本發(fā)明涉及核酸擴(kuò)增以及核酸檢測(cè)領(lǐng)域，具體涉及一種集核酸提取、擴(kuò)增與檢測(cè)一體化的裝置。

背景技術(shù)：

核酸擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)現(xiàn)了對(duì)微量的核酸樣本的擴(kuò)增與檢測(cè)，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于生物醫(yī)藥等領(lǐng)域中。目前，已經(jīng)發(fā)展了包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)PCR、核酸環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)LAMP、依賴核酸序列的擴(kuò)增NASBA、滾環(huán)擴(kuò)增反應(yīng)RCA、連接擴(kuò)增反應(yīng)LCR、解旋酶依賴的核酸擴(kuò)增反應(yīng)HAD等多種核酸擴(kuò)增方法。但是，這些基于目標(biāo)序列的核酸擴(kuò)增方法存在擴(kuò)增產(chǎn)物易交叉污染的問題，由產(chǎn)物污染產(chǎn)生的假陽性信號(hào)會(huì)造成檢測(cè)結(jié)果的錯(cuò)誤判讀。盡管已發(fā)展了一系列方法來防止擴(kuò)增產(chǎn)物的交叉污染，如對(duì)PCR操作進(jìn)行嚴(yán)格的分區(qū)控制、采用閉管擴(kuò)增與檢測(cè)的方法、利用酶解方法消除污染的方法等，但這些方法對(duì)實(shí)驗(yàn)條件以及操作人員要求較高，且人為因素影響較大。此外，現(xiàn)有擴(kuò)增方法所使用的模板都是經(jīng)過獨(dú)立的樣本提取過程，而提取過程中易造成模板交叉污染，影響樣本檢測(cè)結(jié)果的判斷。雖然目前已有多種集核酸提取、擴(kuò)增以及檢測(cè)一體化的裝置與設(shè)備，如GeneXpert System、icubate等，它們能夠在一個(gè)封閉的體系中實(shí)現(xiàn)對(duì)待測(cè)核酸的提取、擴(kuò)增與檢測(cè)，極大地避免了樣本在提取及擴(kuò)增過程中的污染，有效的提高了核酸檢測(cè)的準(zhǔn)確性與可操作性。但這些裝置構(gòu)造復(fù)雜、均需使用熒光探針且設(shè)備價(jià)格昂貴。因此，急需開發(fā)一種相對(duì)簡(jiǎn)單、低成本的集核酸提取、擴(kuò)增以及檢測(cè)一體化的設(shè)備與裝置。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種集核酸提取、擴(kuò)增與檢測(cè)一體化的裝置。

本發(fā)明的目的通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：

一種盒子，它包含：(1)一個(gè)封閉的腔體；(2)與腔體結(jié)合的底座；(3)底座上包含至少兩個(gè)室；(4)至少一個(gè)吸液管，其設(shè)置在腔體內(nèi)，可在腔體內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)與垂直移動(dòng)。

所述的底座與外殼緊密的組裝起來，使盒子內(nèi)形成一個(gè)封閉的腔體。

上述的盒子，進(jìn)一步包含連接在腔體內(nèi)的轉(zhuǎn)軸，其能使吸液管在腔體內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)以及垂直移動(dòng)。

上述的盒子，進(jìn)一步包含連接在腔體內(nèi)的吸液管泵，其能通過吸液管泵組件泵推桿抽吸空氣使液體流入吸液管，通過吸液管泵組件泵推桿推注將液體排出吸液管。

上述的盒子，進(jìn)一步包含腔體內(nèi)的加樣孔。

上述的盒子，進(jìn)一步包含加樣孔蓋，可以將加樣孔密封，使盒子內(nèi)部形成一個(gè)封閉的腔室。

上述的盒子，進(jìn)一步包含密封板，在加樣孔蓋密封加樣孔以后，將密封板滑至加樣孔蓋處，防止加樣孔蓋脫落。

上述的密封板，所述的密封板嵌套在滑槽上，且滑槽只能單向滑至加樣孔蓋位置。

一個(gè)盒子，它包含：(1)密封的腔體；(2)可轉(zhuǎn)動(dòng)以及垂直移動(dòng)的轉(zhuǎn)軸；(3)連接在轉(zhuǎn)軸上的吸液管支架，其可隨轉(zhuǎn)軸轉(zhuǎn)動(dòng)以及垂直移動(dòng)；(4)連接在吸液管支架上的吸液管，其可隨吸液管支架轉(zhuǎn)動(dòng)以及垂直移動(dòng)；(5)底座帶有至少兩個(gè)腔室；(6)吸液管泵組件，其可使吸液管內(nèi)產(chǎn)生氣壓的變化。

上述的盒子，進(jìn)一步包含連通吸液管和吸液管泵的管子。

上述的盒子，進(jìn)一步包含外殼內(nèi)的加樣孔。

上述的盒子，進(jìn)一步包含加樣孔蓋。

上述的盒子，進(jìn)一步包含密封板，在加樣孔蓋密封加樣孔以后，將密封板滑至加樣孔蓋處，防止加樣孔蓋脫落。

上述的密封板，所述的密封板嵌套在滑槽上，且滑槽只能單向滑至加樣孔蓋位置。

一種盒子，它包含：(1)封閉的外殼；(2)吸液管支架；(3)固定在支架上的吸液管；(4)至少兩個(gè)室；(5)控制吸液管在外殼內(nèi)轉(zhuǎn)動(dòng)以及垂直運(yùn)動(dòng)的工具。

本申請(qǐng)涉及到一種封閉式盒子，可用于核酸的提取、至少一重的擴(kuò)增以及檢測(cè)。該盒子內(nèi)部環(huán)境與外界環(huán)境通過盒子本身的材料隔開，形成一個(gè)獨(dú)立的腔體，通過操縱盒子所攜帶的轉(zhuǎn)軸實(shí)現(xiàn)對(duì)盒子內(nèi)部的吸液管進(jìn)行轉(zhuǎn)動(dòng)和垂直移動(dòng)，從而實(shí)現(xiàn)吸液管在盒子內(nèi)不同空間位置的移動(dòng)；同時(shí)通過盒子攜帶的吸液管泵及其組件通過吸液管實(shí)現(xiàn)對(duì)至少一種核酸擴(kuò)增反應(yīng)以及檢測(cè)反應(yīng)的液體試劑在底座上的至少一個(gè)提取室、擴(kuò)增室、檢測(cè)室以及儲(chǔ)液室之間移動(dòng)，所述的試劑可以是提取以及核酸擴(kuò)增所需的緩沖液、核酸擴(kuò)增以及檢測(cè)所需要的至少一種酶和至少擴(kuò)增和檢測(cè)一種目標(biāo)核酸的核酸引物和探針。

本申請(qǐng)所述的盒子，可以進(jìn)行任何核酸擴(kuò)增反應(yīng)，以及檢測(cè)反應(yīng)。通過靶標(biāo)特異性的引物對(duì)經(jīng)提取室提取的核酸模板進(jìn)行擴(kuò)增，產(chǎn)生至少一種擴(kuò)增子。在至少一個(gè)檢測(cè)室中，通過特異性的核酸檢測(cè)探針對(duì)至少一種擴(kuò)增子進(jìn)行特異性的檢測(cè)。通過所述的盒子可以有效的避免在病原微生物等擴(kuò)增檢測(cè)中存在的污染問題。

附圖說明

圖1是本申請(qǐng)?zhí)峁┑暮凶诱w結(jié)構(gòu)圖。

圖2是本申請(qǐng)?zhí)峁┑暮凶觽?cè)視結(jié)構(gòu)圖。

圖3是本申請(qǐng)?zhí)峁┑暮凶痈┮暯Y(jié)構(gòu)圖。

圖4a是本申請(qǐng)?zhí)峁┑暮凶拥鬃母┮晥D。

圖4b是本申請(qǐng)?zhí)峁┑暮凶拥鬃膫?cè)視圖。

圖4c是本申請(qǐng)?zhí)峁┑暮凶拥鬃难鲆晥D。

圖5是本申請(qǐng)?zhí)峁┑暮凶用芊獍宀煌嵌冉Y(jié)構(gòu)圖。

a為密封板立體圖；b為密封板側(cè)視圖；c為密封板仰視圖；d為密封板俯視圖。

圖6是本申請(qǐng)?zhí)峁┑暮凶蛹訕涌咨w不同角度結(jié)構(gòu)圖。

a為加樣孔蓋俯視圖；b為加樣孔蓋立體圖；c為加樣孔蓋仰視圖；d為加樣孔蓋正視圖；e為加樣孔蓋側(cè)視圖。

圖7是本申請(qǐng)?zhí)峁┑暮凶颖猛茥U不同角度結(jié)構(gòu)圖。

a為泵推桿立體圖；b為泵推桿正視圖；c為泵推桿仰視圖。

圖8是本申請(qǐng)?zhí)峁┑暮凶拥鬃皇冶Ｗo(hù)板不同角度結(jié)構(gòu)圖。

a為保護(hù)板俯視圖；b為保護(hù)板仰視圖；c為保護(hù)板側(cè)視圖；d為保護(hù)板立體圖。

具體實(shí)施方式

本申請(qǐng)所述的密封式盒子(圖1)，是由盒子底座5和外殼13密封而成的一個(gè)密閉式腔體，其內(nèi)部含有吸液管泵2組件、轉(zhuǎn)軸3組件、吸液管8、底座腔體等，所述的底座腔體包含至少一個(gè)提取室7、至少一個(gè)擴(kuò)增室15、至少一個(gè)檢測(cè)室10以及至少一個(gè)儲(chǔ)液室11。該密閉式盒子提取的樣本可以是任何形式的樣本，包括血液、組織、痰液、尿液以及糞便等，通過加樣孔14加入樣本提取室7，為保證樣本在盒子內(nèi)無污染，在樣本加入盒子內(nèi)后，蓋上加樣孔蓋17，并把密封板9滑到加樣孔蓋17上，同時(shí)盒子為一次性的使用。另外，為保證樣本可以便利的加入盒子內(nèi)的樣本提取室7中，在加樣孔14處的盒子高度相比盒子的另一側(cè)被剖低了很多，其降低的尺寸根據(jù)實(shí)際需要可以適時(shí)調(diào)整。

為了保證在樣本核酸的正常擴(kuò)增以及檢測(cè)，如圖4a、4b和4c所示，盒子中底座5包含至少一個(gè)提取室7、至少一個(gè)擴(kuò)增室15、至少一個(gè)檢測(cè)室10以及至少一個(gè)儲(chǔ)液室11。提取室7、擴(kuò)增室15以及檢測(cè)室10根據(jù)樣本提取、擴(kuò)增和檢測(cè)的需要，設(shè)計(jì)不同的尺寸和形狀，同時(shí)根據(jù)需要排布其位置，核酸擴(kuò)增室15可完成至少一重的目的核酸片段的擴(kuò)增，預(yù)先在擴(kuò)增室15中將擴(kuò)增所需要的至少一對(duì)引物、酶以及dNTP等混合到一起，或者預(yù)先將擴(kuò)增室15中的引物、酶以及dNTP放入一個(gè)擴(kuò)增室或者至少一個(gè)儲(chǔ)液室11中；在檢測(cè)室10中可以完成對(duì)至少一重產(chǎn)物的特異性檢測(cè)，而完成特異性檢測(cè)所需要的探針、酶等則是預(yù)先放入檢測(cè)室10中或者至少一個(gè)儲(chǔ)液室11中。儲(chǔ)液室11可以根據(jù)實(shí)際需要，設(shè)計(jì)成不同的形狀以及深度。儲(chǔ)存的試劑包含提取所需要的裂解液、洗脫液，擴(kuò)增所需要的引物、dNTP、酶，檢測(cè)所需要的探針、酶，以及其他必須的試劑。這些試劑可滿足至少對(duì)一種樣本的目標(biāo)序列進(jìn)行檢測(cè)，并且這些試劑是預(yù)先存放于相應(yīng)的儲(chǔ)液室11或者擴(kuò)增室15或者檢測(cè)室10后進(jìn)行密封以方便運(yùn)輸和儲(chǔ)藏；同時(shí)，這些密封的材料也要滿足在盒子工作過程中能夠很好的被吸液管刺穿并有利于液體試劑的轉(zhuǎn)移，因此，我們選擇鋁箔紙這種適于盒子需要的材料。

本申請(qǐng)所述的盒子可以與相應(yīng)的底座機(jī)器相匹配，使用時(shí)可放入底座機(jī)器中，通過機(jī)器的一系列的必要器件的操作實(shí)現(xiàn)對(duì)盒子內(nèi)部部件的一些移動(dòng)或者變化，盒子內(nèi)部部件設(shè)計(jì)提供垂直或者轉(zhuǎn)動(dòng)實(shí)現(xiàn)對(duì)盒子內(nèi)部一些組件的操作。如圖1所示，這些部件分別稱為轉(zhuǎn)軸3、支架12、吸液管8以及吸液管泵2。轉(zhuǎn)軸3通過支架12固定連接吸液管8，通過與盒子匹配的機(jī)器控制轉(zhuǎn)軸3的轉(zhuǎn)動(dòng)和上下垂直移動(dòng)，進(jìn)而控制吸液管8在底座5上不同的腔室之間移動(dòng)；吸液管8通過管子與吸液管泵2相連接，與盒子匹配的機(jī)器控制泵推桿1的進(jìn)出實(shí)現(xiàn)對(duì)吸液管8內(nèi)的氣壓的控制，進(jìn)而使液體試劑流入或者流出吸液管8，從而實(shí)現(xiàn)不同的液體試劑在底座5不同的腔室內(nèi)移動(dòng)。轉(zhuǎn)軸3與支架12之間是密封的，為了做到很好的密封，在轉(zhuǎn)軸3與支架12之間安放了密封圈(圖中未能顯示)。為了確保吸液管8轉(zhuǎn)動(dòng)的準(zhǔn)確性，采用光學(xué)或者磁力學(xué)傳感器對(duì)其轉(zhuǎn)動(dòng)位置進(jìn)行檢測(cè)，并及時(shí)調(diào)整。吸液管泵2內(nèi)有彈簧4套在泵推桿1上，當(dāng)在機(jī)械的作用下推泵推桿1時(shí)，吸液管8內(nèi)的氣體被排除，而當(dāng)機(jī)械被撤去后，泵推桿1會(huì)在彈簧4作用下往外運(yùn)動(dòng)，使氣體進(jìn)入吸液管8，通過這一過程完成吸液管對(duì)液體試劑的吸取和排出。

附圖2顯示的是本申請(qǐng)所述盒子的側(cè)視圖。

附圖3顯示的為本申請(qǐng)所述盒子的俯視圖，為保證盒子的密封性，增加了匹配加樣孔14的加樣孔蓋17以及密封板9。為保證樣本的安全性，盒子將不會(huì)再次被打開，因此，在樣本由加樣孔14加入盒子內(nèi)的提取室7后，操作者應(yīng)蓋上加樣孔蓋17，同時(shí)將密封板9滑至加樣孔蓋17上方。由于密封板9滑動(dòng)時(shí)單向的，因此，在密封板9滑動(dòng)至加樣孔蓋17上方后將限定在此位置，確保加樣孔蓋17不能再次被滑開。同時(shí)，為保證加樣孔蓋17蓋上加樣孔14后的密封性，加樣孔蓋17所選用的材料為軟性的塑料或者橡膠等具備一定彈性能力的材料。

附圖4a、4b和4c所示的為本申請(qǐng)所述的盒子底座的俯視圖、側(cè)視圖以及仰視圖。圖中分別從不同角度顯示了樣本提取室7、擴(kuò)增室15、檢測(cè)室10以及儲(chǔ)液室11所排布的其中一種方式；圖5所示的為本申請(qǐng)涉及的密封板9的俯視圖、側(cè)視圖以及仰視圖；圖6所示的為本申請(qǐng)所述的盒子加樣孔蓋17的俯視圖、側(cè)視圖以及仰視圖；圖7所示的為本申請(qǐng)所述的盒子泵推桿1的俯視圖、側(cè)視圖以及仰視圖；圖8所示的為本申請(qǐng)所述的盒子底座5腔室的保護(hù)板6的俯視圖、側(cè)視圖以及仰視圖。

實(shí)施例

使用時(shí)，使用者打開盒子上的加樣孔蓋17，使用加樣器向儲(chǔ)有樣本裂解液的提取室7中加入一定體積的樣本或者預(yù)處理樣本，然后將加樣孔蓋17蓋在加樣孔14上，并使密封板9滑至加樣孔上。盒子放入底座單元中。盒子安裝后盒子的轉(zhuǎn)軸3、泵推桿1等將與機(jī)器裝置相應(yīng)的機(jī)械相匹配，底座單元中有用于核酸擴(kuò)增的加熱器、檢測(cè)用的恒溫加熱器以及可以移動(dòng)的磁鐵。

現(xiàn)以提取好的樣本為例，對(duì)盒子內(nèi)部運(yùn)行具體擴(kuò)增以及檢測(cè)步驟進(jìn)行敘述：

1)通過旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)軸3移動(dòng)吸液管8至提取室正上方，并通過底座單元機(jī)的光學(xué)或者磁性傳感器驗(yàn)證該運(yùn)動(dòng)。

2)壓下泵推桿1排出吸液管8的空氣，同時(shí)下壓轉(zhuǎn)軸3使吸液管8進(jìn)入提取室7并使吸液管8尖部至樣本提取室7液面以下。

3)適當(dāng)松開泵推桿1，吸液泵彈簧4升高使提取好的樣本溶液流入吸液管8。

4)松開轉(zhuǎn)軸3，支架12內(nèi)彈簧升高使轉(zhuǎn)軸3升高，吸液管8升高離開提取室7。

5)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)軸3，使吸液管8移至擴(kuò)增室15的上方位置，采用底座單元機(jī)的光學(xué)或磁性傳感器驗(yàn)證該運(yùn)動(dòng)。

6)下壓轉(zhuǎn)軸3使吸液管8刺破擴(kuò)增室15口處的密封鋁箔紙，進(jìn)入盛有擴(kuò)增體系的擴(kuò)增室15，并使吸液管8尖部至液面以下。

7)壓下泵推桿1排出吸液管8的液體。

8)松開轉(zhuǎn)軸3，支架12內(nèi)彈簧升高使轉(zhuǎn)軸3升高，吸液管8升高離開擴(kuò)增室15。

9)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)軸3，使吸液管8移至甘油存儲(chǔ)室的上方位置，采用底座單元機(jī)的光學(xué)或磁性傳感器驗(yàn)證該運(yùn)動(dòng)。

10)下壓轉(zhuǎn)軸3使吸液管8刺破甘油儲(chǔ)液室11口處的密封鋁箔紙，進(jìn)入并將并使吸液管8尖部至液面以下。

11)適當(dāng)松開泵推桿1，吸液管泵彈簧4升高使礦物油流入吸液管。

12)松開轉(zhuǎn)軸3，支架12內(nèi)彈簧升高使轉(zhuǎn)軸3升高，吸液管8升高離開礦物油儲(chǔ)液室11。

13)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)軸3，使吸液管8移至擴(kuò)增室15的上方位置，采用底座單元機(jī)的光學(xué)或磁性傳感器驗(yàn)證該運(yùn)動(dòng)。

14)下壓轉(zhuǎn)軸3使吸液管8進(jìn)入擴(kuò)增室15并使吸液管8尖部至液面以下。

15)壓下泵推桿1排出吸液管8的液體。

16)松開轉(zhuǎn)軸3，支架12內(nèi)彈簧升高使轉(zhuǎn)軸3升高，吸液管8升高離開擴(kuò)增室15。

17)底座單元機(jī)進(jìn)行核酸擴(kuò)增的程序。

18)底座單元機(jī)保持?jǐn)U增室15的溫度為室溫。

19)下壓轉(zhuǎn)軸3使吸液管8進(jìn)入擴(kuò)增室15并使吸液管8尖部至液面以下。

20)適當(dāng)松開泵推桿1，吸液管泵彈簧4升高使擴(kuò)增產(chǎn)物流入吸液管8。

21)松開轉(zhuǎn)軸3，支架12內(nèi)彈簧升高使轉(zhuǎn)軸3升高，吸液管8升高離開擴(kuò)增室15。

22)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)軸3，使吸液管8移至檢測(cè)室10的上方位置，采用底座單元機(jī)的光學(xué)或磁性傳感器驗(yàn)證該運(yùn)動(dòng)。

23)下壓轉(zhuǎn)軸3使吸液管8刺破甘油檢測(cè)室10口處的密封鋁箔紙，進(jìn)入并將并使吸液管8尖部至液面以下。

24)壓下泵推桿1排出吸液管8的液體。

25)松開轉(zhuǎn)軸3，支架12內(nèi)彈簧升高使轉(zhuǎn)軸3升高，吸液管8升高離開檢測(cè)室10。

26)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)軸3，使吸液管8移至檢測(cè)用酶的儲(chǔ)液室11上方位置，采用底座單元機(jī)的光學(xué)或磁性傳感器驗(yàn)證該運(yùn)動(dòng)。

27)下壓轉(zhuǎn)軸3使吸液管8刺破檢測(cè)用酶的存儲(chǔ)室口處的密封鋁箔紙，進(jìn)入并將并使吸液管8尖部至液面以下。

28)適當(dāng)松開泵推桿1，吸液管泵彈簧4升高使檢測(cè)用酶溶液流入吸液管8。

29)松開轉(zhuǎn)軸3，支架12內(nèi)彈簧升高使轉(zhuǎn)軸3升高，吸液管8升高離開儲(chǔ)液室11。

30)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)軸3，使吸液管8移至檢測(cè)室10上方位置，采用底座單元機(jī)的光學(xué)或磁性傳感器驗(yàn)證該運(yùn)動(dòng)。

31)下壓轉(zhuǎn)軸3使吸液管8進(jìn)入檢測(cè)室10并使吸液管8尖部至液面以下。

32)壓下泵推桿1排出吸液管8的液體。

33)松開轉(zhuǎn)軸3，支架12內(nèi)彈簧升高使轉(zhuǎn)軸3升高，吸液管8升高離開檢測(cè)室10。

34)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)軸3，使吸液管8移至礦物油儲(chǔ)液室11上方位置，采用底座單元機(jī)的光學(xué)或磁性傳感器驗(yàn)證該運(yùn)動(dòng)。

35)下壓轉(zhuǎn)軸3使吸液管8進(jìn)入儲(chǔ)液室11并使吸液管8尖部至液面以下。

36)適當(dāng)松開泵推桿1，吸液管泵彈簧4升高使礦物油流入吸液管8。

37)松開轉(zhuǎn)軸3，支架12內(nèi)彈簧升高使轉(zhuǎn)軸3升高，吸液管8升高離開儲(chǔ)液室11。

38)旋轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)軸3，使吸液管8移至檢測(cè)室10上方位置，采用底座單元機(jī)的光學(xué)或磁性傳感器驗(yàn)證該運(yùn)動(dòng)。

39)下壓轉(zhuǎn)軸3使吸液管8進(jìn)入檢測(cè)室10并使吸液管8尖部至液面以下。

40)壓下泵推桿1排出吸液管8的液體。

41)松開轉(zhuǎn)軸3，支架12內(nèi)彈簧升高使轉(zhuǎn)軸3升高，吸液管8升高離開檢測(cè)室。

42)底座單元機(jī)進(jìn)行擴(kuò)增產(chǎn)物檢測(cè)的程序。

43)底座單元機(jī)保持檢測(cè)室10的溫度為室溫。

44)底座單元機(jī)的檢測(cè)體系對(duì)檢測(cè)室的結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)，并判讀結(jié)果。

一些步驟可以進(jìn)行一次以上。如上以及相關(guān)附圖的所示，本申請(qǐng)描述了一個(gè)用于核酸擴(kuò)增并檢測(cè)的裝置。并且所述的盒子的作用可以在適當(dāng)?shù)母倪M(jìn)后進(jìn)行更多的功能。