe-puro酶切產(chǎn)物和3倍摩爾量的純化后的CMV-EGFP酶切產(chǎn)物混合，加蒸餾水至總體積為10 μl；
②加入10 μl 2×Quick Ligation Buffer，混勻；
③加入1 μl Quick T4 DNA連接酶，混勻；
④在室溫下作用5分鐘后即得連接產(chǎn)物，鏈接產(chǎn)物貯存于-20℃的環(huán)境中。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的8)中抗性刪選的具體步驟是：
①取一管感受態(tài)大腸桿菌細(xì)胞，在冰上溶解后加入3μL連接產(chǎn)物，混勻，冰浴30min；
②將管靜置于42℃中水浴90s后，迅速轉(zhuǎn)移至冰中，冰浴1-2min；
③在管中加入900 μL LB，在37℃中水浴10min；
④將管置于搖床中，在37℃、轉(zhuǎn)速210 rpm下?lián)u菌45min；
⑤將100 μL已轉(zhuǎn)化的細(xì)胞涂布于氨芐青霉素平板上；
⑥倒置平板，在37℃培養(yǎng)16-20h，即完成抗性篩選。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于所述第一步的9)中陽(yáng)性克隆篩選的具體步驟是：
(1) 菌落PCR篩選：
挑取單克隆菌落，置于300μL含氨芐青霉素的LB中，在37℃、轉(zhuǎn)速280 rpm下?lián)u菌 6-8h，得到菌液，菌液采用PrimerSTAR HS DNA polymerase進(jìn)行PCR篩選，得到菌落PCR結(jié)果陽(yáng)性的克??；
(2) 酶切鑒定：
取菌落PCR結(jié)果陽(yáng)性的克隆，采用質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒，并采用BamHI和EcoRI限制性內(nèi)切酶進(jìn)行酶切，能切出1400bp片段的即為酶切鑒定陽(yáng)性的克?。?/p>
(3) 測(cè)序鑒定：
取酶切鑒定陽(yáng)性的克隆，進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果采用Clustalx軟件與EGFP序列進(jìn)行比對(duì)，序列匹配即構(gòu)建成功，即得到pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒。
7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于所述(2)中采用質(zhì)粒小量DNA提取試劑盒提取質(zhì)粒的具體步驟是：
①取1-4 mL在LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)過(guò)夜的菌落PCR結(jié)果陽(yáng)性的克隆的菌液，在12,000×g離心力下離心1 min，棄盡上清液；
②加入250 μL Buffer S1 懸浮細(xì)菌進(jìn)行沉淀；
③加入250 μL Buffer S2，上下翻轉(zhuǎn)混合4-6次，使菌體充分裂解，直至形成透亮的溶液；
④加350 μL Buffer S3，上下翻轉(zhuǎn)混合6-8次，在12,000×g離心力下離心10 min；
⑤吸取步驟④中的離心上清液并轉(zhuǎn)移到制備管中，將制備管置于2 mL離心管中，在12,000×g離心力下離心1 min，棄濾液；
⑥將制備管置回離心管，加入500 μL Buffer W1，在12,000×g離心力下離心1 min，棄濾液；
⑦將制備管置回離心管，加入700 μL Buffer W2，在12,000×g離心力下離心1 min，棄濾液，再加入700 μL Buffer W2，在12,000×g離心力下離心1 min，棄濾液；
⑧將制備管置回2 mL離心管中，在12,000×g離心力下離心1 min；
⑨將制備管移入1.5 mL離心管中，在制備管膜中央加60-80 μL Eluent或去離子水，室溫靜置1 min，在12,000×g離心力下離心1 min，即完成質(zhì)粒的提取。
8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種具有炎癥基礎(chǔ)的結(jié)直腸癌動(dòng)物模型的建立方法，其特征在于所述第二步中逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)建立的具體步驟是：
①接種293T細(xì)胞至匯合度為70-90%時(shí)轉(zhuǎn)染；
②使用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋Lipofectamine 3000試劑；
③使用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋pBabe-CMV-EGFP-puro質(zhì)粒、VSVG質(zhì)粒和pMDL g/p RRE質(zhì)粒，然后添加P3000試劑，混勻，得到預(yù)混液；
④在已稀釋的Lipofectamine 3000試劑中加入等量的預(yù)混液，室溫孵育5min，得到DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物；
⑤將DNA-脂質(zhì)體復(fù)合物加入細(xì)胞培養(yǎng)液中；
⑥轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24、48、72h，分別收集富含逆轉(zhuǎn)錄病毒顆粒的上清液，上清液通過(guò)超離心濃縮病毒，即得到逆轉(zhuǎn)錄病毒介導(dǎo)的EGFP過(guò)表達(dá)系統(tǒng)。