本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領(lǐng)域，具體涉及一種利用微生物生產(chǎn)纖維素酶的方法及液體發(fā)酵培養(yǎng)基，尤其涉及一種利用嗜熱一氧化碳鏈霉菌生產(chǎn)纖維素酶的方法及液體發(fā)酵培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：資源和環(huán)境問題是人類在21世紀(jì)面臨的最嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)。生物資源是可再生性資源，地球上每年光合作用的產(chǎn)物高達(dá)1.5×1011～2.0×1011噸，是人類社會賴以生存的基本物質(zhì)來源，其中90％以上為木質(zhì)纖維素類物質(zhì)。目前，除少數(shù)用于造紙、建筑、紡織等行業(yè)外，這部分資源尚未得到充分的開發(fā)和利用?，F(xiàn)在纖維素酶應(yīng)用已擴(kuò)展到醫(yī)藥、紡織、日用化工、造紙、食品發(fā)酵、工業(yè)洗滌、煙草、石油開采、廢水處理及飼料等各個領(lǐng)域，其應(yīng)用前景十分廣闊。專家預(yù)測，針對扮演綠色化學(xué)品的纖維素酶的研究、開發(fā)和利用是新世紀(jì)研發(fā)可再生性資源的關(guān)鍵，對于解決工農(nóng)業(yè)原料來源、能源危機(jī)、環(huán)境污染等問題都具有十分重要的意義。自然界中能夠分泌纖維素酶的微生物包括細(xì)菌、真菌、放線菌和一些原生動物等。經(jīng)初步統(tǒng)計，已發(fā)現(xiàn)具有降解纖維素能力的微生物有近200種。目前，研究最多的真菌是木霉屬，如里氏木霉、綠色木霉等是比較著名的菌種。對于分解纖維素酶的放線菌，熱單孢菌屬鏈霉屬研究較多。由于霉菌的致病菌較多，其孢子易傳播、感染，因此也限制了其使用和開發(fā)。細(xì)菌產(chǎn)生纖維素酶的量較少，主要是內(nèi)切酶，其大多數(shù)對結(jié)晶纖維素沒有活性，多數(shù)不能分泌到細(xì)菌細(xì)胞外。因此，工業(yè)上很少采用細(xì)菌作為菌的生產(chǎn)菌種。而研究發(fā)現(xiàn)，放線菌產(chǎn)生的纖維素酶活力較高，且放線菌是抗菌素的主要生產(chǎn)菌。在果實和蔬菜加工過程中，為了使植物組織軟化膨潤，一般用加熱蒸煮、酸堿處理等，這樣會損失果蔬的香味和維生素，然而用纖維素酶進(jìn)行果蔬處理可避免上述缺點，同時可使植物組織軟化膨松，能提高可消化性和口感。在飲料業(yè)的應(yīng)用中，例如茶葉、速溶茶飲料加工過程中，采用沸水浸泡和酶法結(jié)合既可縮短抽提時間，又可提高水溶性較差的茶單寧、咖啡因等的抽提率，并能保持茶葉原有的色、香、味。在釀酒過程中，加入纖維素酶能使原料中含有一定纖維素的谷類、薯類、鼓皮、農(nóng)副產(chǎn)品、野生植物及填充料等得到充分利用，增加可發(fā)酵性糖，提高出酒率，縮短發(fā)酵時間，而且酒的口感醇香，雜醇油含量低。以大豆為原料釀造醬油過程中，添加纖維素酶可使細(xì)胞中的蛋白質(zhì)和碳水化合物釋放，這樣既可提高醬油濃度，改善醬油質(zhì)量，又可縮短生產(chǎn)周期，提高產(chǎn)率。纖維素類原料經(jīng)纖維素酶水解后，用微生物發(fā)酵生產(chǎn)單細(xì)胞蛋白或直接利用纖維分解菌。應(yīng)用纖維素或微生物發(fā)酵把植物纖維，如木材、農(nóng)作物秸稈和城市廢料中的纖維素轉(zhuǎn)化成葡萄糖、酒精和有機(jī)酸等產(chǎn)品，這對于開辟工業(yè)原料來源提供新能源和變廢為寶有十分重要意義。隨著世界人口的增加和各國工業(yè)化程度的提高，能源消耗也在穩(wěn)步增加。乙醇是一種可以通過糖發(fā)酵獲得的可再生能源。在美國，乙醇已經(jīng)被廣泛地作為特殊的石油替代品。從20世紀(jì)80年代開始，用玉米生產(chǎn)的燃料乙醇就被作為酒精-汽油混合燃料或者氧化燃料來使用。這些氣體燃料中包含乙醇的體積量高達(dá)10％。使用乙醇混合燃料不但可以減少汽油的用量，還可以減少溫室氣體的排放。然而使用玉米生產(chǎn)的乙醇燃料比石化燃料成本高，因為玉米既要提供食品和飼料、又要用于大量地生產(chǎn)乙醇，這是不可行的，畢竟土地資源是有限的。廢棄木質(zhì)纖維原料比如農(nóng)林廢棄物、草、鋸末和木片等是潛在的生產(chǎn)乙醇的可再生性資源。因此，利用纖維素酶有效地將這些纖維素物質(zhì)轉(zhuǎn)化成葡萄糖等簡單糖，然后通過微生物發(fā)酵的方法將葡萄糖轉(zhuǎn)化成乙醇，將具有重要的意義，這也是當(dāng)今的一個研究熱點之一。近年來，國內(nèi)外真菌纖維素酶的應(yīng)用成為提高畜禽生產(chǎn)和飼料利用的重要措施，提高畜禽飼料的消化率與利用率，進(jìn)而節(jié)省精飼料的用量，提高經(jīng)濟(jì)效益，在畜牧業(yè)生產(chǎn)上有著廣闊的應(yīng)用前景。目前，在紡織業(yè)中生物酶的應(yīng)用范圍較廣，已在纖維改性、真絲脫膠、染整的退漿、精練、整理加工等方面有所應(yīng)用，生物酶具有可降解性，可以對織物進(jìn)行可控的整理。采用纖維素酶進(jìn)行仿舊整理是纖維素酶應(yīng)用最成功的領(lǐng)域，它通過對織物纖維表面的剝蝕作用，染料被剝離，產(chǎn)生水洗石磨的外觀，同時，解決了浮石水洗整理中存在的問題，加工質(zhì)量好，生產(chǎn)效率高。纖維素酶在織物整理中的另一應(yīng)用就是生物拋光，屬于表面改性范圍。纖維素酶拋光整理是去除織物表面的絨毛，達(dá)到表面光潔、柔軟、膨松等獨特性能，懸垂性好，吸水性也得到了改善。同時也解決了麻織物的刺癢感問題，使產(chǎn)品檔次大為提高。我國纖維素酶的研究開始于20世紀(jì)60年代初，幾十年來，各大城市的大專院校及科研院所進(jìn)行了纖維素酶的研究工作，選育出一批降解纖維素的菌種。我國是繼美國、日本和丹麥之后第四個能生產(chǎn)纖維素酶的國家。但迄今為止，我國真正形成生產(chǎn)規(guī)模的酶制劑只有α-淀粉酶、糖化酶等產(chǎn)品，大規(guī)模生產(chǎn)纖維素酶的技術(shù)仍處于探索之中。目前，國外的許多研究者主要致力于產(chǎn)纖維素酶的真菌及細(xì)菌的研究。有關(guān)放線菌纖維素酶的研究還較少，研究尚處于起步階段。因此，需要提供一種穩(wěn)定、高活力纖維素酶的高產(chǎn)方法，其能實現(xiàn)纖維素酶穩(wěn)定高產(chǎn)，提取容易、操作簡便快速、成本低、無污染、社會和經(jīng)濟(jì)綜合效益高。技術(shù)實現(xiàn)要素：為了克服上述現(xiàn)有技術(shù)中的缺點，本發(fā)明提供了一種嗜熱一氧化碳鏈霉菌生產(chǎn)纖維素酶的方法及液體發(fā)酵培養(yǎng)基，采用該工藝和培養(yǎng)基，能實現(xiàn)纖維素酶的高表達(dá)量和高穩(wěn)定性，并提高纖維素質(zhì)原料的處理效率，達(dá)到保護(hù)環(huán)境和生產(chǎn)生物資源的雙重效果，操作簡便快速、成本低、無污染、社會和經(jīng)濟(jì)綜合效益高，適于大規(guī)模推廣應(yīng)用。為達(dá)此目的，本發(fā)明采用了以下技術(shù)方案：第一方面，本發(fā)明提供了一種嗜熱一氧化碳鏈霉菌生產(chǎn)纖維素酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：蔗糖或葡萄糖10-40g/L、酵母膏或尿素10-40g/L、K2HPO40.45-0.65g/L、KH2PO40.15-0.35g/L、MgSO40.25-0.45g/L、CaCO30.1-0.2g/L、CMC-Na1-5g/L、NaCl0.1-0.2g/L和FeSO40.1-0.2g/L。本發(fā)明中采用蔗糖或葡萄糖作為碳源，相比采用可溶性淀粉、麥芽糖、檸檬酸、馬鈴薯淀粉和甘油等碳源，其能夠增加纖維素酶的產(chǎn)率。本發(fā)明中采用酵母膏或尿素作為氮源，相比采用玉米漿、花生粉、黃豆粉、蛋白胨、牛肉膏、硫酸銨、氯化銨和硝酸銨等氮源，其能夠提高纖維素酶的濃度，使其達(dá)到0.75-0.86IU/mL。根據(jù)本發(fā)明，所述蔗糖或葡萄糖的濃度為10-40g/L，例如可以是10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L或40g/L；所述酵母膏或尿素的濃度為10-40g/L，例如可以是10g/L、15g/L、20g/L、25g/L、30g/L、35g/L或40g/L；所述K2HPO4的濃度為0.45-0.65g/L，例如可以是0.45g/L、0.48g/L、0.50g/L、0.52g/L、0.55g/L、0.60g/L或0.65g/L；所述KH2PO4的濃度為0.15-0.35g/L，例如可以是0.15g/L、0.18g/L、0.20g/L、0.22g/L、0.25g/L、0.30g/L或0.35g/L；所述MgSO4的濃度為0.25-0.45g/L，例如可以是0.25g/L、0.28g/L、0.30g/L、0.32g/L、0.35g/L、0.40g/L或0.45g/L；所述CaCO3的濃度為0.1-0.2g/L，例如可以是0.1g/L、0.12g/L、0.15g/L、0.16g/L、0.17g/L、0.18g/L或0.2g/L。根據(jù)本發(fā)明，所述羥甲基纖維素鈉(CMC-Na)的濃度為1-5g/L，例如可以是1g/L、1.5g/L、2g/L、2.5g/L、3g/L、3.5g/L或5g/L；所述NaCl的濃度為0.1-0.2g/L，例如可以是0.1g/L、0.12g/L、0.15g/L、0.16g/L、0.17g/L、0.18g/L或0.2g/L；所述FeSO4的濃度為0.1-0.2g/L，例如可以是0.1g/L、0.12g/L、0.15g/L、0.16g/L、0.17g/L、0.18g/L或0.2g/L。本發(fā)明所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為：蔗糖或葡萄糖15-30g/L、酵母膏或尿素20-30g/L、K2HPO40.5-0.6g/L、KH2PO40.2-0.3g/L、MgSO40.25-0.4g/L、CaCO30.1-0.2g/L、CMC-Na2-5g/L、NaCl0.1-0.2g/L和FeSO40.1-0.2g/L。本發(fā)明中進(jìn)一步優(yōu)選的液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成為：蔗糖15g/L、酵母膏25g/L、K2HPO40.53g/L、KH2PO40.23g/L、MgSO40.283g/L、CaCO30.1g/L、CMC-Na5g/L、NaCl0.1g/L和FeSO40.2g/L。本發(fā)明通過對現(xiàn)有的液體發(fā)酵培養(yǎng)基中各組分進(jìn)行選擇，得出：采用蔗糖或葡萄糖作為碳源、酵母膏或尿素作為氮源，并將K2HPO4和KH2PO4以及MgSO4的含量控制在K2HPO40.5-0.6g/L、KH2PO40.2-0.3g/L和MgSO40.25-0.4g/L時，可以進(jìn)一步實現(xiàn)纖維素酶的高表達(dá)量和高穩(wěn)定性，并提高纖維素質(zhì)原料的處理效率，使纖維素酶的濃度達(dá)到0.75-0.86IU/mL；當(dāng)采用上述進(jìn)一步優(yōu)選的液體發(fā)酵培養(yǎng)基組成時，纖維素酶的濃度可達(dá)到最大值0.86IU/mL。第二方面，本發(fā)明提供了一種利用嗜熱一氧化碳鏈霉菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，包括以下步驟：(1)接種發(fā)酵培養(yǎng)：將嗜熱一氧化碳鏈霉菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，在28-35℃條件下培養(yǎng)48-72h；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：蔗糖或葡萄糖10-40g/L、酵母膏或尿素10-40g/L、K2HPO40.45-0.65g/L、KH2PO40.15-0.35g/L、MgSO40.25-0.45g/L、CaCO30.1-0.2g/L、CMC-Na1-5g/L、NaCl0.1-0.2g/L和FeSO40.1-0.2g/L；(2)酶液制備：將發(fā)酵培養(yǎng)液經(jīng)離心，取其上清液，即得粗酶液。本發(fā)明通過采用上述特定組成的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，能使反應(yīng)器內(nèi)的菌濃度高達(dá)3.0×1011cfu/mL，且所述光反應(yīng)器內(nèi)的纖維素酶濃度為0.75-0.86IU/mL。在第二方面提及的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成同如前所述的第一方面的液體發(fā)酵培養(yǎng)基，在此不做贅述。在步驟(1)中所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成優(yōu)選為：蔗糖或葡萄糖15-30g/L、酵母膏或尿素20-30g/L、K2HPO40.5-0.6g/L、KH2PO40.2-0.3g/L、MgSO40.25-0.4g/L、CaCO30.1-0.2g/L、CMC-Na2-5g/L、NaCl0.1-0.2g/L和FeSO40.1-0.2g/L；進(jìn)一步優(yōu)選為：蔗糖15g/L、酵母膏25g/L、K2HPO40.53g/L、KH2PO40.23g/L、MgSO40.283g/L、CaCO30.1g/L、CMC-Na5g/L、NaCl0.1g/L和FeSO40.2g/L。根據(jù)本發(fā)明，所述嗜熱一氧化碳鏈霉菌(Streptomycesthermocarbonxydus)可采用嗜熱一氧化碳鏈霉菌(Streptomycesthermocarbonxydus)Str430，其已于2010年01月26日保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號為CCTCCM2010026，也可采用其它種類的嗜熱一氧化碳鏈霉菌，在此不做特殊限定，只是將嗜熱一氧化碳鏈霉菌(Streptomycesthermocarbonxydus)Str430作為優(yōu)選。本發(fā)明所述嗜熱一氧化碳鏈霉菌菌株Str430產(chǎn)纖維素酶，該酶具有活力高、穩(wěn)定性好的特性，其在55-75℃范圍內(nèi)保存1h，酶活可保留60％-100％，其酶解溫度為60-70℃，酶解的pH值為4.0-5.0；酶解的動力學(xué)常數(shù)Km達(dá)到0.40mg/mL；最大反應(yīng)速度Vmax為0.33mg/mL，比傳統(tǒng)的纖維素酶具有更高的優(yōu)勢。本發(fā)明所述嗜熱一氧化碳鏈霉菌菌株Str430產(chǎn)纖維素酶是CN102061270A中公開的嗜熱一氧化碳鏈霉菌菌株。根據(jù)本發(fā)明，步驟(2)所述離心的轉(zhuǎn)速為3500-4000r/min，例如可以是3500r/min、3600r/min、3700r/min、3800r/min、3900r/min或4000r/min，優(yōu)選為4000r/min。示例性地，本發(fā)明所述利用嗜熱一氧化碳鏈霉菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，包括以下步驟：(1)接種發(fā)酵培養(yǎng)：將保藏編號為CCTCCM2010026的嗜熱一氧化碳鏈霉菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5％-15％(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速為70-120rpm，通氣量為0.01-0.2VVm，在28-35℃、pH為6.5-8.5的條件下培養(yǎng)48-72h；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：蔗糖或葡萄糖10-40g/L、酵母膏或尿素10-40g/L、K2HPO40.45-0.65g/L、KH2PO40.15-0.35g/L、MgSO40.25-0.45g/L、CaCO30.1-0.2g/L、CMC-Na1-5g/L、NaCl0.1-0.2g/L和FeSO40.1-0.2g/L；(2)酶液制備：將發(fā)酵培養(yǎng)液在3500-4000r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心，取其上清液，即得粗酶液。根據(jù)本發(fā)明，采用步驟(1)的方法培養(yǎng)48-72h后所述反應(yīng)器內(nèi)菌濃度高達(dá)1.0×1011cfu/mL-3.0×1011cfu/mL，并使得步驟(2)得到的粗酶液中的纖維素酶濃度達(dá)到0.75-0.86IU/mL。根據(jù)本發(fā)明，所述發(fā)酵用到的反應(yīng)器為機(jī)械通氣式攪拌發(fā)酵培養(yǎng)系統(tǒng)，但并非僅限于此。第三方面，本發(fā)明還提供了一種根據(jù)第二方面所述方法制備得到的纖維素酶。根據(jù)本發(fā)明，所述纖維素酶的酶解溫度為60-70℃，優(yōu)選為60℃。根據(jù)本發(fā)明，所述纖維素酶的酶解pH值為4.0-5.0。根據(jù)本發(fā)明，所述纖維素酶的動力學(xué)常數(shù)Km＝0.40mg/mL；最大反應(yīng)速度Vmax＝0.33mg/mL。第四方面，本發(fā)明還提供了根據(jù)第三方面所述的纖維素酶在飼料、食品、紙漿或能源工業(yè)中的應(yīng)用。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明至少具有以下有益效果：(1)本發(fā)明采用液體深層發(fā)酵方法，通過對培養(yǎng)基進(jìn)行改進(jìn)，反應(yīng)器內(nèi)菌濃度可高達(dá)1.0×1011cfu/mL-3.0×1011cfu/mL，且所述光反應(yīng)器內(nèi)的纖維素酶濃度為0.75-0.86IU/mL；(2)本發(fā)明利用嗜熱一氧化碳鏈霉菌菌株Str430產(chǎn)纖維素酶，其制得的纖維素酶具有活力高、穩(wěn)定性好的特性；(3)本發(fā)明提供的嗜熱一氧化碳鏈霉菌菌株Str430產(chǎn)纖維素酶的分離提取操作簡單易行，設(shè)備維護(hù)保養(yǎng)方便，規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)過程的設(shè)備投資較少。附圖說明圖1示出了碳源對纖維素酶產(chǎn)量的影響；圖2示出了氮源對纖維素酶產(chǎn)量的影響；圖3示出了KH2PO4和K2HPO4交互影響纖維素酶的產(chǎn)量的響應(yīng)面等高線圖；圖4示出了KH2PO4和MgSO4交互影響纖維素酶的產(chǎn)量的響應(yīng)面等高線圖；圖5示出了K2HPO4和MgSO4交互影響纖維素酶的產(chǎn)量的響應(yīng)面等高線圖；圖6示出了溫度對Cx酶活和濾紙酶活的影響；圖7示出了溫度對Cx酶和濾紙酶活穩(wěn)定性的影響；圖8示出了pH值對Cx酶和濾紙酶活的影響；圖9示出了金屬離子對Cx酶和濾紙酶活的影響；圖10示出了利用雙倒數(shù)作圖法測定Km值。下面對本發(fā)明進(jìn)一步詳細(xì)說明。但下述的實例僅僅是本發(fā)明的簡易例子，并不代表或限制本發(fā)明的權(quán)利保護(hù)范圍，本發(fā)明的保護(hù)范圍以權(quán)利要求書為準(zhǔn)。具體實施方式下面結(jié)合附圖并通過具體實施方式來進(jìn)一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。為更好地說明本發(fā)明，便于理解本發(fā)明的技術(shù)方案，本發(fā)明的典型但非限制性的實施例如下：本發(fā)明中的嗜熱一氧化碳鏈霉菌生產(chǎn)纖維素酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基是通過如下實驗獲得的優(yōu)化方案：基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：淀粉10g、玉米粉10g、葡萄糖5g、酵母膏10g、(NH4)2SO45g、KH2PO45g、K2HPO45g、CaCO31g、MgSO40.5g、CMC-Na5g、蒸餾水1000mL，pH為7.5。在不含碳源的基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基中加入15g/L的不同碳源，包括可溶性淀粉、麥芽糖、蔗糖、葡萄糖、檸檬酸、馬鈴薯淀粉、甘油和乳糖，保持其他成分不變，在相同接種量(10％(v/v))和相同培養(yǎng)條件下(28℃、48h、100rpm)搖瓶發(fā)酵，測定纖維素酶活，結(jié)果見圖1。由圖1可知，蔗糖和葡萄糖作為碳源時，其產(chǎn)纖維素酶效果最佳，分別為0.62IU/mL和0.72IU/mL。對基礎(chǔ)發(fā)酵培養(yǎng)基的碳源用蔗糖來替代，然后分別改用25g/L的玉米漿、花生粉、黃豆粉、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、硫酸銨、氯化銨、硝酸銨和尿素為氮源進(jìn)行最適氮源篩選，保持其他成分不變，在相同接種量(10％(v/v))和相同培養(yǎng)條件下(28℃、48h、100rpm)搖瓶發(fā)酵，測定纖維素酶活，結(jié)果見圖2。由圖2可知，酵母膏和尿素作為氮源時，其產(chǎn)纖維素酶效果最佳，分別為0.75IU/mL和0.5IU/mL。依據(jù)已確定的碳源和氮源，選出N＝11的Plackett-Burman實驗設(shè)計(見表1)，其中有兩項為誤差項，對可能影響產(chǎn)酶的9個因子(KH2PO4、K2HPO4、MgSO4、蔗糖、CaCO3、酵母膏、CMC-Na、NaCl、FeSO4)進(jìn)行考察，結(jié)果見表2。由表2可知，響應(yīng)面擬合方程只有在考察的緊接鄰域里才充分近似真實結(jié)果，要建立有效的響應(yīng)面擬合方程只有先逼近最大產(chǎn)酶區(qū)域，因此進(jìn)行最陡爬坡試驗。將PB試驗篩選出的對產(chǎn)酶影響顯著的因素作為考察對象，根據(jù)顯著因素的正負(fù)效應(yīng)確定最陡爬坡試驗的變化方向和變化步長，快速的逼近最大響應(yīng)區(qū)域。最陡爬坡實驗設(shè)計及結(jié)果如表3所示。由表3結(jié)果可知，最大產(chǎn)酶區(qū)在第4次附近，即故以實驗4的條件為響應(yīng)面實驗因素水平的中心點。表1表2表3實驗序號1234567K2HPO4(g/L)0.400.450.500.550.600.650.70KH2PO4(g/L)0.400.350.300.250.200.150.10MgSO4(g/L)0.200.250.300.350.400.450.50酶活(IU/mL)0.180.280.290.350.240.260.12Box-behnken設(shè)計適用于2-5個因素的優(yōu)化實驗，根據(jù)PB試驗設(shè)計和最陡爬坡試驗的實驗結(jié)果，進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(表4和表5)：以PB實驗篩選得到的對產(chǎn)酶影響顯著的因素作為設(shè)計因素，以最陡爬坡試驗得出的濃度作為中心點，每個因素取3個水平，以(-1，0，+1)編碼，結(jié)果見表5、圖3、圖4及圖5。由表5、圖3、圖4及圖5可知，K2HPO4的濃度為0.53g/L，KH2PO4的濃度為0.23g/L，MgSO4的濃度為0.283g/L，在該條件下進(jìn)行驗證試驗得到實際發(fā)酵酶活為0.81IU/mL。表4編碼因素水平-101AK2HPO4(g/L)0.50.550.6BKH2PO4(g/L)0.20.250.3CMgSO4(g/L)0.30.350.4表5實驗序K2HPO4KH2PO4MgSO4酶活(IU/mL)11-100.662-10-10.6430-110.3540000.6550-1-10.256-1010.567-1010.6801-10.35910-10.5910-1100.45110000.6120000.63131010.55140110.6150000.77160000.75171100.3通過上述實驗可以得出，本發(fā)明用于嗜熱一氧化碳鏈霉菌生產(chǎn)纖維素酶的液體發(fā)酵培養(yǎng)基的最優(yōu)配比為：蔗糖15g/L、酵母膏25g/L、K2HPO40.53g/L、KH2PO40.23g/L、MgSO40.283g/L、CaCO30.1g/L、CMC-Na5g/L、NaCl0.1g/L和FeSO40.2g/L。實施例1利用嗜熱一氧化碳鏈霉菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，包括以下步驟：(1)接種發(fā)酵培養(yǎng)：將保藏編號為CCTCCM2010026的嗜熱一氧化碳鏈霉菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10％(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速為100rpm，通氣量為0.2VVm，在28℃、pH為6.5的條件下培養(yǎng)48h；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：葡萄糖15g/L、尿素25g/L、K2HPO40.53g/L、KH2PO40.23g/L、MgSO40.283g/L、CaCO30.1g/L、CMC-Na5g/L、NaCl0.1g/L和FeSO40.2g/L；(2)酶液制備：將發(fā)酵培養(yǎng)液在4000r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心，取其上清液，即得粗酶液。經(jīng)測定，發(fā)酵培養(yǎng)的反應(yīng)器內(nèi)菌濃度高達(dá)3.0×1011cfu/mL，且反應(yīng)器內(nèi)的纖維素酶濃度達(dá)到0.75IU/mL。實施例2利用嗜熱一氧化碳鏈霉菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，包括以下步驟：(1)接種發(fā)酵培養(yǎng)：將保藏編號為CCTCCM2010026的嗜熱一氧化碳鏈霉菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為5％(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速為70rpm，通氣量為0.2VVm，在30℃、pH為7的條件下培養(yǎng)72h；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：蔗糖15g/L、尿素25g/L、K2HPO40.53g/L、KH2PO40.23g/L、MgSO40.283g/L、CaCO30.1g/L、CMC-Na5g/L、NaCl0.1g/L和FeSO40.2g/L；(2)酶液制備：將發(fā)酵培養(yǎng)液在3800r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心，取其上清液，即得粗酶液。經(jīng)測定，發(fā)酵培養(yǎng)的反應(yīng)器內(nèi)菌濃度高達(dá)2.95×1011cfu/mL，且反應(yīng)器內(nèi)的纖維素酶濃度達(dá)到0.76IU/mL。實施例3利用嗜熱一氧化碳鏈霉菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，包括以下步驟：(1)接種發(fā)酵培養(yǎng)：將保藏編號為CCTCCM2010026的嗜熱一氧化碳鏈霉菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為15％(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速為120rpm，通氣量為0.1VVm，在35℃、pH為8的條件下培養(yǎng)60h；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：蔗糖10g/L、酵母膏30g/L、K2HPO40.45g/L、KH2PO40.35g/L、MgSO40.31g/L、CaCO30.15g/L、CMC-Na2g/L、NaCl0.15g/L和FeSO40.1g/L；(2)酶液制備：將發(fā)酵培養(yǎng)液在3900r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心，取其上清液，即得粗酶液。經(jīng)測定，發(fā)酵培養(yǎng)的反應(yīng)器內(nèi)菌濃度高達(dá)2.90×1011cfu/mL，且反應(yīng)器內(nèi)的纖維素酶濃度達(dá)到0.81IU/mL。實施例4利用嗜熱一氧化碳鏈霉菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，包括以下步驟：(1)接種發(fā)酵培養(yǎng)：將保藏編號為CCTCCM2010026的嗜熱一氧化碳鏈霉菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為10％(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速為100rpm，通氣量為0.2VVm，在28℃、pH為6.5的條件下培養(yǎng)50h；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：蔗糖15g/L、酵母膏25g/L、K2HPO40.53g/L、KH2PO40.23g/L、MgSO40.283g/L、CaCO30.1g/L、CMC-Na5g/L、NaCl0.1g/L和FeSO40.2g/L；(2)酶液制備：將發(fā)酵培養(yǎng)液在4000r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心，取其上清液，即得粗酶液。經(jīng)測定，發(fā)酵培養(yǎng)的反應(yīng)器內(nèi)菌濃度高達(dá)3.0×1011cfu/mL，且反應(yīng)器內(nèi)的纖維素酶濃度達(dá)到0.83IU/mL。實施例5利用嗜熱一氧化碳鏈霉菌生產(chǎn)纖維素酶的方法，包括以下步驟：(1)接種發(fā)酵培養(yǎng)：將保藏編號為CCTCCM2010026的嗜熱一氧化碳鏈霉菌接種于液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量為8％(v/v)，攪拌轉(zhuǎn)速為100rpm，通氣量為0.2VVm，在35℃、pH為7的條件下培養(yǎng)70h；所述液體發(fā)酵培養(yǎng)基的組成為：蔗糖40g/L、酵母膏10g/L、K2HPO40.65g/L、KH2PO40.15g/L、MgSO40.25g/L、CaCO30.1g/L、CMC-Na5g/L、NaCl0.1g/L和FeSO40.2g/L；(2)酶液制備：將發(fā)酵培養(yǎng)液在4000r/min的轉(zhuǎn)速下進(jìn)行離心，取其上清液，即得粗酶液。經(jīng)測定，發(fā)酵培養(yǎng)的反應(yīng)器內(nèi)菌濃度高達(dá)2.90×1011cfu/mL，且反應(yīng)器內(nèi)的纖維素酶濃度達(dá)到0.80IU/mL。實施例6以下是對實施例1得到的纖維素酶進(jìn)行的測定。1、溫度對Cx酶活和濾紙酶活的影響將實施例1得到的粗酶液與底物(濾紙)的反應(yīng)混合物分別在置于30℃、40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和90℃下保溫30min，再計算在各溫度下的纖維素酶(Cx酶)和濾紙酶的酶活力，其結(jié)果如圖6所示。由圖6可以看出，Cx酶和濾紙酶的最適酶解溫度均為60℃，說明嗜熱一氧化碳鏈霉菌Str430的Cx酶和濾紙酶均為高溫酶。2、溫度對Cx酶和濾紙酶活穩(wěn)定性的影響將粗酶液分別置于30℃、40℃、50℃、60℃、65℃、70℃、75℃、80℃和90℃的水浴中保溫1h，立刻用冰水冷卻，測定處理后粗酶液的Cx酶和濾紙酶殘余活性，以酶活最高者為100％，計算在各溫度下的Cx酶和濾紙酶的殘余酶活百分比，其結(jié)果如圖7所示。由圖7可以看出，Cx酶在低于70℃時穩(wěn)定性很好，70℃保溫lh仍然保留81％的活性，高于80℃時酶的活性急劇下降，80℃保溫lh只保留24％的活性；濾紙酶有更好的熱穩(wěn)定性，低于70℃時穩(wěn)定性很好，高于70℃后酶的活性緩慢下降，80℃保溫lh后仍然保持48％。3、pH值對Cx酶和濾紙酶活的影響將粗酶液pH調(diào)至3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0、11.0，在最佳條件下分別測定各pH值下Cx酶和濾紙酶的酶活力，其結(jié)果如圖8所示。由圖8可以看出，Cx酶和濾紙酶的最適酶解pH分別為4.0和5.0，說明嗜熱一氧化碳鏈霉菌Str430的Cx酶和濾紙酶都是酸性酶。4、金屬離子對Cx酶和濾紙酶活的影響在適當(dāng)稀釋的粗酶液中，分別加入濃度為7.5mmol/L的Ca2+、Zn2+、Ba2+、Fe2+、Mg2+、Co2+、Cu2+金屬陽離子，以不添加任何金屬離子為對照，在最佳條件下測定Cx酶、濾紙酶的酶活力，其結(jié)果如圖9所示。由圖9可以看出，Ca2+、Cu2+、Zn2+和Mg2+對Cx酶有抑制活性，Ba2+、Fe2+、Co2+對Cx酶有較強(qiáng)的激活作用，而Zn2+對Cx酶有弱的激活作用；Mg2+和Cu2+對濾紙酶有較強(qiáng)的抑制作用，F(xiàn)e2+和Co2+濾紙酶有較強(qiáng)的激活作用，而Zn2+、Ca2+和Ba2+有較弱的激活作用。5、Cx酶的動力學(xué)性質(zhì)用CMC-Na做底物，在60℃和pH＝5的條件下測定在底物濃度[S]分別為0.1％、0.2％、0.3％、0.4％的反應(yīng)速度[V]，其反應(yīng)速度即為測得的酶活，在以1/[v]為縱坐標(biāo)，1/[S]為橫坐標(biāo)。根據(jù)雙倒數(shù)作圖法，求出Cx酶的動力學(xué)常數(shù)Km和最大反應(yīng)速度Vmax，其結(jié)果如圖10所示。由圖10可以求出Cx酶的動力學(xué)常數(shù)Km＝0.40mg/mL和最大反應(yīng)速度Vmax＝0.33mg/mL。本發(fā)明中通過嗜熱一氧化碳鏈霉菌生產(chǎn)的纖維素酶可以廣泛應(yīng)用于飼料、食品、紙漿或能源工業(yè)中，均具有良好的應(yīng)用前景。申請人聲明，本發(fā)明通過上述實施例來說明本發(fā)明的詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，但本發(fā)明并不局限于上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征，即不意味著本發(fā)明必須依賴上述詳細(xì)結(jié)構(gòu)特征才能實施。所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的技術(shù)人員應(yīng)該明了，對本發(fā)明的任何改進(jìn)，對本發(fā)明所選用部件的等效替換以及輔助部件的增加、具體方式的選擇等，均落在本發(fā)明的保護(hù)范圍和公開范圍之內(nèi)。以上詳細(xì)描述了本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，但是，本發(fā)明并不限于上述實施方式中的具體細(xì)節(jié)，在本發(fā)明的技術(shù)構(gòu)思范圍內(nèi)，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行多種簡單變型，這些簡單變型均屬于本發(fā)明的保護(hù)范圍。另外需要說明的是，在上述具體實施方式中所描述的各個具體技術(shù)特征，在不矛盾的情況下，可以通過任何合適的方式進(jìn)行組合，為了避免不必要的重復(fù)，本發(fā)明對各種可能的組合方式不再另行說明。此外，本發(fā)明的各種不同的實施方式之間也可以進(jìn)行任意組合，只要其不違背本發(fā)明的思想，其同樣應(yīng)當(dāng)視為本發(fā)明所公開的內(nèi)容。當(dāng)前第1頁1 2 3