本發(fā)明涉及一種非化學，以紫外線引發(fā)的高生物相容性聚丙烯酰胺凝膠的制備方法。

背景技術(shù)：

在細胞體外培養(yǎng)技術(shù)中，水凝膠作為重要的合成微三維細胞外基質(zhì)材料，對細胞的生存及活動具有重要影響。本發(fā)明以丙烯酰胺為單體，在交聯(lián)劑，催化劑和紫外光照射下制備具有高生物相容性的聚丙烯酰胺水凝膠。

經(jīng)典的細胞體外培養(yǎng)技術(shù)為二維培養(yǎng)，不足之處在于此方法將細胞的生長限制為在支架表面的單層生長，可能引起細胞行為的改變。三維物質(zhì)系統(tǒng)可以作為良好的細胞外基質(zhì)模擬，減少二維培養(yǎng)所帶來的局限性。用于細胞培養(yǎng)的天然凝膠由于存在大量對細胞的生存和生長繁殖有利的生物體內(nèi)在性的因子，不利于研再生，可調(diào)節(jié)機械性能，易于加工和制造，可通過機械和生物化學信號來調(diào)節(jié)細胞的生存能力和細胞的粘附，分化，擴散和遷移。

聚丙烯酰胺在生物大分子如蛋白質(zhì)，核酸等的分析中具有廣泛的應用。傳統(tǒng)的聚丙烯酰胺以丙烯酰胺為單體，在無N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis）為交聯(lián)劑條件下發(fā)生自由基聚合，形成線性高分子；當存在Bis為N,N,N,N-四甲基乙二胺的作用下聚合交聯(lián)形成具有網(wǎng)狀立體結(jié)構(gòu)的凝膠。通過改變組分中Acr和Bis的配比，可制備硬度不同，孔徑大小不同的聚丙烯酰胺凝膠。由于傳統(tǒng)方法中所使用的交聯(lián)引發(fā)劑TEMED具有強神經(jīng)毒性，為實驗和聚丙烯酰胺凝膠的廣泛使用帶來了安全隱患，本發(fā)明使用紫外光照引發(fā)丙烯酰胺的交聯(lián)聚合，消除了傳統(tǒng)聚丙烯酰胺凝膠的毒性，同時也為聚丙烯酰胺凝膠的大量合成和使用創(chuàng)造了條件。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

解決的技術(shù)問題：本發(fā)明提供一種高生物相容性的聚丙烯酰胺凝膠的光交聯(lián)制備方法，制備的聚丙烯酰胺凝膠表面相對平整并具有可控的彈性模量和較好的生物相容性。同時，本發(fā)明中使用紫外光引發(fā)的丙烯酰胺交聯(lián)聚合，消除了技術(shù)流程中的毒性過程和聚丙烯酰胺凝膠成品的生物毒性，方法更為安全。

技術(shù)方案：一種聚丙烯酰胺凝膠的光交聯(lián)制備方法，制備步驟為：a.以超純水為溶劑，配制2wt.% N,N-亞甲基雙丙烯酰胺（Bis-Acrylamide）和20wt.%過硫酸銨（APS）；b. 避光條件下，將30wt.%丙烯酰胺（Acr-bis）溶液和2wt.% N,N-亞甲基雙丙烯酰胺溶液配制成混合溶液PA，所述30wt.%丙烯酰胺溶液與2wt.% N,N-亞甲基雙丙烯酰胺溶液的體積比為5:（1~6），再與 20wt.%過硫酸銨混合，所述PA與20wt.%過硫酸銨的體積比為（3~7）:1，放置在搖床上充分混合，使其完全混合均勻；c.吸取b步驟所得混合液滴加至潔凈干燥的玻片上，紫外光平行照射進行交聯(lián)；d.用超純水浸泡玻片與材料，將凝膠從玻片上取下，浸泡在PBS溶液中。

優(yōu)選的，將30wt.% 丙烯酰胺和2wt.% N,N-亞甲基雙丙烯酰胺按體積比5:6進行混合，配制為混合液PA；使PA和APS在體系中體積比11:2，制備成混合液。

優(yōu)選的，放置在搖床混合時間不少于30min，搖床轉(zhuǎn)速不低于100r/min不高于300r/min。

優(yōu)選的，上述紫外光波長為不低于254nm 不高于356nm。

有益效果：該操作過程簡單，材料易取且價格低廉，方法中單體的交聯(lián)聚合方法獲得了改進，增進了制備過程的安全性和材料的安全性。所得材料具有高生物相容性，表面較平整，，可以實現(xiàn)創(chuàng)造硬度可調(diào)的細胞三維培養(yǎng)基質(zhì)。相比于傳統(tǒng)的化學交聯(lián)方法，本研究中光交聯(lián)方法聚合丙烯酰胺單體的效率更高且可由調(diào)節(jié)光強進行控制，獲得的材料具有更高的彈性模量，交聯(lián)聚合過程及成品材料中去除了毒性材料TEMED的使用，為細胞的生長創(chuàng)造了穩(wěn)定的三維微環(huán)境，實現(xiàn)安全、高效、低價制備高生物相容性得聚丙烯酰胺凝膠。光交聯(lián)方法制備得到的聚丙烯酰胺凝膠彈性模量可達80~180MPa, 其間差異受原料配比影響；經(jīng)細胞形態(tài)，細胞周期和細胞凋亡檢測，經(jīng)光交聯(lián)得到的聚丙烯酰胺凝膠具有良好的生物相容性，且能夠較好的還原細胞在本體中的生長狀況。

附圖說明

圖1為光交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠實施例2樣品的SEM電鏡照片，結(jié)果顯示樣品表面比較平整，有少量稀疏的褶皺。

圖2為光交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠實施例3樣品的SEM電鏡照片，結(jié)果顯示樣品表面有明顯的溝壑顯示樣品表面相對平整但略有起伏。

圖3為光交聯(lián)聚丙烯酰胺凝膠實施例4樣品的SEM電鏡照片，結(jié)果顯示樣品表面平整，略有起伏但沒有明顯的褶皺。

圖4 為實施例1、2、3、4、5的生物相容性MTT檢測結(jié)果示意圖。

具體實施方式

實施例1

以超純水為溶劑配制20wt.%APS，以超純水為溶劑避光配制2 wt.% Bis-acrylamide，現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫保存；以超純水為溶劑配制75 wt.%乙醇；將100μL 30 wt.% Acr-bis，30μL 2 wt.% Bis-acrylamide，制成混合溶液PA，PA與50μL 20 wt.%APS及820μL 超純水(以1mL體系為例)混合，放置搖床混合約30min；轉(zhuǎn)速為160r/min將清潔后的玻片用超純水沖洗2~3次，用吹風機吹干；吸取一定量溶液滴加于玻片上使溶液的玻片上均勻鋪開，厚度不超過2μm，用256nm的紫外光平行照射玻片進行交聯(lián)；用超純水沖洗表面交聯(lián)的單體和低聚物；用超純水浸泡玻片與材料，將凝膠從玻片上取下浸泡于PBS中，制得聚丙烯酰胺凝膠。實施中交聯(lián)多不穩(wěn)定，出現(xiàn)交聯(lián)不完全或整片無法交聯(lián)的情況，經(jīng)AFM表征可見表面有較多成塊分布的突起和褶皺，彈性模量較低，不易測量，MTT檢測結(jié)果顯示細胞存活率為83%。

實施例2

以超純水為溶劑配制20 wt.%APS，以超純水為溶劑避光配制2 wt.% Bis-acrylamide，現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫保存；以超純水為溶劑配制75 wt.%乙醇；將125μL 30 wt.% Acr-bis，150μL 2 wt.% Bis-acrylamide， 制成混合溶液PA， PA與50μL 20 wt.%APS及675μL 超純水(以1mL體系為例)混合，放置搖床混合約30min；轉(zhuǎn)速為200r/min將清潔后的玻片用超純水沖洗2~3次，用吹風機吹干；吸取一定量溶液滴加于玻片上，使溶液的玻片上均勻鋪開，厚度不超過2μm。用256nm和354nm兩種波長的紫外光平行照射玻片進行交聯(lián)；用超純水沖洗表面交聯(lián)的單體和低聚物；用超純水浸泡玻片與材料，將凝膠從玻片上取下浸泡于PBS中，制得聚丙烯酰胺凝膠。凝膠交聯(lián)程度和成膠效果都很好，AFM表征結(jié)果可見樣品表面分布均勻，微觀表面平整，高度差距在納米級別，樣品的彈性模量在150MPa左右；SEM表征結(jié)果顯示材料表面有少量褶皺出現(xiàn)，MTT檢測細胞存活率為120%。

實施例3

以超純水為溶劑配制20 wt.%APS，以超純水為溶劑避光配制2 wt.% Bis-acrylamide，現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫保存；以超純水為溶劑配制75 wt.%乙醇；將200μL 30 wt.% Acr-bis，130μL 2 wt.% Bis-acrylamide， 制成混合溶液PA， PA與50μL 20 wt.%APS及620μL 超純水(以1mL體系為例)混合，放置搖床混合約60min；轉(zhuǎn)速為120r/min將清潔后的玻片用超純水沖洗2~3次，用吹風機吹干；吸取一定量溶液滴加于玻片上，使溶液的玻片上均勻鋪開，厚度不超過2μm。用256nm和354nm兩種波長的紫外光平行照射玻片進行交聯(lián)；用超純水沖洗表面交聯(lián)的單體和低聚物；用超純水浸泡玻片與材料，將凝膠從玻片上取下浸泡于PBS中，制得聚丙烯酰胺凝膠。凝膠交聯(lián)程度和成膠效果都很好，AFM表征結(jié)果可見樣品表面分布均勻，微觀表面平整，高度差距在納米級別，樣品的彈性模量在80MPa左右；SEM表征結(jié)果顯示材料表面有明顯溝壑出現(xiàn)，MTT檢測細胞存活率為113%。

實施例4

以超純水為溶劑配制20 wt.%APS，以超純水為溶劑避光配制2 wt.% Bis-acrylamide，現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫保存；以超純水為溶劑配制75 wt.%乙醇；將250μL 30 wt.% Acr-bis，50μL 2 wt.% Bis-acrylamide，制成混合溶液PA，PA與50μL 20wt.%APS及650μL 超純水(以1mL體系為例)混合，放置搖床混合約30min；轉(zhuǎn)速為220r/min，將清潔后的玻片用超純水沖洗2~3次，用吹風機吹干；吸取一定量溶液滴加于玻片上，使溶液的玻片上均勻鋪開，厚度不超過2μm。用256nm和354nm兩種波長的紫外光平行照射玻片進行交聯(lián)；用超純水沖洗表面交聯(lián)的單體和低聚物；用超純水浸泡玻片與材料，將凝膠從玻片上取下浸泡于PBS中，制得聚丙烯酰胺凝膠。凝膠交聯(lián)程度和成膠效果都很好，AFM表征結(jié)果可見樣品表面分布均勻，微觀表面平整，高度差距在納米級別，樣品的彈性模量在180MPa左右；SEM表征結(jié)果顯示材料表面平整，MTT檢測細胞存活率為106%。

實施例5

以超純水為溶劑配制20 wt.%APS，以超純水為溶劑避光配制2 wt.% Bis-acrylamide，現(xiàn)用現(xiàn)配，室溫保存；以超純水為溶劑配制75 wt.%乙醇；將275μL 30 wt.% Acr-bis(29:1)，75μL 2 wt.% Bis-acrylamide，制成混合溶液PA，PA與50μL 20 wt.%APS及600μL 超純水(以1mL體系為例)混合，放置搖床混合約30min；轉(zhuǎn)速為120r/min，將清潔后的玻片用超純水沖洗2~3次，用吹風機吹干；吸取一定量溶液滴加于玻片上，使溶液的玻片上均勻鋪開，厚度不超過2μm。用256nm和354nm兩種波長的紫外光平行照射玻片進行交聯(lián)；用超純水沖洗表面交聯(lián)的單體和低聚物；用超純水浸泡玻片與材料，將凝膠從玻片上取下浸泡于PBS中，制得聚丙烯酰胺凝膠。實施中交聯(lián)不夠穩(wěn)定，出現(xiàn)交聯(lián)不完全或整片無法交聯(lián)的情況，經(jīng)AFM表征可見表面平整，高度差很小。由于交聯(lián)和成膠穩(wěn)定性的欠缺，不是理想的配比。MTT檢測細胞存活率為85%。