專利名稱：一種sds-page快速脫色方法及其專用脫色杯的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于電泳凝膠脫色技術(shù)，具體涉及一種SDS-PAGE快速凝膠脫色方法及其 專用脫色杯，本發(fā)明采用蒸餾水或去離子水作為脫色劑，結(jié)合專門的脫色儀，在特定溫度下 利用加熱脫色劑方式進(jìn)行凝膠脫色。
背景技術(shù)：
SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，是在聚丙烯酰胺凝膠系統(tǒng)中引進(jìn)SDS(十二烷基磺酸 鈉)，SDS與蛋白質(zhì)疏水部分相結(jié)合，斷裂分子內(nèi)和分子間氫鍵，破壞蛋白質(zhì)的二級和三級 結(jié)構(gòu)的折疊結(jié)構(gòu)，并使其穩(wěn)定地存在于一個(gè)廣泛均一的溶液中。蛋白質(zhì)在一定濃度的含 有強(qiáng)還原劑的SDS溶液中，與SDS分子按比例結(jié)合，形成帶負(fù)電荷的SDS-蛋白質(zhì)復(fù)合物， 這種復(fù)合物由于結(jié)合大量的SDS，使蛋白質(zhì)喪失了原有的電荷狀態(tài)形成儀保持原有分子 大小為特征的負(fù)離子團(tuán)塊，從而降低或消除了各種蛋白質(zhì)分子之間天然的電荷差異，由于 SDS與蛋白質(zhì)的結(jié)合是按重量成比例的，因此在進(jìn)行電泳時(shí)，蛋白質(zhì)分子的遷移速度取決 于分子大小。當(dāng)分子量在15KD到200KD之間時(shí)，蛋白質(zhì)的遷移率和分子量的對數(shù)呈線性 關(guān)系，符合下式=IogMW = K-bX，式中麗為分子量，X為遷移率，k、b均為常數(shù)，若將已知 分子量的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)的遷移率對分子量對數(shù)作圖，可獲得一條標(biāo)準(zhǔn)曲線，未知蛋白質(zhì)在相 同條件下進(jìn)行電泳，根據(jù)它的電泳遷移率即可在標(biāo)準(zhǔn)曲線上求得分子量(Harnes，B. D and Rickwood，D，1981，GelElectrophoresis of Proteins :A Practical Approach. Oxford and Washington. D. C. :IDL Press. ；Creighton, R. F. et al.，1989，Protein Structure Apractical approach. Oxford :IRL Press.)0SDS-PAGE已成為現(xiàn)代生物學(xué)研究中重要技術(shù)手段，是對蛋白質(zhì)進(jìn)行分離、量化、比 較及特性鑒定的一種經(jīng)濟(jì)、快速、可重復(fù)的方法。SDS-PAGE易于操作和用途廣泛，它已成為 許多研究領(lǐng)域中一種重要的分析技術(shù)(郭堯君，1999，蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)，P123 156， 科學(xué)出版社；汪家政，范明，2000，蛋白質(zhì)技術(shù)書冊，P77 108，科學(xué)出版社)。SDS-PAGE包 括四個(gè)主要步驟，即凝膠制備、電泳、染色、脫色。其中凝膠制備和電泳已有成熟的技術(shù)和 專用設(shè)備，目前SDS-PAGE的凝膠染色主要方法有考馬斯亮藍(lán)染色、銀染、CaCl, KCl等方法 (郭堯君，1999，蛋白質(zhì)電泳實(shí)驗(yàn)技術(shù)，P123 156，科學(xué)出版社；汪家政，范明，2000，蛋白質(zhì) 技術(shù)書冊，P77 108，科學(xué)出版社)，其中考馬斯亮藍(lán)染色由于其清晰度最好，靈敏度較高 而被廣泛采用。然而考馬斯亮藍(lán)染色后需進(jìn)行脫色，將PAGE膠上非特異結(jié)合的考馬斯亮籃 脫掉后，才能顯示出清晰的電泳條帶。凝膠脫色需要用醋酸_甲醇或醋酸-乙醇脫色液在 脫色搖床上脫色2 3小時(shí)，中間需要更換幾次脫色液，脫色一次至少需要60ml脫色液，不 僅浪費(fèi)材料，而且用過的脫色液會(huì)造成環(huán)境污染，同時(shí)脫色液中甲醇和醋酸對人健康危害 嚴(yán)重，還不能及時(shí)看到試驗(yàn)結(jié)果。很多研究者對傳統(tǒng)的方法進(jìn)行了不同程度的改進(jìn)，肖亞中 等(肖亞中，王軍，蒲春雷，2002，一種簡易的聚丙烯酰氨凝膠脫色方法，生物學(xué)雜志19(4)， P34 35)發(fā)現(xiàn)使用20%乙醇和10%冰醋酸作為脫色劑，脫色液中放置紙巾吸附色素，此方 法可以縮短脫色時(shí)間，減少脫色液用量；最近張曉楠等(張曉楠，王爽，候穎，2008，聚丙烯酰氨凝膠的快速脫色及干膠的簡易制作，醫(yī)學(xué)分子生物學(xué)雜志5(1) ；P40 41)在此基礎(chǔ)上 建立了一種更為簡便的方法，用自來水作為脫色液，加入濾紙后，用微波爐加熱到70°C后， 然后在脫色搖床震搖脫色。然而我們在試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，自來水中加熱很容易將凝膠變成白色， 不能恢復(fù)，更不能進(jìn)行結(jié)果驗(yàn)證，此方法可行性不高。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于改進(jìn)SDS-PAGE膠傳統(tǒng)脫色技術(shù)，徹底擺脫使用傳統(tǒng)脫色液脫 色帶來的種種不便，而提供一種更加高效、快捷、安全的SDS-PAGE快速脫色方法，該技術(shù)結(jié) 合專門配備的儀器可以在1. 5 2小時(shí)內(nèi)完成染色脫色過程，并且電泳條帶清晰可辨、背景干凈。本發(fā)明的目的是通過以下技術(shù)方案來實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明的SDS-PAGE快速脫色方法， 包括以下步驟1)凝膠清洗電泳凝膠染色結(jié)束后，用蒸餾水、去離子水或超純水將膠清洗2-3 遍；2)預(yù)脫色將凝膠放入盛有蒸餾水、去離子水或超純水的脫色杯中，水量以剛剛 沒過凝膠為宜，加熱脫色杯，使脫色杯中水達(dá)到80°C時(shí)，停止加熱，將脫色杯中水全部放出， 重新加入冷水，加熱使溫度再次升高到80°C停止加熱，將水再次放出，預(yù)脫色結(jié)束；(此步 的目的是為了防止PAGE膠中高濃度的SDS在高溫下析出，造成泡沫溢出，甚至將膠沖爛。)3)脫色向脫色杯中加入足量蒸餾水、去離子水或超純水，水量是預(yù)脫色時(shí)的2-3 倍，加熱至80°C時(shí)，一邊放出熱水，一邊加入冷水，溫度始終保持在80°C，直到膠上背景干 凈、條帶清晰，脫色完成。4)結(jié)果保存將膠進(jìn)行掃描以及制備干膠。所述電泳凝膠染色是考馬斯亮藍(lán)染色。適用于SDS-PAGE快速脫色方法的專用脫色杯，包括適于加熱的杯體，在杯體上、 下部分別設(shè)置有由熱敏開關(guān)控制的進(jìn)水口和出水口，熱敏開關(guān)由設(shè)置在杯體上的溫度傳感 器控制。其脫色過程具體如下1.電泳凝膠的染色后處理(60-70分鐘)電泳凝膠經(jīng)過考馬斯亮藍(lán)R-250染色后，將染色液回收，凝膠用去離子水、蒸餾水 或超純水清洗3次，然后將凝膠輕輕放入裝有300ml去離子水或蒸餾水的電泳脫色裝置中。2.凝膠預(yù)脫色(10-15分鐘)將脫色杯置于電爐或電磁爐上加熱，待脫色杯中水達(dá)到80°C時(shí)，停止加熱，將杯中 水放出，重復(fù)2次。3.凝膠脫色(20-25分鐘)預(yù)脫色后，向裝有凝膠的脫色杯中加入足量(根據(jù)凝膠數(shù)量)去離子水、蒸餾水或 超純水，置于電爐上(金屬脫色儀可置于電磁爐上)加熱，待溫度升高到80°C時(shí)，溫度傳感 器將溫度傳導(dǎo)到脫色儀上的熱敏感開關(guān)，熱敏感開關(guān)跳起放出熱水，流入冷水，溫度降低， 開關(guān)閉合，溫度上升，如此反復(fù)循環(huán)，脫色杯中溫度一直維持在80°C左右，直到凝膠上電泳 條帶清晰、背景干凈為止。
4.然后將膠進(jìn)行掃描以及制備干膠。本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)1.以去離子水、蒸餾水或超純水取代傳統(tǒng)的甲醇-冰醋酸溶液作為脫色液，成本 低廉，無環(huán)境污染。2.配合專用脫色裝置利用加熱方法在30-40分鐘內(nèi)完成整個(gè)脫色過程，比常規(guī)脫 色方法(3-4小時(shí))更加快捷，加快試驗(yàn)進(jìn)度。3.操作簡單，本方法無需配制特殊脫色液，只要利用一般生化實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有加熱設(shè) 備，采用本方法中脫色杯(或?qū)嶒?yàn)室中燒杯，但需要實(shí)驗(yàn)者在旁邊用冷水控制溫度，防止沸 騰)，可以非常方便的進(jìn)行脫色試驗(yàn)。



圖1為本發(fā)明的工藝流程圖。圖2為本發(fā)明專用脫色杯結(jié)構(gòu)示意圖。圖2中標(biāo)號1為熱敏開關(guān)，2為溫度傳感器，3為脫色杯。圖3為煙草花粉蛋白SDS-PAGE電泳圖。圖4為百合與馬鈴薯花粉蛋白SDS-PAGE電泳圖。圖5為原核表達(dá)植物蛋白及純化過程SDS-PAGE電泳圖。
具體實(shí)施例方式本發(fā)明以下結(jié)合附圖將脫色過程進(jìn)一步描述如圖1所示本發(fā)明的脫色方法按以下步驟完成1)凝膠清洗電泳結(jié)束后，用蒸餾水、去離子水或超純水(不能用自來水)將膠清 洗2-3遍；2)預(yù)脫色將凝膠放進(jìn)脫色杯(脫色杯結(jié)構(gòu)如圖2所示)，加入少量蒸餾水、去離 子水或超純水，水面剛剛沒過凝膠即可，加熱使脫色杯(3)中水達(dá)到80°C時(shí)，停止加熱，將 杯中水放出，重復(fù)2次。3)脫色向脫色杯(3)中加入足量蒸餾水、去離子水或超純水，水量為預(yù)脫色時(shí) 2-3倍，加熱80°C時(shí)，熱敏開關(guān)(1)開啟，熱水流出，冷水流入，溫度降低，熱敏開關(guān)關(guān)閉，溫 度再次升高，如此反復(fù)循環(huán)，脫色杯(3)中水溫一直維持在80°C左右，直到蛋白膠背景干 凈、條帶清晰，脫色完成。熱敏開關(guān)(1)由設(shè)置在杯體上的溫度傳感器(2)控制開啟或關(guān)閉。4)結(jié)果保存將脫色完成的膠利用較大分辨率進(jìn)行掃描，制備干膠保存。
權(quán)利要求
一種SDS-PAGE快速脫色方法，其特征在于它包括以下步驟1)凝膠清洗電泳凝膠染色結(jié)束后，用蒸餾水、去離子水或超純水將膠清洗2-3遍；2)預(yù)脫色將凝膠放入盛有蒸餾水、去離子水或超純水的脫色杯中，水量以剛剛沒過凝膠為宜，加熱脫色杯，使脫色杯中水達(dá)到80℃時(shí)，停止加熱，將脫色杯中水全部放出，重新加入冷水，加熱使溫度再次升高到80℃停止加熱，將水再次放出，預(yù)脫色結(jié)束；3)脫色向脫色杯中加入足量蒸餾水、去離子水或超純水，水量是預(yù)脫色時(shí)的2-3倍，加熱至80℃時(shí)，一邊放出熱水，一邊加入冷水，溫度始終保持在80℃，直到膠上背景干凈、條帶清晰，脫色完成；4)結(jié)果保存將膠進(jìn)行掃描以及制備干膠。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的SDS-PAGE快速脫色方法，其特征在于所述電泳凝膠染色是考馬斯亮藍(lán)染色。
3.一種適用于權(quán)利要求1所述的SDS-PAGE快速脫色方法的專用脫色杯，其特征在于 包括適于加熱的杯體，在杯體上、下部分別設(shè)置有由熱敏開關(guān)控制的進(jìn)水口和出水口，熱敏 開關(guān)由設(shè)置在杯體上的溫度傳感器控制。
全文摘要
一種SDS-PAGE快速脫色方法及其脫色杯，其方法包括以下步驟1)凝膠清洗電泳凝膠染色結(jié)束后，用去離子水等將膠清洗2-3遍；2)預(yù)脫色將凝膠放入盛有上述水的脫色杯中，加熱達(dá)到80℃左右時(shí)，將脫色杯中水放出，該過程重復(fù)2次；3)脫色向脫色杯中加入足量上述水，加熱至80℃時(shí)后換水，再加熱，如此反復(fù)循環(huán)，直到背景干凈、條帶清晰，脫色完成。本發(fā)明優(yōu)點(diǎn)是1、以去離子水等取代傳統(tǒng)的甲醇-冰醋酸溶液作為脫色液，成本低廉，無環(huán)境污染。2、配合專用脫色裝置利用加熱方法在30-40分鐘內(nèi)完成整個(gè)脫色過程，方便快捷，加快試驗(yàn)進(jìn)度。3、操作簡單，本方法無需配制特殊脫色液，只需利用實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有加熱設(shè)備，采用本專業(yè)脫色裝置，就可以非常方便的進(jìn)行脫色試驗(yàn)。
文檔編號G01N1/28GK101871858SQ20101020452
公開日2010年10月27日 申請日期2010年6月22日 優(yōu)先權(quán)日2010年6月22日
發(fā)明者奚家勤, 宋紀(jì)真, 尹啟生, 李鋒, 楊軍, 王信民, 王廣山, 羅朝鵬, 金立鋒 申請人:中國煙草總公司鄭州煙草研究院