本發(fā)明涉及生物檢測(cè)領(lǐng)域，尤其涉及一種microRNA-208b的快速檢測(cè)方法。

背景技術(shù)：

急性心肌梗死是冠狀動(dòng)脈急性、持續(xù)性缺血缺氧所引起的心肌壞死。臨床上多有劇烈而持久的胸骨后疼痛，休息及硝酸酯類藥物不能完全緩解，伴有血清心肌酶活性增高及進(jìn)行性心電圖變化，可并發(fā)心律失常、休克或心力衰竭，常可危及生命。該病在歐美最為常見，美國每年約有150萬人發(fā)生心肌梗死。中國近年來呈明顯上升趨勢(shì)，每年新發(fā)至少50萬，現(xiàn)患至少200萬。

由此可見，急性心肌梗死的早期檢測(cè)是尤為重要的，在現(xiàn)有的研究中，急性心肌梗死的早期檢測(cè)包括對(duì)microRNA-499的檢測(cè)、microRNA-208b的檢測(cè)、microRNA-1的檢測(cè)以及microRNA-133a的檢測(cè)。

現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)上述四個(gè)心肌損傷標(biāo)志物的檢測(cè)通常需要采用1小時(shí)的microRNA的抽提、1.5小時(shí)的逆轉(zhuǎn)錄以及1.5小時(shí)的Real-time PCR(熒光定量聚合酶鏈反應(yīng))，一個(gè)心肌損傷標(biāo)志物的檢測(cè)時(shí)間至少要4個(gè)小時(shí)，從檢測(cè)開始到得到檢測(cè)結(jié)果的時(shí)間很長，眾所周知的，對(duì)人體疾病的檢測(cè)，時(shí)間的長短尤為重要；另外，現(xiàn)有技術(shù)中，對(duì)上述的四個(gè)心肌損傷標(biāo)志物的檢測(cè)步驟也較為繁瑣，工作量非常大；漫長的檢測(cè)過程不僅僅會(huì)讓病人等待的更為煩躁，也讓檢測(cè)的醫(yī)護(hù)人員感到身心俱疲。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)上述存在的問題，本發(fā)明提供一種microRNA-208b的快速檢測(cè)方法，應(yīng)用于急性心肌梗死的心肌損傷標(biāo)志物的檢測(cè)中，以克服采用現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)方法檢測(cè)microRNA-208b這個(gè)心肌損傷標(biāo)志物導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)間很長、工作量較大的問題，從而大大縮短了microRNA-208b這個(gè)心肌損傷標(biāo)志物的檢測(cè)時(shí)間，并且簡化了上述microRNA-208b這個(gè)心肌損傷標(biāo)志物的檢測(cè)方法，在保證檢測(cè)質(zhì)量的基礎(chǔ)上，提高了檢測(cè)效率。

為了實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取的技術(shù)方案為：

一種microRNA-208b的快速檢測(cè)方法，其中，包括：

備料：準(zhǔn)備好患者血清、RNase-free水、濃度為18uM/uL的RNA酶抑制劑以及濃度為0.18uM/uL的DSN酶；

設(shè)計(jì)探針：根據(jù)待測(cè)靶標(biāo)microRNA-208b的序列設(shè)計(jì)出與其完全互補(bǔ)的單鏈DNA序列，而后在所述單鏈DNA序列兩端分別修飾熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，獲得濃度為200nmol/uL的Taqman探針；

反應(yīng)：將所述患者血清、所述RNase-free水、所述DSN酶、所述Taqman探針和所述RNA酶抑制劑按照100:278:2:20:1的配比進(jìn)行混合，在85℃的反應(yīng)溫度下反應(yīng)25分鐘；

檢測(cè)：根據(jù)相應(yīng)Taqman探針設(shè)置反應(yīng)所需的激發(fā)波長和發(fā)射波長，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)反應(yīng)步驟中的反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度，即得到所述患者血清中的microRNA-208b的檢測(cè)結(jié)果；

其中，與所述microRNA-208b完全互補(bǔ)的單鏈DNA序列為：ACAAAC CTT TTG TTC GTC TTAT。

上述的microRNA-208b的快速檢測(cè)方法，其中，所述患者血清的收集包括：獲取患者的靜脈血5mL，以3000rpm離心10min，分離血清用于檢測(cè)。

上述的microRNA-208b的快速檢測(cè)方法，其中，所述熒光基團(tuán)為：5'-TAMRA。

上述的microRNA-208b的快速檢測(cè)方法，其中，所述熒光淬滅基團(tuán)：Eclipse-3'。

上述的microRNA-208b的快速檢測(cè)方法，其中，所述Taqman探針為：5'-TAMRA-ACAAAC CTT TTG TTC GTC TTAT-Eclipse-3'；

其中，TAMRA染料的激發(fā)波長為542nM，發(fā)射波長為568nM，且檢測(cè)步驟中的激發(fā)波長和發(fā)射波長與所述TAMRA染料的激發(fā)波長和發(fā)射波長相同。

上述技術(shù)方案具有如下優(yōu)點(diǎn)或者有益效果：

本發(fā)明提供的microRNA-208b的快速檢測(cè)方法，根據(jù)待測(cè)靶標(biāo)microRNA-208b的序列設(shè)計(jì)出與其完全互補(bǔ)的單鏈DNA序列，而后在單鏈DNA序列兩端分別修飾熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，從而獲得與待測(cè)靶標(biāo)microRNA-208b相對(duì)應(yīng)的Taqman探針，而后將患者血清、RNase-free水、DSN酶、Taqman探針和RNA酶抑制劑按照一定的比例在特定的條件下進(jìn)行反應(yīng)，在激光的激發(fā)作用下，檢測(cè)出反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度，即得到待測(cè)靶標(biāo)microRNA-208b的檢測(cè)結(jié)果，該檢測(cè)方法極為簡單，且用時(shí)較少，從而克服了采用現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)方法檢測(cè)microRNA-208b這個(gè)心肌損傷標(biāo)志物導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)間很長、工作量較大的問題，大大縮短了上述microRNA-208b這個(gè)心肌損傷標(biāo)志物的檢測(cè)時(shí)間，在保證檢測(cè)質(zhì)量的基礎(chǔ)上，提高了檢測(cè)效率。

附圖說明

通過閱讀參照以下附圖對(duì)非限制性實(shí)施例所作的詳細(xì)描述，本發(fā)明及其特征、外形和優(yōu)點(diǎn)將會(huì)變得更加明顯。在全部附圖中相同的標(biāo)記指示相同的部分。并未刻意按照比例繪制附圖，重點(diǎn)在于示出本發(fā)明的主旨。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例2提供的microRNA-208b的快速檢測(cè)方法中不同濃度的microRNA-208b標(biāo)準(zhǔn)品熒光強(qiáng)度的變化示意圖；

圖2是本發(fā)明實(shí)施例2提供的microRNA-208b的快速檢測(cè)方法中microRNA-208b標(biāo)準(zhǔn)品濃度與熒光強(qiáng)度的相關(guān)性示意圖；

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說明，但是不作為本發(fā)明的限定。

實(shí)施例1：

本發(fā)明實(shí)施例1提供的microRNA-208b的快速檢測(cè)方法包括：

備料：準(zhǔn)備好患者血清、RNase-free水、濃度為18uM/uL的RNA酶抑制劑以及濃度為0.18uM/uL的DSN酶；

設(shè)計(jì)探針：根據(jù)待測(cè)靶標(biāo)microRNA——microRNA-208b的序列設(shè)計(jì)出與其完全互補(bǔ)的單鏈DNA序列(ACAAAC CTT TTG TTC GTC TTAT)，而后在單鏈DNA序列兩端分別修飾熒光基團(tuán)(5'-TAMRA)和熒光淬滅基團(tuán)(Eclipse-3')，獲得濃度為200nmol/ul的Taqman探針——Probe microRNA-208b：5'-TAMRA-ACAAAC CTT TTG TTC GTC TTAT-Eclipse-3'；

反應(yīng)：將50ul的患者血清、139ul的RNase-free水、1ul的DSN酶、10ul的Taqman探針Probe microRNA-208b和0.5ul的RNA酶抑制劑進(jìn)行混合配置成反應(yīng)體積，在85℃的反應(yīng)溫度下反應(yīng)25分鐘；

檢測(cè)：由于Taqman探針Probe microRNA-208b中的TAMRA染料的激發(fā)波長為542nM、發(fā)射波長為568nM，故設(shè)置反應(yīng)所需的激發(fā)波長為542nM、發(fā)射波長568nM，使用全自動(dòng)酶標(biāo)儀檢測(cè)反應(yīng)步驟中的反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度，即得到患者血清中的microRNA-208b的檢測(cè)結(jié)果。

在本發(fā)明實(shí)施例1提供的的microRNA-208b的快速檢測(cè)方法中，患者血清的收集包括：獲取患者的靜脈血5mL，將靜脈血放置于4℃冰箱中靜置30min，以3000rpm離心10min，而后收集上清液于無菌RNA-free的EP管中，存儲(chǔ)于-80℃的冰箱中備用，用于檢測(cè)。

圖1是本發(fā)明實(shí)施例1提供的microRNA-208b的快速檢測(cè)方法中不同濃度的microRNA-208b標(biāo)準(zhǔn)品熒光強(qiáng)度的變化示意圖；由圖可知，發(fā)射波長在568nM左右時(shí)，不同濃度的microRNA-208b標(biāo)準(zhǔn)品熒光強(qiáng)度均處于峰值，因此，在發(fā)射波長為568nM時(shí)，可以很好的檢測(cè)到反應(yīng)液中的熒光強(qiáng)度。

圖2是本發(fā)明實(shí)施例1提供的microRNA-208b的快速檢測(cè)方法中

microRNA-208b標(biāo)準(zhǔn)品濃度與熒光強(qiáng)度的相關(guān)性示意圖；由圖可知，濃度范圍在1E-12Mol～1E-6Mol的microRNA-208b標(biāo)準(zhǔn)品，熒光強(qiáng)度的變化是呈線性變化的。

綜上所述，本發(fā)明實(shí)施例1提供的microRNA-208b的快速檢測(cè)方法，根據(jù)待測(cè)靶標(biāo)microRNA-208b的序列設(shè)計(jì)出與其完全互補(bǔ)的單鏈DNA序列，而后在單鏈DNA序列兩端分別修飾熒光基團(tuán)和熒光淬滅基團(tuán)，從而獲得與待測(cè)靶標(biāo)microRNA-208b相對(duì)應(yīng)的Taqman探針，而后將患者血清、RNase-free水、DSN酶、Taqman探針和RNA酶抑制劑按照一定的比例在特定的條件下進(jìn)行反應(yīng)，在激光的激發(fā)作用下，檢測(cè)出反應(yīng)液的熒光強(qiáng)度，即得到待測(cè)靶標(biāo)microRNA-208b的檢測(cè)結(jié)果，該檢測(cè)方法極為簡單，且用時(shí)較少，從而克服了采用現(xiàn)有技術(shù)中的檢測(cè)方法檢測(cè)microRNA-208b這個(gè)心肌損傷標(biāo)志物導(dǎo)致檢測(cè)時(shí)間很長、工作量較大的問題，大大縮短了上述microRNA-208b這個(gè)心肌損傷標(biāo)志物的檢測(cè)時(shí)間，在保證檢測(cè)質(zhì)量的基礎(chǔ)上，提高了檢測(cè)效率。

本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解，本領(lǐng)域技術(shù)人員結(jié)合現(xiàn)有技術(shù)以及上述實(shí)施例可以實(shí)現(xiàn)所述變化例，在此不予贅述。這樣的變化例并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容，在此不予贅述。

以上對(duì)本發(fā)明的較佳實(shí)施例進(jìn)行了描述。需要理解的是，本發(fā)明并不局限于上述特定實(shí)施方式；任何熟悉本領(lǐng)域的技術(shù)人員，在不脫離本發(fā)明技術(shù)方案作出許多可能的變動(dòng)和修飾，或修改為等同變化的等效實(shí)施例，這并不影響本發(fā)明的實(shí)質(zhì)內(nèi)容。因此，凡是未脫離本發(fā)明技術(shù)方案的內(nèi)容，依據(jù)本發(fā)明的技術(shù)實(shí)質(zhì)對(duì)以上實(shí)施例所做的任何簡單修改、等同變化及修飾，均仍屬于本發(fā)明技術(shù)方案保護(hù)的范圍內(nèi)。