本發(fā)明涉及分子檢測(cè)領(lǐng)域，一種快速、方便、準(zhǔn)確、有效的檢測(cè)砧用南瓜‘偉砧1號(hào)’雜交種的分子鑒定方法，屬于分子生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

種子純度，是保證品種優(yōu)良性狀得以展現(xiàn)的關(guān)鍵因素，也是種子質(zhì)量控制中最棘手的問(wèn)題。傳統(tǒng)的田間生態(tài)學(xué)雜交種檢驗(yàn)方法易受環(huán)境條件和栽培措施的影響，鑒定周期長(zhǎng)，成本高，鑒定結(jié)果準(zhǔn)確性差。

隨著分子輔助育種工具的快速發(fā)展，dna分子標(biāo)記已從很多方面優(yōu)于傳統(tǒng)的鑒定方法，可以彌補(bǔ)傳統(tǒng)鑒定方法中存在的許多缺陷和難題，是對(duì)種子雜交種進(jìn)行快速、準(zhǔn)確鑒定的發(fā)展方向和必然選擇。目前，ssr分子標(biāo)記技術(shù)是現(xiàn)階段用于鑒定雜交種的常用方法。

ssr(simplesequencerepeat，ssr)即簡(jiǎn)單重復(fù)序列是普遍存在于真核生物基因組中的一種重復(fù)序列。ssr標(biāo)記屬于微衛(wèi)星標(biāo)記，有很多優(yōu)點(diǎn)，包括多態(tài)性高、共顯性、重復(fù)性好、數(shù)量豐富、對(duì)基因組覆蓋范圍廣以及操作簡(jiǎn)單易檢測(cè)，因而成為構(gòu)建遺傳連鎖圖譜、遺傳多樣性檢測(cè)、進(jìn)行分子標(biāo)記輔助育種、系譜分析、品種指紋圖譜繪制、品種純度檢測(cè)以及目標(biāo)性狀分子標(biāo)記篩選的理想工具，已被廣泛應(yīng)用于基因定位及克隆、品種鑒定、農(nóng)作物育種和進(jìn)化研究等領(lǐng)域。

砧用南瓜‘偉砧1號(hào)’是以‘sf1’為母本，‘s26’為父本育成的南瓜一代雜交種。具有與黃瓜親和力強(qiáng)，高抗枯萎病，嫁接黃瓜增加瓜條亮度的特點(diǎn)，已經(jīng)在設(shè)施黃瓜生產(chǎn)中大面積應(yīng)用。為了保證優(yōu)良雜交品種的推廣和產(chǎn)生最大的經(jīng)濟(jì)效益，篩選出可以對(duì)南瓜‘偉砧1號(hào)’雜交種進(jìn)行準(zhǔn)確鑒定的ssr引物，以解決‘偉砧1號(hào)’在制種過(guò)程中導(dǎo)致制種純度不高的問(wèn)題，為種子生產(chǎn)經(jīng)營(yíng)企業(yè)提供了一個(gè)準(zhǔn)確、穩(wěn)定、快速、實(shí)用的‘偉砧1號(hào)’雜交種鑒定的方法。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種用于檢測(cè)‘偉砧1號(hào)’南瓜雜交種的引物序列。本發(fā)明目的還在于提供一種利用上述引物進(jìn)行‘偉砧1號(hào)’南瓜雜交種的分子鑒定方法。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：

(1)提取南瓜幼苗的基因組dna；

(2)以基因組dna為模板，從已獲得的ssr引物中進(jìn)行pcr擴(kuò)增篩選出父本‘s26’與母本‘sf1’之間的特異性條帶差異明顯的引物ng22；

(3)以砧用南瓜雜交種‘偉砧1號(hào)’的基因組dna為模板，使用ssr引物ng22進(jìn)行pcr擴(kuò)增，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測(cè)；

(4)對(duì)電泳檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行分析：若子代同時(shí)出現(xiàn)父本和母本的特異性條帶，即為真正的雜交種；若子代只出現(xiàn)父本或母本的特異性條帶，即為假雜交種；

附圖說(shuō)明

圖：ssr標(biāo)記ng22在親本及子代中的擴(kuò)增結(jié)果，m為pbr322dna/mspⅰ，1-6為‘偉砧1號(hào)’，7-8為父本，9-10為母本。

具體實(shí)施方式

為了能更加清楚的說(shuō)明本發(fā)明的方法，下面對(duì)本發(fā)明的試驗(yàn)方法作以詳細(xì)的說(shuō)明，在此需加以說(shuō)明的是：本發(fā)明所用到的試劑均有市售。

(一)供試南瓜材料

所用材料包括砧用南瓜雜交種‘偉砧1號(hào)’及其父本‘s26’和母本‘sf1’。

(二)供試南瓜基因組dna的提取

(1)葉片采集：將供試南瓜材料播種于培養(yǎng)缽中，待三葉一心時(shí)期，取植株頂部較為幼嫩的葉片，在-80℃下保存?zhèn)溆谩?/p>

(2)取一片南瓜葉于1.5ml離心管中，在冰盒上充分研磨，加入600μl預(yù)熱的2×ctab緩沖液，10μl的β-巰基乙醇，輕輕混勻，65℃水浴1h(每隔10min輕輕搖晃一次)。

(3)加等體積的氯仿，輕輕混勻，12000rpm離心10min，取上清于另一新的離心管中。

(4)同上。

(5)加入的等體預(yù)冷的積異丙醇，輕輕混勻，-20℃保存30min，12000rpm離心10min，棄上清。

(6)70％乙醇洗滌沉淀2-3次，置于超凈工作臺(tái)風(fēng)干。

(7)加入50μl的ddh2o溶解。

(8)dna質(zhì)量的檢測(cè)：1％的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。

(三)ssr分子標(biāo)記引物的篩選

從已獲得的56個(gè)ssr引物中進(jìn)行pcr擴(kuò)增篩選出父本與母本之間的特異性條帶差異明顯的引物，即ng22。

pcr反應(yīng)體系與程序

(1)pcr反應(yīng)體系

(2)pcr反應(yīng)程序

pcr反應(yīng)程序：

94℃預(yù)變性5min；94℃變性30s，57℃退火30s，72℃延伸1min，30個(gè)循環(huán)；72℃總延伸10min。于4℃冰箱保存。

pcr產(chǎn)物檢測(cè)

(3)12％的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳對(duì)pcr擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)：

凝膠組分(15ml)：

150v電泳3h，關(guān)閉電源，對(duì)膠體水洗兩次，10％乙醇固定10min，水洗兩次，1％硝酸敏化5min，水洗兩次，0.2％硝酸銀染色30min，水洗兩次，2％氫氧化鈉顯色至出現(xiàn)清晰目的條帶，水洗兩次，10％乙酸停顯2min，水洗兩次，拍照保存。

如圖所示，1-5：砧用南瓜‘偉砧1號(hào)’擴(kuò)增出107bp和113bp兩條帶；6，7：父本‘s26’

擴(kuò)增出113bp的條帶；8，9：母本‘sf1’擴(kuò)增出107bp的條帶?；厥仗禺悧l帶，送上

海生物工程公司測(cè)序。雜交種中113bp條帶的序列如seqidno:3所示，107bp條帶

的序列如seqidno:4所示，與父本、母本擴(kuò)增產(chǎn)物的序列相符。