本發(fā)明涉及基因工程和代謝工程技術領域，具體涉及一種適用于谷氨酸棒桿菌的外源啟動子及其應用。

背景技術：

谷氨酸棒桿菌是一種非致病性的革蘭氏陽性菌，廣泛用于工業(yè)生產氨基酸、有機酸、高級醇等工業(yè)產品；同時，谷氨酸棒桿菌無內毒素并且胞外無水解酶活性,其能夠分泌正確折疊的有生物活性功能蛋白質，所以谷氨酸棒桿菌也是一種表達外源蛋白的極為有利的宿主。

啟動子是一段控制基因起始轉錄的重要DNA序列，位于轉錄起始位點上游。而基因的mRNA轉錄水平是最終蛋白表達水平的主要影響因素之一，有研究通過大量的分析證明在控制蛋白表達水平的序列各種區(qū)域中，啟動子區(qū)域的影響力超過45%，是最重要的序列區(qū)域。因此，一個強效的啟動子通過使攜帶基因序列的mRNA高轉錄，從而實現(xiàn)高水平蛋白表達。

對于谷氨酸棒桿菌而言，人們目前依舊局限于應用cspB，trc，tac等有限的啟動子，其中應用tac啟動子谷氨酸棒桿菌的外源蛋白表達水平較高，但仍然無法滿足人們對外源蛋白日益增長的需求。

技術實現(xiàn)要素：

針對上述問題，本發(fā)明提供了一種適用于谷氨酸棒桿菌的外源啟動子，其能解決谷氨酸棒桿菌外源蛋白表達水平低的技術問題，本發(fā)明還提供了該外源啟動子的應用。

一種適用于谷氨酸棒桿菌的外源啟動子，其核酸序列如SEQ ID NO:2所示或與其互補的核苷酸序列。

一種表達載體，其包括所述外源啟動子。

一種外源蛋白表達系統(tǒng)，其包括谷氨酸棒桿菌和所述表達載體。

上述外源啟動子、表達載體或外源蛋白表達系統(tǒng)在外源蛋白表達中的應用。

本發(fā)明的上述外源啟動子包括如SEQ ID NO:1所示的枯草芽孢桿菌的yewA啟動子、yewA基因開放閱讀框前38 bp的核酸序列以及谷氨酸棒桿菌保守SD序列（15bp），其中，yewA基因開放閱讀框前38 bp的核酸序列與谷氨酸棒桿菌保守SD序列的前13 bp的核酸序列構成17個氨基酸的前導肽序列，谷氨酸棒桿菌保守SD序列末尾的堿基TA能夠與外源蛋白基因的啟示密碼子首位的堿基A形成終止密碼子，從而前導肽和外源蛋白分別能夠單獨翻譯，形成含有兩個基因的操縱自結構，以減少第二個基因，即外源蛋白基因在翻譯過程中受到來自于mRNA發(fā)卡結構的抑制，從而提高表達水平。并且經實驗證實，該啟動子能夠有效提高外源蛋白的表達。

附圖說明

圖1為載體p10-A0的質粒圖譜

圖2為傳統(tǒng)啟動子及新式啟動子結構比較圖。

圖3為本發(fā)明啟動子、yewA啟動子以及tac啟動子構建的不同表達載體蛋白表達的SDS-PAGE分析圖。

具體實施方式

本發(fā)明中所用到的菌株：枯草芽孢桿菌168、谷氨酸棒桿菌ATCC 13032和大腸桿菌DH5α均購自中國高校微生物資源數(shù)據(jù)平臺。

限制性內切酶Hind III、BamH I、EcoR V，T4 DNA連接酶等購自Thermo公司；Bsa I二型內切酶、Q5超保真聚合酶購自NEB公司；質粒提取試劑盒、PCR產物純化試劑盒、膠回收試劑盒購自Axygen公司；基因組提取試劑盒購自天根公司；Infusion重組試劑盒購自Clontech公司；氯霉素、卡那霉素等抗生素購自上海生物工程有限公司；其余試劑均為國產或者進口分析純。高速冷凍離心機和PCR熱循環(huán)儀，美國ThermoFisher公司；Synergy H4酶標儀，美國BioTek公司；恒溫金屬浴，北京天根公司；Dark Reader，北京達科為生物公司；核酸和蛋白電泳儀，美國Bio-Rad公司。

本發(fā)明所用載體p19-A0的核酸序列如SEQ ID NO:4所示，其質粒圖譜如圖1所示，其構建方法參見：劉秀霞, 趙子豪, 孫楊, 等. 谷氨酸棒桿菌內源表達元件的篩選[J]. 微生物學通報, 2016-05-24 16:42，載體p19-A0含有egfp報告基因。

1、啟動子的克隆。

包括以下步驟：

a、枯草芽孢桿菌基因組DNA的獲取：通過基因組提取試劑盒提取枯草芽孢桿菌168的基因組DNA。

b、PCR擴增：

PCR擴增條件為：98 °C 、3 min；98 °C 、15 s，72 °C、 3.25 min，30 個循環(huán)；72 °C 、2 min。反應體系為：10×Buffer 5 μl、dNTPs 4 μl (各2.5 mmol/L)、上下游引物各1 μl (0.2 μmol/L)、Q5 DNA聚合酶0.5 μl (2 U/μl)、模板1 μl，加水至50 μl；

本發(fā)明的啟動子、yewA啟動子（以下分別簡稱為NP_yewA、P_yewA）的引物：

yewA-F： TTTTGAAGCTTCTGGTTACCACCATGTCGTATAACCC

yewA-R： CGCCCTTGCTCACCATGACATTTCCCCCTAATTGATTG；

NyewA-F：TTTTGAAGCTTCTGGTTACCACCATGTCGTATAACCC

NyewA-R： CGCCCTTGCTCACCATTAGTTGTCCTCCTTTATGAATAATGAAGATACGAATGAAG；

上述引物5’端分別引入同源臂序列“TTTTGAAGCTTCTGGT”和“CGCCCTTGCTCACCA”，使得擴增后的兩條序列與Bsa I酶切線性化后的載體p19-A0兩端序列一致，在體外同源重組酶的幫助下，能夠發(fā)生同源重組，從而使啟動子與報告基因egfp無縫連接，構建出含有啟動子得EGFP表達質粒；NP_yewA通過其下游引物NyewA-R引入yewA基因開放閱讀框前38 bp的核酸序列以及谷氨酸棒桿菌保守SD序列，即AAAGGAGGACAACTA序列。其中，NP_yewA（對應新式）與P_yewA（對應傳統(tǒng)）的結構區(qū)別如圖2所示。

2、表達載體的構建。

含有NP_yewA或P_yewA的質粒的構建，包括以下步驟：

a、通過II型內切酶Bsa I切割載體p19-A0獲得線性質粒；

b、通過Infusion重組試劑盒將啟動子與線性質粒在反應液中發(fā)生同源重組；

c、將同源重組后獲得的反應液轉化大腸桿菌DH5α，即可構建出含有不同啟動子的EGFP表達質粒；其中含有NyewA的表達質粒簡稱為pN_yewA，含有yewA的表達質粒簡稱為p_yewA。

傳統(tǒng)方法使用的酶切位點如EcoR I、BamH I等會干擾啟動子的正確測定，而本發(fā)明所使用的載體p19-A0避免了這些額外序列的存在和對結果的干擾。

含有tac啟動子（簡稱為Ptac）的陽性對照質粒的構建，包括以下步驟：

a、克隆如SEQ ID NO:3所示的谷氨酸棒桿菌保守SD序列和egfp基因片段，所需的引物為：

SD-EGFP-F: 5‘-CCCAAGCTTAAAGGAGGACAACTAATGGTGAGCAAGGGCG-3’

SD-EGFP-R: 5‘-CCCGGATCCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’

PCR擴增條件與“1、啟動子的克隆”中PCR擴增條件相同；

兩條引物的“AAGCTT”“GGATCC”分代表構建這一陽性對照質粒所需引入的酶切位點，分別為Hind III和BamH I。

b、Hind III和BamH I雙酶切，

c、T4連接。

酶切與連接均按照商品酶試劑的說明書指導進行。

谷氨酸棒桿菌保守SD序列和egfp基因片段與質粒pXMJ19上的Ptac組合，構建組成型表達的陽性對照質粒（簡稱為pTAC），這一經典的陽性對照代表了的谷氨酸棒桿菌高效表達重組蛋白的水平。

3、轉化。

包括以下步驟：

a、通過質粒提取試劑盒分別提取pN_yewA、p_yewA以及pTAC；

b、轉化谷氨酸棒桿菌ATCC 13032。

具體方法為：

（1）谷氨酸棒桿菌感受態(tài)細胞的制備

將在培養(yǎng)基平板上火化后的谷氨酸棒桿菌挑取接種至BHI培養(yǎng)基中，于30°C、230 rpm條件下過夜培養(yǎng)，將菌液轉接至含有3%甘氨酸、0.1%Tween 80和0.5%葡萄糖的LB液體培養(yǎng)基的250 ml三角瓶中，控制其初始OD₆₀₀為0.3，于30°C、230 rpm條件下培養(yǎng)4-6 h，至OD₆₀₀達到0.6-0.9。再將菌液轉移至無菌離心管中，冰上放置15 min。以下操作均在低溫，無菌條件下進行。

4°C、4000 rpm離心5min，去上清，收集菌體，用預冷的10%甘油重懸菌體，懸浮式用移液槍小心的吹打。重復上述離心，去上清步驟3次，用1.5 ml 10%甘油重懸細胞，分裝至1.5ml 離心管中，每管裝100 μl，保存于-80 °C備用。

（2）谷氨酸棒桿菌感受態(tài)的電擊轉化

將感受態(tài)細胞從-80 °C冰箱中去除，至于冰上融化，添加10μl重組質粒后輕輕混勻，轉移至預冷的0.1 cm電擊杯中，于1.8 kv，200 Ω，25 μF條件下電擊細胞。電擊后立即加入含1.85%腦心浸出液的9.2%山梨醇的LB液體培養(yǎng)基1 ml，混勻，轉入1.5 ml離心管中，于46°C水浴6 min，30°C，150 rpm振蕩培養(yǎng)2 h。然后將菌液濃縮后涂布于含有1.85%腦心浸出液的9.2%山梨醇的LB固體培養(yǎng)基上，于30°C培養(yǎng)48h。

4、啟動子的活性測定。

包括以下步驟：

a、培養(yǎng)，將“2、表達載體的構建”中構建的含有pN_yewA、p_yewA或pTAC的谷氨酸棒桿菌分別接種到2 ml 含有10 mg/L氯霉素的腦心浸出液（BHI）培養(yǎng)基中，30 °C、230 r/min培養(yǎng)過夜，然后按照1:100的比例稀釋轉接到新的2 ml BHI培養(yǎng)基中，使用高通量24孔深孔培養(yǎng)板，在相同的條件下培養(yǎng)24小時；

b、菌體收集，將培養(yǎng)好的菌液迅速置于冰上預冷，離心收集菌體，用PBS緩沖液清洗兩次，重懸；

c、EGFP表達量測定：單位菌體的EGFP表達量定義為熒光強度F與樣品OD₆₀₀的比值，使用多功能酶標儀測量OD₆₀₀和熒光強度，其結果如下表所示。

5、啟動子NP_yewA中SD序列單獨應用的效果分析。

通過改變PCR下游引物yewA-R的方法將傳統(tǒng)啟動子P_yewA末端的自身SD序列替換為新式啟動子NP_yewA所應用的保守SD序列，以形成啟動子CP_yewA，用于判斷新式啟動子表達效果的提升是否僅僅來自于這一保守SD序列。

所使用新下游引物為CyewA-R：TTTGGTCTCACCATTAGTTGTCCTCCTTT TGTTGAAATTTGGCCAGAGC

上游引物為yewA-F，按照相同的處理方法PCR之后，將PCR產物，即啟動子CP_yewA插入探測載體之中，并且測定該啟動子的活性。結果發(fā)現(xiàn)，含有啟動子CP_yewA的谷氨酸棒桿菌按照相同條件培養(yǎng)后，所測得的熒光強度為20716 RFU/OD，明顯低于新式啟動子NP_yewA。

上述實驗結果證明：

P_yewA及NP_yewA與蛋白編碼序列直接相連后即可啟動蛋白表達，并且可以在不添加任何化學誘導劑或者物理誘導條件的情況下組成型表達重組蛋白；

在綠色熒光蛋白報告基因的評測下，本發(fā)明的NP_yewA的表達效果與傳統(tǒng)形式的P_yewA相比明顯提升，并且這種提升不是單純的使用保守的谷氨酸棒桿菌SD序列所造成的，而需要結合本發(fā)明所述的新式啟動子結構，構建出NP_yewA才能發(fā)揮出更高的表達效果。同時這一啟動子的活性明顯超過人們常用的經典Ptac。

此外，通過SDS-PAGE分析，含有不同載體的谷氨酸棒桿菌的EGFP蛋白表達測試結果如圖3所示。其中，含有pN_yewA的谷氨酸棒桿菌所對應的EGFP蛋白條帶顏色深于含有p_yewA或pTAC的谷氨酸棒桿菌所對應的EGFP蛋白條帶顏色，亦印證了NP_yewA的蛋白表達水平高于P_yewA、Ptac的蛋白表達水平。