本發(fā)明涉及化合物制備技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)，是一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針及其合成方法以及所述熒光探針在檢測(cè)碳青霉烯酶和含有碳青霉烯耐藥菌中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

β-內(nèi)酰胺類抗生素是目前治療感染性疾病使用的最為廣泛的一類抗生素。但是，這些抗生素也并非萬(wàn)能的，一些致病細(xì)菌，如肺結(jié)核菌（TB），由于自身帶有耐β-內(nèi)酰胺類抗生素的基因，因此，β-內(nèi)酰胺類抗生素對(duì)之常常無(wú)效。更為嚴(yán)重的是，如果人們大量使用甚至濫用抗生素，會(huì)使一些病菌迅速適應(yīng)存在抗生素的環(huán)境從而具有耐藥性，會(huì)不利于對(duì)某些疾病的治療，危及人們的健康。有報(bào)道，全世界每年有大約有50%的抗生素被濫用，而在中國(guó)，這一濫用的比例甚至能接近80%。由于濫用抗生素情況的存在，中國(guó)也成為了致病菌耐藥性最為嚴(yán)重的國(guó)家之一。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，目前在中國(guó)有近30%的住院感染患者是由耐藥菌造成的。耐藥菌的大量存在不僅加重了病人的治療負(fù)擔(dān)，更嚴(yán)重影響到臨床的治療效率。

研究發(fā)現(xiàn)，致病細(xì)菌產(chǎn)生耐藥性的一個(gè)主要原因是因?yàn)榧?xì)菌體內(nèi)產(chǎn)生了一種叫β-內(nèi)酰胺酶（β-lactamase）抗生素滅活酶，這種酶能迅速水解常用的β-內(nèi)酰胺類抗生素，從而使抗生素失去藥效。所述β-內(nèi)酰胺酶可以分為A、B、C、D四個(gè)類型（Ambler分類），其中A、C、D三個(gè)類型為含絲氨酸的β-內(nèi)酰胺酶，B類為含金屬的β-內(nèi)酰胺酶。

碳青霉烯類抗生素是一類具有特殊結(jié)構(gòu)的β-內(nèi)酰胺類抗生素，由于其擁有廣泛的抗菌活性以及能強(qiáng)烈抑制或殺滅不同類型細(xì)菌的能力（J. Antimicrob. Agents. 1999, 11, 93; Antimicrob. Agents Chemother. 2011, 55, 4943.），成為治療嚴(yán)重細(xì)菌性感染的最后一道防線。但是，隨著碳青霉烯類抗生素的廣泛使用，近年來(lái)在世界范圍內(nèi)逐漸出現(xiàn)了對(duì)碳青霉烯類抗生素具有耐藥性的細(xì)菌。研究發(fā)現(xiàn)，革蘭氏陰性菌對(duì)碳青霉烯類抗生素產(chǎn)生耐藥性的主要原因如前所述，是其體內(nèi)產(chǎn)生了能夠水解、破壞碳青霉烯類抗生素的β-內(nèi)酰胺酶，這類β-內(nèi)酰胺酶也被稱為碳青霉烯酶（carbapenemase）。所述碳青霉烯酶一般能水解碳青霉烯抗生素甚至幾乎所有的β-內(nèi)酰胺類抗生素。按照Ambler分類法，碳青霉烯酶包括A類KPC類型的β-內(nèi)酰胺酶；含金屬的B類β-內(nèi)酰胺酶（MBLs)，如VIM、IMP、新德里含金屬β-內(nèi)酰胺酶（NDM）以及比較少見(jiàn)的D類OXA-48類型碳青霉烯酶。有越來(lái)越多的報(bào)道顯示：碳青霉烯酶是目前醫(yī)院及社區(qū)醫(yī)療中心對(duì)獲得性感染疾病治療失敗的主要原因，其中對(duì)含金屬的B類β-內(nèi)酰胺酶（MBLs)的菌株的抑制或殺滅，由于其存在不同菌株之間的基因轉(zhuǎn)移而在臨床上缺乏相應(yīng)的抑制藥劑。因此，在臨床醫(yī)療中能及時(shí)檢測(cè)碳青霉烯酶的情況對(duì)醫(yī)生判斷病情、確定細(xì)菌、確定致病菌對(duì)不同抗生素的抗藥和敏感程度、提出相應(yīng)的治療方案具有重要的意義，也能夠在醫(yī)療中不用或者少用抗生素藥物。

目前，檢測(cè)有碳青霉烯酶表達(dá)的細(xì)菌的方法主要有兩種：一是表型檢測(cè)法；二是基因檢測(cè)法。所述表型檢測(cè)法通常是通過(guò)測(cè)定細(xì)菌對(duì)碳青霉烯抗生素（如亞胺培南、美羅培南或厄他培南）的敏感性來(lái)檢測(cè)的，它包括瓊脂擴(kuò)散測(cè)試法、最小抑菌濃度測(cè)定(MIC)法、雙紙片協(xié)同測(cè)試法（DDST）?，F(xiàn)在推薦用于檢測(cè)克雷伯氏菌表達(dá)的碳青霉烯酶的方法是修飾的霍奇檢測(cè)法（MHT）。但是，霍奇檢測(cè)法缺乏良好的專一性和靈敏性，且消耗時(shí)間長(zhǎng)，通常需要24～48小時(shí)，對(duì)于生長(zhǎng)緩慢的細(xì)菌，比如結(jié)核分支桿菌，需要的時(shí)間更長(zhǎng)，因此需要盡快了解細(xì)菌抗藥性的情況，例如敗血癥病人的治療，這類方法無(wú)法及時(shí)提供選擇抗生素的必要信息。所述基因檢測(cè)法主要是通過(guò)聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)來(lái)進(jìn)行檢測(cè)。這一檢測(cè)方法具有很高的精確性和靈敏度，但是，它的儀器昂貴、花費(fèi)高且不能檢測(cè)到碳青霉烯酶新的基因。

除了表型檢測(cè)法和基因檢測(cè)法以外，現(xiàn)在通過(guò)質(zhì)譜檢測(cè)碳青霉烯酶的方法也有了一定的發(fā)展。1972年通過(guò)比色原理用頭孢硝基噻吩（Nitrocefin）成功地檢測(cè)了β-內(nèi)酰胺酶，其設(shè)計(jì)原理為：頭孢硝基噻吩的β-內(nèi)酰胺環(huán)能被β-內(nèi)酰胺酶快速水解而開(kāi)環(huán)，從而使其顏色由黃色變成紅色。但是，僅通過(guò)顏色的變化來(lái)進(jìn)行檢測(cè)雖然操作簡(jiǎn)單，方便使用，但在很大程度制約了其檢測(cè)的靈敏度。

近年來(lái)，熒光探針——由于其具有背景信號(hào)低、靈敏度高、對(duì)樣品預(yù)處理的要求低等諸多優(yōu)點(diǎn)，在分析測(cè)試領(lǐng)域，尤其是在生物醫(yī)藥領(lǐng)域受到了人們廣泛的關(guān)注。目前，已有較多的熒光探針化合物用于高靈敏度和實(shí)時(shí)的對(duì)β-內(nèi)酰胺酶的檢測(cè)。然而，這些化合物不具有選擇性，即不可能區(qū)分普通β-內(nèi)酰胺酶和碳青霉烯酶。國(guó)際專利申請(qǐng)WO 2012/003955A1公開(kāi)了一種“基于碳青霉烯母核結(jié)構(gòu)設(shè)計(jì)的具有一定熒光性能的碳青霉烯酶熒光探針”，但是它沒(méi)有明確所述熒光探針的光學(xué)性能和對(duì)酶檢測(cè)的生物學(xué)性質(zhì)。2014年，Rao等人報(bào)道了用于檢測(cè)對(duì)碳青霉烯具有耐藥性的腸科桿菌的熒光探針（Angew. Chem. Int. Ed. 2014, 53, 8113–8116）。所述熒光探針是基于常見(jiàn)的頭孢菌素母核，將6,7-位的構(gòu)象由trans轉(zhuǎn)變?yōu)閏is構(gòu)象，合成一系列的化合物，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)β-碳青霉烯酶及表達(dá)有碳青霉烯酶細(xì)菌的選擇性檢測(cè)。但是，所述熒光探針在熒光性能方面都具有一些不足，例如波長(zhǎng)短、靈敏度和選擇性存在不足等問(wèn)題。因此，研究和開(kāi)發(fā)一種具有精確性和靈敏度、有高選擇性、且使用費(fèi)用低、簡(jiǎn)單可行的快速檢測(cè)有碳青霉烯酶表達(dá)的細(xì)菌及其耐藥菌的方法具有非常重要的意義，也為盡可能的減少抗藥性細(xì)菌的出現(xiàn)和延長(zhǎng)現(xiàn)有抗生素的使用壽命，防止抗生素的濫用和誤用提供一個(gè)有效的手段。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于要解決上述問(wèn)題，提供一類耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針，它們是基于碳青霉烯類抗生素設(shè)計(jì)的用于檢測(cè)產(chǎn)生碳青霉烯酶的熒光探針化合物，可用于檢測(cè)產(chǎn)生碳青霉烯酶的耐藥菌并具有精確性和靈敏度、有高選擇性、且使用費(fèi)用低、簡(jiǎn)單可行。本發(fā)明的第二目的是，提供所述熒光探針的合成方法。本發(fā)明的第三目的是，提供所述熒光探針在檢測(cè)碳青霉烯酶和含有碳青霉烯耐藥菌中的應(yīng)用。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案。

一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針，其特征在于，所述熒光探針的結(jié)構(gòu)通式為：

，

在結(jié)構(gòu)通式中：

X為碳原子或硫原子；當(dāng)X為CH時(shí)，R¹為甲基，能夠?yàn)镽或S構(gòu)型；或者X為CH₂或S；

Y熒光基團(tuán)芳香環(huán)上的氧原子、硫原子或連接基團(tuán)（linker），包括4-羥甲基芐基或4-羥基或巰基芐基或氨基甲酸酯連接基團(tuán)。

進(jìn)一步，所述熒光基團(tuán)（fluorophore）為吸收和發(fā)射的熒光基團(tuán)，如7-羥基香豆素、熒光素、萘酰亞胺類染料或菁染料。

進(jìn)一步，所述熒光探針包括其羧酸酯或者羧酸鹽（R³為氫原子或者烷基），所述熒光探針化合物能與生物標(biāo)記物碳青霉烯酶選擇性識(shí)別，從而起到檢測(cè)碳青霉烯酶的作用。

一類耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針，其特征在于，所述熒光探針是在培南類（penem）抗生素母核的3’-位引入具有離去功能性的熒光基團(tuán)或者發(fā)色基團(tuán)，在碳青霉烯酶（carbapenemase）的作用下使β-內(nèi)酰胺環(huán)開(kāi)環(huán)，從而釋放出熒光基團(tuán)或者發(fā)色基團(tuán)，產(chǎn)生光學(xué)性質(zhì)的變化，使所述熒光探針具有用于檢測(cè)青霉烯酶及其耐藥菌的性質(zhì)，其結(jié)構(gòu)通式的表示為：

，

在結(jié)構(gòu)通式中：

X為碳原子或硫原子；當(dāng)X為CH時(shí)，R¹為甲基，能夠?yàn)镽或S構(gòu)型；或者X為CH₂或S；

Y熒光基團(tuán)芳香環(huán)上的氧原子、硫原子或連接基團(tuán)（linker），包括4-羥甲基芐基或4-羥基或巰基芐基或氨基甲酸酯連接基團(tuán)。

為實(shí)現(xiàn)上述第二目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案。

一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法，其特征在于，包括以下步驟：

（1）化合物2的制備

在氬氣保護(hù)下，將叔丁基二甲基氯硅烷（TBDMSCl）與咪唑依次加入到美羅培南中間體F9的干燥DMF溶液中；在20℃反應(yīng)5小時(shí)后加入乙酸乙酯，用水和飽和食鹽水洗滌，再用無(wú)水硫酸鈉（Na₂SO₄）干燥、濃縮，經(jīng)硅膠柱柱層析純化后得到白色固體的化合物2；

（2）中間體3,4的制備

將步驟（1）得到的化合物 2及四醋酸銠（Rh₂(OAc)₄加入到干燥二氯化鋅(ZnCl₂)的二氯甲烷體系中，在氬氣保護(hù)下，將反應(yīng)體系加熱回流90分鐘；通過(guò)薄層色譜（TLC）監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后即可得到中間體3；

將反應(yīng)體系冷卻至-55℃，將2,2,6,6-四甲基哌啶與二異丙基乙二胺混合后滴加到反應(yīng)體系；然后，滴加三氟甲磺酸酐（Tf₂O）；反應(yīng)完全后，將反應(yīng)液經(jīng)硅膠柱柱層析純化后得到白色固體的中間體4；

（3）化合物5的制備

將ZnCl₂與N,N-甲基吡咯烷酮（NMP）體系在真空狀態(tài)下脫氣置換氬氣（Ar）；之后依次加入中間體4、三（2-呋喃）磷、三（二亞芐基丙酮）二鈀（Pd₂dba₃），將所得溶液在25℃下攪拌10min，然后緩慢地加入三丁基乙烯基錫；將反應(yīng)體系在30℃下反應(yīng)10消失后用乙酸乙酯稀釋，再用水洗兩次以及用飽和食鹽水洗一次，將有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥、濃縮；經(jīng)硅膠柱柱層析純化后得到白色固體的化合物5；

（4）化合物6的制備

將步驟（3）得到的化合物5溶解于四氫呋喃（THF）與水中，加入四氧化鋨（OsO₄）水溶液，同時(shí)加入高碘酸鈉（NaIO₄）和高碘酸（H₅IO₆）；將反應(yīng)體系在25℃室溫下攪拌25min，之后倒入到10%的硫代硫酸鈉（Na₂S₂O₃）水溶液中，用乙酸乙酯萃取，無(wú)水硫酸鈉干燥、濃縮，經(jīng)硅膠柱柱層析純化后得到黃色固體的化合物6；

（5）化合物7的制備

在氬氣保護(hù)下，向反應(yīng)瓶中加入步驟（4）得到的化合物6及干燥的四氫呋喃，冷卻到-15℃后加入硼烷-四氫呋喃復(fù)合物，將反應(yīng)體系在-15℃溫度下攪拌10min，之后向反應(yīng)體系中加入冰冷乙酸乙酯與水，用乙酸乙酯萃取，用無(wú)水硫酸鈉干燥、濃縮，得到化合物7（產(chǎn)率約85%的粗產(chǎn)物），無(wú)需純化直接進(jìn)行下一步反應(yīng)；

（6）化合物8的制備

在氬氣保護(hù)下，在反應(yīng)瓶中加入步驟（5）得到的化合物7及二氯甲烷, 冷卻到 0℃后緩慢加入吡啶及異丁基氯甲酸酯，在0℃條件下反應(yīng)4h，經(jīng)硅膠柱柱層析純化后得到化合物8；

（7）化合物9的制備

在氬氣保護(hù)下，在反應(yīng)瓶中加入步驟（5）得到的化合物8及甲苯和四氫呋喃，將所述溶液在液氮乙醇體系中冷卻到-60℃，脫除溶液中的氣體；加入（二亞芐基丙酮）二鈀-氯仿加合物（Pd₂dba₃-CHCl₃）和亞磷酸三乙酯；將反應(yīng)體系在25℃室溫下攪拌2h，之后加入步驟（5）得到的化合物8和7-羥基香豆素；將反應(yīng)體系再脫氣后，在30℃條件下反應(yīng)18小時(shí)；將反應(yīng)液去除溶劑后，用石油醚、乙酸乙酯作為流動(dòng)相在硅膠柱上純化得到白色固體的化合物9；

（8）化合物10的制備

將步驟（7）得到的化合物9溶解于N-甲基吡咯烷酮與N,N-二甲基甲酰胺的混合液中，N-甲基吡咯烷酮與N,N-二甲基甲酰胺的質(zhì)量比為1:3，加入二氟化氫銨，在室溫下反應(yīng)40h，之后加入乙酸乙酯稀釋反應(yīng)體系，將乙酸乙酯相用水洗，再用飽和食鹽水洗，用無(wú)水硫酸鈉干燥、濃縮；將所得混合物用石油醚與乙酸乙酯作為流動(dòng)相經(jīng)硅膠柱柱層析純化后得到化合物10 ；

（9）化合物CPC-1的制備

將步驟（9）得到的化合物10溶解于四氫呋喃中，加入pH為7.0 的0.2M磷酸鹽緩沖液（PB）以及5%的鉑碳催化劑（Pt/C），置換氫氣后在25℃下反應(yīng)2h；將反應(yīng)液過(guò)濾除掉鉑碳后加入去離子水，用乙酸乙酯萃取，將水相用反相C18制備柱純化，冷凍干燥，得到白色固體的化合物CPC-1，即所述的熒光探針：

所述熒光探針（CPC-1）的合成路徑及結(jié)構(gòu)通式為：

。

進(jìn)一步，所述化合物8為關(guān)鍵中間體，以此為衍生物能夠合成其他熒光基團(tuán)的熒光探針化合物，或者是以4-羥基、氨基甲酸酯為連接基團(tuán)的熒光探針化合物。

為實(shí)現(xiàn)上述第三目的，本發(fā)明采取了以下技術(shù)方案。

所述耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針在檢測(cè)碳青霉烯酶和含有碳青霉烯耐藥菌以及在生物、預(yù)防保健、臨床診斷各領(lǐng)域的應(yīng)用。

進(jìn)一步，所述熒光探針能制成試紙、試劑盒或者檢測(cè)芯片用于檢測(cè)。

進(jìn)一步，所述應(yīng)用的方法包括以下步驟：

（1）將本發(fā)明的熒光探針與待測(cè)樣品在一定條件下混合，形成具有光學(xué)性質(zhì)的化合物；

（2）測(cè)量具有光學(xué)性質(zhì)的化合物的光學(xué)信號(hào)變化，從而確定待測(cè)樣品中碳青霉烯酶或者含有碳青霉烯耐藥菌的含量或濃度。

本發(fā)明的積極效果是：

（1）提供了一類耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針，可用于檢測(cè)碳青霉烯酶和含有碳青霉烯耐藥菌并具有精確性和靈敏度、有高選擇性、且使用費(fèi)用低、簡(jiǎn)單可行。

（2）提供了所述熒光探針的合成方法。

（3）提供的熒光探針可應(yīng)用于臨床耐藥菌檢測(cè)，可快速檢測(cè)有碳青霉烯酶表達(dá)的細(xì)菌及其耐藥菌，對(duì)在醫(yī)療中不用或者少用抗生素藥物具有非常重要的意義。

附圖說(shuō)明

圖1為本發(fā)明耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法的流程框圖。

圖2為本發(fā)明的熒光探針在碳青霉烯酶VIM-27下熒光變化圖。

圖3為本發(fā)明的熒光探針在一定濃度的酶下隨時(shí)間的熒光變化圖。

圖4為待檢測(cè)細(xì)菌樣品與熒光探針混合培養(yǎng)2小時(shí)后的熒光成像圖。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合附圖具體介紹本發(fā)明的具體實(shí)施方式和相關(guān)檢測(cè)效果。但是需要指出，本發(fā)明的實(shí)施不限于以下的實(shí)施方式，實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常是按照常規(guī)條件，或者是按照制造廠商所建議的條件。

本發(fā)明提供的熒光探針，是在培南類（penem）抗生素母核的3’-位引入具有離去功能性的熒光基團(tuán)或者發(fā)色基團(tuán)，在碳青霉烯酶（carbapenemase）的作用下使β-內(nèi)酰胺環(huán)開(kāi)環(huán)，從而釋放出熒光基團(tuán)或者發(fā)色基團(tuán)，產(chǎn)生光學(xué)性質(zhì)的變化，使所述熒光探針具有用于檢測(cè)青霉烯酶及其耐藥菌的性質(zhì)，其結(jié)構(gòu)通式為：

，

在結(jié)構(gòu)通式中：

X為碳原子或硫原子；當(dāng)X為CH時(shí)，R¹為甲基，能夠?yàn)镽或S構(gòu)型；或者X為CH₂或S；

Y熒光基團(tuán)芳香環(huán)上的氧原子、硫原子或連接基團(tuán)（linker），包括4-羥甲基芐基或4-羥基或巰基芐基或氨基甲酸酯連接基團(tuán)。

以下介紹本發(fā)明的耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法的具體實(shí)施方式（參見(jiàn)圖1）。

說(shuō)明：在本發(fā)明的實(shí)施中，¹H-NMR用Bruker 400Mz型儀器測(cè)定，測(cè)定溶劑為氘代三氯甲烷（CDCl₃）,內(nèi)標(biāo)為四甲基硅烷（TMS）；所有溶劑均為色譜純、分析純或化學(xué)純，所使用的無(wú)水溶劑均是按標(biāo)準(zhǔn)方法干燥處理獲得的。除另有說(shuō)明的以外，所有反應(yīng)均是在氬氣保護(hù)下進(jìn)行并用TLC跟蹤；產(chǎn)品的純化除另有說(shuō)明的以外均使用硅膠柱色譜法，所使用的硅膠為200-300目。

實(shí)施例1

一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法，其化合物2的制備方法為：

在氬氣保護(hù)下，在反應(yīng)瓶（schlenk）中加入美羅培南中間體F9的干燥DMF20毫升溶液，然后依次加入叔丁基二甲基氯硅烷TBDMSCl3.62g(2mmol,4當(dāng)量equiv）和咪唑2.45g (36mmol, 6equiv)；在20℃條件下反應(yīng)5h后加入乙酸乙酯，用水和飽和食鹽水洗滌，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮后用硅膠柱柱層析得到白色固體的化合物2共2.95g，產(chǎn)率為98%；

其合成路徑及結(jié)構(gòu)通式為：

。

實(shí)施例2

一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法，其中間體3,4的制備方法為：

取二氯化鋅68mg(0.5mmol)置于反應(yīng)瓶瓶中，干燥后加入二氯甲烷，加入實(shí)施例1制備的化合物 2及四醋酸銠（Rh₂(OAc)₄，在氬氣保護(hù)下，將反應(yīng)體系加熱回流90分鐘；通過(guò)薄層色譜（TLC）監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后得到中間體3的溶液。

將7.6g（15mmol）重氮化合物 2、67mg（0.15mmol）Rh₂(OAc)₄、40mL干燥的二氯甲烷依次加入到反應(yīng)瓶中，在氬氣保護(hù)下，將反應(yīng)體系加熱至回流90min，通過(guò)TLC監(jiān)測(cè)反應(yīng)完全后，冷卻至-55℃，將2,2,6,6-四甲基哌啶3.03mL(18mmol)與二異丙基乙二胺1.4mL (7.65mmol)混合后滴加15min以上時(shí)間；然后，滴加三氟甲磺酸酐（Tf₂O）2.6mL(15.75mmol) 40min以上時(shí)間；滴加完畢后，再在-50℃下反應(yīng)1h；將反應(yīng)液通過(guò)硅膠柱純化后得到白色固體的中間體4共8.99g, 產(chǎn)率為98%；

其合成路徑及結(jié)構(gòu)通式為：

。

實(shí)施例3

一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法，其化合物5的制備方法為：

將ZnCl₂ 3.38g(24mmol,1.8equiv) 置于反應(yīng)瓶中，在真空下用電烤槍烘烤反應(yīng)管；冷卻后，加入20mL氮甲基吡咯烷酮（NMP），待體系冷卻后，在真空狀態(tài)下脫氣置換Ar三次；之后依次加入實(shí)施例2制備的中間體4共8.15g(13.5mmol)、三（2-呋喃）磷275mg、Pd₂dba₃ 275mg(1.2mmol)；將所得溶液在25℃室溫下攪拌10min，然后緩慢地加入三丁基乙烯基錫4.8mL(16.8mmol)；將反應(yīng)體系在30℃條件下反應(yīng)10h后用150mL乙酸乙酯稀釋，分別用水洗兩次及飽和食鹽水洗一次，有機(jī)相用無(wú)水硫酸鈉干燥，最后通過(guò)柱層析后得到白色固體的化合物5 共6.1g, 產(chǎn)率為93%；

其合成路徑及結(jié)構(gòu)通式為：

。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.21 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 8.5 Hz, 1H), 7.36 (dd, J = 17.8, 11.1 Hz, 1H), 5.56 (d, J = 17.8 Hz, 1H), 5.48 (d, J = 11.2 Hz, 1H), 5.44 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 5.26 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 4.30 – 4.22 (m, 1H), 4.20 (dd, J = 9.4, 2.6 Hz, 1H), 3.44 – 3.33 (m, 1H), 3.23 (dd, J = 5.5, 2.7 Hz, 1H), 1.25 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.21 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 0.84 (s, 9H), 0.07 (s, 3H), 0.06 (s, 3H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ = 173.01, 160.88, 149.10, 147.67, 143.03, 129.03, 128.20, 125.81, 123.82, 121.92, 65.96, 65.33, 59.23, 56.20, 38.98, 25.77, 22.53, 18.03, 16.86, -4.12, -4.90.

實(shí)施例4

一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法，其化合物6的制備方法為：

將實(shí)施例3制備的化合物5溶解于27mL THF和37mL H₂O中，加入63mgOsO₄ (1.5%W/V水溶液)，之后立即同時(shí)加入NaIO₄和H₅IO₆；將反應(yīng)體系在25℃室溫下攪拌25 min，而后倒入10%的Na₂S₂O₃水溶液中，用乙酸乙酯萃取(65mL×2)，無(wú)水硫酸鈉干燥，濃縮，經(jīng)硅膠柱純化后得到黃色固體的化合物6共1.08g, 產(chǎn)率為45%；

其合成路徑及結(jié)構(gòu)通式為：

。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 10.36 (s, 1H), 8.23 (d, J = 8.7 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 8.6 Hz, 2H), 5.49 (d, J = 13.7 Hz, 1H), 5.36 (d, J = 13.7 Hz, 1H), 4.36 (dd, J = 10.4, 3.3 Hz, 1H), 4.33 – 4.24 (m, 1H), 3.55 – 3.44 (m, 1H), 3.41 (t, J = 3.9 Hz, 1H), 1.26 – 1.18 (m, 6H), 0.84 (s, 9H), 0.07 (s, 3H), 0.06 (s, 3H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 189.06, 172.95, 159.36, 147.95, 143.19, 141.82, 140.14, 128.50, 123.95, 66.51, 65.16, 60.97, 56.21, 38.08, 25.73, 22.14, 18.04, 16.39, -4.12, -5.05.

實(shí)施例5

一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法，其化合物7的制備方法為：

在氬氣保護(hù)下，向反應(yīng)瓶中加入實(shí)施例4制備的化合物6共62mg(1.37mmol)及12mL干燥的THF，冷卻到-15℃后加入硼烷-四氫呋喃復(fù)合物(1.0Min THF；1.4mL)，反應(yīng)體系在-15℃溫度下攪拌10min，而后向反應(yīng)體系中加入比例為1:1的冰冷乙酸乙酯與水(≈40mL )，用乙酸乙酯萃取 (40mL×2)，無(wú)水Na₂SO4干燥，濃縮，HPLC分析得到化合物7粗產(chǎn)物，產(chǎn)率85%，無(wú)需純化直接用于下一步反應(yīng)；

其合成路徑及結(jié)構(gòu)通式為：

。

實(shí)施例6

一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法，其化合物8的制備方法為：

在氬氣保護(hù)下，在反應(yīng)瓶中加入實(shí)施例5制備的化合物7為768mg(1.57 mmol)及10mL二氯甲烷, 冷卻到 0℃后緩慢加入吡啶510μL( 6.3mmol)及異丁基氯甲酸酯622μL(4.8 mmol)，在0℃下反應(yīng)4h，而后經(jīng)硅膠柱純化得到化合物8共0.66g,兩步的產(chǎn)率為71%；

其合成路徑及結(jié)構(gòu)通式為：

。

¹H NMR (400 MHz, CDCl₃) δ 8.20 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 7.64 (d, J = 8.5 Hz, 2H), 5.57 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 5.44 (d, J = 13.9 Hz, 1H), 5.25 (d, J = 13.8 Hz, 1H), 4.80 (d, J = 14.4 Hz, 1H), 4.30 – 4.17 (m, 2H), 3.93 (d, J = 6.7 Hz, 2H), 3.38 – 3.28 (m, 1H), 3.28 – 3.22 (m, 1H), 2.04 – 1.89 (m, 1H), 1.22 (d, J = 6.2 Hz, 3H), 1.19 (d, J = 7.3 Hz, 3H), 0.94 (s, 3H), 0.93 (s, 3H), 0.84 (s, 9H), 0.06 (s, 3H), 0.05 (s, 3H). ¹³C NMR (101 MHz, CDCl₃) δ 174.93, 160.46, 155.09, 147.72, 145.53, 142.67, 128.42, 128.20, 123.81, 74.59, 65.75, 65.59, 61.72, 60.67, 55.74, 40.29, 27.85, 25.74, 22.38, 18.93, 18.01, 15.47, -4.16, -4.95.

研究中我們發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的合成方法制備的化合物8是一個(gè)關(guān)鍵的中間體，能夠以此為衍生物合成其他熒光基團(tuán)的熒光探針化合物，或者是以4-羥基、氨基甲酸酯為連接基團(tuán)的熒光基團(tuán)的熒光探針化合物。

實(shí)施例7

一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法，其化合物9的制備方法為：

在氬氣保護(hù)下，將16mL甲苯和8mL四氫呋喃加入到反應(yīng)瓶中，將溶液在液氮乙醇體系中冷卻到-60℃，用氬氣/真空置換三次脫除溶液中的氣體；將42.5mg Pd₂dba₃-CHCl₃(0.04mmol) 和46μL亞磷酸三乙酯(0.28mmol)加入到反應(yīng)瓶中，將反應(yīng)液在25℃室溫下攪拌2h，而后加入實(shí)施例6制備的化合物8為417mg(0.7mmol)及7-羥基香豆素113mg(0.7mmol)；將反應(yīng)體系再脫氣幾分鐘之后在30℃條件下反應(yīng)18小時(shí)；反應(yīng)液旋掉溶劑后，用石油醚、乙酸乙酯作為流動(dòng)相在硅膠柱上純化得到白色固體的化合物9共293mg, 產(chǎn)率為60%；

其合成路徑及結(jié)構(gòu)通式為：

。

¹H NMR (400MHz, CDCl₃) δ 8.21(d,J = 8.7Hz, 2H), 7.67(d, J = 8.7Hz, 2H), 7.64 (d, J = 9.6Hz,1H), 7.38(d, J = 8.5Hz,1H), 6.87 – 6.81 (m, 2H), 6.26 (d, J = 9.5Hz,1H), 5.54 (d, J = 14.4Hz,1H), 5.48 (d, J = 13.9Hz,1H), 5.29 (d, J = 13.9Hz,1H), 4.78 (d, J = 14.4Hz,1H), 4.32–4.22 (m,2H), 3.45–3.35 (m,1H), 3.31 (dd, J = 4.9, 3.3Hz,1H), 1.24 (d, J = 7.8Hz,3H), 1.22 (d, J = 6.4Hz,3H), 0.85 (s,10H), 0.07 (s,3H), 0.06 (s, 3H). ¹³C NMR (101MHz, CDCl₃) δ 175.18, 161.25, 161.04, 160.75, 155.78, 147.66, 146.91, 143.31, 142.51, 129.05, 128.13, 127.87, 123.78, 113.58, 113.10, 112.53, 101.82, 65.65, 65.50, 63.00, 60.75, 55.43, 40.33, 25.70, 22.28, 17.96, 15.49, -4.24, -4.99.

實(shí)施例8

一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法，其化合物10的制備方法為：

將實(shí)施例7制備的化合物9共 31mg(0.049mmol)溶解于0.6mL的N-甲基吡咯烷酮/N,N-二甲基甲酰胺中，化合物9 與N-甲基吡咯烷酮/N,N-二甲基甲酰胺的體積比為1:3，之后加入11.4mg二氟化氫銨(0.2mmol)，在25℃室溫下反應(yīng)40h，而后加入乙酸乙酯稀釋反應(yīng)體系，乙酸乙酯相分別用水洗，飽和食鹽水洗，無(wú)水硫酸鈉干燥后濃縮；將得到的混合物以石油醚、乙酸乙酯體系作為流動(dòng)相在硅膠柱上純化得到化合物10共(17.4mg, 產(chǎn)率為68%；

其合成路徑及結(jié)構(gòu)通式為：

。

實(shí)施例9

一種耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針的合成方法，其化合物CPC-1的制備方法為：

將實(shí)施例8制備的化合物10共33.8mg(0.065mmol) 溶解于1mL THF，加入0.5mL的0.2M、pH=7.0的磷酸鹽緩沖液以及15mg、5%的鉑碳（Pt/C），置換氫氣后在25℃室溫下反應(yīng)2h；反應(yīng)液經(jīng)過(guò)過(guò)濾除掉鉑碳后，加入 4mL去離子水、4mL乙酸乙酯萃取，剩余水相經(jīng)過(guò)反相C18制備柱純化，冷凍干燥得到白色固體的化合物CPC-1、即所述熒光探針化合物16.4mg；

其合成路徑及結(jié)構(gòu)通式為：

。

¹H NMR (400 MHz, D₂O) δ 7.94 (d,J = 9.5 Hz,1H), 7.56 (d,J = 8.7 Hz,1H), 6.97 (d, J=9.2 Hz,1H), 6.90 (s,1H), 6.30 (d,J=9.4 Hz,1H), 5.45(d,J = 13.3 Hz,1H), 4.79 (s, 2H), 4.24–4.17(m,1H), 4.14(dd,J = 10.0,2.3 Hz,1H), 3.44(d,J=5.1Hz,1H), 3.363.26 (m, 1H),1.27(d,J=6.1Hz,3H), 1.17(d,J=7.3 Hz,3H).

本發(fā)明的合成方法制備的熒光探針可制成試紙、試劑盒或者檢測(cè)芯片應(yīng)用于檢測(cè)碳青霉烯酶和含有碳青霉烯耐藥菌以及在生物、預(yù)防保健、臨床診斷各領(lǐng)域。以下提供3個(gè)應(yīng)用實(shí)施例對(duì)本發(fā)明所述的應(yīng)用進(jìn)行說(shuō)明。

應(yīng)用實(shí)施例1

本發(fā)明制備的熒光探針化合物在碳青霉烯酶及耐藥菌檢測(cè)中的應(yīng)用，包括以下步驟：

（1）將本發(fā)明的熒光探針化合物與待測(cè)樣品在一定條件下混合，形成具有光學(xué)性質(zhì)的化合物。

（2）測(cè)量具有光學(xué)性質(zhì)的化合物的光學(xué)信號(hào)變化，從而確定待測(cè)樣品中碳青霉烯酶或者含有碳青霉烯耐藥菌的含量或濃度。

應(yīng)用實(shí)施例2

測(cè)試碳青霉烯酶為含有鋅離子的B類重組表達(dá)的碳青霉烯酶：VIM-27，IMP-1，A類重組表達(dá)的碳青霉烯酶：KPC-3。

（1）測(cè)定熒光探針化合物在碳青霉烯酶VIM-27下熒光變化（參見(jiàn)圖2）

將檢測(cè)樣品（β-內(nèi)酰胺酶酶或耐藥菌）混在磷酸鹽緩沖液｛1X PBS，pH=7.4, 0.1%表面活性劑〔CHAPS，3-[3-(膽酰胺丙基)二甲基銨]-1-丙磺酸內(nèi)鹽〕｝中置于酶標(biāo)微板內(nèi)，在25℃下通過(guò)酶標(biāo)儀測(cè)量熒光強(qiáng)度的變化，激發(fā)波長(zhǎng)為365nm，發(fā)射波長(zhǎng)為460nm，監(jiān)測(cè)20min時(shí)間左右。（參見(jiàn)圖3，熒光探針在一定濃度的酶下隨時(shí)間的熒光變化圖）。從圖中可以看出熒光探針（CPC-1）在低濃度的碳青霉烯酶（IM-27，IMP-1，KPC-3）的作用下即可發(fā)生明顯的熒光強(qiáng)度的變化，而熒光探針（CPC-1）在沒(méi)有酶的作用下熒光強(qiáng)度并不發(fā)生明顯的變化，因而，這一熒光強(qiáng)度變化與否的現(xiàn)象說(shuō)明本發(fā)明制備的熒光探針能用于檢測(cè)或區(qū)分碳青霉烯酶。

應(yīng)用實(shí)施例2只是檢測(cè)樣品的通用條件。需要指出的是：應(yīng)用實(shí)施中使用的檢測(cè)樣品（酶樣、菌樣、血液樣品、尿液樣品等）、各種試劑（緩沖體系、酶穩(wěn)定劑等）、檢測(cè)條件（酸堿度、溫度等）并不局限于上述待檢測(cè)樣品和通用條件。

應(yīng)用實(shí)施例3

本發(fā)明制備的熒光探針在檢測(cè)表達(dá)有重組碳青霉烯酶的大腸埃希菌和臨床菌中的應(yīng)用

將表達(dá)有不同重組β-內(nèi)酰胺酶(VIM-27、IMP-1、KPC-3、TEM-1)的大腸埃希菌在LB培養(yǎng)基中37℃過(guò)夜生長(zhǎng)，之后將細(xì)菌懸浮液進(jìn)行低溫離心（轉(zhuǎn)速10000rpm、溫度4℃、離心時(shí)間5min），去除上清液，將菌餅再懸浮于PBS中，通過(guò)測(cè)量600nm處的吸光度得到相應(yīng)的細(xì)菌數(shù)量并用CFU/mL（每毫升的菌落形成單位）進(jìn)行表示。對(duì)于每個(gè)用于研究的菌株按照1︰10的四個(gè)梯度進(jìn)行一系列的稀釋；將細(xì)菌檢測(cè)實(shí)驗(yàn)在黑色384孔板上進(jìn)行（總體積為15μL）。在所述384孔板上的每個(gè)孔內(nèi)同時(shí)加入5μL的梯度稀釋的細(xì)菌，然后加入10μL的15μM熒光探針（CPC-1），將得到的待檢測(cè)樣品在25℃室溫下培養(yǎng)2h后通過(guò)酶標(biāo)儀監(jiān)測(cè)熒光強(qiáng)度的變化（參加圖4，待檢測(cè)細(xì)菌樣品與熒光探針化合物混合培養(yǎng)2h后的熒光成像圖）。檢測(cè)結(jié)果為：從圖4中可以看到，只有表達(dá)有碳青霉烯酶的大腸桿菌(VIM-27，IMP-1，KPC-3)能對(duì)熒光探針CPC-1產(chǎn)生響應(yīng)，產(chǎn)生的熒光信號(hào)明顯，而對(duì)照組非碳青霉烯酶的大腸桿菌（TEM-1）以及野生型大腸桿菌不能對(duì)熒光探針CPC-1產(chǎn)生響應(yīng)，幾乎沒(méi)有熒光信號(hào)產(chǎn)生。

應(yīng)用實(shí)施例1-3的結(jié)構(gòu)證明：本發(fā)明所述的耐碳青霉烯類抗生素病菌的熒光探針能夠在檢測(cè)碳青霉烯酶和含有碳青霉烯耐藥菌以及在生物、預(yù)防保健、臨床診斷各領(lǐng)域的進(jìn)行應(yīng)用，可通過(guò)所述熒光探針在熒光強(qiáng)度上變化與否的現(xiàn)象來(lái)檢測(cè)或者區(qū)分碳青霉烯酶，進(jìn)而可快速檢測(cè)有碳青霉烯酶表達(dá)的細(xì)菌及其耐藥菌，指導(dǎo)在醫(yī)療臨床上合理使用抗生素藥物。