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      一種減少擴(kuò)增偏倚的基因突變檢測(cè)方法和試劑與流程

      文檔序號(hào):12056596閱讀:647來(lái)源:國(guó)知局
      一種減少擴(kuò)增偏倚的基因突變檢測(cè)方法和試劑與流程
      本發(fā)明涉及基因檢測(cè)
      技術(shù)領(lǐng)域
      ,尤其涉及一種減少擴(kuò)增偏倚的基因突變檢測(cè)方法和試劑。
      背景技術(shù)
      :基因檢測(cè)是通過血液、其他體液或細(xì)胞對(duì)受檢者的DNA進(jìn)行檢測(cè)的技術(shù)?;驒z測(cè)可以診斷疾病,也可以用于疾病風(fēng)險(xiǎn)的預(yù)測(cè)。通過基因檢測(cè)進(jìn)行疾病早期篩查、疾病診斷、伴隨治療時(shí)常常需要對(duì)多個(gè)低豐度基因突變位點(diǎn)進(jìn)行準(zhǔn)確靈敏的檢測(cè)。例如,腫瘤是高度異質(zhì)性的,其中致病突變可能以極低比例存在。實(shí)現(xiàn)腫瘤的精準(zhǔn)基因檢測(cè)需要從大量的非腫瘤DNA和非致病突變的腫瘤DNA中找到相關(guān)的低豐度基因突變。目前常用的基因檢測(cè)方法均以PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))為基礎(chǔ)。PCR擴(kuò)增為指數(shù)擴(kuò)增,即在擴(kuò)增的指數(shù)期會(huì)使PCR產(chǎn)物達(dá)到2n倍(n為進(jìn)入指數(shù)期的PCR循環(huán)數(shù))。因此PCR擴(kuò)增會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增偏倚,即原本豐度較高的DNA分子在擴(kuò)增產(chǎn)物中所占的比例會(huì)更大,原有的低豐度DNA分子在擴(kuò)增產(chǎn)物中所占的比例變得更小。這樣就容易出現(xiàn)低豐度DNA分子在PCR產(chǎn)物中被湮沒的情況,最終使得檢測(cè)靈敏度變低,甚至出現(xiàn)某些檢測(cè)位點(diǎn)假陰性(即無(wú)法檢測(cè)出)的情況。在高通量測(cè)序中,PCR擴(kuò)增偏倚也會(huì)導(dǎo)致大量的冗余數(shù)據(jù)產(chǎn)生,大大增加了測(cè)序成本。DSN(Duplex-SpecificNuclease)是一種來(lái)自紅金蟹的雙鏈特異性核酸酶,具有熱穩(wěn)定性,在60-65℃時(shí)具有最大活力。DSN能夠高選擇性的識(shí)別并酶切完全匹配的雙鏈DNA,對(duì)單鏈DNA幾乎無(wú)作用。在高通量測(cè)序平臺(tái)文庫(kù)構(gòu)建的某個(gè)時(shí)段適當(dāng)使用DSN核酸酶進(jìn)行處理可以有效減少PCR擴(kuò)增產(chǎn)生的偏倚效應(yīng)。目前現(xiàn)有的減少PCR擴(kuò)增偏倚的技術(shù)解決方案主要是從控制PCR指數(shù)期的角度進(jìn)行的。例如在文庫(kù)構(gòu)建過程中盡量減少PCR循環(huán)數(shù),未達(dá)到指數(shù)期或指數(shù)期擴(kuò)增越少產(chǎn)生的擴(kuò)增偏倚程度就越小。但是減少PCR循環(huán)數(shù)將直接導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物得率低,尤其當(dāng)待檢測(cè)DNA材料量極少時(shí)無(wú)法產(chǎn)生足夠的PCR產(chǎn)物用于檢測(cè),并且低豐度DNA突變很難達(dá)到足夠的拷貝數(shù)以用于檢測(cè)。另一方案是使用擴(kuò)增均一度表現(xiàn)優(yōu)越的DNA聚合酶,此方案只能很小程度上減少擴(kuò)增偏倚,往往并不能解決實(shí)際問題。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素:本發(fā)明提供一種減少擴(kuò)增偏倚的基因突變檢測(cè)方法和試劑,能使高豐度DNA含量與低豐度DNA含量接近,達(dá)到減少擴(kuò)增偏倚的目的,最終實(shí)現(xiàn)通過高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)低成本精準(zhǔn)檢測(cè)低豐度基因突變的目的。根據(jù)本發(fā)明的第一方面,本發(fā)明提供一種減少擴(kuò)增偏倚的基因突變檢測(cè)方法,包括:(a)使用用于捕獲待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域的第一步單向引導(dǎo)延伸引物對(duì)含有目標(biāo)區(qū)域DNA的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)定循環(huán)數(shù)的第一步單向引導(dǎo)延伸,然后使用第一通用引物和第一步單向引導(dǎo)延伸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中上述第一通用引物與上述接頭連接產(chǎn)物上的接頭序列匹配;(b)使用用于捕獲待檢測(cè)位點(diǎn)或區(qū)域的第二步單向引導(dǎo)延伸引物對(duì)上述步驟(a)的產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)定循環(huán)數(shù)的第二步單向引導(dǎo)延伸,其中上述第二步單向引導(dǎo)延伸引物相比上述第一步單向引導(dǎo)延伸引物在模板上的結(jié)合位置距離上述待檢測(cè)位點(diǎn)或區(qū)域更近,然后使用第二通用引物和第二步單向引導(dǎo)延伸引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中上述第二通用引物與上述接頭序列匹配;(c)對(duì)上述步驟(b)的產(chǎn)物進(jìn)行變性,然后在適于已變性的上述步驟(b)的產(chǎn)物退火的溫度下,用雙鏈特異性核酸酶處理上述步驟(b)的產(chǎn)物,以減少豐度過高的DNA分子含量,增加豐度低的DNA分子的相對(duì)含量;(d)使用第二通用引物和第三通用引物對(duì)步驟(c)的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。進(jìn)一步地,上述第一步單向引導(dǎo)延伸引物帶有用于捕獲上述步驟(a)的產(chǎn)物的親和標(biāo)記;優(yōu)選地,上述親和標(biāo)記是位于上述第一步單向引導(dǎo)延伸引物5’端的生物素標(biāo)記。進(jìn)一步地,上述第一通用引物與上述第二通用引物是相同的引物。進(jìn)一步地,上述第一步單向引導(dǎo)延伸引物與上述第二步單向引導(dǎo)延伸引物均位于上述待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域在上述目標(biāo)區(qū)域DNA的同方向。進(jìn)一步地,上述第一步單向引導(dǎo)延伸引物與上述第二步單向引導(dǎo)延伸引物間隔距離是0-110bp,優(yōu)選間隔距離是55bp。進(jìn)一步地,有多個(gè)上述待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域,相應(yīng)的,使用用于捕獲上述多個(gè)上述待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域的多個(gè)第一步單向引導(dǎo)延伸引物和/或多個(gè)第二步單向引導(dǎo)延伸引物。進(jìn)一步地,上述待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域包括點(diǎn)突變、插入、缺失和基因融合。進(jìn)一步地,上述測(cè)序包括測(cè)序以得到上述待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域的基因突變情況。進(jìn)一步地,上述方法在上述步驟(a)之前還包括:(a’)對(duì)上述接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)定循環(huán)數(shù)的擴(kuò)增,并以擴(kuò)增產(chǎn)物替代上述接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行上述步驟(a);優(yōu)選地,上述預(yù)定循環(huán)數(shù)是3-5個(gè)循環(huán)。根據(jù)本發(fā)明的第二方面,本發(fā)明提供一種減少擴(kuò)增偏倚的基因突變檢測(cè)試劑,包括:(a)用于捕獲待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域的第一步單向引導(dǎo)延伸引物,用于對(duì)含有目標(biāo)區(qū)域DNA的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)定循環(huán)數(shù)的第一步單向引導(dǎo)延伸;和第一通用引物,用于以上述第一步單向引導(dǎo)延伸的產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中上述第一通用引物與上述接頭連接產(chǎn)物上的接頭序列匹配;(b)用于捕獲待檢測(cè)位點(diǎn)或區(qū)域的第二步單向引導(dǎo)延伸引物,用于對(duì)上述第一通用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)定循環(huán)數(shù)的第二步單向引導(dǎo)延伸,其中上述第二步單向引導(dǎo)延伸引物相比上述第一步單向引導(dǎo)延伸引物在模板上的結(jié)合位置距離上述待檢測(cè)位點(diǎn)或區(qū)域更近;和第二通用引物,用于以上述第二步單向引導(dǎo)延伸的產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中上述第二通用引物與上述接頭序列匹配;(c)雙鏈特異性核酸酶,用于在上述第二通用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物已變性且適于退火的溫度下,處理上述擴(kuò)增產(chǎn)物,以減少豐度過高的DNA分子含量,增加豐度低的DNA分子的相對(duì)含量;(d)第三通用引物,用于對(duì)雙鏈特異性核酸酶處理的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。本發(fā)明的基因突變檢測(cè)方法使用單向引導(dǎo)延伸結(jié)合DSN核酸酶處理的均一化。PCR前進(jìn)行數(shù)個(gè)循環(huán)的單向引導(dǎo)延伸,使目標(biāo)DNA的產(chǎn)物量呈線性增加,即每一個(gè)單向引導(dǎo)延伸循環(huán)會(huì)產(chǎn)生原模板量一倍的單向引導(dǎo)延伸產(chǎn)物。多個(gè)單向引導(dǎo)延伸后產(chǎn)生足夠的待檢測(cè)DNA分子,再進(jìn)行指數(shù)PCR擴(kuò)增,可以相應(yīng)減少擴(kuò)增偏倚的程度。DSN核酸酶能夠選擇性消除高豐度雙鏈DNA,最終使得高豐度DNA含量與低豐度DNA含量接近,進(jìn)而達(dá)到減少擴(kuò)增偏倚的目的。最終實(shí)現(xiàn)通過高通量測(cè)序技術(shù)來(lái)低成本精準(zhǔn)檢測(cè)低豐度基因突變的目的。附圖說(shuō)明圖1為本發(fā)明實(shí)施例的第一步單向引導(dǎo)延伸和擴(kuò)增過程原理示意圖;圖2為本發(fā)明實(shí)施例的第二步單向引導(dǎo)延伸和擴(kuò)增過程原理示意圖;圖3為本發(fā)明實(shí)施例的單向引導(dǎo)延伸及DSN核酸酶去偏倚的效果示意圖;圖4為本發(fā)明實(shí)施例中純化文庫(kù)進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)的結(jié)果圖,其中M表示Takara100bpmarker,A表示本發(fā)明方法文庫(kù)電泳結(jié)果,B表示對(duì)照實(shí)驗(yàn)的文庫(kù)電泳結(jié)果。圖5為本發(fā)明實(shí)施例中各位點(diǎn)與深度比較結(jié)果,其中A表示本發(fā)明方法的各位點(diǎn)的深度情況,B表示對(duì)照實(shí)驗(yàn)的各位點(diǎn)的深度情況。具體實(shí)施方式下面通過具體實(shí)施方式結(jié)合附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明。如圖1-2所示,本發(fā)明實(shí)施例的減少擴(kuò)增偏倚的基因突變檢測(cè)方法,包括:(a)使用用于捕獲待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域的第一步單向引導(dǎo)延伸引物對(duì)含有目標(biāo)區(qū)域DNA的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)定循環(huán)數(shù)的第一步單向引導(dǎo)延伸,然后使用第一通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中第一通用引物與接頭連接產(chǎn)物上的接頭序列匹配;(b)使用用于捕獲待檢測(cè)位點(diǎn)或區(qū)域的第二步單向引導(dǎo)延伸引物對(duì)步驟(a)的產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)定循環(huán)數(shù)的第二步單向引導(dǎo)延伸,其中第二步單向引導(dǎo)延伸引物相比第一步單向引導(dǎo)延伸引物在模板上的結(jié)合位置距離待檢測(cè)位點(diǎn)或區(qū)域更近,然后使用第二通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中第二通用引物與接頭序列匹配;(c)對(duì)步驟(b)的產(chǎn)物進(jìn)行變性,然后在適于已變性的步驟(b)的產(chǎn)物退火的溫度下,用雙鏈特異性核酸酶處理步驟(b)的產(chǎn)物,以減少豐度過高的DNA分子含量,增加豐度低的DNA分子的相對(duì)含量;(d)使用第二通用引物和第三通用引物對(duì)步驟(c)的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。其中,第三通用引物與第一通用引物和第二通用引物在相反端,也就是結(jié)合在第一通用引物和第二通用引物所結(jié)合的一端相對(duì)的另一端的接頭序列上。待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域,即基因突變所在的位點(diǎn)或區(qū)域,可以是單個(gè)堿基位點(diǎn),也可以是一段堿基序列;其中基因突變可以是點(diǎn)突變、插入、缺失和基因融合等。目標(biāo)區(qū)域DNA,即待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域所在的DNA區(qū)域,與此相對(duì)的,如圖1所示的非目標(biāo)區(qū)域DNA,即不是待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域所在的DNA區(qū)域,這樣的區(qū)域也可能被第一步單向引導(dǎo)延伸引物結(jié)合從而發(fā)生延伸,得到不希望的擴(kuò)增產(chǎn)物。因此,第一步單向引導(dǎo)延伸的產(chǎn)物主要是目標(biāo)區(qū)域DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物,由于單向引導(dǎo)延伸特異性較差,還有少量的非目標(biāo)區(qū)域DNA的擴(kuò)增產(chǎn)物。第一步單向引導(dǎo)延伸過程中使用的作為擴(kuò)增模板的接頭連接產(chǎn)物是片段化的DNA連接接頭序列(例如測(cè)序接頭序列)的產(chǎn)物,其中接頭序列中包含隨機(jī)單分子標(biāo)簽序列,可以對(duì)每一個(gè)DNA分子進(jìn)行特異性標(biāo)記。第一通用引物(圖1中的通用引物)與接頭序列匹配,用于在第一步單向引導(dǎo)延伸之后,實(shí)現(xiàn)PCR擴(kuò)增。第一步PCR擴(kuò)增之后的產(chǎn)物,需要純化,再進(jìn)行第二步單向引導(dǎo)延伸和擴(kuò)增,一種有利的方式是第一步單向引導(dǎo)延伸引物帶有用于捕獲第一步PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的親和標(biāo)記;優(yōu)選地,位于第一步單向引導(dǎo)延伸引物5’端的生物素標(biāo)記,可以通過生物素-親和素的作用實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增產(chǎn)物的純化。步驟(a)中,預(yù)定循環(huán)數(shù)可以是10-30個(gè)循環(huán),優(yōu)選15-20個(gè)循環(huán),相應(yīng)的,使原模板增加15-20倍。第二步單向引導(dǎo)延伸和擴(kuò)增使用的引物距離待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域更近,對(duì)非目標(biāo)區(qū)域DNA產(chǎn)物有篩選去除作用,大大增加了目標(biāo)區(qū)域DNA擴(kuò)增的特異性。步驟(b)中,預(yù)定循環(huán)數(shù)可以是10-30個(gè)循環(huán),優(yōu)選15-20個(gè)循環(huán),相應(yīng)的,使原模板增加15-20倍。然后,再加入通用引物(第二通用引物)進(jìn)行第二步PCR擴(kuò)增。在本發(fā)明實(shí)施例中,第一通用引物與第二通用引物可以是相同的引物,也可以是不同的引物,優(yōu)選使用相同的引物。在本發(fā)明實(shí)施例中,優(yōu)選地,第一步單向引導(dǎo)延伸引物與第二步單向引導(dǎo)延伸引物均位于待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域在目標(biāo)區(qū)域DNA的同方向,圖1-2中顯示為,與帶有隨機(jī)單分子標(biāo)簽序列的接頭相對(duì)的另一個(gè)方向。在本發(fā)明實(shí)施例中,優(yōu)選地,第一步單向引導(dǎo)延伸引物與第二步單向引導(dǎo)延伸引物間隔距離是0-110bp,例如2bp、5bp、10bp、30bp、50bp、55bp、80bp或100bp等,優(yōu)選間隔距離是55bp。在本發(fā)明實(shí)施例中,針對(duì)多個(gè)待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域,可以使用多個(gè)第一步單向引導(dǎo)延伸引物,也就是以引物組的形式提供多個(gè)第一步單向引導(dǎo)延伸引物的混合物,相應(yīng)的,也可以以引物組的形式提供多個(gè)第二步單向引導(dǎo)延伸引物的混合物。在本發(fā)明實(shí)施例中,對(duì)步驟(d)的產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序,即可得到待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域的基因突變情況。在本發(fā)明優(yōu)選的實(shí)施例中,針對(duì)起始材料很少的DNA樣本可以對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)定循環(huán)數(shù)的擴(kuò)增,即“預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增”,例如進(jìn)行3-5個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增。在步驟(c)中,對(duì)第二步單向引導(dǎo)延伸和擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行去偏倚。由于此步驟之前已進(jìn)行了至少兩步PCR擴(kuò)增,導(dǎo)致擴(kuò)增產(chǎn)物不均一。進(jìn)行DSN核酸酶處理,減少豐度過高的DNA分子含量,相對(duì)增加豐度低的DNA分子含量,最終使所有待檢測(cè)分子的測(cè)序深度相對(duì)均一化。此方法基于核酸雜交動(dòng)力學(xué)和雙鏈DNA特異的DSN核酸酶的獨(dú)特特性。變性的DNA進(jìn)行復(fù)性時(shí),豐度高的DNA先復(fù)性,就會(huì)首先被DSN核酸酶消化降解。而DSN核酸酶對(duì)尚未復(fù)性的豐度低的單鏈DNA無(wú)消化降解作用。圖3示出了一個(gè)本發(fā)明實(shí)施例的單向引導(dǎo)延伸及DSN核酸酶去偏倚的效果示意圖,可見相比未做單向引導(dǎo)延伸及DSN處理的情況,做了單向引導(dǎo)延伸及DSN處理的情況能夠得到較好的均一度,體現(xiàn)在不同位點(diǎn)的測(cè)序深度沒有過大的差異,而未做單向引導(dǎo)延伸及DSN處理的情況下,不同位點(diǎn)的測(cè)序深度有幾個(gè)數(shù)量級(jí)的差異。對(duì)應(yīng)于本發(fā)明實(shí)施例的方法,本發(fā)明實(shí)施例還提供一種減少擴(kuò)增偏倚的基因突變檢測(cè)試劑,包括:(a)用于捕獲待檢測(cè)位點(diǎn)或待檢測(cè)區(qū)域的第一步單向引導(dǎo)延伸引物,用于對(duì)含有目標(biāo)區(qū)域DNA的接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)定循環(huán)數(shù)的第一步單向引導(dǎo)延伸;和第一通用引物,用于以第一步單向引導(dǎo)延伸的產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中第一通用引物與接頭連接產(chǎn)物上的接頭序列匹配;(b)用于捕獲待檢測(cè)位點(diǎn)或區(qū)域的第二步單向引導(dǎo)延伸引物,用于對(duì)第一通用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行預(yù)定循環(huán)數(shù)的第二步單向引導(dǎo)延伸,其中第二步單向引導(dǎo)延伸引物相比第一步單向引導(dǎo)延伸引物在模板上的結(jié)合位置距離待檢測(cè)位點(diǎn)或區(qū)域更近;和第二通用引物,用于以第二步單向引導(dǎo)延伸的產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增,其中第二通用引物與接頭序列匹配;(c)雙鏈特異性核酸酶,用于在第二通用引物的擴(kuò)增產(chǎn)物已變性且適于退火的溫度下,處理擴(kuò)增產(chǎn)物,以減少豐度過高的DNA分子含量,增加豐度低的DNA分子的相對(duì)含量;(d)第三通用引物,用于對(duì)雙鏈特異性核酸酶處理的產(chǎn)物進(jìn)行PCR擴(kuò)增并測(cè)序。以下通過實(shí)施例詳細(xì)說(shuō)明本發(fā)明的技術(shù)方案,應(yīng)當(dāng)理解,實(shí)施例僅是示例性的,不能理解為對(duì)本發(fā)明保護(hù)范圍的限制。實(shí)施例中使用的試劑,在沒有特別說(shuō)明的情況下,均為市售的常規(guī)試劑。實(shí)施例本實(shí)施例對(duì)樣本進(jìn)行文庫(kù)構(gòu)建并對(duì)NRAS、KRAS、PI3KA、EGFR4個(gè)基因的7個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè),具體如下:1.含有隨機(jī)單分子標(biāo)簽的接頭設(shè)計(jì)IDX1-S:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNggaattaGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO:1);IDX2-S:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNatccggcGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO:2);IDX3-S:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATNNNNNNNNcaggccgGTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCT(SEQIDNO:3);ADT-AS:pGATCGGAAGAGC(SEQIDNO:4);ADT-AS序列5’端磷酸基團(tuán)修飾。IDX1-S、IDX2-S、IDX3-S(均為接頭的第一鏈)分別與ADT-AS序列退火成雙鏈,構(gòu)成本發(fā)明的三個(gè)接頭ADT1、ADT2、ADT3。2.本實(shí)施例針對(duì)NRAS、KRAS、PIK3CA、EGFR這4個(gè)基因的常見7個(gè)突變點(diǎn)進(jìn)行檢測(cè)。針對(duì)NRAS的Q61K設(shè)計(jì)第一步單向引導(dǎo)延伸引物:NRAS-Q61K-STP1:TTTAATAAAAATTGAACTTCCCTCCCTCC(SEQIDNO:5);第二步單向引導(dǎo)延伸引物:NRAS-Q61K-STP2:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGACTTCCCTCCCTCCCTGCCCCCTTA(SEQIDNO:6)。針對(duì)KRAS的G12D設(shè)計(jì)第一步單向引導(dǎo)延伸引物:KRAS-G12D-STP1:ACTGGTGGAGTATTTGATAGTGTATTAACC(SEQIDNO:7);第二步單向引導(dǎo)延伸引物:KRAS-G12D-STP2:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATG(SEQIDNO:8)。針對(duì)PIK3CA的E545K設(shè)計(jì)第一步單向引導(dǎo)延伸引物:PIK3CA-E545K-STP1:TGACAAAGAAAGCTATATAAGATATTATTT(SEQIDNO:9);第二步單向引導(dǎo)延伸引物:PIK3CA-E545K-STP2:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGTTACAGAGTAACAGACTAGCTAGAGACAATG(SEQIDNO:10)。針對(duì)EGFR的E746-A750設(shè)計(jì)第一步單向引導(dǎo)延伸引物:EGFR-E746-A750-STP1:CAGATCACTGGGCAGCATGTGGCAC(SEQIDNO:11);第二步單向引導(dǎo)延伸引物:EGFR-E746-A750-STP2:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGT(SEQIDNO:12)。針對(duì)EGFR的V769_D770insASV設(shè)計(jì)第一步單向引導(dǎo)延伸引物:EGFR-V769_D770insASV-STP1:TCAAGATCGCATTCATGCGTCTTCACCTG(SEQIDNO:13);第二步單向引導(dǎo)延伸引物:EGFR-V769_D770insASV-STP2:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGTCTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTG(SEQIDNO:14)。針對(duì)EGFR的T790M設(shè)計(jì)第一步單向引導(dǎo)延伸引物:EGFR-T790M-STP1:CCTGCTGGGCATCTGCCTCACCT(SEQIDNO:15);第二步單向引導(dǎo)延伸引物:EGFR-T790M-STP2:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAG(SEQIDNO:16)。針對(duì)EGFR的L858R設(shè)計(jì)第一步單向引導(dǎo)延伸引物:EGFR-L858R-STP1:CTGTTTCAGGGCATGAACTACTTGGAGGA(SEQIDNO:17);第二步單向引導(dǎo)延伸引物:EGFR-L858R-STP2:TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAGGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGT(SEQIDNO:18)。所有第一步單向引導(dǎo)延伸引物5’端使用生物素標(biāo)記修飾。所有第一步單向引導(dǎo)延伸引物等量混合作為第一步單向引導(dǎo)延伸引物組,所有第二步單向引導(dǎo)延伸引物等量混合作為第二步單向引導(dǎo)延伸引物組。預(yù)文庫(kù)引物序列如下:Pre-F:GCTCTTCCGATCT(SEQIDNO:19);Uni-P1:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQIDNO:20)。最終PCR引物序列如下:Uni-P1:CAAGCAGAAGACGGCATACGA(SEQIDNO:21);Uni-P2:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG(SEQIDNO:22)。3.對(duì)照組使用常規(guī)基因突變檢測(cè)方法(直接PCR法)進(jìn)行illumina測(cè)序平臺(tái)文庫(kù)構(gòu)建:對(duì)照組實(shí)驗(yàn)使用2步PCR法,針對(duì)NRAS、KRAS、PIK3CA、EGFR這4個(gè)基因的常見7個(gè)突變點(diǎn)進(jìn)行引物設(shè)計(jì)。針對(duì)NRAS的Q61K設(shè)計(jì)第一步PCR引物:NRAS-Q61K-PCR1F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTACTTCCCTCCCTCCCTGCCCCCTTA(SEQIDNO:23);NRAS-Q61K-PCR1R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTGCCTGTCCTCATGTATTGGTCTCTCATG(SEQIDNO:24)。針對(duì)KRAS的G12D設(shè)計(jì)第一步PCR引物:KRAS-G12D-PCR1F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTGATAGTGTATTAACCTTATGTGTGACATG(SEQIDNO:25);KRAS-G12D-PCR1R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTTTAGCTGTATCGTCAAGGCACTCTTGCCT(SEQIDNO:26)。針對(duì)PIK3CA的E545K設(shè)計(jì)第一步PCR引物:PIK3CA-E545K-PCR1F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTTTACAGAGTAACAGACTAGCTAGAGACAATG(SEQIDNO:27);PIK3CA-E545K-PCR1R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTACCTGTGACTCCATAGAAAATCTTTCTCCT(SEQIDNO:28)。針對(duì)EGFR的E746-A750設(shè)計(jì)第一步PCR引物:EGFR-E746-A750-PCR1F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTCATGTGGCACCATCTCACAATTGCCAGT(SEQIDNO:29);EGFR-E746-A750-PCR1R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTCACATCGAGGATTTCCTTGTTGGCT(SEQIDNO:30)。針對(duì)EGFR的V769_D770insASV設(shè)計(jì)第一步PCR引物:EGFR-V769_D770insASV-PCR1F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTCTTCACCTGGAAGGGGTCCATGTG(SEQIDNO:31);EGFR-V769_D770insASV-PCR1R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTAGGTGAGGCAGATGCCCAGCAGG(SEQIDNO:32)。針對(duì)EGFR的T790M設(shè)計(jì)第一步PCR引物:EGFR-T790M-PCR1F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTATCTGCCTCACCTCCACCGTGCAG(SEQIDNO:33);EGFR-T790M-PCR1R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCAGGAGGCAGCCGAAGGGCATGAG(SEQIDNO:34)。針對(duì)EGFR的L858R設(shè)計(jì)第一步PCR引物:EGFR-L858R-PCR1F:ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGAACTACTTGGAGGACCGTCGCTTGGT(SEQIDNO:35);EGFR-L858R-PCR1R:GTGACTGGAGTTCAGACGTGTGCTCTTCCGATCTCTGCATGGTATTCTTTCTCTTCCGCAC(SEQIDNO:36)。以上對(duì)照實(shí)驗(yàn)組的第一步PCR引物等物質(zhì)的量混在一起作為第一步PCR擴(kuò)增引物組。第二步PCR引物:PCR2F:AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTAC(SEQIDNO:37);PCR2R-4:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAtaattctGTGACTGGAGTTCAG(SEQIDNO:38);PCR2R-5:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATagaggatGTGACTGGAGTTCAG(SEQIDNO:39);PCR2R-6:CAAGCAGAAGACGGCATACGAGATgagattcGTGACTGGAGTTCAG(SEQIDNO:40)。4.用于本實(shí)施例的樣本為一名健康人血液基因組DNA。使用10mlEDTA抗凝管收集10ml靜脈血。使用QiagenDNeasyBlood&TissueKit(250)(Qiagen69506)進(jìn)行基因組DNA抽提。5.基因組DNA片段化將基因組DNA取2份(A和B)各200ng。A使用CovarisS220,超聲波DNA破碎儀片段化至平均300bp大小,進(jìn)行本實(shí)施例實(shí)驗(yàn)。樣本B進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)。6.片段化DNA末端修復(fù)反應(yīng)體系如下表1:表1片段化DNA溶液100ngT4DNA連接酶緩沖液10μl10mMdNTP混合液4μlT4DNA聚合酶5μlT4DNA磷酸化酶5μlKlenow酶1μl總體積100μl金屬浴上20℃溫浴30分鐘。使用120μlAmpureXPbeads進(jìn)行純化,32μl洗脫緩沖液洗脫。7.3’端加多聚腺嘌呤尾配制如下表2反應(yīng)體系:表2末端修復(fù)的DNA溶液32μlKlenow酶緩沖液5μldATP10μlKlenowexo-酶3μl總體積50μl金屬浴上37℃溫浴30分鐘。使用60μlAmpureXPbeads進(jìn)行純化,10μl洗脫緩沖液洗脫。8.連接接頭配制如下表3反應(yīng)體系:表33’加A的DNA溶液10μlT4DNA連接酶緩沖液25μl2μMDNA接頭10μlT4DNA連接酶5μl總體積50μl金屬浴上20℃溫浴15分鐘。使用60μlAmpureXPbeads進(jìn)行純化,34.8μl洗脫緩沖液洗脫。9.預(yù)文庫(kù)擴(kuò)增配制如下表4反應(yīng)體系:表4PCR程序如下:a)95℃3分鐘;b)3個(gè)循環(huán)程序如下:95℃15秒62℃30秒72℃30秒c)72℃5分鐘d)4℃保存。使用60μlAmpureXPbeads進(jìn)行純化,50μl洗脫緩沖液洗脫。10.第一步單向引導(dǎo)延伸及擴(kuò)增配制如下表5反應(yīng)體系:表5引導(dǎo)延伸程序如下:a)95℃10分鐘;b)20個(gè)循環(huán)程序如下:95℃30秒62℃30秒72℃1分鐘c)72℃7分鐘d)4℃保存。加入1ul通用引物Uni-P1(25uM)。進(jìn)行第一步擴(kuò)增。第一步擴(kuò)增程序如下:a)95℃10分鐘;b)10個(gè)循環(huán)程序如下:95℃30秒62℃30秒72℃1分鐘c)72℃7分鐘d)4℃保存。使用60μlAmpureXPbeads進(jìn)行純化,22μl洗脫緩沖液洗脫。11.磁珠篩選使用DynabeadsTMM-270Streptavidin(Catalognos.65305,invitrogen)磁珠對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行篩選。12.第二步單向引導(dǎo)延伸及擴(kuò)增配制如下表6反應(yīng)體系:表6引導(dǎo)延伸程序如下:e)95℃10分鐘;f)20個(gè)循環(huán)程序如下:95℃30秒62℃30秒72℃1分鐘g)72℃7分鐘h)4℃保存。加入1ul通用引物Uni-P1(25uM)。進(jìn)行第二步擴(kuò)增。第二步擴(kuò)增程序如下:e)95℃10分鐘;f)10個(gè)循環(huán)程序如下:95℃30秒62℃30秒72℃1分鐘g)72℃7分鐘h)4℃保存。使用60μlAmpureXPbeads進(jìn)行純化,15μl洗脫緩沖液洗脫。13.均一化處理配置如下表7預(yù)處理反應(yīng)體系:表74X雜交緩沖液5ul第二步單向引導(dǎo)延伸及擴(kuò)增產(chǎn)物15ul總體積20ulPCR儀上98℃2min;68℃5小時(shí)。配制如下表8的2XDSNMasterbuffer:表810XDSNMasterbuffer5ulddH2O20ul總體積25ul每個(gè)反應(yīng)取22ul2XDSNMasterbuffer,PCR儀上68℃預(yù)熱2小時(shí)。將22ul2XDSNMasterbuffer迅速加入到20ul預(yù)處理反應(yīng)體系中,68℃10分鐘。加入2ulDSN酶后68℃25分鐘。加入44ul2XDSNstopsolution,輕輕吹打混勻,置冰上。使用140.8μlAmpureXPbeads進(jìn)行純化,20μl洗脫緩沖液洗脫。14.終文庫(kù)擴(kuò)增配置如下表9反應(yīng)體系:表9均一化處理溶液20μlHIFIReadyMix(KAPABIOSYSTEMS)25μlUni-P1/Uni-P2(各5uM)5μl總體積50μlPCR程序如下:a)98℃45秒;b)10循環(huán)程序如下:98℃15秒60℃30秒72℃30秒c)72℃1分鐘d)4℃保存。取其中5μl純化產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果如圖4所示。使用60μlAmpureXPbeads進(jìn)行純化,30μl洗脫緩沖液洗脫。15.樣本B進(jìn)行對(duì)照實(shí)驗(yàn)文庫(kù)構(gòu)建第一步PCR擴(kuò)增:配制如下表10反應(yīng)體系:表10基因組DNAB200ngAmplitaqGold360MasterMix25μl第一步PCR擴(kuò)增引物組(各25uM)1μlGC-增強(qiáng)劑1μl總體積50μl第一步擴(kuò)增程序如下:a)95℃10分鐘;b)5個(gè)循環(huán)程序如下:95℃30秒62℃30秒72℃1分鐘c)72℃7分鐘d)4℃保存。使用60μlAmpureXPbeads進(jìn)行純化,22μl洗脫緩沖液洗脫。第二步PCR擴(kuò)增:配制如下表11反應(yīng)體系:表11第二步擴(kuò)增程序如下:a)95℃10分鐘;b)5個(gè)循環(huán)程序如下:95℃30秒62℃30秒72℃1分鐘c)72℃7分鐘d)4℃保存。取其中5μl純化產(chǎn)物進(jìn)行2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè),結(jié)果如圖4所示。使用60μlAmpureXPbeads進(jìn)行純化,22μl洗脫緩沖液洗脫。最終文庫(kù)經(jīng)過熒光定量PCR質(zhì)控后,利用Illumina公司NextSeq500進(jìn)行75bp雙端測(cè)序。16.將高通量測(cè)序下機(jī)數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)控過濾后,進(jìn)行BWA比對(duì),并通過單分子標(biāo)簽進(jìn)一步分析各個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的測(cè)序深度,結(jié)果見下表12:表12本實(shí)施例文庫(kù)A與對(duì)照文庫(kù)B各位點(diǎn)與深度比較結(jié)果如圖5所示。對(duì)比圖較明顯看出,本實(shí)施例的實(shí)驗(yàn)方法文庫(kù)A中各個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的測(cè)序深度較為均一。對(duì)照文庫(kù)各個(gè)檢測(cè)位點(diǎn)的測(cè)序深度嚴(yán)重不均一。以上內(nèi)容是結(jié)合具體的實(shí)施方式對(duì)本發(fā)明所作的進(jìn)一步詳細(xì)說(shuō)明,不能認(rèn)定本發(fā)明的具體實(shí)施只局限于這些說(shuō)明。對(duì)于本發(fā)明所屬
      技術(shù)領(lǐng)域
      的普通技術(shù)人員來(lái)說(shuō),在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下,還可以做出若干簡(jiǎn)單推演或替換,都應(yīng)當(dāng)視為屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。SEQUENCELISTING<110>人和未來(lái)生物科技(長(zhǎng)沙)有限公司<120>一種減少擴(kuò)增偏倚的基因突變檢測(cè)方法和試劑<130>16I23776<160>40<170>PatentInversion3.3<210>1<211>73<212>DNA<213>接頭序列<220><221>misc_feature<222>(25)..(32)<223>nisa,c,g,ort<400>1caagcagaagacggcatacgagatnnnnnnnnggaattagtgactggagttcagacgtgt60gctcttccgatct73<210>2<211>73<212>DNA<213>接頭序列<220><221>misc_feature<222>(25)..(32)<223>nisa,c,g,ort<400>2caagcagaagacggcatacgagatnnnnnnnnatccggcgtgactggagttcagacgtgt60gctcttccgatct73<210>3<211>73<212>DNA<213>接頭序列<220><221>misc_feature<222>(25)..(32)<223>nisa,c,g,ort<400>3caagcagaagacggcatacgagatnnnnnnnncaggccggtgactggagttcagacgtgt60gctcttccgatct73<210>4<211>12<212>DNA<213>接頭序列<400>4gatcggaagagc12<210>5<211>29<212>DNA<213>引物序列<400>5tttaataaaaattgaacttccctccctcc29<210>6<211>58<212>DNA<213>引物序列<400>6tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagacttccctccctccctgccccctta58<210>7<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>7actggtggagtatttgatagtgtattaacc30<210>8<211>64<212>DNA<213>引物序列<400>8tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagttgatagtgtattaaccttatgtgtga60catg64<210>9<211>30<212>DNA<213>引物序列<400>9tgacaaagaaagctatataagatattattt30<210>10<211>64<212>DNA<213>引物序列<400>10tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagttacagagtaacagactagctagagac60aatg64<210>11<211>25<212>DNA<213>引物序列<400>11cagatcactgggcagcatgtggcac25<210>12<211>61<212>DNA<213>引物序列<400>12tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagcatgtggcaccatctcacaattgccag60t61<210>13<211>29<212>DNA<213>引物序列<400>13tcaagatcgcattcatgcgtcttcacctg29<210>14<211>59<212>DNA<213>引物序列<400>14tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacaggtcttcacctggaaggggtccatgtg59<210>15<211>23<212>DNA<213>引物序列<400>15cctgctgggcatctgcctcacct23<210>16<211>57<212>DNA<213>引物序列<400>16tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacagatctgcctcacctccaccgtgcag57<210>17<211>29<212>DNA<213>引物序列<400>17ctgtttcagggcatgaactacttggagga29<210>18<211>60<212>DNA<213>引物序列<400>18tcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagacaggaactacttggaggaccgtcgcttggt60<210>19<211>13<212>DNA<213>引物序列<400>19gctcttccgatct13<210>20<211>21<212>DNA<213>引物序列<400>20caagcagaagacggcatacga21<210>21<211>21<212>DNA<213>引物序列<400>21caagcagaagacggcatacga21<210>22<211>62<212>DNA<213>引物序列<400>22aatgatacggcgaccaccgagatctacactcgtcggcagcgtcagatgtgtataagagac60ag62<210>23<211>58<212>DNA<213>引物序列<400>23acactctttccctacacgacgctcttccgatctacttccctccctccctgccccctta58<210>24<211>62<212>DNA<213>引物序列<400>24gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctgcctgtcctcatgtattggtctctca60tg62<210>25<211>64<212>DNA<213>引物序列<400>25acactctttccctacacgacgctcttccgatctttgatagtgtattaaccttatgtgtga60catg64<210>26<211>63<212>DNA<213>引物序列<400>26gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctttagctgtatcgtcaaggcactcttg60cct63<210>27<211>64<212>DNA<213>引物序列<400>27acactctttccctacacgacgctcttccgatctttacagagtaacagactagctagagac60aatg64<210>28<211>64<212>DNA<213>引物序列<400>28gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctacctgtgactccatagaaaatctttc60tcct64<210>29<211>61<212>DNA<213>引物序列<400>29acactctttccctacacgacgctcttccgatctcatgtggcaccatctcacaattgccag60t61<210>30<211>61<212>DNA<213>引物序列<400>30gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctctcacatcgaggatttccttgttggc60t61<210>31<211>59<212>DNA<213>引物序列<400>31acactctttccctacacgacgctcttccgatctgtcttcacctggaaggggtccatgtg59<210>32<211>57<212>DNA<213>引物序列<400>32gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctaggtgaggcagatgcccagcagg57<210>33<211>57<212>DNA<213>引物序列<400>33acactctttccctacacgacgctcttccgatctatctgcctcacctccaccgtgcag57<210>34<211>58<212>DNA<213>引物序列<400>34gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctcaggaggcagccgaagggcatgag58<210>35<211>60<212>DNA<213>引物序列<400>35acactctttccctacacgacgctcttccgatctgaactacttggaggaccgtcgcttggt60<210>36<211>61<212>DNA<213>引物序列<400>36gtgactggagttcagacgtgtgctcttccgatctctgcatggtattctttctcttccgca60c61<210>37<211>40<212>DNA<213>引物序列<400>37aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctac40<210>38<211>45<212>DNA<213>引物序列<400>38caagcagaagacggcatacgagataattctgtgactggagttcag45<210>39<211>46<212>DNA<213>引物序列<400>39caagcagaagacggcatacgagatagaggatgtgactggagttcag46<210>40<211>46<212>DNA<213>引物序列<400>40caagcagaagacggcatacgagatgagattcgtgactggagttcag46當(dāng)前第1頁(yè)1 2 3 
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