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      一種進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)的裝置及方法與流程

      文檔序號(hào):11675990閱讀:315來源:國(guó)知局
      一種進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)的裝置及方法與流程

      本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域,具體涉及核酸擴(kuò)增檢測(cè)技術(shù)及穿戴式醫(yī)療設(shè)備技術(shù)。



      背景技術(shù):

      可穿戴式設(shè)備(wearabledevice)是直接能穿在身上、或直接整合到用戶的衣服或配件中的設(shè)備。該設(shè)備可以集成多媒體、傳感器和無線通信等技術(shù),實(shí)現(xiàn)快速的數(shù)據(jù)獲取、超快的數(shù)據(jù)傳輸,擺脫傳統(tǒng)的手持設(shè)備而獲得無縫的網(wǎng)絡(luò)訪問體驗(yàn)。具有佩戴舒適甚至無感、使用過程不干擾正常生活、外觀適合使用場(chǎng)合和環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。目前全球可穿戴市場(chǎng)規(guī)模約為30億~50億美元,且未來兩到三年有望成長(zhǎng)為300億~500億美元的巨大市場(chǎng),特別是隨著4g和移動(dòng)終端的普及,可穿戴設(shè)備有巨大的發(fā)展?jié)摿ΑD壳皯?yīng)用最廣泛的可穿戴設(shè)備主要是眼鏡、手表、手環(huán)和項(xiàng)鏈等,實(shí)現(xiàn)的功能主要是健康監(jiān)測(cè),如手環(huán)監(jiān)測(cè)心率等;安全保障,如藍(lán)牙近距離通信實(shí)現(xiàn)錢包防竊等;以及游戲娛樂,如kinect體感游戲機(jī)等。隨著支撐技術(shù)的不斷進(jìn)步,可穿戴產(chǎn)品朝著更輕便、更隱蔽、更快捷的方向轉(zhuǎn)變,時(shí)尚型和功能型將成為可穿戴產(chǎn)品的發(fā)展的兩條主線。隨著硬件技術(shù)及互聯(lián)網(wǎng)技術(shù)的發(fā)展,可穿戴產(chǎn)品的功能會(huì)更加的全面,并且具有巨大的市場(chǎng)潛力以及廣闊的發(fā)展空間。

      醫(yī)療管理類可穿戴設(shè)備是目前最主要的發(fā)展方向。利用集成各種傳感器到可穿戴設(shè)備上,能夠長(zhǎng)期實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)人體中某種參數(shù)的指標(biāo)。由于柔性材料如聚二甲基硅氧烷(pdms)、聚甲基丙烯酸甲脂(pmma)等在范德華力的作用下能夠和人體皮膚充分接觸,并且具有較好的透明性,傳熱效應(yīng)和電化學(xué)電阻,通過工程處理之后可以做成彎曲的形狀,和皮膚更緊密的接觸,通常用于集成傳感器做成可穿戴設(shè)備。將柔性電流傳感器集成到隱形眼鏡中,用于檢測(cè)淚液中的葡萄糖含量;將生物傳感器集成到護(hù)口器中可用于檢測(cè)唾液中的乳酸含量;近期還研發(fā)出了將生物傳感器集成到臨時(shí)紋身中,以非入侵的方式測(cè)量人皮膚或間質(zhì)液體中的汗液成分。將基于聚酯片的傳感器集成到柔性材料中,可用于記錄人體的腦電圖(eeg)、心電圖(ecg)和肌電圖(emg),并通過無線數(shù)據(jù)傳輸?shù)姆绞綄⒔Y(jié)果送入電腦終端,實(shí)時(shí)分析人體的檢測(cè)狀況。雖然目前的可穿戴設(shè)備的應(yīng)用領(lǐng)域非常的廣泛,但至今沒有可穿戴設(shè)備可用于核酸擴(kuò)增及檢測(cè)。

      目前核酸擴(kuò)增技術(shù)有很多種,最常見的就是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(polymerasechainreaction,pcr)。該方發(fā)是通過高溫下核酸的變性、延伸、復(fù)性的方法,但是需要有溫度循環(huán)的設(shè)備,所需條件較高,而一些恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)通過酶切割堿基序列,需要一個(gè)恒定溫度即可實(shí)現(xiàn)核酸擴(kuò)增,為可穿戴設(shè)備應(yīng)用到核酸擴(kuò)增領(lǐng)域提供了可能。重組酶聚合酶擴(kuò)增技術(shù)(recombinasepolymeraseamplification,rpa)是一種恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù),擴(kuò)增溫度為31~42?c,接近于人體體溫,且能夠在十幾分鐘內(nèi)將核酸擴(kuò)增到可檢測(cè)的水平,是一種快速核酸恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)。



      技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:

      本發(fā)明首先要解決的技術(shù)問題是提供一種進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)的裝置,可以對(duì)核酸進(jìn)行快速的檢測(cè),且所需要的外部設(shè)備條件要求低,能夠隨時(shí)隨地進(jìn)行檢測(cè)。

      本發(fā)明解決上述技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案是:一種進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)的裝置,包括檢測(cè)系統(tǒng)和芯片,芯片置于檢測(cè)系統(tǒng)內(nèi),檢測(cè)系統(tǒng)包括光激發(fā)設(shè)備和信號(hào)采集設(shè)備,由光激發(fā)設(shè)備發(fā)出的光,照射到芯片上,在檢測(cè)區(qū)域產(chǎn)生發(fā)射光,經(jīng)過濾得到熒光信號(hào),信號(hào)采集設(shè)備采集該熒光信號(hào)從而進(jìn)行檢測(cè),該芯片能夠被集成在穿戴設(shè)備上。

      在采用上述技術(shù)方案的同時(shí),本發(fā)明還可以采用一下進(jìn)一步的技術(shù)方案:

      檢測(cè)系統(tǒng)包括殼體,殼體內(nèi)設(shè)有驅(qū)動(dòng)設(shè)備、光激發(fā)設(shè)備、信號(hào)采集設(shè)備、檢測(cè)設(shè)備和檢測(cè)腔室,驅(qū)動(dòng)設(shè)備包括電源和變壓器,驅(qū)動(dòng)設(shè)備為光激發(fā)設(shè)備和信號(hào)采集設(shè)備供電,光激發(fā)設(shè)備包括風(fēng)扇、散熱器和led光源,檢測(cè)設(shè)備包括激發(fā)片、二向分鏡和發(fā)射片,信號(hào)采集設(shè)備為工業(yè)相機(jī),激發(fā)片置于led光源的前端,發(fā)射片置于工業(yè)相機(jī)的鏡頭前端,二向分鏡和芯片置于檢測(cè)腔室內(nèi),光激發(fā)設(shè)備位于檢測(cè)腔室的一側(cè)且led光源朝向檢測(cè)腔室的方向,工業(yè)相機(jī)位于檢測(cè)腔室的上方且鏡頭朝向檢測(cè)腔室的方向,芯片置于檢測(cè)腔室的底部,二向分鏡在檢測(cè)腔室內(nèi)成45度角放置,其一面朝向光激發(fā)設(shè)備,另一面朝向工業(yè)相機(jī)。

      芯片包括設(shè)置在中部的六邊形的反應(yīng)腔室,該反應(yīng)腔室的兩端分別設(shè)有進(jìn)液口和出液口,反應(yīng)腔室的上下兩面分別設(shè)有頂層和底層作為封層,當(dāng)芯片置于檢測(cè)腔室內(nèi)時(shí),其下方設(shè)有加熱片,加熱片由驅(qū)動(dòng)設(shè)備供電。

      芯片是具有生物相容性的高分子聚合物芯片,例如pdms,芯片的頂層包含通道結(jié)構(gòu),芯片的底層是0.5mm厚的pdms膜,pdms通道的厚度為0.5-1.5mm,進(jìn)液口和出液口的孔徑為1-4mm。

      芯片頂層的通道結(jié)構(gòu)為單通道結(jié)構(gòu)或多通道結(jié)構(gòu),通道的總體積不小于50μl。

      led光源的功率為5-15w。

      激發(fā)片的帶通波長(zhǎng)為435-480nm。

      發(fā)射片的帶通波長(zhǎng)為500-560nm。

      該芯片能夠被集成在腕表上,佩帶在人體手腕處。

      本發(fā)明所要解決的另一個(gè)技術(shù)問題是提供一種進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)的方法,該方法應(yīng)用上述的裝置,并包括以下步驟:

      (1)測(cè)量人體溫度:向芯片中注水,將芯片通過穿戴設(shè)備固定在人體皮膚表面,通過熱電偶測(cè)量芯片中的液體溫度,驗(yàn)證用人體體溫?cái)U(kuò)增的可行性;

      (2)構(gòu)建核酸檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)曲線:

      (2.1)從原始濃度的核酸模板開始按比例稀釋,得到梯度稀釋的模板濃度;

      (2.2)按照rpa試劑盒說明書上的方法,配置好反應(yīng)所需混合物;

      (2.3)在混合物中加入不同濃度的模板和醋酸鎂充分混勻;

      (2.4)將混勻后的反應(yīng)物從進(jìn)液口打入芯片,放入檢測(cè)系統(tǒng),拍照記錄熒光強(qiáng)度;

      (2.5)將芯片佩戴在人體皮膚表面,通過人體體溫進(jìn)行擴(kuò)增,反應(yīng)一定時(shí)間后,取出芯片放入檢測(cè)系統(tǒng)中拍照記錄;

      重復(fù)步驟(2.1)-(2.5)至少三次,

      (2.6)imagej分析檢測(cè)區(qū)域的綠色熒光強(qiáng)度,根據(jù)反應(yīng)結(jié)束后的熒光強(qiáng)度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線;

      (3)樣本濃度檢測(cè):按照步驟(2.1)-(2.5)檢測(cè)樣本并將檢測(cè)結(jié)果帶入標(biāo)準(zhǔn)曲線中,得到樣本中的核酸濃度。

      本發(fā)明的有益效果是:本發(fā)明設(shè)計(jì)了與人體皮膚直接接觸的可穿戴設(shè)備,將含有rpa試劑的芯片插入手表中,利用手腕處的體溫提供rpa擴(kuò)增所需的溫度,通過自帶的光學(xué)系統(tǒng)檢測(cè)反應(yīng)后產(chǎn)生的熒光信號(hào)。利用本發(fā)明的裝置可以對(duì)核酸進(jìn)行快速的檢測(cè),甚至可以定量核酸的含量,且所需要的外部設(shè)備條件要求低,在貧困地區(qū)也可以廣泛使用,對(duì)貧困地區(qū)易發(fā)生的重大傳染病如hiv、hbv、ebola和zika等檢測(cè)具有重大的意義,對(duì)一些突發(fā)性疾病病原檢測(cè)如mers、流感等也有重要的意義。由于檢測(cè)所需要的時(shí)間短,只要20分鐘左右,也適用于出入境的人員做傳染病檢測(cè)。該方法在快速核酸檢測(cè)、傳染病防治等方面擁有廣闊的商業(yè)潛力。

      附圖說明

      圖1是芯片的結(jié)構(gòu)圖。

      圖2是芯片的分解狀態(tài)示意圖。

      圖3是檢測(cè)裝置的結(jié)構(gòu)圖。

      圖4是實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增結(jié)果圖。

      圖5是核酸濃度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      圖中標(biāo)號(hào):1-芯片,2-頂層,2-1-進(jìn)液口,2-2-出液口,2-3-反應(yīng)腔室,3-底層,4-加熱片,5-光激發(fā)設(shè)備,5-1-風(fēng)扇,5-2-散熱器,5-3-led光源,6-電源,7-驅(qū)動(dòng)設(shè)備,8-工業(yè)相機(jī),9-檢測(cè)系統(tǒng),9-1-發(fā)射片,9-2-二巷分鏡,9-3-激發(fā)片,10-二號(hào)擋板,11-檢測(cè)腔室。

      具體實(shí)施方式

      以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案作進(jìn)一步詳細(xì)說明,實(shí)施例僅用于解釋本發(fā)明的實(shí)施方式或過程,不是對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限定。

      實(shí)施例1,一種進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)的裝置,參照附圖1-3。

      本發(fā)明提供一種進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè)的裝置,該裝置能夠利用穿戴設(shè)備佩帶在人體皮膚表面,從而感受人體溫度,進(jìn)行核酸擴(kuò)增檢測(cè),具體來說,本發(fā)明的裝置包括檢測(cè)系統(tǒng)9和芯片1,芯片1可以被置于穿戴設(shè)備,例如腕帶或腕表中,從而與人體皮膚直接接觸。

      芯片1的具體結(jié)構(gòu)是:芯片1包括設(shè)置在中部的六邊形的反應(yīng)腔室2-3,該反應(yīng)腔室2-3的兩端分別設(shè)有進(jìn)液口2-1和出液口2-2,反應(yīng)腔室2-3的上下兩面分別設(shè)有頂層2和底層3作為封層,當(dāng)芯片1置于檢測(cè)系統(tǒng)9的檢測(cè)腔室內(nèi)時(shí),其下方設(shè)有加熱片4,加熱片4由檢測(cè)系統(tǒng)9內(nèi)的驅(qū)動(dòng)設(shè)備7供電。

      本發(fā)明中的芯片1是具有生物相容性的高分子聚合物芯片,例如pdms,芯片1的頂層2中包含通道結(jié)構(gòu),通道結(jié)構(gòu)可以是單通道結(jié)構(gòu)或多通道結(jié)構(gòu),只需要保證通道的總體積不小于50μl。當(dāng)芯片1位pdms時(shí),芯片1的底層3是0.5mm厚的pdms膜,pdms通道的厚度為0.5-1.5mm,進(jìn)液口2-1和出液口2-2的孔徑為1-4mm。

      檢測(cè)系統(tǒng)9包括光激發(fā)設(shè)備5和信號(hào)采集設(shè)備,由光激發(fā)設(shè)備5發(fā)出的光,照射到芯片1上,在檢測(cè)區(qū)域產(chǎn)生發(fā)射光,經(jīng)過濾得到熒光信號(hào),信號(hào)采集設(shè)備采集該熒光信號(hào)從而進(jìn)行檢測(cè)。

      檢測(cè)系統(tǒng)9包括殼體,殼體內(nèi)設(shè)有驅(qū)動(dòng)設(shè)備7、光激發(fā)設(shè)備5、信號(hào)采集設(shè)備、檢測(cè)設(shè)備和檢測(cè)腔室11,驅(qū)動(dòng)設(shè)備7為光激發(fā)設(shè)備和信號(hào)采集設(shè)備供電,驅(qū)動(dòng)設(shè)備7包括電源6和變壓器,變壓器將電源6的電源轉(zhuǎn)換為不同的電壓,以適應(yīng)檢測(cè)系統(tǒng)中不同用電裝置的需求。

      光激發(fā)設(shè)備5包括風(fēng)扇5-1、散熱器5-2和led光源5-3,風(fēng)扇5-1的額定電壓為12v,led光源5-3的功率為11w,額定電壓為11v,所需電壓由電源6提供,且由驅(qū)動(dòng)模塊7中的變壓器轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)的電壓。

      檢測(cè)設(shè)備包括激發(fā)片9-3、二向分鏡9-2和發(fā)射片9-1,信號(hào)采集設(shè)備為工業(yè)相機(jī)8,激發(fā)片9-3置于led光源5-3的前端,發(fā)射片9-1置于工業(yè)相機(jī)8的鏡頭前端且貼緊工業(yè)相機(jī)8的鏡頭,二向分鏡9-2和芯片1置于檢測(cè)腔室11內(nèi),激發(fā)片9-3的中心波長(zhǎng)為475nm,帶寬為40nm,距l(xiāng)ed光源5-3的距離為2.3mm;光激發(fā)設(shè)備5位于檢測(cè)腔室11的右側(cè)且led光源5-3的發(fā)射方向朝向檢測(cè)腔室的方向,工業(yè)相機(jī)8位于檢測(cè)腔室11的上方且鏡頭朝向檢測(cè)腔室11的方向,芯片置于檢測(cè)腔室的底部,檢測(cè)腔室11是55×55mm的正方形腔室,二向分鏡在檢測(cè)腔室內(nèi)成45度角放置,其一面朝向光激發(fā)設(shè)備,另一面朝向工業(yè)相機(jī),二號(hào)擋板10是一塊黑色的pmma板,用于遮住干擾光,距激發(fā)片9-3的距離為2.3mm,防止散射光產(chǎn)生背景干擾。

      實(shí)施例2,構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線,參照附圖5。

      本實(shí)施例使用hiv-1dna質(zhì)粒為檢測(cè)模板,將混合物注入芯片中,芯片通過手表與人體緊貼,利用人體體溫?cái)U(kuò)增核酸,并檢測(cè),建立不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)曲線。具體包括如下步驟:

      (1)從原始濃度109copies/ml的hiv-1dna質(zhì)粒模板開始按1:10的比例稀釋,得到梯度稀釋的模板濃度。

      (2)rpa試劑盒購(gòu)買自twist,按照配套說明書上的方法,29.5μlrehydrationbuffer,2.1μlprimer-f,2.1μlprimer-r,0.6μlprobe和3.2μl水,配置好混合物。

      (3)在混合物中加入10copies/mlhiv-1dna模板10μl,2.5μl醋酸鎂充分混勻,得反應(yīng)物。

      (4)在冰上將反應(yīng)物打入芯片4中,放到檢測(cè)系統(tǒng)中,ccd工業(yè)相機(jī)8拍照記錄檢測(cè)區(qū)域初始反應(yīng)的熒光強(qiáng)度。

      (5)將芯片鑲嵌在手表中,配戴在人體的手腕處,反應(yīng)24分鐘后,取出芯片置于檢測(cè)系統(tǒng)中拍照記錄。

      (6)將(2)中的模板分別換成模板濃度為105-102copies/m,重復(fù)(2)-(5)。

      (7)重復(fù)(2)-(6)三次。

      (8)imagej分析檢測(cè)區(qū)域2-3的綠色熒光強(qiáng)度,根據(jù)反應(yīng)結(jié)束后的熒光強(qiáng)度建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

      (9)陰性對(duì)照組使用rna-free水代替核酸模板,重復(fù)(4)-(5)。標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖4。

      實(shí)施例3,核酸擴(kuò)增檢測(cè),參照附圖4。

      1)在pdms芯片1中打入50μl水,放置在加熱片上4,插入熱電偶測(cè)通道中水的溫度,調(diào)節(jié)加熱溫度,使水的溫度達(dá)到33~34?c,模仿體溫。

      2)將hiv-1dna質(zhì)粒濃度從109copies/ml開始按1:10開始稀釋,得到不同的濃度梯度。

      2)根據(jù)rpa試劑說明書的方法,29.5μlrehydrationbuffer,2.1μlprimer-f,2.1μlprimer-r,0.6μlprobe和3.2μl水,配置好混合物。

      3)加入10copies/ml的hiv-1dna模板10μl,醋酸鎂2.5μl,充分混勻,得反應(yīng)物。

      4)在冰上將反應(yīng)物打入芯片1中,放到檢測(cè)系統(tǒng)中,ccd工業(yè)相機(jī)8拍照記錄檢測(cè)區(qū)域初始反應(yīng)的熒光強(qiáng)度。

      5)加熱片4開始加熱,工業(yè)相機(jī)8每隔三分鐘記錄一次擴(kuò)增圖像,共統(tǒng)計(jì)到30分鐘。

      6)濃度為105~102copies/mlhiv-1dna作為擴(kuò)增模板,重復(fù)步驟6)~8)。

      7)重復(fù)5)~9)三次。

      8)imagej分析檢測(cè)區(qū)域2-3的熒光強(qiáng)度,建立實(shí)時(shí)熒光擴(kuò)增曲線。檢測(cè)結(jié)果如圖3。

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